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不同微生物菌落特征范文1
關鍵詞：食品檢驗 紙片法 平板計數法 微生物檢測
前言：
食品安全問題越來越受到人們的重視，微生物對食品的污染問題也相應地備受關注。在食品生產、加工、儲存、運輸、銷售等各個環節中都有污染微生物的可能。一旦污染，微生物將大量繁殖而引起食品腐敗變質，或導致食源性感染和食物中毒，食品的檢測與分析工作已經提高到一個極其重要的地位。特別是為了保證食品的標準品質，開展食品科學技術研究，尋找食品污染的根源，人們更需要對食品進行各種有效營養物質和對人體有害、有毒物質的檢驗和分析。自20世紀70年代起，各種食品檢測不斷出現，主要包生物化學技術、紙片法等，目前這些技術在食品檢測和分析等方面已經得到了較好的應用，特別是紙片法。紙片法以其操作簡便、靈敏度高、速度快等優勢在食品檢測領域得到愈來愈廣泛的應用[1，2]。
一、紙片法的原理
紙片法，即以紙片、紙膜、膠片等作為培養基載體，將特定的培養基和顯色物質附著在上面，通過微生物在上面的生長、顯色來測定微生物的方法[3]?？焖贉y試片法有以濾紙為載體的測試片，這種測試片是一種水合物干膜，由上下兩層薄膜組成，上層是聚丙烯薄膜，下層是上印有網格的聚乙烯薄膜，通過一種冷水可溶性的凝膠劑附著在培養基上。培養基上有微生物生長所需的營養物質、特異性顯色物質和抗生素。
紙片擴散法是將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴散，隨著擴散距離的增加抗菌藥物的濃度呈對數減少，從而在紙片的周圍形成一種濃度梯度。在藥物擴散的同時，紙片周圍抑菌濃度范圍內的測試菌不能生長，而抑菌濃度范圍外的菌株則繼續生長，從而在紙片的周圍形成透明的抑菌圈。不同抗菌藥物抑菌圈的直徑因受藥物在瓊脂中的擴散速率的影響而可能不同，抑菌圈的大小可反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的最低抑菌濃度（MIC）呈負相關，即抑菌圈越大，MIC越小。
二、紙片法的優、缺點及改進
本文介紹的是北京陸橋公司研制的Easy TestTM紙片（簡稱ET），E T微生物測試紙片是一種將脫水培養基附著于無紡布棉墊上的即用型檢測產品，利用了特異性酶與特異性顯色底物反應的原理，使目標菌與非目標菌呈現可明顯區別的不同特異性顏色，ET測試紙片的培養載體采用了無紡布和水溶性營養底物的設計，具有良好的吸水性，可快速吸收測試液，使微生物自動均勻分布于無紡布上，為測試液和營養底物創造了一個固定的混合區域。這種紙片法排除了濾紙測試片不易計數、營養物質分布不均、顯色指示劑單一和保水性差的缺點，待測樣品不需滅菌、本身帶有培養基，樣品可直接加入。其特點可歸納為：可應用于現行GB/T 4789-2008和SN標準中；使用方便，即用型產品，省去配制步驟，減少工作量；大量縮短檢測時間，提高檢測效率；降低對操作人員的技術要求；準確：靈敏度高、特異性強；可用于食品微生物檢測和環境衛生檢測，可分別檢測菌落總數、大腸菌群計數、霉菌和酵母計數、金黃色葡萄球菌計數。如用大腸菌群快檢紙片檢測餐具的表面，操作簡便、快速、省料，特異性和敏感性與發酵法符合率高，使用時應正確掌握操作技術和判斷標準，從而達到理想的檢測效果[4]。
從實用性來說，ET紙片省卻了大量的玻璃器皿的麻煩，操作簡便，攜帶方便，污染小；可在野外迅速檢測所采集樣本，避免常規方法因運輸時間長而造成的菌落環境變化，更能反映采集樣本真實菌落情況；培養后所長的為有色菌落，便于計數。
紙片法也有其弊端，測試片較小，菌量數較大時計數困難；只研制出了少數幾種類型的測試片，只能局限于幾個指標的檢測上。
目前，對紙片法分改進主要是擴大被檢測目標菌種種類；研制具有檢測較大菌量的紙片，并且提高檢測準確性。神保勝彥[5]（1991）對紙片法作了進一步研究和改進，改進后的紙片法不僅能夠確定抗生素的種類，而且提高了檢出率和準確性，氯霉素最低檢出量0.01mg/kg，土霉素0.05mg/kg，鏈霉素1mg/kg，紅霉素0.05mg/kg，青霉素0.0025mg/kg。
三、紙片法在食品微生物檢驗中的應用[6]
1.菌落總數測試片，揭起覆蓋的膠片，將1ml樣品懸液滴于紙片中央后蓋回，用壓板輕輕壓下，將樣品均勻地覆蓋于培養基上。靜置約1min使培養基中的凝膠固化。測試片水平放于37℃恒溫箱內培養。細菌總數測試片培養48±3h后計數紅色菌落數作為細菌總數，亦可用作乳酸菌測定。
2.霉菌、酵母菌測試片，該測試片含霉菌酵母生長的營養物質、菌落生長的指示劑，并添加抗生素以抑制細菌生長。接種后，21℃～25℃培養3～5 d，計數。酵母菌菌落特征：小型菌落，邊緣清晰，顏色均一，灰白色至藍綠色，菌落隆起。霉菌菌落特征：大型菌落，邊緣模糊，中間顏色深暗，顏色不均一，菌落扁平。
3.大腸菌群、大腸桿菌檢測紙片，該測試片含有改良的VRB（Violet Red Bile）培養基及葡萄糖苷酸酶指示劑。絕大多數大腸桿菌能產生β-葡萄糖苷酸酶，與培養基中的指示劑反應，產生藍色沉淀環繞在大腸桿菌菌落周圍，表面覆蓋的膠膜，可留住發酵乳糖產生的氣體，形成藍色和深藍色的菌落并有氣泡相連。大腸菌群菌落在測試片上產酸，pH指示劑使培養基變為暗紅色，在紅色菌落周圍有氣泡者為大腸菌群。所以，一次測試即可測出大腸桿菌和大腸菌群數：帶氣泡的藍色和紅色菌落為大腸菌群，帶氣泡的藍色菌落為大腸桿菌。
4.金黃色葡萄球菌測試片，該測試片含有改良的Baird Parker培養基，對于金黃色葡萄球菌的生長有很強的選擇性，并能將其鑒定出來，與3個Baird Parker平板加一個血漿凝固酶試管的方法等效。其可形成暗紫色菌落，如果在測試片上有其它可疑菌落出現，可以使用金黃色葡萄球菌確認反應片。其含有顯色劑及脫氧核糖核酸，由于金黃色葡萄球菌產生的脫氧核糖核酸酶，具有耐高溫特性，高溫處理后仍能將DNA降解而與反應片上的顯色劑反應形成粉紅色環。
5.沙門氏菌測試片，將選擇性培養基中加入沙門氏菌特有辛酯酶的顯色指示劑，并將其加載在紙片上，通過培養，如果樣品中含有沙門氏菌，即可在紙片上呈紫紅色的菌落。
四、分別用紙片法和平板計數法檢驗食品中的大腸菌群
1.檢驗之前的準備，檢驗之前的準備是保證檢驗高質量的前提，應做好以下幾點：
1.1為了保證微生物檢驗的高質量，要求檢驗人員的要有專業知識和熟練的技術，而且還必須具備對工作的高度責任感和實事求是的科學工作作風。確保實驗室人員得到及時培訓及不斷更新知識，學習和掌握新理論、新技術和新方法。
1.2 環境，實驗室應具有進行微生物檢驗適宜充分的設施條件，包括檢測設施（專用于微生物檢測和相關活動）及輔助設施（大門、走廊、管理區、樣品區、清潔間）特殊的設備要在特殊的環境下放置和操作。所用無菌實驗室應符合GB19489[7]的規定。
1.3 操作，操作人員必須嚴格按照GB/T
4789[8]食品微生物檢驗標準中的操作規程進行檢驗，做好滅菌處理，為防止二次污染采取必要措施，原始記錄要真實準確，不得隨意填寫。按照GB/T 4789標準規定的方法進行數據處理及結果判定。
以嚴謹科學態度，做好上述幾個環節準備工作，就能使我們微生物檢驗數據的準確性得以保證，為食品衛生和安全提供可靠技術保障。
2.材料與試劑
2.1 材料：培養箱、移液器、水浴鍋等。
2.2 試劑與培養基：北京陸橋大腸菌群ET測試紙片，培養基。
2.3 茵株：大腸桿菌標準菌株一株，金黃色葡萄球菌標準菌株一株，實驗室分離保存菌株兩株（沙門氏菌和酵母菌）。
2.4 樣品：瓶裝啤酒、冰點、休閑小食品、糕點、速凍食品、水產品、乳制品、熟肉制品等為本實驗室日常抽檢樣品和委托檢驗樣品，生肉類、熟制品、涼拌菜共十二類產品，每類10份樣品，共120份樣品。
3.比較與實驗方法
3.1 方法比較：根據實際試驗操作情況，將GB方法（平板計數法）[9]同ET測試紙片法進行對比，主要列舉和分析計數原理、操作步驟、培養時間等。
3.2 檢測結果比較實驗
3.2.1 菌株加標實驗：將大腸桿菌、沙門氏菌和酵母菌分別和干擾菌金黃色葡萄球菌一起加入各類食品樣品中，每類加入3份，共36份樣品。每份樣品目標污染值約為1*10CFU/ML，每份樣品均采用GB平板計數法VRBA法和北京陸橋大腸菌群測試紙片ET法同時檢驗。
3.2.2 普通樣品檢測：將120份樣品按照GB4789.3—2010處理，用平板計數法VRBA法和ET測試紙片法同時檢驗。
3.2.3 結果分析：將加標實驗的36個結果和普通樣品檢測中的陽性結果取對數，進行配對t檢驗，計算P值，研究兩種方法間是否存在顯著性差異[10]。
4.結果與分析
4.1 方法比較，針對GB4789. 3—平板計數VRBA法與ET測試法的比較見表1。
4.2 菌株加標實驗結果：加標的36個樣品結果見表2。
4.3 普通樣品檢測結果：十二類120個樣品中，共檢出59對陽性結果，具體結果見表3。
4.4 通過配對t檢驗計算可知P值為0.16 > 0.05，可見兩種方法檢測結果無差異。
4.5紙片法與平板計數法相比較，具有快速、簡便、易于操作等特點[11]，平板計數法需要72h出結果，而紙片法只需24h就能報告檢測結果，檢測速度得到了很大的提高，更能滿足現代食品進出口業務快進快出的要求，而且紙片法操作簡便，省去了培養基配制、殺菌消毒、器皿洗滌等繁瑣的勞作，有效提高了實驗室的工作效率，但是測試片價格較貴，可先在專業食品檢測實驗室和經濟效益較好的食品生產企業推廣使用。
五、結論
盡管食品微生物的檢測方法有很多種，但紙片法在食品檢測的實際應用中表現出操作簡便、靈敏度高、速度快等特點，已在食品領域的微生物檢測中得到廣泛應用。隨著紙片法食品微生物檢測技術的不但發展，相信紙片法會在食品微生物檢測、監控等方面發揮愈來愈大的作用。
參考文獻：
[1] 唐靈.郭奕芳.吳翊等.紙片法和國際法檢測奶制品細菌總數和大腸菌群數的結果比較.2000.
[2] 吳清平.周艷紅.蔡芷荷.衛生微生物特異性顯色培養基的研究與應用[J].中國衛生檢驗雜志.2005.
[3] 李洪.龔濤.達永淑.等.探討影響大腸菌群快速紙片法的因素[J].職業衛生與病傷.2002.
[4] 王芳.王凱.樊赟.劉沛.王磊.Easy Test（TM）測試片——微生物快速檢測新產品.《食品安全導刊》.2010.
[5] 神保勝彥.孟惠英.蜂蜜中殘留四環素類和磺胺類藥物的微生物簡易檢測法.《農業新技術新方法譯叢》.1993.
[6] 王會娟.王麗.路琳等.實驗室常用的微生物快速檢驗技術.[J].肉類工業.2004.
[7] 《實驗室生物安全通用要求》.GB19489-
2008.
[8] 微生物檢測標準.2010.
[9] GB 4789.3-2010.食品安全國家標準.食品微生物學檢驗大腸菌群計數.
不同微生物菌落特征范文2
從醫學微生物學的角度出發，口腔醫學專業所接觸的微生物有其自身鮮明的特點：口腔微生物數量龐大、種類豐富，且厭氧菌占較大比例。這就決定了使用普通的細菌培養方法是無法客觀反應口腔內微生物構成的。于是針對口腔專業的特殊需要，并兼顧教學的趣味性，調動學生主動探索的興趣，我們對口腔專業添設了題為“發現你所不知道的自己”的全新實驗課教學單元，該部分共計4次實驗課，包括8個實驗學時。
第一次實驗課的主要內容是口腔微生物的構成、口腔厭氧菌及厭氧培養法。在本次實驗課上，教師先啟發學生分析口腔的特殊環境，安排學生以小組為單位思考、討論口腔微生物的構成，最后由教師進行歸納性總結，并系統講解口腔菌群的組成。然后，向學生介紹口腔厭氧菌及其存在部位，并簡要介紹常見的厭氧培養法，包括高層瓊脂柱法、厭氧培養皿法、亨蓋特滾管技術、厭氧罐技術等。要求學生思考、討論各種方法的異同點和各自的優缺點，重點掌握厭氧罐技術，我們將在后續的實驗學時中采用此法進行口腔厭氧菌的培養。
第二次實驗課的主要內容是介紹常見的口腔真菌及其相關口腔疾病、真菌的培養與常用培養基，并進行口腔微生物樣本的采集與接種。在本次實驗課上，主要講解真菌適宜的生長環境與條件以及真菌培養中最常使用的沙保氏培養基的配制，并教學生進行口腔微生物樣本的采集與接種。具體操作包括：
①需氧培養：用無菌棉簽采集齦上牙菌斑或牙垢接種于固體血瓊脂平板培養基，37℃倒置于培養箱孵育；
②厭氧培養：用無菌棉簽采集齦下牙菌斑或牙垢接種于加有還原劑的固體平板，置于厭氧罐中，抽真空并密封，放入37℃培養箱中孵7天；
③真菌的選擇培養：用無菌棉簽采集后牙鄰間隙牙菌斑，接種于新鮮配置的沙保氏培養基，28℃培養箱中培養7天；
④牙菌斑的剛果紅負性染色法直接觀察菌群構成：剛果紅負染后讓學生在油鏡下觀察并報告球菌、直桿菌、梭菌、絲狀菌、彎曲菌和螺旋體六大類微生物的百分比。
第三次實驗課的主要內容是培養菌落觀察及鑒定。具體操作包括：
①觀察厭氧和需氧培養基上菌落的形態，大小，顏色等特征，分別選取數個單菌落進行革蘭染色，觀察不同菌落的革蘭染色性。
②觀察沙保培養基中的菌落生長情況，挑取數個不同的單菌落分別接種于科馬嘉顯色培養基，28℃孵育7天。
第四次實驗課的主要內容是觀察科馬嘉醫學顯色培養結果，根據菌株在培養基上的不同色彩對其進行大致的分類鑒別。
同組同學共享實驗數據，根據四次實驗的結果并結合本組同學自身口腔健康情況討論口腔微生物的構成與常見的口腔健康或疾病之間的關系，撰寫實驗報告。
2實驗課教學改革成果
通過8個學時的主題實驗課學習和操作，同學們生動詳細的了解了自己的口腔菌群構成，鮮活的觀察到了自己原來所不知道的自身口腔微生態。全課程不僅充滿趣味，更貼近口腔醫學工作的實際。教學全程氣氛輕松愉快，學生學習態度積極，思維敏銳活躍，課堂上體現了很高的主動性、創造力和團隊協作精神。課程結束后，我們分別對參加普通微生物學實驗課學習和參加針對口腔專業微生物學實驗課學習的不同批次的醫學專業學生進行了問卷調查，發現與參加傳統課程的同學相比，參加改革后口腔專業微生物學實驗課的同學對課程教學的滿意程度提高了25％，對醫學微生物學以及相關專業課的學習興趣提升了30％。當然，學生的期末考試成績的優秀率、通過率以及考試平均分也均有大幅度提高。
3討論
不同微生物菌落特征范文3
關鍵詞：喀什地區；水體；生態分布；豐度
中圖分類號 X52 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）24-0029-04
A Preliminary Study on Microbial Ecological Distribution of the Main Rivers in Kashgar
Liu Zhenming et al.
（College of Life and Geographic Sciences，Kashgar University Key Laboratory of Ecology and Biological Resources in Yarkand Oasis of Education of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Kashgar 844006，China）
Abstract：The water microorganisms of Kizil River，Tuman River，East Lake，South Lake in Kashgar city were isolated by the serial dilution plate count technique，and the ecological distributions of different microbial physiological groups were studied. The results indicated that the microorganisms of the waters in Kashgar region display extreme abundance in biodiversity，the number and the diversity of bacteria was significantly higher than that of fungi or actinomycetes，the number of microorganisms in Tuman River was larger than others. Microbial abundance fluctuated seasonally，the quantity of microorganism in summer were much larger than that of in winter，and the abundance in upstream was also larger than that of in downstream.
Key words：Kashgar；Water；Ecological distributions；Abundance
喀什市位于新疆維吾爾自治區西南緣（E73°20′～79°57′，N35°20′～40°18′），是南疆的政治、經濟、文化中心，古絲綢之路上的重要商埠，亦是新疆維吾爾自治區唯一的歷史文化名城?？κ彩兴Y源較為豐富，來源較廣，流經市內的主要河流有3條：克孜勒河、蓋孜河和吐曼河，孕育著喀什47萬人民。2010年5月中央新疆工作座談會決定大力建設新疆，設立喀什經濟特區，近幾年來喀什地區經濟文化建設取得了迅猛發展，城鎮化水平進一步提升。但在大開發、大建設過程中，也不可避免地帶來了一定的水環境問題，如水體污染嚴重、富營養化加劇、礦化度升高等，嚴重制約了喀什地區經濟社會的可持續發展。當前克孜勒河、吐曼河等已遭受嚴重污染，并將嚴重威脅地到喀什市的地下水供水安全[1]。因此，近年來對其水質監測與評價成為生態環境保護工作者關注的熱點。
水資源質量的評價指標涉及多項生物學參數和非生物學參數，其中微生物最具有指示意義[2]。水域生態系統中的浮游微生物不僅與區域環境密切相關，還在物質與能量儲存中發揮積極作用，其類群分布與數量變化受到水文狀況、營養鹽含量及人類活動的影響[3-5]。探討水體微生物生態分布可為深入研究水域生態系統的功能結構及生物生產力提供一定的參考素材，為水環境質量評價及綜合治理提供科學依據。近年來對喀什水質的研究多集中于污染原因和治理對策研究[6，7]，而微生物學指標調查及分析鮮見報道。為此，本研究對喀什城市河流中微生物群落構成、數量及時空分布等進行了初步檢測分析，旨在為喀什城市河流污染現狀及防治對策提供生物學依據。
1 材料與方法
1.1 樣品采集 選擇流經喀什市的5個主要河流和湖泊：克孜勒河、蓋孜河、吐曼河、東湖、南湖，分別于2015年2月、8月同一位點、同一時段取樣，分析水體中微生物群落的時空分布，同時現場檢測采樣點水溫、濁度、pH等項目。5個水體中3條河流屬流動水體，按照一定比例將各河段分為上、中、下游，依據流速、流域面積及河水深度不同分別在河兩岸布設采樣點6個，無菌操作法取樣，每一采樣點取3瓶水。東湖、南湖為靜止水體，根據水域面積采樣：將2個湖面劃分成5個斷面，同樣無菌操作法取樣，每一斷面取3瓶水，盡快帶回實驗室檢測分析。
1.2 水體微生物分析
1.2.1 菌株分離培養及計數 采用常規稀釋平板法，將樣品在無菌工作臺下適度稀釋（10-1、10-2、10-3、10-4），每一稀釋度設3個平行，用移液槍移取100μL稀釋液涂布到3種不同培養基平板上。細菌分離培養用細菌通用培養基LB，真菌分離用馬丁氏培養基，放線菌培養用YPD培養基。接種后各平板置于37℃培養箱恒溫倒置培養，其中細菌培養1～2d，真菌培養4～5d，放線菌培養6～7d。待菌落長至合適大小，挑取單克隆用平板劃線法純化2～3次，即得到不同類型微生物純培養物。微生物計數均采用平皿傾注法檢測菌落總數，并進行統計分析證明。平板適宜計數標準為細菌和放線菌為每皿50～200個菌落，真菌每皿20～80個菌落，取3個平行樣品的均值作為終值。
1.2.2 表型特征 參照《常用細菌鑒定手冊》[8]觀察分離到的微生物表型特征（包括形態、大小、顏色、透明度等），記錄并分析可培養微生物多樣性。
1.3 統計分析 采用DPS（Data Processing System）7.05對微生物數量進行方差分析，最小顯著差異法（least significant difference，LSD）進行多重比較，分析不同水體中微生物時空分布規律。
2 結果與分析
2.1 微生物種群、數量的季節分布 微生物的生命活動對外界因子較敏感，其數量易受環境條件影響，始終處于不斷發展變化中，不同季節、不同水域環境中微生物數量及種類各異。由表1可知，調查期間喀什5個水體中細菌數量波動范圍為4.1×104～7.7×105，真菌波動范圍2.1×102～7.4×103，放線菌為1.0×102～6.0×102，各區系最高峰均出現在2015年8月。5個水體中3類微生物數量和類型季節變化趨勢一致，8月份的細菌、真菌、放線菌數量均高于2月份，微生物類型也較豐富。尤其吐曼河中游細菌數量由8.5×104增加到1.2×105，數值差別達到1個數量級（P
微生物季節變動與各類群微生物自身生長特性、環境因子及水體各項理化性質密切相關[9]，尤其溫度對微生物生命活動影響強烈，推測喀什5個水體中微物季節差異主要受溫度影響。微生物生長繁殖在一定范圍內與溫度呈正相關，而喀什夏季光照十分充足、水溫升高，微生物生產力顯著提高，數量自然增加；冬季光照減弱、水溫相對降低，抑制微生物新陳代謝，導致微生物種類貧乏，數量稀少。此外，可能還受到溶解氧、透明度、營養鹽水平以及部分離子濃度影響。
2.2 微生物種群、數量的空間分布 喀什不同河流中微生物豐度及分布情況（年均值）如表2所示。由表2可知，5個不同水體中細菌、真菌、放線菌數量差異顯著（P蓋孜河>南湖>東湖>克孜勒河，真菌數量分布為吐曼河>東湖>南湖>克孜勒河>蓋孜河，放線菌數量分布為東湖>南湖>吐曼河>蓋孜河>克孜勒河。根據污水生物系統法評價標準，細菌總數>106/mL為多污帶，105～106/mL為α-中污帶，
從河段看，3條河流微生物豐度從上游至下游逐步升高，推測上游水體中有機物含量較少，污染較輕，水體自凈能力使微生物含量較低。河水流動過程中受人們大量生活污水、工業有機廢水及農作物施肥等影響，越往下游營養物質越豐富，氮、磷營養物質富集超標越嚴重，污染越加劇，致使下游河段微生物種類、豐度最多，尤以吐曼河最顯著。從多樣性看，細菌類群也較真菌、放線菌豐富，如吐曼河下游細菌種類多達14種，而霉菌、放線菌種類有7種。
3 討論
微生物對環境污染或變化較為敏感，其作為水質評價的一項重要指標，能及時反映整個水生環境的變化，從生物學角度為水環境質量監測評價與處理提供依據。研究發現喀什5個水體中微生物數量差異顯著，但均以細菌絕對優勢菌，真菌和放線菌相對較少，這與其他水體中微生物生態分布相符。吳根福[10]對杭州西湖水域菌群分布調查發現，水體微生物數量以細菌最高，放線菌數量較少；王風芹[11]等報道賈魯河水體微生物數量細菌數量顯著高于真菌和放線菌，但上下游水體中微生物區系數量沒有呈現規律性變化。
喀什5個水體中細菌豐度均超過104cfu/mL，為β-中污型水體，尤其吐曼河細菌數量年均達到2.6×105，表明吐曼河水質一年四季均處于嚴重污染狀態，為重污染帶。這與吐曼河承擔著喀什工農業活動和生活用水的主體責任，排污口較多，大量工業廢水廢物及生活污水直接排入關系巨大。東湖和南湖屬于湖泊，水動力交換差，水體滯庫時間長，也為水體富營養化創造客觀條件，導致微生物污染。
喀什水體中各微生物類群分布受季節影響顯著，夏季豐度、類群均高于冬季，與張紅光有關青藏高原青海湖和納木錯湖水微生物[12]的報道相符。而朱亮[13]對宿遷市大運河沉積微生物時空分布研究顯示，冬季微生物數量反而高于夏季，與Comte[14]、Findlay[15]等報道相符；北京溫榆河流域微生物數量受季節影響并不顯著[16]。說明微生物的季節變動是一個復雜的綜合問題，水體中的微生物并不是獨立存在的。推測不同季節下微生物數量多寡可能與地域環境因子有關，受微生物所能利用的底物含量制約，而喀什冬夏季溫差較大，直接影響微生物新陳代謝，也會對水體生態系統初級生產力、溶解氧等產生一定影響，最終導致微生物群落結構改變。
從河段看，吐曼河、克孜勒河、蓋孜河3條河流中下游河段污染均較上游輕，推測原因主要與人類活動影響有關。河流水體本身具有過濾自凈能力，河體中的泥沙也可以吸附一定有機污染物質，所以上游污染較輕。但水體流動過程中承接人類大量的工農業廢水、廢物，造成氮、磷、鉀等元素不斷積蓄，為各類微生物生長繁殖提供充足的營養源，造成中下游水體富營養化，環境污染加劇，破壞了河段間生態平衡。感觀上比較，下游水體顏色也明顯變暗、混濁，同上游形成強烈反差。綜上，喀什主要河流水質已呈現不同程度的富營養化，日益惡化的水環境問題應當引起政府和科研部門的高度關注。
研究結果提示當前喀什主要水體中微生物豐度較高，類群較豐富，受工農業生產和居民生活影響較多的中下游水系中微生物尤其多，夏季數量高于冬季?？κ菜w中微生物時空分布格局，體現了其作為一個敏感指標對自然及人類活動雙重影響下河流湖泊生態環境變化的響應。進一步探討喀什河流中不同微生物生理類群與水體中氮、磷、鉀營養鹽、溶解氧（DO）、化學耗氧量（COD）等的相關性，或可為喀什河流污水生物治理及水體生態修復提供更全面的理論和參考資料。
參考文獻
[1]張勝楠，林寧，王晶.喀什市主要水體富營養化調查與評價[J].廣州化工，2015（19）：122-124.
[2]吳東浩，王備新，張詠，等.底棲動物生物指數水質評價進展及在中國的應用前景[J].南京農業大學學報，2011，34（2）：129-134.
[3]范玉貞.衡水湖微生物菌群分布的研究[J].衡水學院學報，2009，11（8）：70-72.
[4]VUILLEMIN A，ARIZTEGUI D，L?CKE A，et al.Paleoenvironmental conditions define current sustainability of microbial populations in Laguna Potrok Aike sediments，Argentina[J].Aquatic Sciences，2014，76（1）：101-114.
[5]龐興紅，呂麗媛，牛遠，等.太湖夏季浮游細菌群落多樣性的空間格局[J].水生生物學報，2014（2）：335-341.
[6]卡米力江?阿布都熱衣木，艾尼瓦爾?買買提.喀什市地表水水質變化趨勢分析[J].水利科技與經濟，2011，17（3）：54-55.
[7]張攀，陳.喀什噶爾河流域河流生態治理的思路和對策[J].新疆水利，2010（1）：52-54.
[8]蔡妙英，東秀珠.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.
[9]VAN DER GUCHT K，VANDEKERCKHOVE T，VLOEMANS N，et al.Characte-rization of bacterial communities in four reshwater lakes differing in nutrient load and food web structure[J].FEMS Microbiol Ecol，2005，53（2）：205-220.
[10]吳根福，吳雪昌，吳潔，等.杭州西湖水域微生物的生態調查[J].水生生物學報，2000，24（6）：589-596.
[11]王風芹，侯淑芬，謝慧，等.賈魯河水體微生物菌群結構季節動態變遷研究[J].河南農業大學學報，2012，46（4）：438-441.
[12]張紅光，李琳，趙燕，等.青藏高原不同海拔湖水中可培養微生物的季節性變化[J].中獸醫醫藥雜志，2013（3）：49-55.
[13]朱亮，趙林多，劉鋼，等.大運河沉積微生物群落結構特征分析[J].中國礦業大學學報，2010，39（2）：295-301.
[14]COMTE J，JACQUET S，VIBOUD S，et al.Microbial community structure and dynamics in the largest natural french lake（lake bourget）[J].Microbial Ecology，2006，52（1）：72-89 .
[15]FINDLAY R H，WATLING L，MAYER L M. Environmental impact of salmon net-pen culture on marine benthic communities in Maine：a case study[J].Estuaries，1995，18（1）：145-179.
不同微生物菌落特征范文4
關鍵詞： 草原圍封年限；土壤微生物；土壤酶
中圖分類號： S 812.2文獻標識碼： A文章編號： 10095500(2012)01000106
典型草原不僅是中國北方重要的生態屏障和牧民賴以生存的基本生產資料，也在維持生態平衡、調節氣候、涵養水源、保持水土、防風固沙等方面占據主要地位，對維護生態安全，促進牧區經濟發展有著十分重要的意義。然而，由于人口與家畜數量的劇增，目前典型草原面臨著生物多樣性減少，生產能力下降，草原大面積退化等嚴重問題。隨著國家對生態恢復與草原保護的關注，相關部門開展了大量生態建設工作，其中對退化草地實行圍封禁牧是區域生態重建的一項重要舉措。作為退化草地恢復治理的手段之一，圍封禁牧通過控制家畜的采食及踐踏，從而使退化草地植物群落結構改善，物種多樣性增加，草地生產能力提高\[1-4\]，土壤結構改善，養分含量增加\[1,5-8\]，土壤微生物數量增加，酶活性增強\[9,10\]，草地恢復演替。
近年來，國內外學者針對草地圍封恢復演替過程中植被及土壤理化性狀的變化做了大量研究\[1-8\]，但在圍封后土壤生物學性狀的變化及其與植被、土壤養分的相關性方面所做的研究不多，居于此，以內蒙古錫林郭勒盟南部太仆寺旗典型草原為研究區域，在該區域選取不同圍封年限的生長季圍封恢復草地為研究對象，開展圍封年限對典型草原土壤微生物及酶活性影響的研究，探討典型草原恢復演替過程中土壤生物學性狀的變化規律，揭示土壤生物學性狀與草地植被及土壤養分的相關關系，以期深入認識草地的圍封恢復演替機制，指導半干旱典型草原區退化草地的恢復與草地資源的科學管理。
1材料和方法
1.1研究區域概況
研究區域位于內蒙古錫林郭勒盟南部太仆寺旗境內，地處N 41°35′~42°10′，E 114°51′~115°49′。研究區域土壤類型主要為栗鈣土。氣候類型屬中溫帶半干旱大陸性氣候，冬季寒冷干燥，夏季溫暖濕潤。年均溫1.6 ℃，年均降水量407 mm，年均蒸發量為1 900.6 mm。太陽輻射強，總輻射量134～138 kcal/cm2。
研究區域植被類型以半干旱典型草原為主，以羊草（Leymus chinensis）和克氏針茅（Stipa krylovii）為建群種，位于草群上層，糙隱子草（Cleistogenes quarrosa）、冷蒿（Artemisia frigida）和星毛委陵菜（Potentilla acaulis）形成低矮的下層，伴生成分有草（Koeleria cristata）、根莖冰草（Agropyron michnoi）、寸草苔（Carex duriuscula）、麻花頭（Serratula centauroides）、豬毛菜（Salsola collina）等。有毒有害雜草包括瓣蕊唐松草（Thalictrum petaloideum）、狼毒（Stellera chamaejasme）、披針葉黃華（Thermopsis lanceolata）等。
1.2研究方法
1.2.1樣地選擇與設置在研究區域采用空間系列代替時間系列的取樣方式（即利用空間上處于不同演替階段的樣地來推斷草地演替的趨勢與速率），根據實地調查、資料記載與調查訪問，選取植被組成一致、土壤類型相同，但圍封年限不同的生長季圍封草地為研究對象，選取未圍封的自由放牧草地為對照。研究樣地在2009年8月的植被、土壤狀況及管理方式見旬，在每一樣地內采用蛇形取樣法選取30個點，用土鉆按0～10、10～20、20～30 cm分層取樣，剔除根系、石塊等雜物，按層混合后將樣品分成兩份，一份風干，用于土壤酶活性的測定，另一份保鮮帶回實驗室，4 ℃保存于冰箱，用于土壤微生物數量及微生物生物量的測定。
1.2.3土樣分析方法土壤微生物數量采用稀釋平板計數法測定。其中真菌采用馬丁-孟加拉紅培養基，以平板表面涂抹法計數。即稱取土壤鮮樣10 g，在無菌條件下用無菌水配成不同濃度梯度懸浮液，取稀釋度為10-1，10-2，10-3的土壤懸浮液各50 μL，接種于盛有滅菌的馬丁-孟加拉紅培養基的培養皿中，用無菌刮刀涂抹均勻。每個濃度3次重復，恒溫（25 ℃）培養5～7 d，選取每皿菌落數為15～150的1個稀釋度統計菌落數，按公式：菌數（cfu/g）=菌落平均數×稀釋倍數/干土%計算真菌數量。放線菌采用改良高氏一號培養基，以平板表面涂抹法計數，除取稀釋度為 10-3，10-4，10-5的土壤懸浮液各50 μL接種于盛有滅菌的改良高氏一號培養基外，其余與真菌數量測定方法相同。恒溫（28 ℃）培養7～10 d，按上述方法和公式統計菌落數并計算放線菌數量。細菌采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，以平板表面涂抹法計數。除恒溫（28 ℃）培養3 d統計菌落數外，其余與放線菌數量測定方法相同\[11\]。
土壤微生物量碳、氮采用氯仿熏蒸法測定\[12\]，用 Multi N/C 3000可溶性碳氮測定儀（德國耶納分析儀器公司）測定。
土壤脲酶活性采用苯酚鈉比色法測定，以1 g土壤中NH3N的毫克數表示，活性單位為NH3N mg/g土；土壤轉化酶活性采用硫代硫酸鈉滴定法測定，活性單位為Na2S2O4 mL/g土\[13\]。
1.2.4數據分析采用SPSS 11.5進行單因素方差分析（Oneway ANOVA）、多重比較（Duncan法）和相關分析（Pearson法）；采用Excel 2003作圖。
2結果與分析
2.1圍封年限對典型草原土壤微生物數量的影響
土壤3大類微生物具有強大的酶系統，能引起土壤中植物殘體和有機化合物的分解，在土壤有機物和無機物轉化過程中起著巨大作用，與土壤肥力有密切的關系\[11\]。重度退化自由放牧草地采用生長季圍封恢復措施后，土壤0～30 cm土層細菌、放線菌、真菌數量顯著增加(表2)。不同圍封年限細菌數量的高低順序為：20年＞7年＞13年＞10年＞0年，放線菌和真菌數量的高低順序為：13年＞20年＞10年＞7年＞0年。具體表現為：1）與自由放牧草地相比，圍封7、10、13年，土壤0～10 cm土層細菌數量無顯著性增加，10～20、20～30 cm土層細菌數量呈無規律性變化；圍封20年土壤0～10、10～20、20～30 cm土層細菌數量均顯著增加（P＜0.05）。2）圍封7、10年，土壤0～10、10～20、20～30 cm土層放線菌數量無顯著性增加；圍封13年，土壤0～10、10～20、20～30 cm土層放線菌數量顯著增加（P＜0.05）；圍封20年，土壤0～10 cm土層放線菌數量顯著增加（P＜0.05），10～20、20～30 cm土層放線菌數量無顯著性增加。3）圍封7、10年，土壤0～10 cm土層真菌數量顯著增加（P＜0.05），10～20、20～30 cm土層真菌數量無顯著變化；圍封13、20年，土壤各層真菌數量均顯著增加（P＜0.05）。
2.2圍封年限對典型草原土壤微生物生物量的影響
土壤微生物生物量是土壤有機質中最活躍和最易變化的部分\[14\]，對植物養分具有貯存和調節作用，其大小和活性直接影響養分的礦化和固定\[15\]，亦影響土壤酶活性。重度退化自由放牧草地采用生長季圍封恢復措施后，土壤微生物量碳、氮含量顯著增加(圖1，2)。具體表現為：圍封7年，土壤0～10 cm土層微生物量碳、氮含量顯著增加，與自由放牧草地差異顯著（P＜0.05），10～20、20～30 cm土層無顯著變化；圍封10、13、20年，土壤0～10、10～20、20～30 cm土層微生物量碳、氮含量均顯著增加，與自由放牧草地差異顯著（P＜0.05）。
圖1不同圍封年限典型草原土壤微生物生物量碳
Fig.1Soil microbial biomass C of typical steppein different
exdosure period
圖2不同圍封年限典型草原土壤微生物生物量氮
Fig.2Soil microbial biomass N of typical steppein different
exdosure period
2.3圍封年限對典型草原土壤酶活性的影響
土壤轉化酶又名蔗糖酶，是廣泛存在于土壤中的一個重要的酶，它對增加土壤中易溶性營養物質起著重要作用\[16\]。土壤脲酶與土壤中含氮物質的轉化有關，其活性可以表征土壤中的氮素狀況，反映土壤有機態氮向有效態氮的轉化能力和土壤無機氮的供應能力\[17\]。自由放牧草地采用生長季圍封恢復措施后，土壤轉化酶、脲酶活性均顯著增強，不同圍封年限土壤0～30 cm土層轉化酶、脲酶活性的高低順序為：13年＞20年＞10年＞7年＞0年(圖3，4)。就不同圍封年限土壤轉化酶、脲酶活性空間層次的比較結果來看，圍封7年，土壤0～10 cm土層轉化酶活性顯著增強（P＜0.05），10～20、20～30 cm土層轉化酶活性無顯著變化；圍封10、13、20年，土壤0～10、10～20、20～30 cm土層轉化酶活性均顯著增強（P＜0.05）。
2.4土壤生物學性狀與草地植被、土壤養分間的相關關系
研究指出，草地生態系統土壤微生物活動能力的強弱受土壤狀況、牧草生長、利用方式和強度等的影響，且對土壤環境的變化較為敏感\[18\]。研究采用Pearson相關分析，對不同圍封年限典型草原土壤微生物及酶活性與草地植被及土壤養分（表1）進行相關分析，結果表明：土壤微生物及酶活性與草地植被及土壤有機質、全氮含量間呈正相關關系，以土壤真菌數量、微生物量碳、微生物量氮含量與草地植被及土壤養分含量間的相關性最為顯著，相關系數均達顯著水平（P＜0.05）（表3）。說明放牧草地采用生長季圍封措施后，由于控制了家畜對草地的采食與踐踏，草地植被發育良性化，較多的根量和凋落物的輸入與分解改善了土壤環境，促進了土壤有機質的形成和積累，土壤環境良性發展，微生物數量增加，活動能力增強。
(1)關于圍封年限對土壤微生物及酶活性的影響，前人研究指出，退化草地隨著恢復年限的延長，土壤細菌、放線菌、真菌數量隨之增加，土壤酶活性增強\[19\]，土壤微生物量碳、氮含量與植被恢復年限關系密切，表現為隨著植被恢復年限的延長土壤微生物量碳、氮含量顯著增加\[20\]。研究結果表明，重度退化自由放牧草地采用生長季圍封恢復措施后，土壤微生物數量、微生物量碳、氮含量顯著增加，酶活性增強，且隨圍封年限的延長呈增加的變化趨勢。說明圍封禁牧有利于土壤微生物數量的增加及活動能力的增強，與前人研究結論一致\[9,10,19,20\]。
(2)前人研究指出，土壤微生物數量及活動能力受土壤營養狀況、土壤質地、植被組成和覆蓋度等的綜合影響\[21\]。草地土壤微生物數量與植被蓋度、有機C含量、全N含量、土壤微生物量氮含量均呈正相關關系\[22\]。相關分析結果表明，典型草原恢復演替過程中土壤微生物數量、微生物量碳、氮及土壤酶活性與草地植被蓋度、地上現存量、0～30 cm土層根系生物量、凋落物現存量、有機質含量、全N含量均呈正相關關系。與前人研究結論一致\[22\]。表明退化草地在恢復演替過程中植被與土壤之間形成一個相互作用，相互影響的統一系統\[1,23\]。退化草地圍封后植被恢復演替，較多的根量和凋落物的輸入與分解改善了土壤環境，促進了土壤有機質的形成和積累，給土壤微生物提供了充足的食物來源和良好的生長環境，從而促進土壤微生物數量的增加及活動能力增強。
(3)草地生態系統中土壤微生物數量的多少及活動能力的強弱對土壤環境的變化較為敏感，可用來反映土壤的肥力狀況\[18\]。然而，對于土壤微生物數量、生物量及酶活性能否作為土壤肥力和土壤健康評價的指標，不同學者觀點不一。有學者認為，土壤微生物數量及酶活性與土壤有機質、全氮等養分含量間具有顯著的相關性，可以用來指示土地的健康狀況\[22,25\]。土壤微生物數量和生物活性的高低具有時效性，可以反映土壤養分轉化的強弱，是土壤肥力和土壤健康的重要指標\[26,27\]。也有學者認為，土壤微生物數量和生物活性與土壤的營養水平間并不存在顯著相關關系\[28\]。研究結果表明，放牧草地圍封后引起的植被恢復和土壤養分含量的增加，促使土壤微生物數量及生物活性顯著增強，并且土壤微生物數量、生物量及酶活性的變化與土壤有機質、全N的變化規律相同，兩者關系密切。因此認為土壤微生物數量、生物量及酶活性可以用來作為土壤肥力和土壤健康的評價指標。
參考文獻：
\[1\]單貴蓮，徐柱，寧發，等. 圍封年限對典型草原植被與土壤特征的影響\[J\]. 草業學報，2009，18（2）：3-10.
\[2\]賈曉妮，程積民，萬惠娥. 云霧山本氏針茅草地群落恢復演替過程中的物種多樣性變化動態\[J\]. 草業學報，2008，17（4）：12-18.
\[3\]Hüseyin K F,Steven S S, Bilal S. The effect of longterm grazing exclosure on range plants in the central Anatolian Region of Turkey\[J\]. Environmental Management,2007,39:326-337.
\[4\]Kazuhiro K,Kazuhiko T,Jiang D M,et al. Vegetation restoration by seasonal exclosure in the Kerqin Sandy Land,Inner Mongolia\[J\]. Plant Ecology,1998,139:133-144.
\[5\]邵新慶，石永紅，韓建國，等. 典型草原自然演替過程中土壤理化性質動態變化\[J\]. 草地學報，2008，16（6）：566-571.
\[6\]程杰，高亞軍.云霧山封育草地土壤養分變化特征\[J\].草地學報，2007，15（3）：273-277.
\[7\]Su Y Z,Li Y L,Zhao H L.Soil properties and their spatial pattern in a degraded sandy grassland under postgrazing restoration, Inner Mongolia, northern China\[J\]. Biogeochemistry,2006,79:297-314.
\[8\]Alder P,Lauenroth W.Livestock exclusion increases the spatial heterogeneity of vegetation in Colorado shortgrass Steppe\[J\]. Applied Vegetation Science,2000(3):213-222.
\[9\]姚拓，龍瑞軍. 天祝高寒草地不同擾動生境土壤三大類微生物數量動態研究\[J\]. 草業學報，2006，15（2）：93-99.
\[10\]趙吉. 典型草原土壤健康的生物學優化監測與量化評價\[D\]. 呼和浩特：內蒙古大學，2005.
\[11\]許光輝，鄭洪元. 土壤微生物分析方法手冊\[M\]. 北京：農業出版社，1986.
\[12\]吳金水，林啟美. 土壤微生物生物量測定方法及其應用\[M\]. 北京：氣象出版社，2006.
\[13\]關松蔭. 土壤酶及其研究法\[M\]. 北京：農業出版社，1986.
\[14\]李楊，黃國宏，史奕. 大氣CO2濃度升高對農田土壤微生物及其相關因素的影響\[J\]. 應用生態學報，2003，14（12）：2321-2325.
\[15\]殷士華. 土壤微生物量及其與養分循環的關系研究進展\[J\]. 土壤學進展，1993(4)：1-8.
\[16\]孫瑞蓮，趙秉強，朱魯生，等. 長期定位施肥對土壤酶活性的影響及其調控土壤肥力的作用\[J\]. 植物營養與肥料學報，2003，9（4）：406-410.
\[17\]王俊華，尹睿，張華勇，等. 長期定位施肥對農田土壤酶活性及其相關因素的影響\[J\]. 生態環境，2007，16（1）：191-196.
\[18\]田洪艷，郭平，周道瑋. 草原開墾對草原土壤及植被的擾動生態學作用\[J\]. 干旱區研究，2001，18（3）：67-70.
\[19\]金晶，曹致中，曹毅. 人工恢復沙化草地的土壤微生物和酶活性的研究\[J\]. 草原與草坪，2011，31（1）：84-88.
\[20\]成毅，安韶山，李國輝，等. 寧夏黃土丘陵區植被恢復對土壤養分和微生物生物量的影響\[J\]. 中國生態農業學報，2010，18（2）：261-266.
\[21\]Diaz Ravifia M，Acea M J.Seasonal changes in microbial biomass and nutrient flush in forest soils\[J\]. Biology and Fertility of soils,1995,19：220-226.
\[22\]丁玲玲，祁彪，尚占環，等. 東祁連山不同高寒草地型土壤微生物數量分布特征研究\[J\]. 農業環境科學學報，2007，26（6）：2104-2111.
\[23\]Agustin R,Adrian E.Smallscale spatial soil-plant relationship in semi-arid gypsum environments\[J\]. Plant and Soil,2000,220:139-150.
Influence of exclosure period on soil microorganism
and its enzyme activity in typical steppe
SHAN Guilian1,CHU Xiaohui1,LUO Fucheng1,MA Yubao2,
LI Linghang2,CHEN Gong1
(1. Grassland Science Department,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China;
2. Grassland Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Science,Hohhot 010010,China)
不同微生物菌落特征范文5
關鍵詞：基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術 馬爾尼菲籃狀菌 鑒定
Study on the optimized pretreatment conditions for identification of Talaromyces marneffei by MALDI-TOF MS
LIU Yugu HE Ying FU Junfang LONG Jun XIONG Jun JIANG Lingxiao WANG Yanfang
Microbiome Medicine Center,Department of Laboratory Medicine,Zhujiang Hospital, Southern Medical University;
Abstract：Objective To construct the database of Talaromyces marneffei for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry(MALDI-TOF MS) identification, and to explore the best culture conditions and pretreatment method for MALDI-TOF MS identification of Talaromyces marneffei.Methods A self-built mass spectrometry database was constructed by using 8 strains of Talaromyces marneffei.The effects of different culture media [Sabouraud Dextrose Agar(SDA),Sabouraud Dextrose Broth(SDB)],culture temperature(28,35 ℃),culture day and pretreatment methods(formic acid acetonitrile method and direct coating method) on the quality of spectrum and the accuracy of identification were compared.Results In VITEK MS research use only mode(RUO mode),the self-built mass spectrometry database of Talaromyces marneffei was successfully constructed.SDA was more suitable for MALDI-TOF MS identification of Talaromyces marneffei than SDB,and the latter had more interference peaks in the acquisition spectrum.The characteristic peaks of the spectra collected at the two temperatures were similar, but the identification accuracy of colonies at 35 ℃ was slightly higher.The accuracy rate of colony identification was higher than 71.4% when cultured for 3-5 days, and the highest rate could reach 100.0% when cultured for 5 days.The extraction effect of formic acid acetonitrile method was better than that of direct coating method.Conclusion The best identification accuracy could be obtained by culturing Talaromyces marneffei on SDA at 35 ℃ for 3-5 days and pretreated with formic acid acetonitrile method.This is also applicable to the Talaromyces marneffei with atypical morphology.
Keyword：Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry; Talaromyces marneffei; identification;
馬爾尼菲籃狀菌(TM)是一種雙相真菌，流行于東南亞地區及我國南方地區，可致播散性感染，多發于免疫缺陷患者，其病情兇險、預后差，因此早期準確鑒定尤為重要[1-3]。目前，TM的鑒定以其典型菌落特征(溫度雙相性和紅色素)為主，但對于形態不典型菌株，單一溫度培養時檢驗人員易出現判斷錯誤的情況，從而延誤患者的診治。分子生物學方法雖是“金標準”,但目前尚不適用于臨床檢驗科的常規鑒定。近年來，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術(MALDI-TOF MS)在微生物鑒定領域發展迅速，因其具有快速準確的優點被稱為最有前景的鑒定方法[4-5]。目前MALDI-TOF MS應用較廣泛的有Bruker Biotyper及VITEK MS系統，但其對于雙相真菌的應用研究較為滯后[6]。本研究擬在VITEK MS科研模式(RUO模式)中構建TM的參考數據庫，并通過比較不同培養條件及樣品前處理方法，探索用于TM質譜鑒定的最佳培養條件和前處理方法。現報道如下。
1 材料與方法
1.1 材料來源
南方醫科大學珠江醫院檢驗科分離的TM 8株，菌株編號分別為ZJ01、ZJ02、ZJ2360、ZJ399、ZJ18919110、ZJ110307、ZD180201、ZJLin, 以上菌株均經形態學及ITS測序鑒定。以大腸埃希菌ATCC8739作為校準和內質控菌株。
1.2 儀器與試劑
MALDI-TOF MS儀(法國生物梅里埃股份有限公司，數據庫版本V3.0,RUO模式);隔水式電熱恒溫箱(28、35 ℃),高速冰凍離心機，大型落地搖床(美國Themo Fisher科技有限公司);電子天平；沙保弱葡萄糖瓊脂培養基(SDA,廣州市迪景微生物科技公司);VITEK MS-CHCA基質液(主要成分為α-氰基-4羥基肉桂酸)、VITEK MS-FA(主要成分為甲酸，酵母菌前處理液)、VITEK MS-DS靶板(法國生物梅里埃股份有限公司);葡萄糖，蛋白胨[生工生物工程(上海)股份有限公司];70%乙醇，甲酸，乙腈(天津市化學試劑供銷公司),蒸餾水等。
1.3 方法
1.3.1 分生孢子懸液制備
于SDA平板接種上述8株TM,28 ℃培養5 d, 用含0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液收集菌液，并經12層無菌紗布過濾得到孢子懸液，計數并調節孢子濃度為2×107個/毫升。
1.3.2 菌株培養
取上述TM菌株約2×106個孢子接種于SDA、沙氏葡萄糖肉湯培養基(SDB)中，于28、35 ℃進行培養，分別在第3、5、7、9天取菌落前處理進行質譜鑒定。以編號ZD180201菌株的質譜數據建立TM質譜參考庫。其余7株TM用于驗證參考庫及構建TM超級譜圖庫。
1.3.3 菌落前處理方法
酵母相菌落(35 ℃)分別采用甲酸乙腈法或者直涂法處理，菌絲相菌落(28 ℃)生長過程的孢子與菌絲不夠豐富，且部分生長呈現“咬瓊脂”現象，難取樣，因此未采用直涂法，按照VITEK MS推薦的絲狀真菌前處理方法即甲酸乙腈法處理，具體步驟如下。甲酸乙腈法：按照VITEK MS絲狀真菌前處理方法進行處理，即生物安全柜內挑SDA或SDB中菌落分別于900 μL 70%乙醇靜置10 min, 14 000 r/min離心2 min, 棄上清液；沉淀中加入70%甲酸和乙腈各40 μL振蕩混勻，14 000 r/min離心2 min。取1 μL上清液及質控菌株加于靶板點位上，干燥后覆蓋1 μL CHCA基質液，室溫下干燥上機，自動采集質譜譜圖。直涂法：生物安全柜內直接取酵母相菌落適量涂靶板，待干后加入0.5 μL VITEK MS-FA,干燥后覆蓋1 μL CHCA基質液，同上采集質譜譜圖。
1.3.4 構建參考庫
以其中1株(編號ZD180201)在不同培養基(SDA、SDB),培養溫度(28、35 ℃),培養天數(3、5、7、9 d),前處理方法(甲酸乙腈法、直涂法)的高質量譜圖，即背景噪音低、基峰分辨率高、主次峰分布錯落有致、一致性好、主峰信號強度強、基線穩定及出峰數為80～250個的譜圖，構建TM參考庫，加入VITEK SARAMI數據庫中。
1.3.5 結果判讀
專用分析軟件對鑒定結果進行判讀，版本為V3.0。靶板點位通過點位顏色變化來提示結果的可信度，通常有綠、黃、紅3種顏色。綠色提示只有一個鑒定結果，概率為60.0%～99.9%,結果可信度水平高。黃色提示儀器對標本分辨率較低，需要進一步采用試驗進行區別。紅色提示與數據庫中任何質譜不匹配。
1.3.6 驗證并創建超級譜圖庫
利用其余7株TM驗證TM參考庫，并匯總高質量質譜譜圖，創建超級譜圖庫，保留39～41個特征性峰，特征性峰權重之和≤1 400。
1.4 統計學處理
計數資料以頻數或百分率表示，比較不同培養天數、培養溫度、前處理方法時的TM質譜鑒定正確率。正確率=正確鑒定菌株數/總數×100%。因樣本量小，未進行統計分析。
2 結 果
2.1 不同培養天數、培養溫度及前處理條件對TM質譜譜圖的影響
TM質譜譜圖的離子峰以位于質荷比m/z 7 848.00、6 113.00、6 668.00、3 335.00附近的特征峰為主，見圖1。不同培養溫度時，特征峰信號基本相似但略有不同，28 ℃培養特征峰主要以m/z 6 113.00附近為主峰，見圖1A、B,而35 ℃培養以m/z 7 848.00附近為主峰，見圖1C、D。
相比于SDB,SDA培養的TM更易采集到較多的特征離子峰信號且強度明顯的高質量質譜譜圖，見圖1A、B。TM在SDB 35 ℃培養的菌落采集的高質量譜圖數量較少，譜圖主要表現為干擾峰多，特征峰信號強度不明顯，未納入參考庫。且未使用SDB繼續對其他7株臨床分離菌株進行培養。
不同培養時長對特征峰的數量與強度影響較為明顯，培養3～5 d時采集的質譜譜圖質量更佳，可獲得較多數量且信號強度明顯的特征峰，信噪比較高，見圖1A、B、C、D,而培養第9天時特征峰的數量明顯減少且信號強度減弱，甚至消失，見圖1E、F。
甲酸乙腈法與直涂法前處理方法進行比較后發現，在特征峰最佳的第3天培養時，甲酸乙腈法較直涂法可獲得更多數量、信號強度更明顯的特征峰，且信噪比更高，質譜譜圖與參考庫中的特征性質譜譜圖匹配效果更好，提示蛋白提取效果更佳，見圖1C、D。
2.2 MALDI-TOF MS對不同培養溫度、培養天數的TM的鑒定正確率比較
不同培養溫度下的TM鑒定結果顯示，在相同培養天數時，35 ℃培養菌落鑒定正確率均高于28 ℃培養菌落，其中35 ℃培養3～7 d內鑒定正確率均超過70.0%,培養5 d時鑒定正確率可達100.0%。而28 ℃培養菌落則需要在培養3～5 d內行MALDI-TOF MS鑒定，正確率可超過70.0%,見表1。
不同培養天數下的TM鑒定結果顯示，培養第5天鑒定正確率最高(28 ℃培養時鑒定正確率為85.7%,35 ℃培養時鑒定正確率為100.0%),而培養第9天時鑒定正確率最低，均不足50.0%,見表1。
2.3 MALDI-TOF MS對不同前處理方法培養的TM的鑒定正確率比較
利用甲酸乙腈法、直涂法對35 ℃,SDA培養的TM進行前處理，結果顯示，經甲酸乙腈法提取蛋白進行鑒定的正確率略高于直涂法，見表2。另外，甲酸乙腈法及直涂法對TM的鑒定效果均表現為培養第3～5天鑒定正確率最高，隨著培養時間延長，鑒定正確率降低，見表2。
2.4 MALDI-TOF MS在不典型TM鑒定中的價值
2.4.1 不典型TM的形態學特征
本研究中的不典型TM菌株分離自南方醫科大學珠江醫院患者肺泡灌洗液和痰液，形態學表現為溫度雙相型，但是紅色素產生極緩慢，28 ℃培養7～9 d局部開始分泌紅色素，經ITS測序證實為TM(100%),見圖2。
2.4.2 TM自建數據庫在不典型菌株鑒定中的應用
對于28 ℃培養7 d未分泌紅色素的不典型TM菌株(編號ZJLin),生長速度較典型TM慢，但培養3～5 d時可被TM自建數據庫正確鑒定，而培養第7～9天均無法經TM自建數據庫正確鑒定。不同溫度和前處理方法對鑒定結果均無差異。見表3。
3 討 論
近年來，隨著免疫抑制人群數量的增加，TM感染發病率也隨之上升。目前臨床微生物實驗室對TM的鑒定，主要依賴其溫度雙相的菌落特征(35 ℃培養為酵母樣，28 ℃培養為霉菌樣)及典型紅色素來判斷，但形態學鑒定主要依賴于檢驗人員的經驗。分子生物學鑒定則需要獲取足夠數量的菌體。對于生長緩慢的菌落，其鑒定耗時長。這限制了TM感染的早期診斷和及時治療。同時，形態不典型菌株的出現，向微生物實驗室對TM的快速準確鑒定提出挑戰。
MALDI-TOF MS是微生物鑒定領域的一項極具前景的新技術，有成本低、耗時短、準確、高效等優點，可實現菌株的快速鑒定，目前在國內檢驗科被廣泛推廣。但國內外常用的Bruke Biotyper及VITEK MS系統均無TM鑒定參考庫，且適合用于TM質譜鑒定的菌落培養條件及前處理方案鮮有報道。
質譜鑒定的準確性受許多因素影響，如培養基種類、培養條件、培養時間、蛋白提取方法等[7]。本研究比較了兩種溫度(28、35 ℃)、兩種培養基(SDA、SDB)培養3～9 d的質譜鑒定正確率。其中從SDB 35 ℃培養菌落采集的質譜譜圖數量少，干擾峰較多且特征峰信號強度不明顯，考慮為液體培養基搖菌時菌量不足及洗滌不充分所致。因此，操作時應盡可能將菌落沉淀洗滌干凈。另外，從28 ℃ SDA及SDB中培養菌落采集到的質譜譜圖無明顯差異。液體培養基培養操作較復雜，培養液等營養成分會干擾質譜分析，且菌落培養耗時更長，因此固體培養基更適合臨床微生物室的快速鑒定。LAU等[8]發現，補充構建數據庫后，MALDI-TOF MS能準確鑒定TM,其菌絲相和酵母相質譜譜圖類似。本研究發現TM菌絲相及酵母相的特征峰相似，且與文獻報道的主峰一致，但在35 ℃培養時鑒定正確率略高。
不同真菌培養時間下質譜譜圖的特征峰數量和強度存在明顯差異[9-11]。本研究發現，TM培養3～5 d時進行質譜鑒定的正確率高，且第5天最佳，可達100.0%。這主要與此時質譜譜圖質量佳、信噪比高及鑒定結果穩定有關。隨著培養時間的延長，特征峰信號強度減弱，甚至消失，從而出現錯誤鑒定或無鑒定結果，這可能與真菌細胞壁較厚且堅韌難破壁、色素產生干擾等有關。
TM于28 ℃時呈菌絲相，35 ℃呈酵母相生長。法國梅里埃公司推薦對絲狀真菌采取甲酸乙腈法，對酵母菌采用直涂法進行前處理。直涂法用于酵母菌鑒定效果好，且適用于多種商業化MALDI-TOF MS系統[12-15]。而甲酸乙腈法是利用甲酸及乙腈對菌體進行蛋白提取來獲得高質量質譜譜圖，不僅適用于酵母菌鑒定[16],也適用于曲霉、皮膚癬菌等絲狀真菌鑒定[17-20]。本研究比較兩種前處理方法對TM酵母相菌落的鑒定發現，對培養3～5 d的菌落，甲酸乙腈法的鑒定正確率略優于直涂法(100.0%、100.0% vs.71.4%、85.7%)。這與甲酸乙腈法蛋白提取更充分有關。
綜上所述，本研究發現經SDA培養3～5 d的酵母相(35 ℃)菌落，經甲酸乙腈法處理后，可獲得良好的質譜譜圖，鑒定正確率高。此條件也同樣適用于形態不典型的TM,為TM的快速、準確鑒定提供了輔助手段。但本研究僅納入8株TM的質譜譜圖，還需要更多菌株進一步完善數據庫并驗證。MALDI-TOF MS提高了真菌鑒定的準確性，但在鑒定中仍需努力解決如生物安全問題、少見菌株數據庫問題及樣本處理標準化等問題。
參考文獻
[1] CHAN J F,LAU S K,YUEN K Y,et al.Talaromyces (Penicillium) marneffei infection in non-HIV-infected patients[J].Emerg Microbes Infect,2016,5(3):e19.
[2] CAO C,XI L,CHATURVEDI V.Talaromycosis (Penicilliosis) due to Talaromyces (Penicillium) marneffei:insights into the clinical trends of a major fungal disease 60 years after the discovery of the pathogen[J].Mycopathologia,2019,184(6):709-720.
[3] LAU S,TSANG C C,WOO P.Talaromyces marneffei genomic,transcriptomic,proteomic and metabolomic studies reveal mechanisms for environmental adaptations and virulence[J].Toxins(Basel),2017,9(6):192-197.
[4] SINGHAL N,KUMAR M,KANAUJIA P K,et al.MALDI-TOF mass spectrometry:an emerging technology for microbial identification and diagnosis[J].Front Microbiol,2015,6(2):791-804.
[5] KASSIM A,PFLüGER V,PREMJI Z,et al.Comparison of biomarker based Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) and conventional methods in the identification of clinically relevant bacteria and yeast[J].BMC Microbiol,2017,17(1):128-144.
[6] SANGUINETTI M,POSTERARO B.Identification of molds by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry[J].J Clin Microbiol,2017,55(2):369-379.
[7] 胡驍，林肖惠，佟巍，等.沙門菌MALDI-TOF MS標準菌庫的建立及應用研究[J].衛生研究，2014,43(1):40-46.
[8] LAU S K,LAM C S,NGAN A H,et al.Matrix-assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry for rapid identification of mold and yeast cultures of Penicillium marneffei[J].BMC Microbiol,2016,16:36-45.
[9] ALANIO A,BERETTI J L,DAUPHIN B,et al.Matrix-assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry for fast and accurate identification of clinically relevant Aspergillus species[J].Clin Microbiol Infect,2011,17(5):750-755.
[10] DE CAROLIS E,POSTERARO B,LASS-FL?RL C,et al.Species identification of Aspergillus,Fusarium and Mucorales with direct surface analysis by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry[J].Clin Microbiol Infect,2012,18(5):475-484.
[11] SANTOS C,PATERSON R R,VEN?NCIO A,et al.Filamentous fungal characterizations by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry[J].J Appl Microbiol,2010,108(2):375-385.
[12] BILLE E,DAUPHIN B,LETO J,et al.MALDI-TOF MS Andromas strategy for the routine identification of bacteria,mycobacteria,yeasts,Aspergillus spp.and positive blood cultures[J].Clin Microbiol Infect,2012,18(11):1117-1125.
[13] WON E J,SHIN J H,LEE K,et al.Accuracy of species-level identification of yeast isolates from blood cultures from 10 university hospitals in South Korea by use of the Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry-Based Vitek MS system[J].J Clin Microbiol,2013,51(9):3063-3065.
[14] PENCE M A,MCELVANIA T E,WALLACE M A,et al.Comparison and optimization of two MALDI-TOF MS platforms for the identification of medically relevant yeast species[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2014,33(10):1703-1712.
[15] IRIART X,LAVERGNE R A,FILLAUX J,et al.Routine identification of medical fungi by the new Vitek MS Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight system with a new time-effective strategy[J].J Clin Microbiol,2012,50(6):2107-2110.
[16] NORMAND A,GABRIEL F,RIAT A,et al.Optimization of MALDI-TOF Mass Spectrometry for yeast identification:a multicenter study[J].Med Mycol,2020,58(5):639-649.
[17] SUH S O,GROSSO K M,CARRION M E.Multilocus phylogeny of the Trichophyton mentagrophytes species complex and the application of Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time-of-Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry for the rapid identification of dermatophytes[J].Mycologia,2018,110(1):118-130.
[18] AMéRICO F M,SIQUEIRA L P,NEGRO G M,et al.Evaluating VITEK MS for the identification of clinically relevant Aspergillus species[J].Med Mycol,2020,58(3):322-327.
不同微生物菌落特征范文6
關鍵詞：亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌；羽絨羽毛；微生物
引言
我國的羽絨羽毛資源十分豐富，并且是世界上最大的羽絨及其制品的生產國、出口國和消費國，產量占世界總產量的70%以上。羽絨是一種動物源性產品，衛生安全問題尤為重要，而亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌廣泛存在于羽絨羽毛原料中，生產過程中滅菌處理不嚴格就會有殘留。
亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌是梭狀芽孢桿菌屬的一群細菌，能形成芽孢，并還原亞硫酸鹽產生硫化物，厭氧生長，具有動力，且革蘭氏陽性[1]。該菌在自然界中分布廣泛，通常存在于人和動物糞便排泄物、廢水和土壤中。該菌具有一定的致病性，可引起創傷感染、食物中毒和壞死性腸炎。
我國羽絨羽毛中亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌的檢驗依照國家標準GB/T 10288―2003《羽絨羽毛檢驗方法》和行業標準FZ/T 80001―2002《水洗羽毛羽絨試驗方法》。但是這兩個標準中某些技術參數不很完善，對檢驗過程的某些問題指導性不強。本文參照上述兩個標準并結合實際亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌檢驗工作，研究了培養時間、培養溫度、亞硫酸鹽添加量和多粘菌素B添加量對檢出菌落數的影響關系，以期掌握亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌檢驗的關鍵點，提高檢驗水平。
1試驗部分
1.1試劑與材料
羽絨羽毛：取自某品牌送檢原料亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌檢驗呈陽性樣品；
0.1%滅菌的蛋白胨生理鹽水：蛋白胨1g，氯化鈉8.5g，蒸餾水1000mL；
亞硫酸鐵多粘菌素B培養基：胰蛋白胨15g，酵母浸膏10g，檸檬酸鐵胺0.5g，亞硫酸鈉1g，瓊脂16g，10mL多粘菌素B，1000mL蒸餾水；
革蘭氏染色液試劑盒（北京陸橋技術有限責任公司）；脫脂棉紗布（河南焦作聯盟衛生材料有限責任公司）。
1.2試驗儀器
顯微鏡（XS-212，江南儀器廠）；調速多用振蕩器（HY-2，江南儀器廠）；厭氧培養箱（1029，美國熱電公司）。
1.3試驗方法[2-3]
1.3.1試樣前處理
用滅菌一次性手套取出12g（精確到0.1g）試樣，放入經過滅菌處理的三角燒瓶中，加入1200mL 0.1%無菌蛋白胨生理鹽水，無菌室中室溫振蕩3h。通過消毒紗布過濾溶液，取該溶液5mL于經過滅菌處理的三角燒瓶中待用。
1.3.2亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌的測定
將5mL樣品濾液置于75℃水浴中處理10min。取處理后的原始濾液1mL做10倍遞增稀釋，同時即以吸取該稀釋度的1mL稀釋液于滅菌平皿內。及時將晾至（46±1）℃的亞硫酸鹽多粘菌素B培養基注入平皿約15mL，小心轉動使試樣與培養基充分混勻。待凝固后，再用5mL相同培養基覆蓋表層。再次凝固后置于厭氧培養箱中37℃厭氧培養48h。
1.3.3菌落計數和確證試驗
厭氧培養48h后，計數黑色和暗棕色菌落。取特征菌落進行確證試驗，鏡檢為革蘭氏陽性梭狀芽孢桿菌，過氧化氫酶試驗陰性。
2結果與討論
2.1亞硫酸鹽的影響
亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌以還原亞硫酸鹽成硫化氫為主要特征。因此，對該菌進行檢驗的選擇性培養基中一定含有亞硫酸鹽。試驗中對培養基中亞硫酸鹽的添加量進行了優化，結果表明，每100mL培養基中添加10%亞硫酸鈉溶液為1mL時，最利于亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌的生長繁殖（見圖1）。
圖1不同Na2SO3添加量的檢出菌落圖
2.2多粘菌素B添加量的影響
多粘菌素B是由多粘芽孢桿菌產生的一組多肽類抗生素，對大腸桿菌、綠膿桿菌等革蘭氏陰性桿菌有抑制或殺菌作用。亞硫酸鐵多粘菌素B培養基中添加多粘菌素B能有效地抑制革蘭氏陰性桿菌的生長，提高對亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌檢驗的選擇性。試驗發現，多粘菌素B的添加量對亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌的檢出菌落數有一定影響。添加量在每100mL培養基中1mL～2mL時最有利于亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌的生長（見圖2）。
2.3培養溫度的影響
溫度是影響機體生長與存活的最重要因素之一。在一定范圍內，機體的代謝活動與生長繁殖隨著溫度的上升而增加，溫度上升到一定程度，開始對機體產生不利影響，如果溫度繼續提高，細胞功能急劇下降以至死亡[4]。試驗發現，亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌的培養溫度在36℃～40℃時最利于其生長（見圖3）。
圖2不同多粘菌素B添加量的檢出菌落圖
圖3培養溫度對檢出菌落的影響（a, 陽性樣品; b, 空白）
2.4培養時間的影響
當少量微生物接種到一個恒定容積的培養基中，在適宜條件下培養。開始有一短暫時間，細胞數并不增加，以后增加很快，然后又趨于穩定，最后逐漸下降[5]。在亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌的培養過程中，培養時間過短，可見菌落過少；時間過長，則易造成菌落相連或染菌。因此，在48h內應間隔一段時間計數一次，如發現菌落相連，則以上一次計數為準。 試驗選取亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌檢驗陽性羽絨樣品，取三份樣品進行平行試驗，并記錄不同培養時間的檢出菌落數（見表1）。
表1培養時間的影響
3結論
亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌是羽絨羽毛制品微生物檢驗的重要指標。依照GB/T 10288―2003和FZ/T 80001―2002進行檢驗時，培養溫度、培養時間等因素都會影響亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌的生長，因此要嚴格控制各項環境條件和培養基配方，提高檢驗的準確性，確保檢驗質量。
參考文獻:
[1] 陳彥長. 常見細菌及檢驗實用技術[M]. 北京：中國科學技術出版社, 2004.
[2] GB/T 10288―2003 羽絨羽毛檢驗方法[S].
[3] FZ/T 80001―2002 水洗羽毛羽絨試驗方法[S].
[4] 魏明奎. 微生物學[M]. 北京：中國輕工業出版社, 2009.
[5] 黃怡,譚玉靜,陳慧，等. 羽毛羽絨微生物檢測方法初步研究[J]. 中國纖檢, 2008 (10)：44-47.
