前言：尋找寫作靈感？中文期刊網用心挑選的下瘀血湯對肝癌細胞生物活性的影響，希望能為您的閱讀和創作帶來靈感，歡迎大家閱讀并分享。
摘要：研究下瘀血湯對肝癌細胞的作用以及對 Ｎａｎｏｇ信號通路的影響。方法：將 ＨｅｐＧ２細胞分為空白血清組、低劑 量含藥血清組、中劑量含藥血清組；高劑量含藥血清組，通過 ＭＴＴ、流式細胞儀、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ測肝癌細胞增殖、凋亡及侵襲情 況，實時 ＰＣＲ、蛋白質印跡法測 ＮａｎｏｇｍＲＮＡ、Ｂｃｌ ２、胱天蛋白酶 ３水平。結果：空白血清組肝癌細胞的 ＯＤ值及侵襲數量 高于中劑量、高劑量含藥血清組（Ｐ＜０ ０５），肝癌細胞凋亡率低于低劑量、中劑量、高劑量含藥血清組（Ｐ＜０ ０５），高劑量 含藥血清組肝癌細胞 ＯＤ值及侵襲數量最少、凋亡最高；空白血清組肝癌細胞中 ＮａｎｏｇｍＲＮＡ及 Ｂｃｌ ２蛋白表達高于低劑 量、中劑量、高劑量含藥血清組（Ｐ＜０ ０５），胱天蛋白酶 ３的蛋白表達水平低于低劑量、中劑量、高劑量含藥血清組（Ｐ＜ ０ ０５），與低劑量、中劑量劑量含藥血清組比較，高劑量含藥血清組肝癌細胞中 ＮａｎｏｇｍＲＮＡ及 Ｂｃｌ ２蛋白表達明顯降低 （Ｐ＜０ ０５），胱天蛋白酶 ３蛋白表達顯著升高（Ｐ＜０ ０５）。結論：下瘀血湯通可抑制肝癌細胞的活性及其侵襲力、促進癌 細胞的凋亡，其作用機制可能調控與 Ｎａｎｏｇ信號通路，從而促進胱天蛋白酶 ３的表達、抑制 Ｂｃｌ ２水平有關。
關鍵詞 ：下瘀血湯；肝癌細胞；Ｎａｎｏｇ信號通路；肝癌細胞活性；肝癌細胞凋亡；肝癌細胞侵襲；Ｂ細胞淋巴瘤 ２；胱天蛋白酶 ３
肝癌是一種發生在肝臟的惡性腫瘤，其發病率 較高，致死人數較多。據相關數據統計表明，世界上 每年約 ６０萬人患肝癌，在我國，患有肝癌的人數占 全世界的 ５０％之多［ １ ２］ 。早期肝癌患者無明顯的癥 狀，患者在檢查時多為中晚期，因此導致肝癌晚期患 者在 ５年內的生存率僅有 ５％［ ３ ４］ 。對于癌癥的治 療，我國目前主要以手術以及化療為主，但化療的耐 藥性較強，使得患者在的預后達不到理想目標。近 年來，中藥在臨床上對于治療肝癌具有一定的優勢， 中藥中下瘀血湯最早用于婦女產后淤血等，根據近 年來的實驗研究發現，下瘀血湯可抗肝纖維化、防治 肝硬化［ ５ ６］ 。下瘀血湯由生大黃、桃仁、錎蟲等多為中藥組成，周岱翰教授運用下瘀血湯治療肝癌積累 了豐富經驗［ ７］ 。Ｎａｎｏｇ（胚胎干細胞轉錄因子）是一 種與干細胞特性相關的轉錄因子，近年來研究表明， 癌細胞中的干細胞樣特性（為高表達干細胞相關基 因特征）與腫瘤的惡性發展及預后聯系密切，因此 Ｎａｎｏｇ在腫瘤中的作用引起了醫學界的重視［ ８ ９］ 。 至今，在前列腺癌等多種癌癥中均發現 Ｎａｎｏｇ的表 達異常，在 肺 癌 細 胞 體 內 成 瘤 的 過 程 中 也 發 現 Ｎａｎｏｇ的異常表達［ １０ １１］ ，但對于癌細胞活性的具體 作用機制目前為止尚不明確，因此本研究探討下瘀 血湯對肝癌細胞的作用及對 Ｎａｎｏｇ的影響。
１ 材料與方法
１ .１ 材料
１ .１ .１ 動物 選取 １０只 ６～８周齡健康 ＳＤ大鼠， 雄性，體質量（０ １２±０ ０２）ｋｇ，購自上海西唐生物公 司（動物合格證號：粵檢證字第 ９５Ａ０８號）。常規飼 養，自由飲食飲水，飼養 １周后進行實驗。人肝癌細 胞 ＨｅｐＧ２來自廣州吉妮歐公司，置于 ３７℃、５％的 ＣＯ２培養箱內培養 ４ｈ，待細胞完全貼壁后，更換培 養液（１０％胎牛血清杜爾貝科改良伊格爾培養基 （Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ，ＤＭＥＭ）），待細 胞融合度到 ８０％～９０％時，傳代，吸棄培養基，磷酸 鹽緩沖液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）沖洗 ３次， 胰蛋白酶（０ ２５％）消化，完全培養基中斷。將剩余 貼壁細 胞 吹 打 脫 落，收 集 細 胞 懸 液 至 離 心 管 中 （１５ｍＬ）離心 ５ｍｉｎ，離心半徑 ８ｃｍ，１５００ｒ／ｍｉｎ。 去上清液，重懸，按 １∶３比例接種到新的培養瓶，作 好標記，繼續培養。取 ３～５代細胞用于實驗。本研 究已通過南方醫科大學珠江醫院醫學倫理委員批準 （倫理審批號：２０１７ ０７４）。 １. １. ２ 藥物 下瘀血湯：生大黃（四川商宇藥業公 司，批號：０７４１８０８０１），桃仁（上海哈靈公司，批號： １２０９５３ ２００７０５），錎 蟲 （廣 東 三 藍 公 司，批 號： Ｚ１９９９１１０１），由南方醫科大學珠江醫院中藥制劑室 煎制，濃度為每毫升含生藥量 ０ ４ｇ。 １ .１. ３ 試劑與儀器 ＤＭＥＭ培養液（上海吉諾生物 公司，貨號：ＣＭ０１０４），胎牛血清（杭州沃豐生物公 司，貨號：ＳＦＢＥ），酶標儀（上海閃譜科技公司，型號： ＲｅａｄＭａｘ１９００），流式細胞儀（賽默飛世爾科技生命 科學產品，型號：ＡｔｔｕｎｅＮｘＴ），胰蛋白酶（上海實維 儀器技術公司，型號：９００２ ０７ ７）。
１. ２ 方法
１. ２ .１ 分組與含藥血清制備 將培養的人肝癌細 胞 ＨｅｐＧ２采用數字隨機法分為空白血清組、低劑量含藥血清組、中劑量含藥血清組、高劑量含藥血清 組。１０只大鼠采用數字隨機法分為正常組及下瘀 血湯湯組，常規喂養，下瘀血湯組灌服（２２ １５ｇ／ｋｇ） 水煎濃縮液，正常組給予同等劑量蒸餾水灌胃，２ 次／ｄ，共干預 １周，最后一次灌胃 ２ｈ后，正常組及 下瘀血湯組大鼠均戊巴比妥麻醉（３％），心臟取血， 分離血清，－２０℃保存備用。 １. ２ .２ 下瘀血湯干預方法 空白血清組：正常細胞 在 １５０μＬ１０％大鼠空白血清培養基 ＋１３ ５ｍＬ無 血清培養基；低劑量含藥血清組：正常細胞在 ７５μＬ ２ ５％大鼠下瘀血湯含藥血清 ＋７５μＬ７ ５％大鼠空 白血清培養基 ＋１３ ５ｍＬ無血清培養基；中劑量含 藥血清組：正常細胞在 ７５μＬ５％大鼠下瘀血湯含藥 血清 ＋７５μＬ５％大鼠空白血清培養基 ＋１３ ５ｍＬ無 血清培養基；高劑量含藥血清組：正常細胞在１５０μＬ １０％大鼠下瘀血湯含藥血清 ＋１３ ５ｍＬ無血清培 養基。 １. ２. ３ 檢測指標與方法 １ .２ .３. １ ＭＴＴ檢測各組肝癌細胞活性 將各組癌 細胞（３×１０３個／孔）接種到 ９６孔板中，貼壁后饑餓 ２４ｈ，待細胞的密度培養到 ５０％時，更換培養基，加 入 ＭＴＴ于 ３７ ５℃，５％ＣＯ２下培養，４ｈ后離棄上清 液，加入 ＤＭＳＯ，采用酶標儀于 ４９０ｎｍ波長下測定 光密度 ＯＤ值。 １ .２. ３ .２ 實時 ＰＣＲ檢測各組 Ｎａｎｏｇ的表達 用 Ｔｒ ｉｚｏｌ裂解各組 ＨｅｐＧ２細胞，提取 ＲＮＡ并逆轉錄，將 逆轉后所得的 ｃＤＮＡ進行熒光反應實驗。擴增條件 為，９４℃預變性 ５ｍｉｎ后，９４℃ ３０ｓ，５５℃ ３０ｓ， ７２℃ １ｍｉｎ，共 ３５ｃｙｃｌｅ，７２℃延長 １０ｍｉｎ，以甘油 醛 ３ 磷酸脫氫酶（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３ ｐｈｏｓｐｈａｔｅＤｅｈｙ ｄｒｏｇｅｎａｓｅ，Ｇ３ＰＤＨ）為內參。引物序列見表 １。１ .２. ３ .３ 蛋白質印跡法檢測 Ｂｃｌ ２、胱天蛋白酶 ３ 的表達 將 ＨｅｐＧ２細胞細胞進行裂解并提取核蛋 白，并對核蛋白的濃度進行測量，分裝后，保存在零 下 ２０℃的環境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶 液進行混均，按照 ４∶１的比例進行電泳。后將蛋白 樣品（５０μｍ）轉移聚偏二氟乙烯（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅｆｌｕｏ ｒｉｄｅ，ＰＶＤＦ）膜上，脫脂奶粉封閉 １ｈ。加入 １抗按１∶１００稀釋后孵育過夜，ＴＴＢＳ漂洗 ３次，１０ｍｉｎ／次， 最后加入 ２抗對溶液稀釋，常溫封閉。取出 ＰＶＤＦ 膜，漂洗 １次／隔 １０ｍｉｎ，共 ３次，二氨基聯苯胺（３， ３′ ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ＤＡＢ）顯色后照相，后計算其蛋 白表達含量。 １. ２. ３ .４ 流失細胞儀檢測各組肝癌細胞的凋亡情 況 收集細胞（２×１０５／孔）接種于 ６孔板中，胰蛋白 酶消化，完全培養基終止；ＰＢＳ清洗，進行細胞計數， １２５０ｒ／ｍｉｎ，離心半徑 ８ｃｍ，離心 ６ｍｉｎ，棄上清，混 入 ５００μＬＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（結合緩沖液）重懸。加入 ５μＬＡｎｎｅｘｉｎＶ ＦＩＴＣ混勻、１０μＬ碘化丙啶（Ｐｒｏｐｉｄ ｉｕｍＩｏｄｉｄｅ，ＰＩ）混勻，室溫避光孵育 ５～１５ｍｉｎ，隨即 進行流式細胞儀檢測。 １ .２ .３ .５ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ法檢測各組肝癌細胞的侵襲力 各組 ＭＣＦ ７細胞接種與 ６孔板中，將 ５０ｍｇ／Ｌ 的基質膠稀釋后加入小室上層，３７℃下呈凝膠狀 態，細胞數目為 １×１０５／ｍＬ，上室中加入細胞懸液， 下室中加入少量胎牛血清培養基，３７ ５℃，培養２ｄ， 取出 培 養 基，拭 去 殘 留 細 胞，現 配 結 晶 紫，每 孔 ５００μＬ，將小室放入，２５℃染色 ３０ｍｉｎ，ＰＢＳ清洗 １ 次，晾干。顯微鏡觀察每個樣本連續選 ５清晰視野 進行數量統計，然后計算器平均數。
１ .３ 統計學方法
采用 ＳＰＳＳ２１ ０統計軟件進行 數據分析，采用單因素方差分析或重復測量方差分 析，計量資料采用均數 ±標準差（珋ｘ±ｓ）表示，以 Ｐ＜ ０ ０５為差異有統計學意義。
２ 結果
２ .１ 肝癌細胞活性比較
４組肝癌細胞 ＯＤ值隨著 時間的延長均有所增加，空白血清組與低劑量含藥 血清組在不同時間點的細胞活性均較為接近（Ｐ＞００５）空白血清組在 ２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ時 ＯＤ值均高于 中劑量、高 劑 量 含 藥 血 清 組，差 異 有 統 計 學 意 義 （Ｐ＜００１），低劑量含藥血清組、中劑量含藥血清 組、高劑量含藥血清組任意 ２組比較，差異有統計學 意義（Ｐ＜０ ０１）。見表 ２。
２ .２ 肝癌細胞中 ＮａｎｏｇｍＲＮＡ的表達結果比較
空白血清組肝癌細胞中ＮａｎｏｇｍＲＮＡ的水平高于低劑量、中劑量、高劑量含藥血清組，差異有統計 學意義（Ｐ＜００１），低劑量含藥血清組、中劑量含藥 血清組、高劑量含藥血清組任意 ２組肝癌細胞中 ＮａｎｏｇｍＲＮＡ的水平比較，差異有統計學意義（Ｐ＜０ ０１）。見表 ３。
２ .３ 肝癌細胞中 Ｂｃｌ２
胱天蛋白酶 ３蛋白表達結 果比較 空白血清組肝癌細胞中 Ｂｃｌ２的蛋白表達 水平高于低劑量、中劑量、高劑量含藥血清組（Ｐ＜００１），胱天蛋白酶 ３的蛋白表達水平低于低劑量、 中劑量、高劑量含藥血清組（Ｐ＜００１）；低劑量、中 劑量、高劑量含藥血清組 ３組肝癌細胞中 Ｂｃｌ ２、胱 天蛋白酶 ３蛋白任意 ２組比較，差異均有統計學意 義（Ｐ＜００１）。見圖 １、表 ４。
２. ４ 肝癌細胞凋亡率比較
空白組肝癌細胞凋亡 最少，隨著藥物劑量的增加肝癌細胞凋亡增加，Ｑ２ 與 Ｑ４相加顯示肝癌細胞凋亡數量。見圖 ２。空白 血清組肝癌細胞凋亡率與低劑量含藥血清組比較明 顯降低（Ｐ＜０ ０１），中劑量含藥血清組肝癌細胞凋 亡率高于低劑量含藥血清組（Ｐ＜０ ０１），與中劑量 含藥血清組比較，高劑量含藥血清組肝癌細胞凋亡 率顯著升高（Ｐ＜０ ０１）。見表 ５。
２. ５ 肝癌細胞侵襲能力比較
空白血清組肝癌細 胞的侵襲數量高于低劑量含藥血清組（Ｐ＜００１）， 中劑量含藥血清組肝癌細胞的侵襲數量低于低劑量 含藥血清組（Ｐ＜０ ０１），高劑量含藥血清組肝癌細 胞的侵襲數量最少，顯著低于其他 ３組（Ｐ＜０ ０１）。 見圖 ３、表 ６。
３ 討論
研究發現誘發肝癌因素有多種，如病毒性肝炎、 酒精性肝病等，患有乙肝、肝硬化患者肝癌發病率較 高［ １２］ 。肝癌干細胞是肝癌的起始細胞，是一種具有 很強的增殖分化能力的細胞，目前 Ｎａｎｏｇ是肝癌干 細胞的標志物，其對于干細胞的增殖分化等具有一 定的調控作用［ １３］ ，有關研究發現，肝癌干細胞的增 殖分化越強時，Ｎａｎｏｇ的表達水平越高，但目前為止 未發現有何中藥物可調控其的表達，本研究探討藥 物對 Ｎａｎｏｇ的影響以及對肝癌細胞的作用。 圖 ３ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ法檢測各組肝癌細胞侵襲力 （結晶紫染色，×４００） 表 ６ 各組細胞凋亡率比較（珋ｘ±ｓ，％） 組別 細胞凋亡率 空白血清組 ８２ ３５±７ ２６ 低劑量含藥血清組 ７５ １８±６ ７５中劑量含藥血清組 ６２２３±５８２高劑量含藥血清組 ５４２７±６ ５７注：與空白血清組比較，Ｐ＜０ ０１；與低劑量含藥血清組比 較，Ｐ＜０ ０１；與中劑量含藥血清組比較，Ｐ＜０ ０１ 下瘀血湯中大黃具有清瘀熱、活血化瘀等作用， 其性寒，藥性沉穩；桃仁具有去除瘀血的功效，善于 破除血滯［ １４］ ；下瘀血湯中大黃的有效成分大黃素根 據多種研究證實可阻礙多種腫瘤細胞的分化及增 殖。根據相關研究表明，下瘀血湯中的桃仁可抗血 栓、抗腫瘤等作用；土鱉蟲可破血逐瘀消積，具有促 進胃癌等癌細胞凋亡等作用。在耿燕楠［ １５］ 研究下 瘀血湯對胃癌細胞的實驗中表明，其可促進胃癌細 胞的凋亡并抑制其生長。根據張浩等［ １６］ 研究發現， 下瘀血湯通過下調核仁紡錘相關蛋白 １（Ｎｕｃｌｅｏｌａｒ Ｓｐｉｎｄｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＰｒｏｔｅｉｎ１，Ｎｕｓａｐ１）的表達進而阻 礙肝癌細胞的增殖，同時又促使肝癌細胞凋亡加速。 本研究的結果與上述研究結果相似。 肝癌干細胞具有自我復制、多項分化及自我增 殖的功能，在體外特定條件下培養可抑制其分化， Ｎａｎｏｇ可通過結合靶基因調控區，可有效的抑制其 分化基因的表達［ １７］ 。Ｎａｎｏｇ在肝癌細胞中水平生 升高是由于 Ｎａｎｏｇ具有自我分化分能力，在受到刺 激后表達增高可影響癌細胞發展進程，使其分化增 加，導致癌癥惡化。曾金敏等［ １８］ 研究 Ｎａｎｏｇ對膀胱 癌作用機制中發現，Ｎａｎｏｇ被沉默后基質金屬蛋白 酶 ２、基質金屬蛋白酶 ９的表達降低，且侵入到襯墊 ?６３７２? ＷＯＲＬＤＣＨＩＮＥＳＥＭＥＤＩＣＩＮＥ Ｏｃｔｏｂｅｒ．２０２２，Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．１９膜外側的 Ｔ２４細胞減少，其癌細胞侵襲力降低。楊 曉文等［ １９］ 對肝癌細胞的研究中提出，下調 Ｎａｎｏｇ的 水平，可抑制癌細胞的增殖。本研究與上述研究結 果相似，因此本研究認為，下瘀血湯可能是通過下調 Ｎａｎｏｇ水平減少癌細胞的活性。 Ｂｃｌ ２（Ｂ細胞淋巴瘤 ２）是凋亡抑制的標志物， 可聚集機體內突變的物質，促使癌細胞發生發展， Ｂｃｌ ２可通過 Ｐ２７來抑制細胞周期 Ｇ１／Ｓ轉換，具有 抑制細胞凋亡的作用［ ２０］ 。劉曉宇和張紅［ ２１］ 研究半 邊蓮煎劑對肝癌的作用及對肝癌中 Ｐ２７及 Ｂｃｌ ２的 影響時發現，半邊蓮煎劑可以抑制肝癌的發展，其作 用機制可能與半邊蓮抑制劑減弱了 Ｂｃｌ ２的表達、 提高了 Ｐ２７的表達有關。大黃是下瘀血湯中的一味 中藥材。孫瑋［ ２２］ 研究乳腺癌的研究中提出，大黃可 降低 Ｂｃｌ ２的水平，促進癌細胞的凋亡。 胱天蛋白酶 ３是由多腺苷二磷酸核糖聚合酶 及 ＡＰＤ 核糖組成細胞凋亡的執行蛋白酶，是一種凋 亡信號蛋白，對于細胞凋亡凋亡有正向促進作用，當 細胞凋亡時，多腺苷二磷酸核糖聚合酶的聯系被切 斷，使鋅指結構與催化區域分離，導致功能發揮異 常，加劇凋亡［ ２３］ 。孫媛和李青山［ ２４］ 等通過沙利度 胺聯合葉酸、氟尿嘧啶、奧沙利鉑（ＦｏｌｉｎｉｃＡｃｉｄＦｌｕ ｏｒｏｕｒａｃｉｌＯｘａｌｉｐｌａｔｉｎ，ＦＯＬＦＯＸ）促進了肝癌細胞凋亡 的研究發現，其作用機制與激活胱天蛋白酶 ３信號 通路有關。根據耿燕楠［ １５］ 的研究表明，下瘀血湯對 于胃癌裸鼠移植瘤生長抑制作用的研究發現，下瘀 血湯對胃癌裸鼠異種移植瘤的抑制率為 ３６５％，其 機制與調控胱天蛋白酶 ３、Ｂｃｌ ２蛋白表達有關，這與 本研究結果相似，說明下瘀血湯促進肝癌細胞凋亡可 能與下調 Ｂｃｌ２、提高胱天蛋白酶 ３的表達有關。 綜上所述，下瘀血湯通可抑制肝癌細胞的活性 及其侵襲能力、促進癌細胞的凋亡，其作用機制可能 調控與 Ｎａｎｏｇ信號通路，從而促進胱天蛋白酶 ３的 表達、抑制 Ｂｃｌ ２水平有關。
作者:莫國臻 黃關璇 石宇昕 吳秀芹 曹傳輝 單位:南方醫科大學珠江醫院