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細胞生物學特性范文1
【摘要】
為了研究多發性骨髓瘤（multiple myeloma， MM）病人骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells， MSC）的病理生物學特性，以探討MSC在MM骨損傷發生中的作用，取11例初治MM病人和5例正常人骨髓，用貼壁法體外分離培養MSC 。應用流式細胞術分析MM骨髓MSC表型，MTT法檢測MSC增殖能力，組織化學染色測定細胞向成骨細胞和脂肪細胞分化能力。應用酶聯免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）測定細胞培養上清液中白介素-6（interleukin-6，IL-6）和干細胞生長因子（stem cell factor， SCF）濃度。收集MSC培養上清作為條件培養液，按梯度濃度加入人SKO007骨髓瘤細胞系培養體系中，MTT法測定細胞增殖能力差異。結果表明：與正常人骨髓MSC比較，MM患者骨髓MSC的表型無改變，均一表達CD29、CD73、CD166和HLA-ABC，不表達CD45和CD31； MM患者骨髓MSC增殖和分化能力正常，且具有相似的成骨和成脂肪分化功能； MM骨髓MSC分泌IL-6和SCF的水平均明顯高于正常； MM來源的MSC培養上清顯著促進SKO007細胞的增殖。結論： MM患者骨髓MSC的增殖分化功能正常，MM時骨損傷可能與MSC分化功能無關，而IL-6和SCF高表達為骨髓瘤細胞提供了必要的生存信號。
【關鍵詞】 間充質干細胞; 多發性骨髓瘤; 細胞因子
Biological Properties of Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow of Patients with Multiple Myeloma
AbstractThe study was purposed to explore the role of mesenchymal stem cells (MSCs) in the pathogenesis of bone disease particularly observed in multiple myeloma (MM)， the biological features of marrow derived MSCs from patients with MM have been investigated. Marrow aspirates were harvested from 11 newly diagnosed patients with MM and 5 normal adults and MSCs were isolated and culture-expanded by the cell properties of adherence to plastic flasks， The phenotype was analyzed by flow cytometric technique. The proliferation of MSCs was observed by MTT assay and their differentiation capacities into osteoblasts and adipoblasts were assessed with lineage-specific histochemical staining. The concentrations of IL-6 and SCF in the culture supernatant were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). MSC culture supernatants were collected and MTT assay was performed to evaluate their support on the proliferation of an MM cell line SKO007 cells. The results showed that bone marrow-derived MSCs from MM patients were homogenously positive for CD29， CD73， CD166 and HLA-ABC and negative for hematopoietic cell marker CD45 and endothelial cell marker CD31， the phenotype of which was similar to that of marrow counterparts from normal adults. MTT assay indicated that MSCs from MM patients or normal adults proliferated at similar rates. MSCs from MM patients occupied in vitro osteogenic and adipogenic capacity as those from normal adults. The levels of IL-6 and SCF in culture supernatant were greatly up-regulated in MM patients by ELISA assay. Furthermore， MSC culture supernatants from MM bone marrow displayed enhanced activity to promote the proliferation of SKO007 cells. It is concluded that marrow-derived MSCs from bone marrow of MM patients are normal in their proliferation and differentiation capacities， and myeloma bone disease may not be ascribed to the differentiation of MSCs while the elevated secretion of IL-6 and SCF may provide necessary cues for the survival of malignant myeloma cells.
Key wordsmesenchymal stem cell; multiple myeloma; cytokine
多發性骨髓瘤（multiple myeloma， MM）患者呈現特征性的骨質破壞。這種骨質損傷與破骨細胞數量增加，成骨細胞數減少，從而導致骨吸收與成骨之間失平衡有關［1］。間充質干細胞（mesenchymal stem cells， MSC）是存在于骨髓的結締組織干細胞，不但可以向成骨細胞、成軟骨細胞和成脂肪細胞分化，而且是骨髓基質細胞的前體細胞［2］。骨髓基質細胞為骨髓瘤細胞提供了必需的生存和增殖支持，并由此促進破骨細胞的增殖分化，導致溶骨性損傷［3］；而骨髓瘤細胞可通過細胞因子分泌和(或)細胞間的直接接觸，引起成骨細胞的凋亡［4］。但是，以上這些病理改變是否涉及MSC本身，抑或MSC的某些改變促進了疾病進程尚不清楚。為此，我們對骨髓瘤MSC的特性進行了研究。
材料和方法
材料來源
11例MM均為初治患者，男7例，女4例，平均年齡59.4歲; IgG型6例， IgA型3例， κ輕鏈型2例。對照骨髓來源于骨髓象和血象檢查正常的健康人，共5例，其中男3例，女2例，平均年齡51.7歲。SKO007 MM細胞株為本研究所傳代的細胞株。
骨髓MSC的分離和培養
按參考文獻［2］的方法，取肝素抗凝的骨髓，α-MEM稀釋2倍后Percoll梯度密度離心收獲單個核細胞。將細胞接種于含10%人骨髓MSC專用培養血清的α-MEM中（血清為Stem Cells公司產品），培養48小時后去除非貼壁細胞，繼續培養至貼壁細胞約80%融合，收集培養上清于-70℃凍存備用。0.05%胰蛋白酶消化傳代培養。第3代細胞用于以下實驗。
細胞免疫表型分析
胰蛋白酶消化收集MSC，加入FITC或PE標志的小鼠源抗人CD29、CD31、CD34、CD45、CD73、CD166、HLA-ABC和HLA-DR單克隆抗體（eBioscience公司產品），室溫下避光反應30分鐘。用PBS洗滌2次后，FACSCalibur (Becton Dickinson， USA)收集細胞參數，用流式細胞儀檢測，WinMDI 2.9軟件分析結果。
增殖能力的MTT法測定
收集MSC，按750個細胞/孔接種于含MSC完全培養液的96孔培養板中，每組6孔；將SKO007細胞按1000/孔接種于不含血清的RPMI 1640 培養液的96孔培養板中，培養體系中分別加入10%、20%和40%的MSC培養上清，每組4孔。細胞培養72小時后加入10 μl MTT（1 g/L），繼續培養4小時。離心去除培養液，加入二甲亞砜裂解細胞，以未加MTT孔為本底，570 nm波長下測定OD值。
多系分化的鑒定
成骨分化將細胞按5×104/孔接種于6孔培養板，或1×104/孔接種于24孔培養板中，加入地塞米松（10-7mol/L）、維生素C（50 mg/L）和β-磷酸甘油（10 μmol/L），培養12天，期間換液2次。應用白細胞ALP染色試劑（Sigma公司產品）進行堿性磷酸酶原位染色。
成脂肪分化將細胞按2×104/孔接種于24孔培養板中，次日加入地塞米松（10-6mol/L）、IBMX（0.5 mmol/L）和消炎痛（10 μmol/L），連續培養7天后去除培養基，用PBS洗滌2次后多聚甲醛室溫固定1小時，1%油紅O染色，光學顯微鏡下觀察。
MSC的細胞因子分泌功能測定
消化傳代細胞培養至貼壁層致密時，更換無血清的α-MEM，培養48小時后收集培養上清，于-70℃凍存備用。按照試劑盒（Bio-Rad產品）操作說明，應用酶聯免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）測定，依據由重組人白介素-6（interleukin-6，IL-6）和干細胞生長因子（stem cell factor， SCF）（Peprotech產品）所作的標準曲線，測定培養上清IL-6和SCF濃度。
統計學處理
試驗數據以平均值±標準差（±SD）表示，以t檢驗進行數據分析，P值
結果
MM患者與正常人骨髓MSC免疫表型的比較
體外培養的MM患者和正常人骨髓MSC均一地表達間充質細胞標志CD73和CD166，表達黏附分子CD29，不表達造血細胞標志CD45和內皮細胞標志CD31。此外，細胞表達HLA-I類分子(HLA-ABC)，不表達HLA-DRII類分子。MM骨髓MSC表型與正常人來源MSC相似， MM患者骨髓MSC表型無改變（圖1）。
MM患者骨髓MSC增殖能力分析
利用MTT法檢測第3代細胞增殖速率。MM患者骨髓MSC與正常人骨髓MSC組比較沒有顯著差異，OD值分別為0.46±0.11與0.39±0.08 (P>0.10) ，MM患者骨髓MSC增殖能力正常（圖2）。
MM患者與正常人骨髓MSC體外成骨和成脂肪能力比較
MM患者和正常人骨髓MSC經成骨誘導體系培養后，細胞形態均發生了明顯的變化，部分細胞由紡錘形轉變為多邊形或不規則形狀；12天后經NBT-BCIP染色顯示細胞堿性磷酸酶（ALP）活性，MM患者骨髓與正常人骨髓組細胞顯色強度比較無明顯差別（圖3A、B），顯示MM患者骨髓MSC成骨能力并沒有減低。應用成脂肪誘導體系作用7天，油紅O染色顯示兩組細胞體外成脂肪性能未見明顯差別，MM患者骨髓MSC體外成骨和成脂肪能力正常（圖3C、D）。
MM患者與正常人骨髓MSC的IL-6和SCF表達量比較
1×106 MM患者骨髓MSC細胞48小時分泌的IL-6總量顯著高于正常人骨髓MSC，分別為(9.36±2.11)ng 和(4.72±1.64)ng（P
MSC培養上清對SKO007細胞的增殖支持作用
將SKO007細胞用無血清體系培養，加入不同濃度的MSC培養上清，72小時后MTT法測定細胞活力。結果表明：未加條件培養液組大部分細胞死亡；加入10%和20%條件培養液后，兩組細胞增殖能力無差別；濃度升至40%時，MM患者骨髓MSC培養上清明顯促進SKO007細胞增殖，兩組比較差異有統計學意義（P
討論
MM是B細胞克隆性疾病，腫瘤細胞刺激骨吸收，促進血管形成，導致溶骨性骨損傷，即使化療成功實施后，骨損傷仍然存在，提示骨髓中成骨細胞的干細胞—MSC可能存在本質的異常。MSC是存在于骨髓的結締組織干細胞，是骨髓基質細胞的前體細胞。骨髓基質細胞與骨髓瘤細胞相互影響，促進破骨細胞的增殖分化和成骨細胞凋亡。為此，我們分離培養了初治MM骨髓MSC，并與來自年齡相近正常人骨髓的MSC比較，觀察MM患者骨髓MSC是否存在生物學特性的異常。結果表明，體外培養的這兩種來源MSC表型一致，均不表達造血細胞和內皮細胞的標志，提示MM血管形成可能與MSC向內皮細胞的分化無關。MM患者骨髓MSC不表達HLA-DR，提示MM病人骨髓微環境中炎性因子或相關的調控因素使MSC維系了固有的表型。MSC具有很強的體外增殖和多向分化能力。MM病人骨髓中成骨細胞數量減少［4］，可能與 MM骨髓MSC的增殖分化能力有關。本研究采用MTT法檢測MSC細胞增殖速率，結果顯示MM骨髓源MSC增殖能力與正常骨髓源MSC比較沒有顯著差異，提示MM病人的MSC增殖能力正常。在體外，MM骨髓MSC經成骨誘導體系培養后，具有正常的體外成骨能力，且與正常人骨髓MSC相似; MSC體外成脂肪能力與正常骨髓MSC亦相當。本研究表明，MM病人MSC體外增殖分化能力維持在正常水平，骨髓瘤細胞沒有改變MSC固有的自我更新和多向分化能力。然而研究已發現，骨髓瘤細胞與成骨細胞系共培養后成骨細胞株Runx-2基因表達下調，從而抑制成骨細胞向骨細胞分化成熟［5-7］。因此，骨髓瘤骨疾病涉及的病理改變可能發生于成骨細胞階段，而與MSC分化能力無關。研究已經表明，MSC和骨髓基質細胞可分泌G-CSF、GM-CSF、VEGF、SCF及IL-6等多種細胞因子［3，8， 9］，這些因子相互影響，形成網絡調節骨髓瘤細胞的生物學特性［10］，促進骨髓瘤細胞增殖和存活。人骨髓瘤細胞也表達成骨細胞特異性轉錄因子Runx2，并分泌骨橋蛋白（osteopontin， OPN）［7］。研究發現OPN也與胃癌的侵襲轉移有關［11］。骨髓基質細胞分泌IL-6等細胞因子，促進骨髓瘤細胞分泌與成骨發育相關的因子，以抑制成骨新生，促進骨溶性損傷［3，12］。骨髓瘤細胞是骨髓中堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor， bFGF）的主要來源。bFGF促進骨髓組織新生血管形成、刺激基質細胞分泌IL-6［13］。人骨髓MSC也表達bFGF受體。骨髓瘤病人MSC細胞分泌異?？赡芘c體內異常細胞因子網絡調節有關。本研究發現，在體外，MM患者骨髓MSC分泌的IL-6和SCF量明顯高于正常人骨髓MSC，而細胞培養上清促進骨髓瘤細胞SKO007增殖。MM患者骨髓MSC表型和增殖分化功能與正常MSC相當，這提示骨髓MSC在MM病人體內受到骨髓瘤細胞的直接刺激作用后，高表達IL-6和SCF，并以旁分泌的形式維系瘤細胞的惡性表征，從而間接影響成骨和骨吸收過程，這可能是骨髓瘤并發骨疾病的原因之一。
總之，多發性骨髓瘤病人骨髓MSC生物學性狀與正常骨髓MSC比較無明顯變化，而其高表達IL-6與SCF可能與骨髓瘤細胞的直接作用有關。本實驗研究了骨髓瘤MSC的表型、增殖分化、功能等特征，其結果為MM骨損傷的發生機制及其干預治療等的研究提供了重要信息。
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細胞生物學特性范文2
1.1細胞活力測定
采用Trypanblue拒染試驗檢測凍存前及復蘇后細胞的存活率。將待檢細胞制成細胞懸液，取細胞懸液與04％臺盼藍溶液以9∶1混合均勻（使臺盼藍溶液終濃度為004％），3min后觀察，并用血球計數板計數。鏡下觀察可見健康活細胞胞體完整、細胞透明、不著色，凡著色呈藍色者均為死細胞。計數1000個細胞，計算細胞活率。
1.2生長曲線繪制
向24孔培養板每孔內接種1mL密度約為1×104個／mL細胞，從接種之日算起，每隔24h計數2個孔內的細胞密度，算出平均值，連續測定12d，以培養時間為橫坐標，以細胞密度為縱坐標，繪制細胞生長曲線。
1.3細胞染色體分析
選取第4代生長良好的新生昆明犬成纖維細胞，按照常規方法［9］進行染色體制片，Gimesa染色后選擇染色體分散與形態良好的分裂相在油鏡下觀察拍照，作核型圖，對50～100個分裂中期細胞進行染色體數目統計。
2結果與分析
2.1細胞的形態學觀察
新生昆明犬耳緣皮膚組織經膠原酶分離培養3～4d后，鏡下觀察可見有少數細胞沿組織塊邊緣慢慢貼壁伸展，細胞形狀不規則，且其組織塊的生長暈形成時間較長。經8～10d培養才出現大量成片生長的優勢細胞，此時觀察細胞的形態呈長梭形、多角形或扁平星形，為典型的成纖維細胞形態。后再經3～4d細胞生長至匯合，并長滿整個細胞培養瓶表面（圖1A），此時可進行傳代和凍存。傳代后的細胞生長旺盛，在形態上與原代細胞無明顯差異，經2～3d即可長至近100％匯合，此時細胞呈放射狀或渦旋狀走勢（圖1B）。待傳代時，加入消化液后顯微鏡下可見細胞回縮，呈圓形（圖1C）。
2.2成纖維細胞凍存前和復蘇后的活
耳部成纖維細胞凍存前和復蘇后的活率分別為933％，908％（圖2）。凍存前與復蘇后的細胞存活率差異不顯著（P＞005），說明原代細胞和傳代細胞生長狀態良好，培養條件適宜，且凍存和復蘇的過程對細胞活力狀況損害較小。
2.3生長曲線
根據昆明犬耳部成纖維細胞接種于24孔板連續培養12d的細胞計數情況，繪制出了成纖維細胞的生長曲線（圖3）。昆明犬耳部成纖維細胞的生長曲線呈典型的“S”形，即經過了潛伏生長期、對數生長期、平臺期以及衰亡期。其表現為1～2d的潛伏生長期細胞總數基本保持不變，從第3天起，細胞數量開始增加，3～8d左右細胞明顯地進入對數生長期，細胞數量快速增長，第8～9天，細胞由于缺乏足夠生長空間而增長放緩，開始進入平臺期。第9天后，由于細胞數量的急劇增加、生長空間的極大限制，經過短暫的平臺期后，細胞發生接觸抑制快速進入衰亡期，細胞生長幾乎停止，隨后細胞逐漸脫落死亡，此時鏡下可見有大量凋亡細胞漂浮。由生長曲線上的數據分析，耳部成纖維細胞群體倍增時間約為32h。
2.4核型觀察分析
昆明犬耳部成纖維細胞中期染色體分裂相與核型分析如圖4所示：染色體數目2n＝78（XX）。計數80個4代細胞的染色體數目，總數2n＝78的細胞數約占總細胞數的90％，達到了建立細胞系75％～80％的要求，說明所建細胞系為穩定的二倍體細胞系。39對染色體中有38對常染色體均為端著絲粒（T）染色體，長度逐漸遞減；性染色體X，Y均為中央著絲粒（M），X染色體的長度最大。
3討論
目前，國內已有一些研究報道建立了比格犬胎兒成纖維細胞系［10］、德國牧羊犬耳部和腹部成纖維細胞系［11］及雜交犬皮膚成纖維細胞系［12］等，但利用犬類的這些細胞遺傳資源進行更加廣泛深入的研究（如醫療和動物模型的建立、體細胞克隆等）還十分欠缺。在國外，已有較多使用所建立的犬胎兒或成體成纖維細胞系進行體細胞核移植（SCNT）的研究［13－16］。值得注意的是，在警用工作犬領域，7頭世界首批體細胞克隆警犬于2007年底在韓國誕生［17］，2009年韓國克隆專家根據美國911英雄警犬“特拉克”的遺傳信息，再次利用體細胞克隆技術成功獲得了5頭牧羊犬（http：／／wwwcnwnewscom／html／tech／cnkpzs／20090621／122171html）。LEE等［18］將曾服役于韓國國家緊急事務管理署（NEMA）具有6年全球救援經驗的退役搜救犬進行克隆，最終獲得2頭克隆犬。這些克隆后代中大多數工作犬已服役并具備與父輩同樣卓越的工作性能。同時，OH等［19］的研究也表明，利用SCNT技術將能使一頭優秀的檢驗檢疫犬復制出一群同樣優秀的檢驗檢疫犬。體細胞克隆技術最大的優勢在于克隆出生的動物與供體細胞來源的動物具有幾乎100％相同的基因，即能完全保持親代優異的先天特質。要成為一只優秀的警犬，就必須要具備高智商、敏銳的嗅覺、良好的親和能力等警犬所必備的各種特質。按照傳統的警犬繁育方式，培育出一頭優秀警犬至少需要3～4年時間，花費約10萬元，期間要消耗大量的人力、物力和時間，且培訓的優秀率低，不超過12％；而要培養出一頭功勛級的警犬需要付出的代價就更大，最少需數10人，4～5年時間，約50萬元的費用，且培養出一頭功勛級警犬的效率很低，約8‰。而動物體細胞克隆技術可以批量復制優秀、功勛級的警犬，可以大大降低培育成本，提高培養功勛警犬的培育效率。因此，體細胞核移植技術在警犬繁育中具有廣闊的應用前景。然而，體細胞核移植技術首先必須要解決的是供體細胞的來源和體細胞分離培養的問題。本研究利用膠原酶消化法建立了新生昆明犬耳部成纖維細胞系，并對其體外培養的生物學特性也進行了初步的分析與探討。在動物成纖維細胞的體外分離培養中，分離組織可以取自胎兒、新生幼仔及成體動物［20－22］。其中，胎兒取材不僅難度大、成本高，且對優良品種的保存也十分不利。相反地，新生幼仔或成體動物耳部、腹部及腹股溝等部位皮膚組織的取材則顯得十分便捷，且不影響動物的健康成長。本試驗取材自新生昆明犬耳緣皮膚組織（＜1cm2），對于新生仔犬，其傷口愈合快、皮膚組織修復能力強，應激性小且容易護理。另外，新生幼犬較成犬組織分化程度低，其成纖維細胞理論上應具有較強的增殖能力、易培養及適于進行相關基因操作研究。本試驗所建立的新生昆明犬耳部成纖維細胞具有典型的成纖維細胞形態，如細胞呈梭形或星形，當生長至匯合時細胞會平行排列，呈渦旋狀和放射狀生長。其凍存前和復蘇后存活率差異不顯著（P＞005），細胞復蘇后增殖快、生命力旺盛，且形態未發生變化。這表明凍存和復蘇過程中的各項條件對細胞活力影響較小，試驗中采用的凍存和復蘇的方法是可行的。
細胞生物學特性范文3
【摘要】 目的 建立次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶（HGPRT）基因缺陷型骨肉瘤細胞系LM9，進行細胞形態、生長特性及致瘤性等生物學特性檢測。方法 應用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）誘導骨肉瘤細胞系LM8突變，用8-單雜鳥嘌呤（8-AG）篩選HGPRT基因缺陷型骨肉瘤細胞系LM9；觀察細胞形態、細胞核型分析、細胞生長周期等生物特性，接種C3h鼠觀察致瘤性。結果 突變后細胞仍具有典型的成骨肉瘤細胞特征，細胞異型性明顯，染色體眾數為64-66，接種鼠具有成瘤性，成瘤率為100%。結論 本實驗建立了HGPRT基因缺陷型骨肉瘤細胞系LM9，具有典型的鼠源性骨肉瘤細胞特征，可用于雜交瘤、腫瘤疫苗等多方面的研究，是一個較好的實驗工具。
【關鍵詞】 次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶基因缺陷型 骨肉瘤 細胞系
The establishment of hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase-genedefect osteosarcomma cell lineage and assessment of its biological characteristics
【Abstract】 Objective To establish the HGPRT-defect osteosarcoma cell lineage，and determine the ability of sarcomagenesis and fusion.Methods N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG) was used to induce the mutation of an osteosarcoma cell lineage(LM8)，then culturing mixed with 8-azaguanine killed those cells of HGPRT positive，We got the HGPRT-defect osteosarcoma cell lineage LM9. The LM9 cells were observed on cells biology characteristic such as morphous and cell cycles biology inoculated into mice and their growths were surveyed in the mice.Results The LM9 cell lineage has typical characteristics of osteosarcoma cells and it is sarcomagenic to C3h mice.Conclusion The LM9 cells lineage was obtained by method of mutation， it is typical of osteosarcoma cells characteristics and has a prospect of being used in tumor vaccine and other researches.
【Key words】 HGPRT-defect osteosarcoma cell lineage
腫瘤的免疫治療是以激發和增強機體的免疫功能，以達到控制和殺滅腫瘤細胞的目的。常將其作為一種輔助療法與手術、化療、放療等常規療法聯合應用。先用常規療法清掃大量的腫瘤細胞后，再用免疫療法清除殘存的腫瘤細胞，可提高腫瘤治療的效果［1］。建立各種腫瘤細胞系是研究腫瘤細胞生物學特性有力工具，本文構想建立一種HGPRT基因突變型的骨肉瘤細胞系，它具有原親本瘤細胞的免疫原性而在代謝上有較大的改變［2］，根據這一特性，可利用它更有效的進行細胞融合，篩選及制備腫瘤表面抗原多肽疫苗。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 骨肉瘤細胞 LM8細胞系購自Rich cell bank ，系C3h鼠源性骨肉瘤細胞系，含100ml/L小牛血清的RPMI 1640完全培養液放在37℃，50ml/L CO2孵箱中培養，對數生長期時，用2.5mg/L的胰酶（含2mg/L的EDTA）消化、離心、調整細胞數后傳代、接種。
1.1.2 動物及飼養 4～6周齡C3h鼠8只（第四軍醫大學實驗動物中心提供），雌性，體重17～25g。
1.2 方法
1.2.1 致突變及篩選 LM8系細胞取對數生長期1.0×106/瓶，單層，培養基為RPMI 1640，向瓶中加入2μg/ml的MNNG完全培養液作用15h后，除去致突變液，用PBS沖洗，胰蛋白酶(0.05%)+EDTA(0.02%)1:1混合消化，制備細胞懸液，接種1×103/瓶，培養10天，細胞生長匯合后，傳代，以3×103數/瓶密度繼續接種，24h后，向培養液中加10μg/ml的8-AG培養液，培養24h待細胞匯合，傳代，更換不含8-AG的篩選液培養基繼續培養，細胞接近半匯合時，凍存。
1.2.2 突變細胞系LM9鑒定 取對數生長期細胞LM8和LM9接種于培養瓶中，次日加入1% HAT完全營養篩選液，用倒置顯微鏡觀察細胞的生長情況。
細胞形態觀察：收集對數生長期細胞0.01M的PBS洗2次2000rpm×10min離心收集細胞，棄上清，以4%的pH7.4的戊二醛固定，按電鏡標本常規制備方法，進一步固定，包埋，超薄切片，鉛-鈾染色JEM-2000型投射電鏡觀察。
1.2.3 細胞生長特征 調整突變細胞濃度按1×104接種于24孔板，置37．5℃ 5%孵箱培養，每個樣品重復3次，連續計數8天，以培養時間為橫坐標，細胞數為縱坐標，繪制細胞的生長曲線。
1.2.4 流式細胞儀分析細胞周期測定 培養細胞以0.1M PBS液(pH7.4)洗2次，懸溶于190μg結合緩沖液中調整細胞濃度為1×106/ml，加10μl異硫氰酸熒光素(PTIC)標記的連接素(Amexin)和10μl的20mg/L的普匹碘氨（PI），混合均勻，避光室溫孵育10min，結合緩沖液洗1次后用 Couter Elite流式細胞儀（Coulter 公司）進行分析細胞周期情況。
1.2.5 體內致瘤性觀察 調整細胞濃度為5×105接種于10只小鼠右下肢皮下待皮下出新腫瘤結節時，按文獻［3］測量腫瘤大小并觀察動物存活情況。
2 結果
2.1 HGPRT基因缺陷型骨肉瘤細胞篩選 培養瓶中細胞經突變篩選后細胞呈明顯多角形態，細胞個體大而豐滿、整齊，有個別巨大的細胞，可見有核分裂相，細胞生長良好。
2.2 HGPRT基因缺陷型骨肉瘤細胞形態特征 光鏡下培養的細胞為多角形，核大可見分裂相，相差顯微鏡下細胞形態呈上皮樣排列，生長的單層細胞有重疊生長的能力，細胞成圓形或橢圓形，核大，胞漿深染，且相對較少，核1～2個，細胞異型性明顯，核絲分裂偶見，細胞呈彌散分布，組織屬惡性腫瘤（圖1）。
圖2 電鏡觀察細胞核大有異型性，核眼明顯，染色質分散，稍聚于核膜，胞漿較長，富含線粒體，溶酶體，線粒體腫大并增多，少量的粗面內質網，胞漿內有豐富的游離核糖體，細胞間排列緊密
2.4 HGPRT基因缺陷型骨肉瘤細胞鑒定 加入HAT后LM8 細胞生長良好，呈對數生長，第四天達到高峰，LM9 細胞在24h后即出現死亡，72h后細胞全部死亡。
2.5 HGPRT基因缺陷型骨肉瘤細胞生長曲線 見圖3。細胞第四天進入對數生長期，生長迅速。
2.6 HGPRT基因缺陷型骨肉瘤細胞生長周期 流式細胞儀測得細胞G1=53.5，G2=19.5，G1/G2=1.837，為亞三倍體細胞，符合腫瘤細胞的特點。
2.7 HGPRT基因缺陷型骨肉瘤細胞體內致瘤性 接種5×105的HGPRT基因缺陷型骨肉瘤細胞后腫瘤的生長如圖4，小鼠體內14天時全部成瘤，成瘤率為100％，隨著時間延長腫瘤體積不斷增加。
圖4 接種LM9細胞后C3h鼠腫瘤的生長情況
3 討論
腫瘤的免疫治療是以激發和增強機體的免疫功能，以達到控制和殺滅腫瘤細胞的目的。雖然目前已經建立了多種免疫方法，但治療的效果尚需進一步提高，給機體輸入具有抗原性的瘤苗，刺激機體免疫系統產生抗腫瘤免疫以治療腫瘤。該法應用的前提是腫瘤抗原能刺激機體產生免疫反應［4～6］。由于人腫瘤相關抗原的免疫原性很弱，不足以有效地刺激機體的免疫應答，因此單純用自身或同種腫瘤細胞作瘤苗治療腫瘤的效果不好。腫瘤免疫應答的主要效應細胞是TC細胞，TC細胞識別腫瘤表面的肽抗原（peptide）與MHCⅠ類分子的復合物，必需要有第二信號才能活化。這個第二信號可以由TC細胞表面的CD28分子與粘附分子B7的結合來提供。B7分子主要存在于活化的B細胞和抗原呈遞細胞表面。大多數腫瘤細胞由于沒有B7分子，因此腫瘤細胞雖具有肽抗原與MHCⅠ類分子的復合物，但由于不能提供第二信號，所以不能活化TC細胞［7，8］。因此腫瘤細胞與抗原提呈細胞的融合可以提供T細胞活化通路，這就為腫瘤疫苗的研制展示了光明的前景。
人和嚙齒類細胞的HGPRT基因位于X染色體上，該基因在兩性細胞中都呈半合子狀態（單倍性），它的基因產物為次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT），由2～4個蛋白亞單位組成，該酶能促次黃嘌呤和鳥嘌呤與磷酸核糖焦磷酸(PRPP)間的轉磷酸核糖基作用而生成一磷酸次黃苷(IMP)，這是細胞合成的補救途徑，但此酶特異性不強，也能把嘌呤擬似物6-巰基嘌呤(6-MP)和8-氮雜鳥嘌呤(8-AG)摻入DNA中引起細胞死亡，因此，當HGRPT基因突變時，細胞就表現為對6-MP或8-AG的抗性，在有6-MP或8-AG的條件下，它們能夠生存，而野生型細胞即能夠攝取6-MP或8-AG而死亡，以上特點是構成HGRPT突變細胞篩選的理論基礎［3］。
本實驗所篩選的突變細胞系，仍具有典型腫瘤細胞的生物學特性，細胞個體大而豐滿，整齊，有個別巨大的細胞，可見有核分裂相，細胞生長良好。細胞核異型性明顯，加入HAT后細胞在24h后即出現死亡，72h后細胞全部死亡。細胞周期G1/G2=1.837，為亞三倍體細胞，符合腫瘤細胞的特點。接種C3H小鼠體內14天后全部成瘤，成瘤率為100％。
HGPRT基因缺陷型骨肉瘤細胞由于HGRPT表達缺失，對HAT不敏感，能用HAT篩選出來。因此，在骨肉瘤細胞的免疫治療研究中可作為一種簡便的分離篩選手段。這種篩選方法以用于骨肉瘤細胞的融和，以篩選雜交瘤細胞，導致免疫學特性的變化，將有利于腫瘤細胞的更進一步的研究及研制更為有效的殺滅腫瘤細胞的生物治療方法。
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細胞生物學特性范文4
[關鍵詞] CIK細胞;擴增;殺傷活性
[中圖分類號] R392.12 [文獻標識碼] A [文章編號]1673-7210（2007）12（c）-019-03
The study of the expansion in vitro and its biological characteristics of cytokine-induced killer cells
WANG Jia-lie, MA Guo-qiang, BAO Li-qing, LIU Yan-ru
(Study Center of Respiratory Disease, Inner Mongolia Hospital, Huhhot010017,China)
[Abstract] Objective: To observe the proliferation ability in vitro and its biological characteristics of cytokine-induced killer cells. Methods: PBMCs were isolated with successive non-adhere method fromvenous blood ,then were induced to be cytokine-induced killer cells by ficoll density gradient centrifugation in the presence of IFN-γ，IL-1β，IL-2 and anti-CD3 antibody. LAK (lymphokine activated killer) cells were prepared as control. The proliferation ability of CIK cells was measured by calculation , the phenotype of CIK cells was analyzed by flow cytometry（FCM）and the killing tumor cell activity of CIK cells was tested with MTT method. Results: After 16 days of induction the proliferation rate of CIK cells reached a high peak, possessing strong proliferate ability with over 100 times expansion after 21 days culture; In comparison with LAK, CIK cells had no difference in early stage, but onday 18,21 the multiplicationability of CIK cells was higher than that of LAK cells markedly (P
[Key words] Cytokine-induced killer cells; Multiplication ability; Killing ability
細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer，CIK)是將人外周血單個核細胞(PBMC)在體外經過多種細胞因子作用后培養獲得的一群異質細胞。它同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子[1，2]，兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞的非MHC限制性殺瘤特點，被認為是增殖速度最快，殺瘤活性最強，殺瘤譜最廣的效應細胞。過繼性免疫治療是治療惡性腫瘤的一個重要輔助治療方法，用于過繼性免疫治療的免疫活性細胞必須具有較強的擴增力和殺傷性。本實驗通過對CIK細胞的體外培養及其生物學特性的研究，以尋求用于過繼免疫治療的高效免疫活性細胞。
1 材料與方法
1.1實驗材料
人外周血樣品取自中心血站12例健康成人自愿者的靜脈血50 ml。男6名，女6名，年齡20～50歲。人肺腺癌細胞株A-549購自南京凱基生物科技發展公司。
1.2主要試劑和儀器
RPMI1640培養基(美國GIBCO公司)；特級無支原體無熱源胎牛血清(美國TBD公司)；人淋巴細胞分離液(密度：1.077 g/cm3 ，TBD生物技術發展中心，天津)；二巰基乙醇(美國TBD公司)；臺盼藍（美國Sigma公司）；二甲亞砜（美國Sigma公司）；青霉素，鏈霉素（華北制藥有限公司）；胰蛋白酶（南京凱基生物科技發展公司）；乙醇、谷氨酰胺、PBS、EDTA等購自北京化學試劑公司；MTT試劑盒（南京凱基生物科技發展公司）；重組人白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素-2(IL-2)和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)(PEPROTECH公司)、CD3mAb（美國Stem Cell Technologies公司）；CD3-FITC（異硫氰酸熒光素）、CD4-PE（藻紅阮熒光素）、CD8-PE、CD3-FITC、CD56-PE和鼠抗人IgG熒光抗體（美國eBioscienc公司）；流式細胞儀(美國BD公司)；550酶標儀（美國Biorad公司）。
1.3實驗方法
1.3.1 PBMC的分離(密度梯度離心法)及LAK、CIK細胞的誘導將人外周抗凝血用淋巴細胞分離，吸取白膜層細胞即PBMC，PBS洗滌3遍，加入含10%無熱源胎牛血清RPMI1640（1 mmol/L丙酮酸鈉、2 mmol/L谷氨酞胺、10 mmol/L Hepes、89 mmol/L NaHC03、50 μmol/L巰基乙醇、0.1 mg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素培養基），調整細胞濃度，接種于25 cm2培養瓶中，1.0×107個/（10 ml?瓶)，置于37℃、5% CO2飽和濕度培養箱內靜置2 h，可見分為黏附于瓶壁的細胞和非黏附細胞。取非黏附細胞分成2組。LAK組:加入500 U/ml IL-2，每3天換液1次并補加500 U/ml IL-2。CIK組:第1天加入IFN-γ 1 000 U/ml、IL-1β10 U/ml，24 h后加入IL-2 100 U/ml、CD3mAb 50 ng/ml，此后每隔3 d換液1次，并補加IL-2及CD3mAb。
1.3.2LAK、CIK細胞表型的檢測在培養1，4，7，10，13，16，19，22 d取培養的細胞，用PBS洗滌兩遍，調整細胞濃度為5.0×106個/ml，取100 μl懸液加入流式專用試管中，加入FITC、PE標記的鼠抗人單克隆抗體CD3-FITC、CD4-PE、CD8-FITC、CD3-FITC、CD56-PE，對照為IgG1-FITC、IgG12PE，25℃下避光孵育0.5 h，用PBS液洗滌3遍，洗去多余的抗體。并用同型無關陰性抗體做對照，在流式細胞儀（美國BD公司）上檢測分析，至少分析1.0×105個細胞。
1.3.3 LAK、CIK細胞殺傷活性的檢測取對數生長期的肺癌細胞A-549作為靶細胞，用RPMI1640培養基稀釋成1.0×105個/（100 μl?孔），接種細胞于96孔培養板中，然后取出培養兩組效應細胞，把效應細胞加入靶細胞孔中混合，另設單獨靶細胞和效應細胞組，每組設3個復孔，放置培養箱中培養24 h，每孔加入MTT(5 mg/ml)測儀于570 nm處測OD值，按下面公式計算各組LAK的殺傷活性。
1.4統計學處理
數據采用SPSS12.0統計軟件包處理，數據以均數±標準差（x±s）表示，多個均數間使用單因素方差分析，兩樣本均數的比較用t檢驗，P
2 結果
2.1 CIK細胞的增殖情況
實驗表明PBMC在細胞因子作用下均能增殖，鏡下可見細胞飽滿透亮、聚集成團，呈集落樣生長。與LAK比較，在前期無明顯差異，至19、22 d時擴增能力顯著高于LAK細胞的擴增倍數(P
表1不同培養天數LAK、CIK細胞的增殖情況(x±s，倍)
2.2 CIK細胞的表型分析
用流式細胞儀分析細胞表型，結果顯示CIK細胞培養后，其主要效應細胞CD3+CD56+ 細胞較培養前顯著增加(P
與培養前比較，*P
2.3 CIK細胞的殺瘤活性
CIK細胞在培養至第13天即有較高的殺瘤活性，為61.17%，顯著高于LAK細胞的41.02%(P
與單純的LAK對照組比較，*P
3 討論
近年來惡性腫瘤的發病率呈逐年上升的趨勢，隨著細胞免疫學和分子生物學的發展，細胞免疫治療成為除化療、放療之外的又一重要輔助治療手段，副作用輕微，安全性較好[3]。過繼免疫治療(ALT)是惡性腫瘤生物治療的一個重要手段，是通過直接向腫瘤患者輸注具有抗腫瘤活性的免疫活性細胞，在體內發揮抗腫瘤作用，以此來達到治療腫瘤的目的。淋巴因子誘導的殺傷細胞（lymphokine activated killer，LAK）是由IL-2激活的殺傷細胞，具有廣譜殺傷腫瘤的細胞活性，其較早用于臨床腫瘤免疫治療并取得了一定療效。細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine induced killer，CIK)是一種非MHC限制性的高效溶解腫瘤的細胞毒性T細胞，其主要效應細胞表面既有T細胞表面標志CD3，也有NK細胞表面標志CD56[4，5]，因而兼有T淋巴細胞抗瘤活性和NK細胞非MHC限制性殺瘤的特點。CIK 細胞是一類非主要組織相容性復合物(MHC)和非T細胞受體(TCR)限制性的免疫活性細胞，在培養過程中，一些非活性細胞在多種細胞因子的共同刺激下，激活為有細胞毒作用的CIK 細胞。這些活性細胞發揮抗腫瘤作用的機制很可能是通過黏附分子LFA-1/I、CAM-1相互結合后，能夠分泌大量的BLT 酯酶的細胞質顆粒，這些顆粒能夠直接穿透封閉的靶細胞膜進行胞吐，從而導致腫瘤細胞的裂解[6]；同時，CIK細胞自身還能分泌IL-2、IL-6、TNF-α和GM-CSF等一些細胞因子，提高細胞毒作用。是目前最新、殺傷腫瘤效果最佳的生物免疫治療方法。Lanier于1986年首次發現這種異質細胞群(主要是CD3+CD56+細胞)，其在外周血淋巴細胞中的比例為1%～5%[7]。經過多年的實踐，科學家們找到了體外大量擴增CIK細胞的方法，即應用細胞因子IL-1β，IL-2，IFN- γ和CD3單抗共同培養產生CIK。我們在實驗中采取此方法，在分離外周血單個核細胞中先加IFN-γ，24 h后加入抗CD3單抗、IL-1β與IL-2，培養22 d，每3天換液和補加細胞因子，培養13 d時即有25%左右的細胞是CD3+CD56+細胞，具有典型的CIK細胞形態和生物學性狀。CIK具增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣、毒副作用小等優點，目前自體及異體外周血CIK細胞已被用于一些實體瘤和惡性血液病的治療，并取得了較好的療效。我們的實驗結果表明，與LAK 細胞相比，CIK細胞具有更強的增殖能力，培養至22 d時體系中總的細胞數可增加100多倍。用流式細胞儀分析細胞表型， 結果顯示CIK細胞培養后， 其主要效應細胞CD3+CD56+ 細胞較培養前顯著增加(P
綜上所述，本研究采用IFN-γ、抗CD3單抗、IL-1β和IL-2等多種細胞因子成功從健康人非貼壁PBMCs中誘導出大量的具有典型形態和免疫表型的CIK細胞，且具有較高的殺傷活性，為下一步臨床治療腫瘤奠定了基礎。
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細胞生物學特性范文5
【摘要】 目的： 研究人胃癌細胞SGC7901中多肽N乙酰氨基半乳糖轉移酶2 (ppGalNAcT2) 基因表達與腫瘤轉移相關基因MMP2，TGFβ1表達的相關性，以及對細胞增殖和形態生物學特性的影響。方法： 用兩個已構建好的反義表達載體轉染胃癌細胞SGC7901，通過G418篩選，建立一系列旨在封閉胃癌細胞SGC7901 ppGalNAcT2基因表達的亞細胞克隆。通過共聚焦顯微鏡，RTPCR檢測反義封閉ppGalNAcT2基因RNA表達后，胃癌細胞SGC7901中TGFβ1，MMP2表達水平，細胞增殖以及形態的變化。結果： 反義封閉ppGalNAcT2基因表達后， 胃癌細胞SGC7901 ppGalNAcT2的表達水平明顯降低，細胞的形態發生改變，分裂增殖減慢。結果還顯示，反義封閉ppGalNAcT2基因表達可使TGFβ1，MMP2基因在mRNA表達水平均增加，提示ppGalNAcT2基因表達可能對胃癌細胞SGC7901浸潤轉移產生影響。 結論： ppGalNAcT2可能在腫瘤的增殖、浸潤和轉移中發揮作用。
【關鍵詞】 SGC7901細胞； 多肽N乙酰氨基半乳糖轉移酶; 基質金屬蛋白酶; 轉化生長因子β1
［Abstract］ Objective: To study the effect on the cell proliferation and the level of MMP2 and TGFβ1 in the SGC7901 cells caused by antisense blocking ppGalNAcT2 gene expressionMethods： The antisense expressing vectors of two different length ppGalNAcT2 gene segments were constructed and transfected into SGC7901 cells.A series of subcellular clones aiming at blocking of ppGalNAcT2 gene expression of SGC7901 cells were established by G418 selection.After antisense blocking， the cells were first tested with fluorescent microscopy.Then the expression of ppGalNAcT2，MMP2 and TGFβ1 gene cells growth were studied with RTPCR.The effects of ppGalNAcT2 antisense RNA on the proliferation of SGC7901 cells were tested by MTT. Results： The results showed that ppGalNAcT2 level in SGC7901 cells was obviously redudced and the cell proliferation was slower after antisense blocking.It indicated that the blocking of ppGalNAcT2 gene expression had influence on SGC7901 cell proliferation.It was also revealed that the blocking of ppGalNAcT2 gene expression could increase the mRNA and protein level of MMP2 and TGFβ1. Conclusion： The result suggests that ppGalNAcT2 has an important role in the cell proliferation， invasion and metastasis of cancer.
［Key words］ SGC7901 cell; polypeptide Nacetylgalactosaminyltransferase; matrix metalloproteinase; transforming growth factorβ1
糖蛋白的糖鏈按照其連接方式的不同，分為兩大類：一類稱N連接型糖鏈，又稱N聚糖，主要存在于血漿蛋白和細胞膜及胞質的糖蛋白中。另一類稱O連接型糖鏈，又稱O聚糖，主要見于分泌液中的糖蛋白，俗稱黏蛋白［1］。腫瘤細胞含有富含O聚糖結構域的膜結合黏蛋白類糖蛋白，這些糖蛋白的基因表達具有細胞特異性并且在腫瘤細胞中常發生變異。有關糖基轉移酶的研究，以往人們較多地關注參與N糖苷鍵連接有關的酶，近年來隨著O糖基化相關酶新基因的發現和克隆，有關O糖基化產生的糖鏈結構和功能的研究受到廣泛重視。多肽:N乙酰氨基半乳糖轉移酶（polypeptide Nacetylgalactosaminyltransferase，ppGalNAcTs）是O糖鏈合成第一步的糖基轉移酶，ppGalNAcT2是該家族中組織分布及底物譜較廣的成員，很有可能是O糖鏈合成的限速酶，有著重要的生物學意義［2］。
為了深入研究ppGalNAcT2的生物學功能，我們成功地構建了ppGalNAcT2反義表達質粒載體，反義封閉ppGalNAcT2基因表達［3］；我們也成功地構建了ppGalNAcT2的RNA干擾真核表達載體，轉染SGC7901細胞得到穩定的ppGalNAcT2基因剔除細胞株［4］。為探討ppGalNAcT2在腫瘤細胞生長增殖及浸潤轉移中的作用，本研究將ppGalNAcT2反義重組載體運用脂質體介導轉染人胃癌細胞SGC7901，得到封閉胃癌細胞SGC7901細胞ppGalNAcT2基因表達的亞細胞克隆，并對其生長繁殖及浸潤轉移相關基因基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）和轉移生長因子β1（transforming growth factorβ1，TGFβ1）的表達進行了初步研究。
1 材料與方法
1.1 材 料
人胃癌細胞株SGC7901為本室保存。反義重組載體pEGFPFDT2和pEGFPFXT2由本室構建保存。RPMI1640培養基購自Gibco BRL公司， RTPCR試劑盒購于Promega公司，轉染試劑盒G418選擇性抗生素購于Roche公司。PCR引物為上海博亞公司合成。NBT/BCIP染色試劑盒為華美生物工程公司產品，antihTGFβ1、antihMMP2及βactin 單抗均為R&D公司產品。
1.2 方 法
1.2.1 重組質粒轉染SGC7901細胞 pEGFPFDT2和pEGFPFXT2重組載體分別是將T2全長序列1 716 bp和T2序列中的一片段753 bp經酶切后反向連接入pEGFPC1載體中，分別形成反義重組載體pEGFPFDT2和pEGFPFXT2。轉染前將SGC7901細胞接種于24孔板，加入不同濃度的G418觀察細胞的死亡情況，確定最低致死濃度。將處于對數生長期的SGC7901細胞接種于培養瓶(1×106/ml)，于37℃，5％CO2孵箱中孵育12 h后，按FUGENE6介導轉染貼壁細胞的方法，將純化的重組質粒和陰性空質粒轉染SGC7901細胞。72 h后加入G418溶液至終濃度為600 mg/L，培養2周左右直到出現抗G418細胞克隆。
1.2.2 共聚焦顯微鏡觀察 將蓋玻片置于6孔板中，把轉染過的細胞培養于其中，待細胞長到30%～40％的匯合度時棄去培養基，用PBS輕輕淋洗后，每孔加1 ml 4％低聚甲醛固定半小時后，吸出低聚甲醛，用PBS洗2遍，封片后置于共聚焦顯微鏡下觀察轉染進細胞的質粒所表達的GFP熒光。
1.2.3 細胞形態學觀察 將未轉染細胞、轉染空載體的細胞及轉染了反義重組載體pEGFPFDT2和pEGFPFXT2的細胞株分別命名為SGC7901，SGC79010，SGC7901FDT2，SGC7901FXT2，將4種細胞置于顯微鏡下，觀察其形態的變化，并拍照記錄。
1.2.4 相關基因的檢測 細胞總RNA的提取采用Trizol一步法。以所得到的細胞總RNA為模板，使用Promega公司的試劑盒進行RT反應，得到cDNA。選用βactin為內對照，以各種細胞株的總RNA的RT產物為模板同時進行PCR擴增，檢測轉染反義ppGalNAcT2的SGC7901細胞ppGalNAcT2，TGFβ1，MMP2等相關基因表達的變化。PCR反應條件是94℃預變性4 min， 94℃變性50 s，55℃退火50 s，72℃延伸90 s，35個循環，72℃再延伸10 min。PCR引物序列及預擴增片段長度如下（表1）。
1.2.5 MTT法檢測細胞增殖 取對數生長期細胞，胰酶消化成單個細胞懸液后，計數細胞，將細胞調整到一定濃度后，接種于96孔板上，每孔加200 μl細胞懸液，每隔24 h隨機取4孔，各加MTT 50 μl，5 h后小心吸去液體，加二甲基亞砜(DMSO) 150 μl，待顯色后轉移到酶標儀上測定光密度值(490 nm)。以第1天的光密度值為1以后各天顯示值為與第1天之比值，作生長曲線圖，觀察細胞增殖變化。
2 結 果
2.1 共聚焦顯微鏡觀察結果
在共聚焦顯微鏡下觀察到轉染后的細胞發出綠色熒光（圖1），并發現GFP綠色熒光都集中于胞質中，證實轉染成功。表1 PCR引物序列
2.2 轉基因細胞形態學觀察結果
熒光顯微鏡下可以看到轉染了反義RNA載體的細胞形態有所變化，相對于未轉染的細胞及轉染了空載體的細胞其形態更顯得梭長，提示轉染反義重組載體可能影響細胞的生長特性(圖2)。
2.3 轉移相關基因的變化
結果表明轉染了pEGFPFDT2和pEGFPFXT2細胞ppGalNAcT2的mRNA表達明顯降低，而TGFβ1和MMP2的mRNA表達水平均相對增加(圖3)。顯示ppGalNAcT2可能與腫瘤的浸潤轉移密切相關。
3 討 論
ppGalNAcT及其家族作為黏蛋白O糖基化的起始酶，可能與腫瘤的生長和轉移密切相關。我們觀察了ppGalNAcT2在8種腫瘤細胞中的表達譜后發現［3，5］，在人胃癌細胞株SGC7901中，ppGalNAcT2的表達較其他細胞要高。本研究通過轉染表達ppGalNAcT2反義RNA的質粒，成功獲得了ppGalNAcT2表達受抑制的人胃癌細胞克隆，為研究該基因在腫瘤發生發展中的作用提供了實驗模型。進一步的相關功能研究結果表明，轉染了ppGalNAcT2反義RNA的質粒的SGC7901細胞ppGalNAcT2 mRNA表達水平降低，TGFβ1，MMP2的mRNA表達水平均相對增加。由于TGFβ1，MMP2都與腫瘤的浸潤轉移及增殖相關，因此推測ppGalNAcT2與腫瘤的浸潤轉移及增殖密切關聯。
關于轉移瘤生長相關的細胞因子，近年來研究較多的有IGFⅡ，TGFβ，EGF，IL6等。TGFβ1基因被認為參與了信號轉導、細胞生長、轉化和腫瘤發生等過程，在許多腫瘤組織中高表達。TGFβ1可促進某些腫瘤細胞的局部浸潤或腹膜播散，并削弱免疫系統對腫瘤的排斥效應［6］。TGFβ mRNA表達受多種因素的影響，近年的研究發現TGFβ mRNA的水平升高似乎與高糖的程度呈正相關［7］，Ziyadeh等在體外研究中證實，高糖增強系膜細胞TGFβ mRNA的表達及活性，而在糖尿病研究中也發現非酶糖基化產物可促進TGFβ1 mRNA的表達。本研究中轉染了表達ppGalNAcT2反義RNA的質粒的SGC7901細胞TGFβ1的表達明顯高于未轉染的細胞和轉染空載的細胞。可能的原因是由于抑制了細胞內ppGalNAcT2的表達，酶促糖基化減少，而非酶糖基化增加，這樣同時增加了糖濃度和非酶糖基化產物。這兩個因素可促進TGFβ1 mRNA表達相對增加。而TGFβ1又與MMP的表達密切相關，TGFβ1能誘導人類細胞株轉錄出高水平的MMPs mRNA［8］。有報道稱，在轉基因小鼠的研究中發現TGFβ的過表達能抑制良性皮膚瘤的形成，而對于皮膚癌卻能促進其浸潤轉移，并證實是MMPs合成增加所致［9］。在本研究中，ppGalNAcT2反義RNA能抑制ppGalNAcT2的表達，而ppGalNAcT2表達水平的降低促進了TGFβ1的表達，進而可能促進MMPs的合成。
TGFβ1是具有雙重調節作用的因子，體外實驗證明TGFβ1是腫瘤細胞生長的主要負性調控因子，TGFβ1與細胞表面受體結合，通過p53和PRB的低能磷酸化，抑制cmyc的表達，使細胞分裂停止，抑制腫瘤細胞的生長［10，11］。在本研究中，推測ppGalNAcT2的減少導致TGFβ1的合成增加進而減慢了細胞的生長。
我們的工作還觀察到ppGalNAcT2對胃癌細胞SGC7901對細胞外基質成分的黏附能力有影響［12］，因而有關ppGalNAcT2在整體動物腫瘤生長、浸潤與轉移過程中的作用值得進一步研究。
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細胞生物學特性范文6
關鍵詞:細胞生物學;實驗教學;教學改革
醫學細胞生物學是當代醫學科學的基本構成，通過從個體、細胞、亞細胞和分子等水平對細胞生命現象的規律和本質進行探討，從而為個體發育、組織功能、疾病發展等生命現象及生物醫學問題的認識提供理論支撐和研究平臺［1］。而細胞生物學實驗是醫學細胞生物學課程不可忽略的實踐教學部分，與理論課程相輔相成。其作為理論教學的延續和補充，是一種無法被替代的教學形式。實驗課程在鞏固和加深對知識點理解的同時，也培養了學生基本的實驗技能，鍛煉了提出問題、思考問題和解決問題的能力，培養了創新思維和專業素養，符合現代高等人才培養要求和教學改革的主流思路。醫學細胞生物學和細胞生物學實驗聯合開展，作為醫學本科生一年級的必修課程，是開啟醫學生涯的敲門磚。
1本校細胞生物學實驗教學現狀
細胞生物學實驗是最受學生喜愛的實驗課程之一。通過實踐操作，利用顯微系統可以直接將枯燥的理論知識形象、生動地展示在學生面前，有利于培養學習興趣，增加積極性，幫助快速且充分地理解一些文字難以具體描述的知識難點，并能夠實現理論知識的驗證和補充。學生普遍反映，多邊形的蟾蜍上皮細胞、橢圓形的肝細胞、不規則的細胞等、各類細胞的直觀呈現對他們產生了很大的刺激，不僅加深了對細胞結構形態與功能之間相互關系的理解，同時滿足了其自我成就感，增強了自信心。現階段，我校細胞生物學實驗教學包含了顯微鏡的使用、細胞基本形態觀察、細胞生理、細胞化學、細胞融合、細胞分裂、染色體制備和細胞培養等內容，課程設置主要以基礎性實驗為主，實驗類型單一(表1)。在多媒體教學改革的背景下，采用安裝顯微數碼互動教學系統是我校重點學科建設的一大喜事。顯微數碼互動教學系統利用網絡手段，將學生顯微鏡和教師顯微鏡連接成一體，突破了傳統的“點對點”教學模式，初步實現了“點對面”教學。教師可以通過多媒體對學生進行實時監察，減輕了工作強度，還提高了解決學生問題的效率。學生與教師的互動和雙向交流得到了很大程度的提高［2］。但是，由于系統終端連接數量的限制、系統成像清晰度局限、學生數量的壯大、傳統教學方式的固化思想、數碼互動教學作用發揮受限等因素，教學過程中仍存在一些問題。例如，學生顯微鏡下的視野無法高質量地投影到大屏幕，使得教學質量大幅度下降。特別是進行細胞細微結構定位分析的實驗，學生顯微視野下可清晰看到口腔上皮細胞經中性紅－詹那斯綠B染色后，細胞核呈紅色，核周圍存在較多亮綠色的線粒體顆粒，但由于拍照系統和投影的局限，大屏幕上無法清晰分辨出線粒體。大班教學模式中，1名教師帶領40名學生進行實驗，即使利用數碼互動系統，還是無法兼顧到所有學生，難免出現課堂偷懶、課下抄襲紙質實驗報告等不良現象。
2細胞生物學實驗教學改革思路
2．1創新教學模式
在傳統封閉教學模式下，學生只是在規定的時間進入實驗室，在教師的講解下，按部就班進行規范化、簡單化的實驗［3］。該模式下，學生盲目地“依方抓藥”，對實驗的掌握程度不高，對實驗內容、原理缺乏理解，導致對實驗結果的分析也無法精確到位，同時學生能動性降低，自主創新能力難以得到培養。創新教學模式下，開放實驗室，安排學生參與教學前準備，進行課前5min準備工作的展示和分享。參與教學前準備與課前展示，一是加強學生對實驗和科學研究的整體認識，促進學生對實驗原理和實驗技術的掌握。二是調動學生對實驗設計進行思考，形成學生主動查閱文獻、分析資料的良好狀態。三是鍛煉學生演講和表達能力，培養學生的思考能力和自主性。翻轉課堂是提高學生自主能力的另一有效手段［4］。經過多次參與教學前準備和課前展示，學生初步掌握了基本的專業知識和掌握實驗設計的一般方法。在此基礎上，采用翻轉課堂的教學模式，由教師提前告知學生實驗內容。學生以小組為單位，通過查找資料，自行設計實驗，進行課前準備和具體操作，并記錄實驗結果，撰寫實驗報告(表2)。最后在教師的指導下，討論并解決實驗中遇到的困難和分析討論實驗結果。翻轉課堂使學生成為了教學活動的主體，加強學生的主動求知欲，調動科研熱情，塑造自信心。此外，從教師角度出發，翻轉課堂是一種新的挑戰，它賦予了教師新的身份。教師成為教學活動的引導者。這對教師的教學能力和責任心提出了進一步的要求。因此，翻轉課堂不失為加強師資隊伍建設、增強教師自身素養的一劑良方。
2．2優化考核方式
當前醫學細胞生物學課程考核方式由理論考核和實驗課平時成績兩部分組成。實驗平時成績占比10%，主要根據學生的實驗報告和實驗操作表現來評定。而期末理論考核成績占比90%，采取閉卷考核形式，卷面試題涵蓋理論課程和實驗課程兩方面，各自占比為90%和10%。這種考核體系缺乏科學性，無法公正、客觀地對學生的學習效果和學習的能動性進行評價。不乏學生仍然采取傳統的應試考試方式，通過題庫刷題和考前突擊背誦重點而取得高分成績，實際上對知識點并未理解到位，未構建基本的知識框架，僅僅形成應付考試的短時記憶。因此，我們可以將理論課程和實驗課程分開獨立考核。理論課程考核由平時課堂的問題回答、期中測試和期末理論考核來綜合評定。而實驗考核采取動態考核方法，注重對學生學習態度的引導以及科研素質和知識運用能力的培養。實驗課考核不合格，給予一次重考和補修機會。實驗考核成績分3部分:平時成績、課前展示與實驗結果分析討論和實驗考核。平時成績占15%，由教師根據平時考勤、實驗課操作表現和實驗報告記錄情況等綜合表現進行評定。課前展示與實驗結果分析討論占35%，由學生與教師根據學生的講解和匯報的具體表現，進行客觀、公正的學生自評和教員打分，最后取平均分。實驗考核占50%，考核環節采取抽題回答和具體實驗操作來體現，問答題以實驗設計、結果討論分析和實驗問題解決方法為主，主要加強對實驗原理、基本操作流程、重點操作細節和實驗結果分析的考查，達到實踐、思考和創新能力的提高。
2．3完善課程設置
傳統的細胞生物學實驗以單一的基礎性實驗為主，教學內容陳舊，與時展脫節［5］。對實驗內容進行改革，去粕取精，將科研工作引入教學，增設綜合性實驗和創新性實驗(表2)。例如，細胞分裂實驗可以從原始簡單的馬蛔蟲子宮和洋蔥根尖切片觀察改變為利用免疫熒光技術對染色質和細胞骨架進行顏色標記，觀察細胞分裂的動態過程，而傳統的馬蛔蟲子宮切片和洋蔥根尖切片通過新媒體投影，以視頻圖片的形式展示，設計分裂時期判斷的問題，通過教師提問、學生回答的模式展開。該模式不僅豐富了實驗內容，增加課堂互動，且在引導學生運用理論知識的同時還引入了細胞時空動態特性的概念。細胞培養實驗由簡單的傳代培養改變為細胞培養綜合性大實驗，包含細胞復蘇、傳代、凍存、細胞形態觀察、細胞大小測量、細胞計數、活力測定和細胞衰老相關半乳糖苷酶活力鑒定等內容，讓學生走進當代細胞生物學實驗技術，充分體驗科學研究的樂趣和價值。
