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蛋白酶抑制劑范文1
中圖分類號：P618.21 文獻標識碼：A 文章編號：1009-914X（2014）10-0374-01
蛋白酶抑制劑（proteinase inhibitor， PI）是一類能夠抑制蛋白水解酶活性的物質，廣泛存在于動植物和微生物中。其中胰蛋白酶抑制劑（Trypsin inhibitor， TI）具有重要的藥用價值，對急性胰腺炎、肺氣腫、抗休克、防治腦水腫和腦缺血等都有很好的臨床 治療 效果，還有研究表明對 HIV 和腫瘤的治療也有重要意義。因此，從傳統中藥中篩選具有TI活性的材料有很廣闊的應用前景和市場價值。
魚腥草為三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的地上部分，具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋之功效，是臨床應用極其廣泛的中藥之一。本實驗根據前期篩選的結果，利用魚腥草為材料對從魚腥草中提取TI的工藝進行優化，找出最佳的提取條件，為今后的 工業 化生產TI提供基礎性數據。
1 儀器與試劑
1.1 試劑胰蛋白酶（ 北京麒麟宏偉公司） 、大豆蛋白酶抑制劑（國藥集團化學試劑有限公司）、苯甲酰DL-精氨酸對硝基苯胺（BAPNA）（上海三杰生物技術有限公司）、三-羥甲基-氨基甲烷、無水氯化鈣、鹽酸、三氯乙酸、氫氧化鈉等為國產分析純；魚腥草。
1.2？ 儀器可見光分光光度計（7202B） 、離心機（LD-4） 、精密pH 計、水浴鍋、精密 電子 天平（FA2004N）。
2 方法
2.1？ 魚腥草中胰蛋白酶抑制活性成分提取的正交實驗設計根據 文獻 及預實驗結果，本實驗采用雙蒸水作為提取TI的溶劑。稱取干燥的魚腥草全草5 g，粉碎，在平行操作條件下，選用L9（34）正交實驗表進行提取實驗，以胰蛋白酶活性大小為指標，進行9次實驗，每次實驗重復3次，然后過濾并收集濾液，減壓濃縮到100 ml。
2.2？ 魚腥草中胰蛋白酶抑制活性成分對胰蛋白酶的抑制率測定方法采用苯甲酰DL-精氨酸對硝基苯胺（BAPNA）法：取胰蛋白酶液1 ml，加藥材提取液1 ml在37℃水浴保溫5 min，加入BAPNA溶液5 ml，37℃水浴保溫10 min后，立即加1 ml三氯乙酸（30%）終止反應，用分光光度法在410 nm條件下測定吸光度。按下列公式 計算 樣品提取液的抑制百分率：i=（Ar-Abr ）-（As-Abs）（Ar-Abr）×100%
式中：i ―抑制百分率；Ar ―標準溶液的吸光度；Abr―含標準溶液的空白對照液的吸光度；As―樣品溶液的吸光度；Abs―含樣品溶液的空白對照液的吸光度。
3 結果與方差分析
由方差分析可知，各因素對提取效果的影響程度依次為B>A>C>D，其中因素B為高度顯著，因素A，C影響顯著，因素D沒有統計學意義，對試驗結果的影響很小。由R值可知， 各因素對試驗結果的重要次序為B>C>A>D?？紤]到規?；a中 經濟 、效率等因素，本文優選工藝A1B2C3D2， 即在60℃，用30倍量水， pH值為9，3 h/次為最佳提取工藝。按照此工藝條件進行3次平行實驗，測定提取液對胰蛋白酶的抑制率，結果平均抑制率為58.27%，表明本實驗確定的工藝路線穩定可靠。
4 討論
因素A對實驗結果有顯著的影響，60℃時提取活性最高，隨著溫度的上升抑制率有下降的趨勢，說明隨著溫度的上升對TI有失活的作用。因素B對實驗有高度顯著的影響，在所有因素中影響最顯著，說明隨著溶劑量的增加會提高TI的提取效率，但從變化趨勢看當30倍量時繼續增加溶劑量，TI的提取率增幅不是很明顯，因此考慮生產成本和效益用30倍量是最好的。因素C對實驗結果也有顯著影響，隨著pH值的增加，提取活性成分的提取率增加，這說明在堿性條件下提取效率升高。
本實驗通過正交實驗法對提取工藝條件進行了優化， 并按最佳工藝進行了驗證試驗， 結果證明用該工藝作為魚腥草中TI的有效部位的粗提取，具有工藝簡單、提取率高、操作控制容易、穩定性好的特點。
參考文獻
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蛋白酶抑制劑范文2
【摘要】
目的建立一種能夠檢測不同分子大?。ㄓ绕涫堑头肿恿浚┑鞍酌敢种苿┑碾娪痉椒?。方法根據特異蛋白酶抑制劑抑制靶蛋白酶活性的原理，借助明膠-Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品，膠板經蛋白酶水解后，以考馬斯亮藍染色。結果小分子量的胃蛋白酶抑制劑與較大分子量的BBI均能在該方法中顯示出活性帶，并且利用該方法檢測到山合歡種子中含有一種胰蛋白酶抑制劑。結論該方法能夠滿足不同分子大小、不同類型蛋白酶抑制劑檢測的需要。山合歡胰蛋白酶抑制劑的發現對山合歡進一步的研究和綜合開發有重要意義。
【關鍵詞】 山合歡 Tricine系統 蛋白酶抑制 電泳
Abstract：ObjectiveTo establish an detecting method for protease inhibitors， especially for low-molecular-weight inhibitors. MethodsInhibitor samples were separated on a gelatin-SDS-PAGE in a Tris-Tricine buffer system. After electrophoresis， the gel was incubated with the target proteases to hydrolyze the background gelatin. The inhibitor bands， which were undigested by the target proteases， were stained.ResultsLow-molecular-weight inhibitor (pepstatin A) and larger inhibitor (soybean Bowman-Birk inhibitor) were demonstrated by this method and showed clear blue inhibitor bands in the white background. By this method， a trypsin inhibitor was detected from the seeds of Albizzia kalkora (Roxb.) Prain. ConclusionThis method not only fit for inhibitors with different molecular mass， but fits for inhibitors with various species. Moreover， the trypsin inhibitor found in Albizzia kalkora is important for further research and overall exploration.
Key words：Albizzia kalkora (Roxb.) Prain； Tricine buffer system； Protease inhibitor; Electrophoresis
蛋白酶抑制劑是一類可以抑制靶蛋白酶水解活性的功能多肽，參與體內許多重要生理過程的調節，廣泛存在于豆科、禾本科及葫蘆科等植物的種子及塊莖中［1］。此外，動物的血液、、胰臟中以及酵母菌、鏈霉菌屬等微生物中亦有蛋白酶抑制劑的存在［2］。蛋白酶抑制劑具有抗炎抗感染的能力，已被廣泛用于治療急性胰腺炎，燒傷后休克及產后大出血等疾?。?］。更重要的是許多臨床前研究發現蛋白酶抑制劑具有降糖、抗輻射、抑制因不良環境因素引起的癌轉化過程、抑制腫瘤細胞生長的作用，有可能開發出新型的治療糖尿病、抗癌藥物［4～6］。因此尋找及利用蛋白酶抑制劑是極具研究意義的。由于蛋白酶抑制劑屬于小分子多肽，有些蛋白酶抑制劑的分子量甚至小于1 000，為了能從材料中尋找新的蛋白酶抑制劑，建立適合于低分子量蛋白酶抑制劑的檢測方法十分必要。我們采用Tricine系統，在分離膠中加入明膠，電泳分離樣品后，膠板以特定蛋白酶水解，最后用考馬斯亮藍染色的方法，建立了一種滿足不同分子量大小、不同類型的蛋白酶抑制劑檢測需要的電泳方法。
1 儀器與材料
TU-1901紫外分光光度計(北京普析)；Mini Protein III垂直板電泳槽（美國BioBrad公司）；山合歡Albizzia kalkora (Roxb.) Prain的成熟種子采自西南交通大學峨眉校區；Acrylamide、Bisacrylamide、胰蛋白酶、甘氨酸、Tris、Tricine、胃蛋白酶抑制劑(Pepstatin A，分子量為685 Da)為Amresco.產品；胃蛋白酶、大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制劑(BBI，分子量為8800 Da)為Sigma產品；其余試劑均為國產分析純。
2 方法與結果
2.1 山合歡蛋白酶抑制劑粗提物制備按Genov等［7］的方法略加修改。山合歡種子(20 g)打磨成粉，加入200 ml去離子水，室溫攪拌提取2 h，離心(6 000 ×g，20 min， 4℃)，沉淀再用100 ml去離子水抽提1次，離心(6 000 ×g，20 min，4℃)，合并2次上清液。加固體硫酸銨至35%飽和度，4 ℃靜置過夜，離心(6 000 ×g，20 min，4 ℃)收集上清液。上清液加入固體硫酸銨至55%飽和度，4 °C放置2 h，離心(6 000 ×g，20 min，4℃)，收集沉淀，用少量去離子水溶解，對去離子水充分透析，離心(10 000 ×g，10 min，4℃)，所得上清液即為山合歡蛋白酶抑制劑粗提物，置-20 °C下儲存。
2.2 合歡蛋白酶抑制劑粗提物抑制活力的測定蛋白質濃度的測定采用Bradford法［8］，以牛血清白蛋白為標準蛋白。抑制活力按照Erlanger等人的方法［9］，以實驗條件下，與不加抑制劑的樣品的吸收值比較，每降低0.1個A410 nm的吸收值為一個抑制活性單位。
實驗結果：由20 g山合歡種子可以制備得到14 ml粗提物，用Bradford法測定蛋白質含量為0.5 mg·ml-1，測定對胰蛋白酶的抑制活力為202 單位/mg蛋白。實驗結果表明山合歡粗提物中含有胰蛋白酶抑制劑。
2.3 明膠-SDS-PAGE明膠-SDS-PAGE采用Hanspal等［10］的方法略加修改，分離膠濃度12%(pH 8.8)，分離膠中含有0.2% (W/V)明膠。樣品處理液配方：6% SDS，300 mM Tris-HCl，pH 8.0，50%甘油，0. 05%溴酚藍。樣品與樣品處理液按2∶1比例混合。電極緩沖液為25 mM Tris，250 mM甘氨酸 (pH 8.3)，0.1% SDS。電泳完畢后，膠板經去離子水沖洗3次，置于2.5% Triton X-100溶液中復性25 min（兩次）。用去離子水沖洗膠板多次，將含有BBI和山合歡粗提物的電泳膠條置于胰蛋白酶酶解緩沖液中，另將含有Pepstatin A的電泳膠條置于胃蛋白酶酶解緩沖液中，37 °C水浴保溫30 min，再用考馬斯亮藍R-250染色40 min，10%乙酸-10%乙醇脫色過夜。胰蛋白酶酶解緩沖液配方為100 mM Tris-HCl，pH 8.0緩沖液(內含50 μg/ml胰蛋白酶)。胃蛋白酶酶解緩沖液配方為0.2% NaCl，HCl，pH 3.0緩沖液(內含50 μg/ml胃蛋白酶)。結果見圖1。
2.4 明膠-Tricine-SDS-PAGE采用Schagger等人建立的Tricine系統［11］并略加修改，分離膠為12%(W/V)丙烯酰胺，0.32%(W/V)雙丙烯酰胺，0.2%(W/V)明膠，10%(W/V)甘油，0.75 M Tris-HCl，pH 8.45，0.1% SDS。濃縮膠為5%(W/V)丙烯酰胺，0.13%(W/V)雙丙烯酰胺，0.33 M Tris-HCl pH 6.8。樣品處理液配方及樣品的處理與明膠-SDS-PAGE方法相同。電泳時，以0.2 M Tris (pH 8.9)緩沖液為陽極緩沖液，以0.1 M Tris，0.1 M Tricine，0.1% SDS (pH 8.25)緩沖液為陰極緩沖液，電流大小為1 mA/孔，當溴酚藍遷移至凝膠底部時停止電泳。電泳完畢后，膠條的處理過程與明膠-SDS-PAGE相同。結果見圖2。
3 討論
明膠-SDS-PAGE是根據Laemmli系統而建立的檢測蛋白酶抑制劑的常用電泳方法［10］。該方法適合于檢測較高分子量的蛋白酶抑制劑，如BBI在明膠-SDS-PAGE中能觀察到清晰的抑制活性帶(圖1a)。然而在傳統Laemmli系統中，小分子短肽的濃縮是較困難的，因為小分子短肽與SDS形成的復合體具有與SDS本身類似的電荷和大小，會出現短肽-SDS復合物與SDS顆粒共遷移的現象，導致分子量小于1 kDa的短肽無法取得較好的分離效果［11，12］。如圖1c中，含有Pepstatin A的電泳膠條未發現有抑制活性帶的出現。
Schagger等［11］報道了一種改進的Laemmli 法， 用Tris-Tricine體系代替Tris-glycine體系后可很好地分離分子量在1～100 kD的蛋白質。該方法降低了分離膠的pH值(pH 8.45)，使蛋白質的移動速度變慢，提高了電泳分辨率；其次，采用不連續的電極緩沖體系和使用Tricine替代甘氨酸作為慢遷移離子，解除短肽-SDS復合物與SDS顆粒的共遷移效應，改善小分子量短肽的電泳效果［11］。我們首先考察該方法的靈敏度，結果發現500 ng的BBI在明膠-Tricine-SDS-PAGE中能觀察到清晰的抑制活性帶(圖2a)，其電泳遷移率要低于明膠-SDS-PAGE，表明該方法具有很高的靈敏度。更為重要的是Pepstatin A在明膠-Tricine-SDS-PAGE中能夠觀察到一條清晰的抑制活性帶(圖2c)。以上結果表明該方法的優點在于靈敏度高，能夠檢測不同類型、不同分子大小的蛋白酶抑制劑，彌補了明膠-SDS-PAGE無法檢測低分子量蛋白酶抑制劑的缺陷，從而為大量樣品的篩選工作提供了有效、快捷的技術手段。
山合歡Albizzia kalkora屬豆科含羞草亞科喬木。近年來發現山合歡皮具有鎮靜安神、抗抑郁等功效［13， 14］，是一種極具開發價值的藥用植物。但一旦山合歡皮被使用后，會損壞樹木，破壞生態環境。山合歡種子一般在秋天結果后作為廢料任其自然消失，未充分加以利用。因此，在應用山合歡皮時，應同時開發山合歡種子，一可充分利用自然資源，二可保護環境。我們分別利用明膠-SDS-PAGE和明膠-Tricine-SDS-PAGE檢測了山合歡粗提物，結果均發現只有一條抑制活性帶(圖1b，圖2b)，說明山合歡種子只含有一種胰蛋白酶抑制劑。迄今未見國內外有關山合歡胰蛋白酶抑制劑的報道。因此，本實驗結果對山合歡進一步的研究和綜合開發具有重要意義。對此我們將進一步分離純化這種胰蛋白酶抑制劑，并進行抑制腫瘤細胞實驗。 參考文獻
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蛋白酶抑制劑范文3
【摘要】 目的 探討血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C（cystatin C）在診斷早期糖尿病腎病(DN)中的價值。方法 測定糖尿病正常蛋白尿組（A組），糖尿病微量蛋白尿組（B組），糖尿病大量蛋白尿組（C組）的血清cystatin C和血尿素氮（BUN）、血清肌酐（Scr），對各項指標比較分析。結果 cystatin C值C組明顯高于B、A組，B組高于A組，cystatin C在三組之間差異均有統計學意義（P＜0.05）；BUN、Scr在A、B組中無顯著性差異，但C組患者的BUN和Scr明顯高于A、B組，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 血清cystatin C是診斷早期DN的理想指標。
【關鍵詞】 半胱氨酸蛋白酶抑制劑C 糖尿病腎病
【Abstract】 Objective To explore the diagnostic value of serum cystatin C in early stage diabetic nephropathy.Methods Determination of diabetic normal albuminuria group (A)， diabetic microalbuminuria group (B group)， a large number of diabetic proteinuria group (C)， cystatin C serum blood urea nitrogen (BUN)， serum creatinine (Scr)， the various indicators Comparative analysis.Result Cystatin C value of the group C was significantly higher than group B and A， group B than group A.Cystatin C IN the three groups was statistically significant differences (P＜0.05); BUN， Scr in the A， B group， no significant differences， but Group C with BUN and Scr were significantly higher than A， B group， the difference was statistically significant (P＜0.05).Conclusion Serum cystatin C in early diagnosis of diabetic kidney disease is the ideal targets.
【Key words】 Cystatin C Diabetic nephropathy
糖尿病腎病(DN)是糖尿病微血管病變的重要組成部分之一，一旦病情進展至臨床腎病期，治療效果差，是導致糖尿病病人死亡的主要原因之一。早期發現DN，及早采取治療性干預措施可延緩甚至逆轉病情，因此及早診斷DN至關重要。目前主要以尿白蛋白排泄率作為DN的診斷和分期標準，但該法受發熱，尿路感染，高血糖等多種因素的影響，因此尋求其他簡便易行的診斷指標是今后的研究方向。近年國外有研究指出［1］，血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C（Cystatin C）是反映腎小球濾過率良好而敏感的指標，國內亦有報道［2］其診斷早期DN的敏感性高。為了探討Cystatin C在早期DN中的診斷價值，作者自2007年3至9月分組對DN病人的cystatin C與血尿素氮(BUN)，血清肌酐(Scr)進行測定，并分析比較，其結果如下。
1 臨床資料
1.1 一般資料 糖尿病正常蛋白尿組（A組）病人43例，男23例，女20例；平均年齡45.6歲，平均病程5.3年，24h尿白蛋白排泄＜30mg；DN微量白蛋白尿組（B組）病人24例，男13例，女11例；平均年齡47.3歲，平均病程8.5年， 24h尿白蛋白排泄30～300mg；DN大量白蛋白尿組（C組）病人15例，男8例，女7例；平均年齡60.4歲，平均病程11.7年，24h尿白蛋白排泄>300mg。均為本院內分泌科住院病人。糖尿病的診斷符合1999年WHO糖尿病的診斷標準。所有病人均無心血管、呼吸系統及急慢性感染等合并癥，以上各組病人年齡、性別、病程經比較均無統計學意義，具有可比性。
1.2 方法 病人入院后留取24h尿，測定24h尿白蛋白定量，抽取靜脈血5ml分離血清，分別檢測cystatin C，BUN，Scr。24h尿白蛋白測定采用德國BN Prostec特定蛋白分析儀，免疫速度比濁法測定，試劑為原產微量白蛋白試劑盒；血清cystatin C濃度測定采用日立7060全自動生化分析儀，乳膠顆粒增強免疫比濁法測定，為北京九強公司生產的試劑盒，血清BUN，Scr測定采用日立7060全自動生化分析儀酶法測定，試劑盒購自日本第一化學株氏社。
1.3 統計學分析 應用SPSS13.0軟件進行統計分析，計量資料以（x±s）表示，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 各組血清cystatin C，BUN，Scr結果比較 三組病人cystatin C，BUN，Scr結果見表1。cystatin C值C組明顯高于B、A組，B組高于A組，cystatin C在三組之間差異均有統計學意義（P＜0.05）；BUN、Scr在A、B組中差別無統計學意義，但C組病人的BUN和Scr明顯高于A、B組，差異有統計學意義（P＜0.05）。表1 各組cystatin C、BUN、Scr的測量結果
2.2 血清cystatin C和BUN，Scr診斷早期DN的比較 以尿微量白蛋白（＞20μg/min）作為診斷早期DN的金標準，血清cystatin C（＞0.96mg/L）診斷早期DN的敏感性為87.31％，而Scr＞134μmol/L為34.26％，BUN＞134mmol/L為30.52％。血清cystatin C診斷早期DN的敏感性高于Scr和BUN，差異有統計學意義（P＜0.05）。
3 討論
在臨床工作中，如何準確地評估糖尿病腎功能情況，特別是對糖尿病早期腎功能損害程度的判定，對及早干預糖尿病腎病(DN)的進展有非常重要的作用。目前臨床中常用的反映腎小球濾過功能的指標有BUN、SCr、24h尿肌酐清除率（CCr），但均有一定的局限性，且不同程度地受到一些腎內或腎外因素的影響。由于腎臟強大的代償功能，在腎功能輕度受損時BUN、SCr可無變化，當BUN、SCr高于正常時已表明60%～70%的有效腎單位受到了損害，因此BUN、SCr敏感性較差，不能作為腎臟早期功能受損的指標。此外BUN、SCr還受到蛋白攝入量、體內代謝水平及某些藥物的影響，不能真實地反映腎小球濾過功能。24h CCr雖然是反映腎小球濾過功能較敏感的指標，但也有一定的局限性，也會受一些因素的干擾，如腎小管能分泌少量的肌酐，使測得的結果較實際腎小球濾過率高;此外尿液收集、記錄不準確，部分尿液丟失，尿液儲存不當，特別是在高溫下，尿酸會向肌酐改變，以上因素對結果均有影響。
近年國外有研究指出，血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C（Cystatin C，Cys C）反映腎小球濾過率的水平較BUN、SCr為好［1］。Cys C是一種非糖基化的堿性蛋白產物，分子量為13559，由120氨基酸組成，是體內最重要的半胱氨酸蛋白酶抑制劑之一。Cys C是人體內的有核細胞產生，生產率穩定，不受個體肌肉量、性別、年齡、腎前因素和慢性炎癥的影響［3，4］，血清Cys C幾乎完全由腎小球濾過，被腎小管分解代謝，而不被腎小管重吸收及分泌［1，4］。Cys C自1985年發現，已逐漸應用于臨床，通過對血中Cys C的測定來反映腎小球的濾過率（腎臟功能），不需收集尿液，只需一份血標本，且重復性良好。據報道，血Cys C濃度與腎小球濾過率的相關性明顯優于SCr，因而能更精確地反映腎小球濾過率，特別是在腎功能僅有輕度減退時，血Cys C的敏感性遠優于SCr［1～3］［5～9］。本文結果顯示：cystatin C值C組明顯高于B、A組，B組高于A組，cystatin C在三組之間差異均有統計學意義（P＜0.05）；BUN、Scr在A、B組中差別無統計學意義，但C組患者的BUN和Scr明顯高于A、B組，差異有統計學意義（P＜0.05）。血清cystatin C診斷早期DN的敏感性高于Scr和BUN，差異有統計學意義（P＜0.05）。綜上所述，血清cystatin C與尿微量白蛋白相關性好，敏感性高，是診斷早期DN的理想指標，其檢測方法簡單、快捷、方便，值得臨床推廣和應用。
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蛋白酶抑制劑范文4
【關鍵詞】 胱抑素C；冠心病
血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(Cystatin, CysC) 目前已成為臨床上評價腎小球濾過功能的一個重要指標，不受個體肌肉量、性別、年齡、腎前因素和慢性炎癥的影響，其含量升高或降低直接與多種疾病有關[1]，不僅在腎臟疾病方面有臨床價值,而且在肝臟疾病、糖尿病、冠心病等方面也具有一定的價值。為探討冠心?。–HD）患者血清CysC的臨床檢測價值，本文采用免疫比濁法檢測Cys C的濃度，并同時其與尿素（Urea）、肌酐（Cr）、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C) 、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和脂蛋白a[LP(a)]水平進行比較，旨在研究血清Cys C在冠心病患者中的變化及意義。現報道如下：
1 材料與方法
1.1 研究對象 我院住院的CHD患者60例，診斷均參照文獻[2]的標準，排除肝炎、腫瘤、肺心病等。其中穩定型心絞痛組，；男性16例、女性7例，平均年齡56.5歲、不穩定型心絞痛組，男性11例、女性8例，平均年齡60歲、心肌梗死組，男性12例、女性6例，平均年齡58歲。另設健康對照組80例，男43例，女37例，年齡35～79歲，平均年齡53.5±12.5歲，經體檢、心電圖及負荷試驗、心臟超聲、X線等檢查均未發現異常。入選研究對象無嚴重感染、創傷、腫瘤、風濕、甲狀腺功能低下以及嚴重肝腎功能異常等疾病。
1.2 研究方法
1.2.1 標本的采集：受試者1周內保持平時的飲食習慣，3d內避免高脂飲食，24h內不飲酒，空腹12h后靜脈采血5ml，離心分離血清測定。
1.2.2 儀器與試劑：以東芝40全自動生化分析儀、伊利康試劑、伊利康校準品和Roche質控品組成的檢測系統[3]。CysC 、LP(a)試劑采用免疫比濁法， BUN、Cr均采用酶法、HDL- C、LDL-C均采用直接法。
1.2.3 統計學分析：采用統計學軟件SPSS13.0對數據進行處理，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，組間均數的比較采用t檢驗，P < 0.05差異有統計學意義。
2 結果
2.1 血清CysC水平不穩定型心絞痛組、心肌梗死組組均高于對照組（P
表1 各組檢測指標水平()
（注:a與對照組相比P
3 討論
冠心病已成為目前嚴重危害人類健康及影響人們生活質量最常見心血管疾病。在臨床及基礎研究中多被重視并加以控制，以降低心血管疾病的發病率及病死率。在腎損害病人中，缺血性心臟病如心絞痛、心肌梗死和猝死，以及腦血管疾病、外周血管疾病和心力衰竭較為常見。腎損害與動脈粥樣硬化關系十分密切。而CysC能自由地被腎小球濾過，但不被腎小管重吸收和分泌, 且不受炎癥等因素影響，故CysC是一項反映腎小球濾過功能的理想指標[4]。本研究結果顯示血清CysC水平心肌梗死和不穩定型心絞痛組均高于對照組，且心肌梗死組高于不穩定型心絞痛、穩定型心絞痛組，表明血清CysC水平是腎功的敏感指標。而血清Urea水平心肌梗死組高于對照組，血清Cr水平冠心病組與對照組無顯著差異。LP(a)是冠心病的一個獨立危險因素[5]。本研究顯示血清LP(a)水平不穩定型心絞痛組和心肌梗死組均顯著高于對照組，但兩組間無統計學差異，同時，血清HDL-C水平心肌梗死組顯著低于對照組，該結果得出HDL-C水平與心血管的保護作用呈正相關，HDL-C降低時心血管容易損傷報道一致[6]。
綜上所述，血清CysC和LP(a) 水平的總體變化趨勢一致，但在心肌梗死和不穩定型心絞痛的冠心病組，CysC似乎更敏感，該結果提示血清CysC水平可能成為反應冠心病危險因素的又一重要指標，測定血清CysC 水平對冠心病患者具有重要臨床意義。
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蛋白酶抑制劑范文5
【關鍵詞】 胱氨酸蛋白酶抑制劑C；同型半胱氨酸；2型糖尿病腎病
近年來2型糖尿?。═2DM）的發生率增高， 且呈年輕化趨勢。糖尿病腎?。―N）是糖尿病常見的并發癥之一， 是T2DM重要的致死因素， 然而糖尿病早期腎損傷具有可逆性[1， 2]。因此， 及時發現糖尿病早期腎損傷， 對于糖尿病腎病的預防、延緩或減慢疾病的進程十分關鍵。目前臨床上使用的腎功能檢測指標血清肌酐（Scr）只是在內生肌酐清除率（Ccr）低于50%時才出現增高， 不能發現早期腎損傷， 容易錯過最佳治療時期而導致腎衰， 因此臨床早期全面診斷顯得尤其重要。有報道血清中胱氨酸蛋白抑制劑C（CysC）較Scr能更好地反映腎功能損傷的程度[3]， 同時檢測尿微量白蛋白（U-MA）可以早期診斷糖尿病腎小球損傷[4]。近年來研究表明同型半胱氨酸（HCY）與糖尿病微血管并發癥具有相關性[5]。本文通過對健康者、糖尿病及糖尿病腎病患者CysC、HCY、U-MA、Scr、 FPG及BUN的水平進行同時檢測， 并通過Scr含量計算出的Ccr， 探討聯合檢測對DN早期診斷的應用價值與意義。
1 資料與方法
1. 1 一般資料 收集2012年6月～2012年12月間經本院內分泌科確診的門診或住院患者。糖尿病組100例， 男66例， 女34例， 年齡35～80歲。其中分為單純糖尿?。―M）組72例， 男45例， 女27例， 年齡41～80歲；糖尿病腎?。―N）組28例， 男17例， 女11例， 年齡35～73歲。健康組80例， 經本院體檢中心確診無心腦血管疾病和糖尿病的健康者， 男45例， 女35例， 年齡30～68歲。
1. 2 方法 ①標本收集：空腹12 h抽取靜脈血， 以促凝管收集的標本測定CysC、HCY、Scr、 FPG及BUN， 收集隨機尿測U-MA。②儀器與試劑：以免疫膠乳比濁法測定CysC（北京利德曼生化股份有限公司批號2092721）， 循環酶法測定HCY（北京萬泰德瑞診斷技術有限公司批號ZL3102AA32）， 酶法測Scr（德賽診斷系統有限公司批號120081）， 谷氨酸脫氫酶法測定BUN（德賽診斷系統有限公司批號00000138）， 免疫比濁法測U-MA（德賽診斷系統有限公司批號17174）和免疫比濁法測FPG（中生北控生物科技股份有限公司批號201203）， 以上檢測均在全自動生化分析儀（日立7600-010）上進行。所有檢測均受控于室內質控和衛生部室間質量質控計劃。③Ccr計算公式：Ccr（ml/min）=uCRE×uV×1.73/ Scr×體表面積（uCRE為尿肌酐， Scr為血肌酐， uV為尿量）
1. 3 統計學方法 所有數據均以SPSS11.1系統處理， 以 （x-±s）表示， 組間比較采用兩樣本均數t檢驗， P
2 結果
2. 1 各組指標的檢測結果 表1中可見DN組各指標顯著高于健康組， 各組間比較差異具有統計學意義（P
2. 2 各指標相關性分析 DM組中HCY與CysC呈正相關（r=0.887， P
2. 3 糖尿病不同病史階段CysC、HCY、Scr、BUN、Ccr的陽性率分析分別以CysC>1.25 mg/L， HCY>15.0 μmol/L， Scr>133.0 μmol/L， BUN>8.1 mmol/L， Ccr
3 討論
糖尿病腎損害是糖尿病嚴重的慢性微血管并發癥， 也是糖尿病患者的主要死因之一， 有超過30%的患者發展為腎功能衰竭及需要腎透析。相關專家認為與其他指標相比， CysC檢出糖尿病腎病的靈敏度為40%， 特異性為100%， 因此有必要在診斷糖尿病而無證據有腎病患者中定期檢測CysC濃度變化以觀察其與糖尿病微血管病變的關系。而HCY作為一種血管損傷性氨基酸也與糖尿病腎病損害相關， 認為高HCY血癥是DN的一個獨立危險因素[5， 6]。聯合檢測血HCY與CysC可早期預測糖尿病腎損害的程度， 從而可從不同角度、更安全地評價糖尿病早期腎損害[7]。也有研究提示， 2型糖尿病在確立診斷時即應檢測尿微量白蛋白。本研究同時對CysC、HCY、U-MA、Scr、 FPG及BUN進行檢測， 探討聯合檢測對DN早期診斷的應用價值與意義。
本研究結果顯示在糖尿病患者中， 當Ccr下降時， CysC、HCY的升高比血Scr更快、更早。本文研究結果顯示DN組血清CysC和HCY水平明顯高于對照組， 差異具有統計學意義（P
本研究同時對糖尿病不同病史階段CysC、HCY、Scr、BUN、Ccr的陽性率進行了分析比較， 結果提示在DM的疾病過程中， CysC和HCY幾乎同時且較早出現異常， Ccr的異常也出現較早但陽性率低于CysC和HCY， Scr、BUN的異常則出現較晚， 提示CysC、HCY對于糖尿病早期腎損傷的診斷有重要意義。建議在常規糖尿病治療過程中定期檢測CysC、HCY， 及時發現糖尿病早期腎損傷， 這對糖尿病腎病的預防、延緩或減慢疾病的進程具有重要的臨床意義。
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蛋白酶抑制劑范文6
【關鍵詞】 MMPs ;TIMPs; 肝纖維化
肝纖維化是許多慢性肝病的共同病理過程，是細胞外基質(ECM)的合成與降解失衡，導致在細胞間質的過度沉積[1-4 ]，肝組織結構改建。許多細胞因子參與了這一過程，但是MMPs是最重要的一種[5]。MMPs幾乎能降解細胞外基質(ECM) 的所有成分，而其天然抑制劑-基質金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)能與MMPs成員結合成復合物抑制其活性[6]。二者的調節異常將引起ECM合成或降解的失衡，與各種器官纖維化疾病密切相關。研究發現，通過調節MMPs與TIMPs基因的表達來治療肝纖維化是肝纖維化治療的新途徑。本文就MMPs/TIMPs與肝纖維化的關系及治療前景作一綜述。
1 MMPs分類、功能、結構及活性的調控
MMPs是一組基質金屬蛋白酶。MMPs在肝內主要由肝星狀細胞(HSC) 和 Kupffer細胞表達分泌，參與細胞外基質降解的一類鋅-鈣離子依賴的內源性蛋白水解酶家族，因其需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子而得名，是迄今為止發現的唯一能分解纖維類膠原的酶，幾乎能降解除多糖以外的所有ECM成分，在生理病理過程中發揮著重要的作用。MMPs家族由24種成員組成，其中有23種存在于人體中。
1. 1 MMPs 可被分成六類[7] (1) 膠原酶類。主要包括MMP-1、MMP-8、MMP-13和MMP-18。它們能夠降解間質膠原(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原)，也能消化許多別的ECM及可溶性蛋白[5]。 MMP-1又稱成纖維細胞型，是人類主要的間質膠原酶，結締組織細胞、肝內HSC、肝細胞、枯否氏細胞均有分泌，分解底物為膠原蛋白 (Ⅲ>I>Ⅱ)。而MMP-13是鼠類主要的間質膠原酶。MMP-8又稱中性粒細胞膠原酶，主要降解Ⅰ型膠原。(2) 明膠酶類(gelatinases)。包括MMP-2(明膠酶A)及MMP-9(明膠酶B)。它們可降解明膠(變性膠原)和Ⅳ、Ⅴ和Ⅺ型膠原、層粘連蛋白、蛋白聚糖等。MMP-2和膠原酶類以相似的方式可以降解I，Ⅱ，和Ⅲ型膠原，但其活性較MMP-1弱[8]。(3) 基質分解素(strogylisin)。主要包括MMP-3、MMP-10和MMP-11，僅有MMP-3在肝臟中存在。底物廣泛，包括蛋白多糖、層粘蛋白、纖維連接蛋白、Ⅳ型膠原、明膠等。MMP-3與MMP-10均有相似的結構及降解底物，但MMP-3蛋白水解的效率比MMP-10更高，除能降解ECM成分外，它還可激活多種MMPs的前酶原。MMP-11對ECM的降解能力較弱。(4)基質溶解因子(Matrilysins)。MMP-7及MMP-26歸為此組。MMP-7又稱Matrilysin 1，MMP-26又稱matrilysin-2或endometase。在正常肝組織中，MMP-26僅在內皮細胞有少量表達。MMP-26能降解許多ECM成分，它大多被儲存在細胞內[9]。(5)膜型金屬蛋白酶MT-MMPs(Membrane-Type MMPs)。這一類特殊的蛋白酶，主要存在于細胞膜上，具有廣泛的底物特異性。其中4個是Ⅰ型跨膜蛋白(MMP-14、15、16、24)，2個是GPI錨連蛋白(MMP-17及MMP-25)。除了MT14-MMP之外，其它均能激活MMP-2酶原，這些酶能降解許多ECM分子。MMP-14在肝臟主要表達于活化的HSC中，與TIMP-2、MMP-2共同調節膠原的代謝[10]。(6) 其它種類的MMPs。包括MMP-12、19、20、21、23、27和28。MMP-12主要在巨噬細胞中表達，對于巨噬細胞的遷移起重要作用。MMP-23主要在一些再生性的組織中表達。而MMP-28在角質細胞中可見，在機體中參與止血及傷口修復[11]。MMP-12及MMP-19和MMP-20的主要底物為彈力蛋白、明膠、層粘連蛋白和Ⅳ型膠原。
1. 2 MMPs的調控 MMPs在機體內的表達，激活及其對底物的分解過程均受到嚴格的調控[5]，其調控包括酶基因表達水平，酶原激活程序以及酶活性抑制等3個方面[12]：(1)MMPs的表達水平的調控：正常成人組織大多數MMPs表達水平很低，但在各種炎癥細胞因子、激素、生長因子、CD40等作用下不僅能促進或抑制 MMPs mRNA的轉錄，且能影響其半壽期。對MMPs表達起上調作用的有TNF-α、IL-1 、血小板源性生長因子及成纖維細胞生長因子(FGF)等，起下調作用的有轉化生長因子-β (TGF-β)、視黃酸、 血管緊張素Ⅱ和糖皮質激素等，增強和抑制因子都作用于MMPs基因的前肽區。(2)MMPs的活性水平的調控：MMPs均以酶原的形式分泌，活化后才具有降解細胞外基質的作用。活化方式有3種[13]，即①逐級活化方式-由血清蛋白酶如纖維蛋白溶解酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶，彈性蛋白酶或激肽酶等介導。纖維蛋白溶解酶是MMPs最強有力的生理性激活物[14]。MMPs的前肽結構被血清蛋白酶水解，酶活性中心暴露后，再被其它的蛋白水解酶(如其他MMPs)激活。體內最主要的MMPs激活系統是組織或血漿的纖溶酶原釬溶酶系統( t-PA )。此外，某些 MMPs 可相互激活[5];②膜型-MMPs激活-膜型-MMPs能活化其它MMPs;③細胞內激活-細胞內激活的精確機制和對細胞外MMP s 活性的作用，目前仍不明了。(3)MMPs的活性抑制物：激活的MMP可被普通的蛋白酶清除劑抑制，如α2-巨球蛋白，但主要被特異的TIMPs所抑制。
2 TIMPs的分類、結構、功能及活性的調節
MMPs的表達和活化并不一定代表最后對ECM降解能力。因體內還存在MMPs的特異的抑制劑-組織金屬蛋白酶抑制物(TIMPs) 。這是一組具有抑制 MMPs功能的活性多肽，在 ECM代謝的調節中起著非常重要的作用。
目前共發現有4種TIMPs[5]。根據其發現的先后順序依次命名為TI MP- l、TI MP-2、TIMP-3和TIMP-4。TIMPs是一組低分子量的糖蛋白，廣泛分布于組織和體液中，可由成纖維細胞、上皮細胞、內皮細胞等產生。其中TIMP- l、TI MP-2、TI MP-4為可溶性蛋白質分子;而TIMP-3是僅存在于ECM中、并與ECM緊密結合的不可溶性蛋白質分子[15]。
TIMPs由各自獨立的基因表達，但四者氨基酸序列具有部分同源性，且都可與特定的活性MMPs通過非共價鍵結合成1:1復合物，抑制后者對ECM的降解，這種非共價鍵結合在生理條件下是可逆的。在肝臟中主要由HSC表達TIMP-1、2、3[16]。對肝纖維化的診斷，TIMP-1特異性和敏感性均明顯高于TIMP-2。
TIMP-1在肝臟由Kupffer細胞、HSC及肌纖維母細胞產生，以活化的HSC表達最強[17]，能被多種細胞因于誘導產生，是體內存在與作用最廣泛的一種TIMPs。它能結合除14、19以外的所有MMPs而使其活性減弱，可有效地抑制除MMP-2和膜型MMP外的大多數MMPs，是MMP-9活性的特異性抑制劑。TGF-β、IFN、TPA、IL-1、IL-10、IL-β，NO、RA等能夠誘導TIMP-1的基因表達[18]。
TIMP-2是Ⅳ型膠原酶 MMP -2 的特異性抑制因子。TIMP- 2/MMP -2系統對Ⅳ型膠原的增生沉積和降解起著重要的調節作用。
3 針對MMPs和TIMPs的抗肝纖維化策略
肝硬化是肝臟實質性病變，不可逆轉，而肝纖維化是可逆性病變。因此，研究肝纖維化發病機制，進而尋求阻斷肝纖維化過程的有效方法，對控制肝病的進展，有著十分重要的意義。
鑒于MMPs和TIMPs在肝纖維化發展中的不同作用，增加MMPs或減少TIMPs的合成與表達將是肝纖維化基因治療的一條新思路。
目前國內外有關抗肝纖維化的各種治療手段大多是通過下調TIMP-1、2的表達來實現肝纖維化的逆轉[19，20]。
楊長青等[21]運用DNA重組技術構建可表達大鼠MMP-1基因和反義TIMP-1序列的真核表達質粒，將其導入免疫損傷性肝纖維化模型大鼠體內，觀察MMP-1和反義TIMP-1重組表達質粒對實驗動物肝纖維化的影響。結果顯示MMP-1、反義TIMP-1表達質粒均可促進肝臟中I、Ⅲ 型膠原的降解;病理形態學顯示MMP-1、反義TIMP-1 表達質粒均對肝纖維化有一定的逆轉作用;以兩種質粒的聯合應用效果最好，單獨使用反義TIMP-1表達質粒次之，單獨使用MMP-1表達質粒作用有限。
Parsons CJ [22]等發現在CCl4持續損傷的情況下，應用人抗鼠TIMP-1抗體后膠原沉積減少，能有效地控制肝纖維化的發展。Liu WB等[23，24]選用TIMP-1為靶基因，將表達反義TIMP-1的重組質粒導人體外培養的HSC內及用豬血清誘導的肝纖維化大鼠體內，發現反義TIMP-1均被成功表達，TIMP-1的基因及蛋白表達水平明顯下降，間質膠原酶的活性增加，I、Ⅲ型膠原沉積量減少。顯示肝纖維化水平降低66%。Iimuro Y等為了研究人類基質金屬蛋白酶-1 (MMP-1)傳遞的基因能否降解I型和Ⅲ型膠原的問題，利用腺病毒和MMP的重組體導入已造模成功的小鼠體內，發現纖維化顯著的減弱[25] 。
轉化生長因子β1 (transforming growth factor beta 1，TGF-β1)為現知最強力的促肝纖維化因子。在肝纖維化啟動、進展乃至肝硬化的形成中發揮核心作用，是激活HSC并促進其表達ECM的關鍵因素，除抑制間質膠原酶和基質溶解素的表達外，同時還具有促進TIMP-1和MMP-2的作用[26]。由于TGF-β1在肝纖維化中的廣泛作用，尤其是肝損傷后，肝HSC對 TGF-β1的自分泌及旁分泌作用，使得阻斷TGF-β1的信號通路成為肝纖維化治療的理想選擇[27]。
總之，隨著研究的不斷深入，人們逐步認識到MMPs/TIMPs在肝纖維化形成中的作用，故研制的藥物如能抑制TIMPs活性/增強MMPs活性，或者抑制其上游信號通路間接抑制TIMPs促進MMPs的活性，從而抑制肝纖維化，就有可能減緩或阻斷肝纖維化的進程。迄今為止，肝纖維化過程中，MMPs、TIMPs調控機制、細胞來源、ECM各種成分之間及其與細胞之間的相互關系等問題有待進一步研究。近年隨著分子生物學進展，對MMPs、TIMPs的分子結構和基因調控有了一定的了解，對肝纖維化的發病機制研究及從基因水平治療各種肝纖維化提供了新的途徑。
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