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液相色譜范文1
中圖分類號O657.7+2 文獻標識碼A 文章編號 1674-6708（2011）35-0084-02
0 引言
液質聯用技術是20世紀90年展起來的一門綜合性技術，液相色譜儀的高分離效能與質譜儀的高靈敏度、高選擇性使之成為科學研究與檢測領域強有力分析工具。液相色譜―質譜聯用儀廣泛應用于食品安全、藥品檢測和開發，農藥殘留、水質分析和蛋白質生物標志物的發現和驗證等工作。而液相色譜―質譜聯用儀的準確可靠是利用儀器進行科學試驗的前提；判斷儀器是否準確可靠就需要建立一套科學有效并且可行的校準方法。
目前，實驗室用液相色譜―質譜聯用儀主要由液相色譜和質譜儀兩部分組分；與液相色譜連接質譜計有單極，多極兩種。其中，液相色譜的作用是將分析樣品通過色譜柱進行分離；質譜儀的作用是將分離出的樣品轉化為運動的帶電氣態離子碎片，引入磁場并按質荷比（m/z）大小分離并記錄，其過程為可簡單描述為：
其中，z為電荷數，e為電子電荷，U為加速電壓，m為碎片質量，V為電子運動速度。質譜儀一般由進樣系統、電離源、質量分析器、真空系統和檢測系統構成。
1 計量特性
液相色譜―質譜聯用儀各項技術指標見表1：
2 校準條件
2.1 實驗室環境
1）儀器室內無強烈的機械振動和電磁干擾，不得存放與實驗無關的易燃、易爆和強腐蝕性氣體或試劑；
2）實驗室溫度：15℃~27℃；
3）實驗室濕度：75%RH。
2.2 標準物質和試劑
1）利血平（reserpine）：標準物質；
2）氯霉素（chloramphenicol）：標準物質；
3）乙腈（acetonitrile）：液相色譜級或同級別；
4）甲醇（methol）：液相色譜級或同級別；
5）聚乙二醇（polyehtylene glycols，縮寫為PEG）：色譜級或同級別；
6）乙酸銨（ammolun acetate）：色譜級或同級別。
2.3 校準設備
數字溫度計：測量范圍0℃~100℃，最小分度不大于0.1℃。
3 校準項目和校準方法
3.1 分辨力
儀器穩定后，執行Autotune命令進行自動調諧，檢查儀器質量偏差、分辨力及離子強度的變化是否達到規定的要求，直到調諧通過，打印調諧報告，得到半峰寬FWHM。
注：1）調諧液常見種類有PPG（聚丙烯醇）、PEG（聚乙二醇）和NaI（碘化鈉）等溶液，不同儀器廠商有不同的規定：同時，正負離子模式調諧可用不同配制的PPG溶液或PEG溶液等，具體調諧時可根據各儀器規定的要求執行；2）也可以采用手動調諧
3.2 質量范圍
在正離子模式下，以PEG（根據儀器規定的濃度配制）溶液為調諧校準物質，對儀器的+Q1（一級質譜正離子）、+Q3（三級質譜正離子）進行調諧，質量數設定達到2000以上，觀察儀器是否出現2000以上（含2000）的質譜峰。在負離子模式下，以NaI（根據儀器規定的濃度配制）溶液為調諧校正物質，對儀器的―Q1（一級質譜正離子）、―Q3（三級質譜負離子）進行調諧，質量數設定達到2000以上，觀察儀器是否出現2000以上（含2000）的質譜峰。
3.3 信噪比
3.3.1 ESI+源（ESI的正離子模式）
儀器調諧優化后，以200μL/min速度注入5μL濃度為1pg/μL的利血平溶液（溶劑為70:30的乙腈/水），采用MRM掃描方式，選擇離子對609-195（母離子為609，子離子為195）作為監測對象，連續測量3次，根據公式（1）計算其S/N，取平均值作為其信噪比。
S/N=H（609-195）/H噪聲 （1）
式中：H（609-195）為離子對609-195的峰高；
H噪聲為基線噪聲。
3.3.2 ESI-源（ESI的負離子模式）
參照2.3.1的條件，注入5μL濃度為0.5pg/μL的氯霉素溶液（溶劑為70:30的乙腈/水），采用MRM方式，選擇離子對321-152（母離子為321，子離子為152）連續測試3次，根據公式（1）計算S/N，取平均值作為其信噪比。
3.4 質量準確性
儀器調諧通過后，采用針泵進樣方式，以10μL/min速度注入5μL濃度為100ng/μLPEG1000溶液（溶劑為70：30的乙腈/水，溶劑含有2mmol/L 乙酸銨），通過離子掃描檢測出碎片離子1004.622u±0.05u準確質量數。每隔5min測量1次，測量6次，根據公式（2）計算其質量數的實測值與理論值之差，根據公式（3）計算標準偏差，以此評價質量準確性。
式中： ΔM為質量準確性，單位u；
Mi為離子質量數實測值，單位u；
為離子質量數測量平均值，單位u；
為離子質量數理論值，單位u；
S為離子質量數測量標準偏差，單位u。
3.5 測量重復性
3.5.1 ESI+源（ESI的正離子模式）
儀器優化后，選擇泵流速為200μL/min，色譜柱為C18，流動相為70：30的乙腈/水，注入5μL濃度為20pg/μL的利血平溶液（溶劑為70：30的乙腈/水，且溶劑含有2mmol/L乙酸銨），通過MRM掃描方式，選擇檢測對象為609-195離子對，測量6次，按質量色譜峰進行面積積分，根據公式（4）計算其RSD，以此評價重復性。
式中： RSD為相對標準偏差，%；
xi為第i次測量的峰面積；
為6次測量峰面積的算數平均值；
i為測量序號。
3.5.2 ESI-源（ESI的負離子模式）
儀器優化后，選擇泵流速為200μL/min，色譜柱為C18，流動相為70：30的乙腈/水，注入5μL濃度為20pg/μL的氯霉素溶液（溶劑為70：30的乙腈/水，且溶劑含有2mmol/L氯化銨），通過MRM掃描方式，選擇檢測對象為321-152離子對，測量6次，按質量色譜峰進行面積積分，根據公式（4）計算其RSD，以此評價重復性。
3.6 柱溫箱溫度控制
將數字溫度計探頭固定在柱溫箱內，選擇35℃和45℃（也可以根據用戶使用溫度設定）進行校準，按儀器說明書操作，通電升溫，待溫度穩定后，記下溫度計讀數并開始計時，以后沒每隔10min記錄一次讀數，共計7次，求出平均值。平均值與設定值之差為ΔTs，7次讀數最大值與最小值之差為控溫穩定性Tc。
4 校準的意義和周期
通過對液相色譜―質譜聯用儀的校準可以很好的控制在實驗分析過程中因使用的液相色譜―質譜聯用儀的精度誤差而帶來的分析誤差。提高實驗數據的真實性和準確性。
臺式液相色譜―質譜聯用儀的校準一般委托有相應資質的第三方校準機構進行校準。一般校準周期不超過2年。儀器使用維護人員可根據實際使用情況對周期進行調整。在更換重要部件、維修或對儀器性能有懷疑時，應隨時校準。
參考文獻
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[6]JJG705-2002 液相色譜儀檢定規程.
液相色譜范文2
液相色譜檢測技術在食品營養檢測中的作用
食品營養檢測是食品檢驗的一個重要部分，其中，對食品糖分、氨基酸以及維生素含量的檢測尤為重要。首先，糖分作為食品所含有的三大營養成分之一，能夠為人類活動提供很多能量，也是食品營養的一項主要指標。根據種類的不同，食品中含有的糖分種類和量也會有所不同，在食品營養檢測內容中，可以分為葡萄糖、果糖、蔗糖以及淀粉。糖分具有一定的還原性，且大多易溶于水，因此在進行食品糖分檢測時，某些參數常常無法保證準確性。而液相色譜檢測技術的應用，則能夠以其高靈敏度，將食品中碳水化合物的相關參數有效的測量出來，并對糖分質量評價提供準確依據。其二，氨基酸是生物生存必須具備的物質，氨基酸在人體內主要發展成的基礎性物質是蛋白質和酶。然而，由于蛋白質和酶的穩定性很差，容易因環境的改變而發生變化，所以對蛋白質和酶的有效檢測需要應用先進可靠的技術手段。液相色譜檢測技術流動相的范圍很廣泛，同時還具備良好的靈敏性，因此能夠在蛋白質和酶的參數檢測中起到很好的作用。其三，維生素不僅能夠為人體生產活動提供能量，還能在人體健康方面起到重要作用。人體的正?；顒有枰掷m補充維生素，否則很容易導致人體個別功能發生異常，甚至引起器官的病變。食品是人類獲取維生素的重要來源，可是過去對食品中維生素的檢驗手段卻非常落后，只能將食品中的維生素提取出來再進行檢驗，在這一過程中食品質量很容易發生變化，進而導致檢驗結果與實際不符。液相色譜檢測技術的應用則能夠比較精確地進行維生素檢測，不僅檢測流程大大簡化，還能有效排除各種干擾因素。
液相色譜檢測技術在食品添加劑檢測中的作用
在食品添加劑檢測中，對甜味劑和食用級色素的檢測是非常重要的組成部分。甜味劑一般是指提高食品甜味的添加劑，根據來源的不同，甜味劑可以分為天然甜味劑和人工合成甜味劑；根據其中包含的營養價值，可以分為營養型甜味劑和非營養型甜味劑；根據化學本質的不同，可以分為糖類甜味劑和非糖類甜味劑。甜味劑的種類很多，其中成本最低、使用方法最簡單的甜味劑是糖精鈉，在各種食品的制作中有非常廣泛的使用。但是，糖精鈉的攝入量如果過大，就會對人體造成不利影響。液相色譜檢測技術的應用，能夠將食品中糖精鈉等各類甜味劑的含量準確的測量出來，從而保證食品的質量安全。食用級色素是用于改變食品顏色的添加劑，并且人體可以適量攝入。食用級色素的化學本質與食用香精比較類似，既可以天然獲取，也能人工合成。天然食用色素提取自動植物，大多對人體沒有傷害。人工合成食用色素則是主要以苯胺燃料為原料制作而成，苯胺燃料分離自煤焦油，不僅能夠引發人體中毒，還有可能導致細胞的癌變，對人體的傷害很大。因此，液相色譜檢測技術的應用是非常有意義的，通過檢測，保證食品中的色素無害，保證食品安全。
液相色譜檢測技術在食品藥物殘留檢測中的作用
人們在種植農作物時，為了提高農作物的產量，會使用各類有機化學物質和農藥。這些化學物質和農藥在促進農作物生長方面能夠起到一定作用，不僅可以保證農作物的生長質量，還能有效提高農作物的產量。然而，這些化學物質和農藥在帶來好處的同時，還為食品安全帶來了一定的威脅。農藥是一種分子量大的一種有機化合物，而且難以降解，在使用后，會殘留在土壤、水以及植物體中，人們在食用相關的食品之后，農藥會逐漸在人體中累積，達到一定量后就會對人體的健康造成巨大危害。在食品農藥殘留量的檢測中，可以將液相色譜檢測與氣相色譜法相結合，不僅能夠定性的檢測出農藥的種類，還能定性的精確測量出農藥含量。在農作物的種植過程中，人們會使用農藥，而在動物的養殖中，則會使用獸藥。與農藥對農作物生長的作用類似，獸藥也能夠在一定程度上促進動物的生長發育，甚至縮短動物的生長周期。使用過獸藥的動物體內一般都會殘留有獸藥成分或者相關的代謝產物，這些物質都是對人體健康不利的，因此，對于動物食品中的獸藥檢測同樣是非常重要的。液相色譜檢測技術能夠有效檢測出諾氟沙星、環丙沙星以及恩諾沙星等多種抗生素藥物的存在，并精確的測量出藥物的殘留量。
液相色譜范文3
【關鍵詞】液相色譜法；葡萄酒；日落黃；胭脂紅
doi：10.3969j.issn.1004-7484（x.2013.10.758文章編號：1004-7484（2013-10-6195-01
日落黃與胭脂紅是人工合成的可食用色素，常被添加至各類飲品中以提高其色澤的鮮艷度與觀賞性。由于人工合成色素多用煤焦油作為原料制備而成，且制備工藝與水平參差不齊，導致其安全性普遍較差[1]。人工合成色素中的苯環、蒽環等對于人體具有毒害作用，長期使用會嚴重影響消費者的健康，因此我國對于人工合成色素的用量有嚴格的限制。葡萄酒中日落黃與胭脂紅的使用較為常見，對于含乙醇的飲品中日落黃與胭脂紅的含量測定主要采用液相色譜法[2]。本文通過液相色譜法對葡萄酒中的這兩種色素進行測定，具備準確、高效、靈敏、簡便等優點，最終取得了滿意的結果。
1資料與方法
1.1儀器與試劑本文所用高效液相色譜儀為島津公司生產的LC-20AT系列高效液相色譜儀，BT224s電子天平（德國賽多利斯公司，NeXpower1000超純水儀（韓國公司，日落黃（中科院：GBW（E100003a，胭脂紅（中科院：GBW（E100004a，甲醇（中國天津市康科德公司為色譜純，乙酸銨（中國天津市科密歐公司為分析純，水為超純水。
1.2色譜條件與標液的配制本文色譜柱為島津公司生產的C18柱（5um，150×4.6mm，流動相為甲醇-乙酸銨（0.02molL，流速為1.0mlmin，柱溫為32℃，檢測波長為509nm，洗脫方式如下：
標準溶液的配制方法為：準確稱取日落黃與胭脂紅各0.1000g，采用超純水溶解，定容至100ml，獲得1.0mgml的標準溶液。工作溶液為取上述標液進行稀釋，獲得1ugml、5ugml、10ugml、20ugml以及50ugml的工作液。
1.3樣品的前處理與測定準確稱取樣品5.00g，置于50ml燒杯中加熱以除去乙醇，將其轉移至25ml容量瓶中定容，過0.45um水系濾膜后，常規注入進樣瓶中準備進樣。根據保留時間定性，峰面積定量，定量方法采用外標法。
2結果
2.1線性與檢出限通過對混標工作液進行測試可得，在1.00-50.0uml范圍內，日落黃與胭脂紅的線性關系良好，日落黃回歸方程為y=59.032x-8.6513，線性相關系數為0.9999，胭脂紅的回歸方程為y=44.733x-6.452，線性相關系數為0.9999。以信噪比為SN=3計算檢出限可得，日落黃的檢出限為0.20mgkg，胭脂紅的檢出限為0.25mgkg。
2.2精密度與回收率取6份葡萄酒樣品，加入st1進行上機檢測可得，6次進樣結果的精密度分別為日落黃2.2%，胭脂紅1.5%，符合相關要求。選取高（st5、中（st3、低（st1三種濃度進行加樣回收可得，回收率為92.0%-98.8%，見表2。
3討論
3.1前處理方法的選擇本文選用水作為提取溶劑，其原因在于日落黃與胭脂紅均為水溶性色素，因此采用水提取即可獲得較高回收率。有研究顯示采取聚酰胺吸附法進行提取能夠獲得更好的回收率，且基質干擾較小[3]，但本文認為葡萄酒中所含基質較少，對于色譜柱的影響較小，因此采用一步提取法即可達到滿意的結果。
3.2色譜條件的優化本文檢測的兩種色素：日落黃與胭脂紅均屬于水溶性色素，具有較強的極性，因此在選擇色譜柱時采用反相色譜柱，以達到較好的分離效果[4]。在選擇流動相時，本文最初選擇了3對流動相：甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙酸銨，通過平行操作后，最終獲得甲醇-乙酸銨作為流動相的分離效果最佳。檢測波長最初設定為483nm，因為日落黃在481、483、486nm處均有最大吸收，但由于胭脂紅在509nm處的吸收較大，因此選擇509nm能夠完全滿足日落黃與胭脂紅均具有較大吸收。
3.3光譜優化本文所采用的紫外檢測器理論上可以采集波長為190-700nm的光譜圖，對于色譜峰的定性具有可靠性，且能夠有效避免單純憑借保留時間對待測物質進行定性的不準確性。本文選擇509nm的目的在于避開254nm以下波長，降低雜質的干擾，使得待測物質在低濃度的情況下仍能夠獲得良好匹配度。
4小結
本文認為該方法采用一步提取法對樣品進行前處理，能夠達到操作簡便、處理快速的優點。利用梯度洗脫的方式能夠使得檢測方法靈敏度更高，受雜質干擾更小。采用本法對葡萄酒中的色素進行分析，能夠使色譜峰良好分離，結果準確性高、可靠性佳、分析速度快。因此對于葡萄酒中的色素分析可以采用該方法，對于其他液體食品中人工合成色素的測定，該方法也具有一定的指導意義
參考文獻
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液相色譜范文4
【摘要】
目的建立鮮壁虎的高效液相色譜指紋圖譜，探討不同壁虎間的相似程度。方法采用高效液相色譜法分析鮮壁虎提取液中相關物質的保留時間和吸收強度，對6種壁虎樣品共有峰峰面積進行聚類。結果選定的色譜條件給出了較好的保留時間分布和吸收強度，建立起鮮壁虎的hplc指紋圖譜，聚類分析給出了相應結果。結論該hplc指紋圖譜可用于鑒定鮮壁虎，壁虎所含化學成分的多寡等因素與其品種相關。
【關鍵詞】 鮮無蹼壁虎 指紋圖譜 高效液相色譜法 聚類分析
abstract：objectiveto establish an hplc fingerprint of fresh gekko, and to discuss the similarity among gekkos. methodsthe retention time and absorption intensity of extracts of gekko were determined by hplc,peak area of six kinds of gekko samples’mutual peaks were applied to grade by hierarchical cluster analysis. resultsbetter distribution of retention time and absorption intensity were shown under the given chromatographic condition, the hplc fingerprint was established and the result of hierarchical cluster analysis was got. conclusionthe fresh gekko can be identified effectively and the chemical constituents of different gekko are related to the kinds.
key words：fresh gekko; fingerprint; hplc; hierarchical cluster analysis
壁虎（gekko）屬隸爬行綱有磷目蜥蜴亞目。我國現知有壁虎屬動物11種［1］。其性味咸、寒，有小毒，能夠祛風、定驚、散結、解毒，治中風癱瘓、歷節風痛、風痰驚癇、瘰疬、惡瘡、破傷風、癰瘡、胃嗝氣等癥。 現代 醫學認為壁虎對腫瘤、結核等疾病有確切療效［2～5］。近年來對壁虎抗腫瘤作用的基礎研究也有所報道［6，7］。筆者應用“壁虎散” 治療 肺癌等腫瘤療效顯著，且副作用很小，是潛在的可開發利用的抗腫瘤中藥品種。由于壁虎種類較多，它們體內所含的有效藥物成分的種類及含量的多寡均會有所不同。為保證研究中所用壁虎的種屬純正，建立壁虎的高效液相色譜指紋圖譜，用于對壁虎的鑒定具有重要的意義。
1 儀器與材料
1.1 儀器與試劑黃金系列通用ⅰ型高效液相色譜儀（126型泵，166型紫外-可見光檢測器，gold軟件；美國bechman公司）；ds-1高速組織搗碎機（上海標本模型廠）。色譜純乙腈（美國tedia公司），分析純95%乙醇。
1.2 藥材實驗所用壁虎的物種及來源見表1。壁虎均于9月從產地購買，并經當地藥檢所鑒定。表1 6種壁虎的種類及來源（略）
2 方法和結果
2.1 色譜條件層析柱：購自大連江申分離 科學 技術公司（瑞士 spherigel c18填料）， 4.6 mm×250 mm，5 μm粒度。流動相：a，亞沸水；b，乙腈。梯度洗脫：0～5 min，100% a，流速0.7ml/min ；5～ 6 min流速由0.7 ml/min升至1 ml/min；6～16 min，0～10% b；16～21 min，10～40% b；21～31 min，40 ～ 60% b；31～46 min，60～100% b；46～60 min，100% b。進樣量10 μl；檢測波長205 nm；室溫。
2.2 供試品的制備購買秋季捕捉的活壁虎，隨機選取14～15只（約50 g），在容器內放置72 h，以消化、排空壁虎體內的食物，蒸餾水清洗晾干后準確稱重，置入95％酒精致死，用搗碎機粉碎勻漿（轉速：10 000/ min），50 ml 95％酒精分兩次涮洗搗碎機，合并涮洗液以浸泡勻漿后的壁虎，不時搖動，浸泡24 h后抽濾；濾渣用50 ml 95％酒精再次浸泡提取，抽濾；合并兩次的提取液，定容于100 ml；置-2℃冰箱內保存；使用時，取一定量的樣品液經0.45 μm微孔濾膜過濾；當其溫度轉變為室溫后，以10 μl進樣分析。
濰坊干壁虎的處理：將捕捉到的濰坊活壁虎按常規方法制成干品；取15只干壁虎，用100ml 95％酒精浸泡1 d（軟化），用搗碎機粉碎勻漿（轉速：10000 r·min-1），用原酒繼續浸泡2 d，提取，抽濾；濾液經0.45μm微孔濾膜過濾，以10μl進樣分析。
2.3 方法學考察
2.3.1 檢測波長的確定由于業界對壁虎所含的有效藥物成分尚無系統的研究和分析，其有效藥物成分組成和結構尚不得而知，為了使壁虎乙醇提取液中所含有的物質能在紫外光檢測波長下被最大限度地檢出，宜選擇短波長進行檢測。在選用205，210，215，220 nm進行色譜分析后，對比所得色譜圖發現：除色譜吸收的強度隨波長增大而依次降低外，吸收峰的數量多寡無明顯改變，據此而確定205 nm為色譜參數，用于色譜檢測。
2.3.2 流動相及柱溫的確定實驗表明使用空調控制室溫，在22～26℃的溫度條件下，色譜峰的保留時間沒有明顯的變化，經5次在該溫度范圍內的測試，結果顯示色譜峰的保留時間、峰高、峰面積數據的rsd均小于1.2%，在室溫條件下的測試結果是可靠的。經采用不同的流動相梯度洗脫，方法中所述的梯度是最佳方案，尤其是方法開始的最初5 min以0.7 ml/min的流速進行洗脫可使保留時間較短（3～8 min）的物質得到較好的分離，滿足測試的需要。
2.3.3 穩定性考察取鮮無蹼壁虎的乙醇溶液測試品分別在0，6，12，24，36，48 h不同時間進行測試，考察色譜峰保留時間與吸收強度的一致性，如圖1中所標示的各指紋峰的保留時間與吸收強度的rsd均小于1.1%。
2.3.4 儀器精密度實驗在空調的設定溫度為24℃時，取測試品連續五次進樣，圖1中各指紋峰的保留時間、峰高及峰面積的rsd均小于0.6%。
2.3.5 重復性實驗取壁虎分4次制作供試品，分別進樣。結果顯示各指紋峰的保留時間、峰高及峰面積的rsd均小于1.6%。
2.4 色譜圖中選作指紋峰的保留時間區間范圍的確定
2.4.1 壁虎95％酒精提取液的后續處理采用濰坊壁虎作抗腫瘤藥用效果研究，勻漿后的壁虎用95％酒精連續浸泡提取5次，抽濾后，合并5次提取的抽濾液，在30℃下減壓蒸餾濃縮，除去其中的乙醇，獲得帶黃色固體沉淀以及脂肪物的水液；添加一倍體積的蒸餾水后，水液經正己烷和二氯甲烷分別各萃取4次，得黃色水溶液。水溶液在30℃下減壓蒸餾濃縮，凍干，得棕色浸膏狀物。浸膏狀物用95％酒精溶解，作硅膠柱層析，得各層析后樣品。
2.4.2 各水溶性樣品的抗腫瘤效果用各樣品以mtt法對hepg2和ct-26腫瘤細胞作體外抑瘤率實驗。其中棕色浸膏狀物濃度為5 mg/ml時，抑瘤率最高可達37%，硅膠柱層析得到的4#樣品，濃度為1 mg/ml時，抑瘤率最高可達49%，棕色浸膏狀物對小鼠作體內抑瘤實驗，通過腫瘤實體稱重對比，抑瘤率可達63%。體內、外抑瘤實驗均表明壁虎含活性較高的抗腫瘤有效藥物成分。
2.4.3 確定指紋峰的保留時間區間范圍通過上述各水溶性樣品進行相同色譜條件下的色譜分析，發現各色譜圖中的吸收峰的保留時間均在20 min以內，考慮到抗腫瘤有效成分是水溶性的（謝爽、王學美的研究也有同樣的結論［6，7］），故將保留時間在20 min以內作為選取指紋峰的時間界限。
2.5 聚類分析為進行各種壁虎所含抗腫瘤成分的比較，對各壁虎色譜數據進行了聚類分析。聚類分析使用各壁虎保留時間在20 min以內共有的12個吸收峰，以每個壁虎的12個吸收峰的總面積除各吸收峰的峰面積，得到如表2所示的各吸收峰的相對峰面積，以此進行聚類分析。聚類分析使用spss統計軟件，采用離差平方和法（ward’s method）及歐氏距離（euclidean distance）。表2 各壁虎共有吸收峰的相對峰面積（略）
2.6 結果
測試所得各壁虎的hplc色譜圖，其中濰坊壁虎的色譜圖如圖1所示。
實驗發現濰坊壁虎干品的色譜圖（圖2）與鮮品的有很大的差異，故鮮品的指紋圖譜不適用于干品。
以各鮮壁虎色譜圖中保留時間作標記的各吸收峰為指紋峰。取其中吸收強度最大的（保留時間分別為5.234，5.263，5.273，5.246，5.259，5.250）吸收峰為 參考 峰，確定其它指紋峰的相對保留時間和相對峰高，以歸一化法（rai=ai/σai）確定各指紋峰的相對峰面積。由色譜中各指紋峰的相對保留時間、相對峰高及相對峰面積（ra），即可構建起樣品的hplc指紋圖譜。各鮮壁虎色譜圖中吸收峰的保留時間見表3。表3 各壁虎hplc指紋峰的保留時間（略）
聚類分析所得的樹狀關系圖見圖3。
3 討論
壁虎和乙醇的選擇:為盡可能全面地研究分析壁虎體內所含物質的抗腫瘤活性，需要盡可能多地將壁虎所含物質提取出來。選用乙醇是考慮到乙醇與水的互溶性，選擇鮮壁虎是因為鮮壁虎自身含水。在第一遍用乙醇浸泡壁虎勻漿物時，壁虎體內所含的水溶性好的物質可借助于壁虎體液與乙醇的互溶而被提取出來，當抽濾分離后，濾渣中含水甚少，再次用乙醇浸泡濾渣時，可保證其中脂溶性良好的物質也被提取出來。若對壁虎干品進行同樣的處理，則干壁虎所含有的水溶性物質就不可能被很好地提取出來。從干、鮮壁虎的色譜圖中可以看到，在梯度洗脫的前半段時間，干壁虎的吸收峰數少、吸收強度低，而在后半段時間內，干、鮮壁虎的吸收峰數基本相等，但干壁虎的吸收強度要顯著大于鮮壁虎的。
關于壁虎的hplc色譜圖：鮮壁虎的乙醇提取液中所含物質種類繁多，在某一特定色譜條件下，不可能使所有的吸收峰都得到良好的分離，盡管在樣品洗脫的初始階段（前20min）吸收峰的分離狀況不甚理想，峰的重疊相對較為嚴重；但色譜數據的穩定性良好，可以滿足作為指紋圖譜的需要。
關于相似度分析：僅從各壁虎在20 min以內的吸收峰的保留時間就可發現，在各吸收峰的保留時間序列中，各種壁虎均有峰的缺失。按時間序列，吸收峰的總數有20個，但六種壁虎的共有峰只有12個；因此從圖譜的直觀上就可以區分出不同的壁虎。為不同壁虎的鑒定提供了依據。
聚類分析的結果表明6種壁虎中，g.sw和g.a最為相似，相似度可達98.61%，當聚為五類時，兩者為一類，其他壁虎各自為一類；當聚為四類時，g.sw和g.a為一類，g.h和g.j為第二類，g.su 和g.t各自為一類；當聚為兩類時，g.sw、g.a、g.t和g.su為一類，而g.h和g.j為另一類。盡管在目前這12個共有峰尚未歸屬為某個確定的化合物，但隨著研究的深入，各吸收峰的化合物名稱及分子結構將一一確定；聚類分析將提供壁虎間相互替代的思路。
尚需解決的問題：擬通過后續的進一步分離純化，以獲得抗腫瘤活性成分的純品及其抗腫瘤效果，并解決指紋圖譜中各吸收峰的歸屬問題。
本文所介紹的壁虎hplc指紋圖譜可用于壁虎的鑒定，聚類分析的結果給出了不同壁虎間的相似程度。
【參考 文獻 】
液相色譜范文5
【摘要】
目的采用高效液相色譜（HPLC）法測定不同白芍藥材中芍藥苷含量，確定哪種白芍含芍藥苷最高。方法采用色譜柱：Hypersil C18柱（4.6 mm×200 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.05%磷酸水（14：86）；檢測：UV 230 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：25℃。結果2年生、10月份采收貯存期短的亳州白芍芍藥苷含量最高。結論該方法簡便準確可靠、重復性好。
【關鍵詞】 白芍 芍藥苷 高效液相色譜 質量
Abstract:ObjectiveTo compare the quality of different Radix Raeoniae Alba with HPLC methods. MethodsThe separation was carried out on Hypersil C18 column（4.6 mm×200 mm，5μm）； the mobile phase was acetonitrile-H2O (acidified to 0.05% with phosphoric acid)（14∶86）；the flow-rate was 1.0mml/min； the column temperature was 25℃. ResultsThere was the highest content of paeoniflorin in Radix Paeoniae Alba of two -year-growing time harvested in October with short storage time.ConclusionThe method is simple， rapid with good reproducibility.
Key words:Radix Paeoniae Alba； Paeontflorin； HPLC； Quality
白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall的干燥根，其主要成分為芍藥苷（Paeoniflorin）、芍藥內脂苷（Albiflorin）、氧化芍藥苷（Oxypaeoniflorin）、苯甲酰芍藥苷（Benzoylpaeoniflorin），通稱芍藥總苷（total glucosides of paeony， TGP）。具有抗炎、抗病毒、解痙鎮痛、護肝等多種藥理活性。白芍藥材及各種制劑均以芍藥苷含量為質量控制標準。
1 儀器與試藥
1.1 儀器
高效液相色譜儀（四元泵、柱溫箱、MVD檢測器、Agilent1100 色譜工作站）、電子分析天平AE240 （十萬分之一，瑞士，METTLER-TOLEDO Co.）、CQ250超聲波清洗器（上海超聲波儀器廠）、UV-3300（日本日立公司）。
1.2 試藥
芍藥苷對照品（編號：0900-200102，含量測定用，中國藥品生物制品檢定所購），白芍藥材經江西中醫學院藥用植物學科組鑒定符合2000年版《中國藥典》白芍項下標準。乙腈為色譜純（Merk Co.），水為雙蒸水，其它試劑均為分析純。
2 方法與結果
2.1 對照品溶液制備
精密稱取白芍對照品適量，加50%乙醇制成每毫升含60 mg的溶液，搖勻，即得。
2.2 供試品溶液的制備
精密稱取本品干燥的粉末0.5 g，置50 ml容量瓶中，精密加入50%乙醇35 ml，超聲提取30 min，冷卻，加50%乙醇至刻度，搖勻，濾過，再過0.45 μm濾膜，取續濾液作為供試品溶液。
2.3 色譜條件
色譜柱： Hypersil C18柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）（大連Elite公司）；流動相：乙腈-0.05%磷酸水（14∶86）；檢測：UV 230 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：25℃。理論塔板數以芍藥苷峰計算不得低于2 000。在上述色譜條件下，取對照品溶液、供試品溶液各進樣10 μl進行HPLC測定，結果見圖1～2。由圖中可見供試品中芍藥苷與芍藥苷對照品峰保留時間一致，并且與樣品中其它組分達到了很好的分離。
2.4 線性關系
考察精密稱取芍藥苷對照品0.024 80 g，置50 ml容量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，即得到2.48 mg/ml的芍藥苷對照品溶液，從中分別精密吸取0.25，0.5，2.5，5.0，10.0和15.0 ml的對照品溶液，分別置6個25 ml的容量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。分別精密吸取上述對照品溶液各10 μl，繪制標準曲線，得回歸方程Y=1 809.398 4X+2.213 5，r=0.999 99。
2.5 提取方法的確定
本實驗對提取溶劑、提取溶劑的濃度、提取時間、提取方法等進行綜合考察，最后確定供試品溶液的制備方法為：用50%乙醇超聲提取30 min即可。
2.6 精密度實驗
精密吸取同一份供試品溶液10 μl，重復進樣6次，測定芍藥苷峰面積積分值，RSD為0.80%。
2.7 重現性實驗
按“供試品溶液的制備”方法，對同一批樣品分別制備6份供試品溶液，各吸取10 μl進樣測定，測得芍藥苷含量RSD為0.72%。
2.8 穩定性實驗
取同一份供試品溶液在上述色譜條件下，分別在0，6，12，24，36，72 h各進樣10 μl，測定芍藥苷峰面積積分值RSD為0.64%。
2.9 回收率實驗
采用加樣回收測定法。分別精密稱取已知含量（芍藥苷1.778%）的樣品約0.25 g，共6份，分別加入一定量的對照品（濃度為0. 88 mg/ml，精密加入5 ml），按“供試品溶液的制備”方法制備供試品溶液，進行HPLC測定，測得芍藥苷的平均回收率為99.92%，RSD為1.36%；結果見表1。結果表明，本法回收率高。表1 回收率實驗結果（略）
2.10 樣品含量測定
精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μl進樣測定，結果見表2。表2 13批樣品的芍藥苷含量測定結果（略）
3 討論
3.1 不同產地芍藥苷含量差異 從芍藥苷含量測定結果看，不同產地的白芍芍藥苷含量各不相同。其主要成分芍藥苷含量以亳州產白芍最高；本實驗所用亳州白芍為帶皮的根，與文獻［1］報道的未去皮白芍藥材中芍藥苷含量最高相符。
3.2 不同采收期芍藥苷量差異從芍藥苷含量測定結果看，以四川白芍為例，采收期8月份，9月份，10月份芍藥苷含量不同，采收期在10月份芍藥苷含量最高，與文獻［2］報道的采收期在10月份芍藥苷含量最高相符。
3.3 貯存期對芍藥苷含量的影響從白芍飲片1（貯存1年）、白芍飲片3（貯存2年）、白芍飲片4（貯存3年）芍藥苷含量測定結果看，隨貯存期的延長，白芍中芍藥苷的含量呈下降趨勢，所以白芍的貯存期不宜太長。
3.4 不同生長年限對芍藥苷含量的影響不同生長期亳州白芍中芍藥苷的含量不同，以2年生者含量最高，隨著生長期的延長，芍藥苷的含量呈下降趨勢。據有關文獻報道可能因為生長期長，淀粉含量增加，芍藥苷在體內轉化分解。這提示合理利用亳州白芍資源，可縮短生長期，增加芍藥苷含量，即經濟又有效。
總之，根據上述測定結果，可見本法操作簡單，重現性好，可作為白芍質量控制的有效方法。
參考文獻
［1］施大文，董欣，何婉霞．白芍的品質評價［J］.中藥材，1988， 11(4)：39.
液相色譜范文6
【摘要】 建立了米面制品中硫脲的液相色譜串聯質譜(LCMS/MS)測定方法。實驗優化了樣品提取方法、液相色譜條件和質譜參數。樣品用80%乙醇超聲波提取，離子交換色譜分離，色譜柱為NUCLEOSIL 1005SA 陽離子交換柱，流動相為乙腈(1%乙酸+0.2%乙酸銨)水溶液(30∶70)，流速0.5mL/min。采用電噴霧質譜正離子模式電離，多反應選擇離子檢測，檢測離子對為m/z 77/60和m/z 77/43，其中m/z 77/60為定量離子對。結果表明: 本方法簡便快速、準確可靠，相對標準偏差
【關鍵詞】 硫脲， 液相色譜， 串聯質譜， 面條， 米粉
1 引 言
硫脲(thiourea)又稱硫代尿素，是一種紡織品的化學漂白劑，曾一度作為防腐劑，廣泛用于各類需要漂白、保鮮防腐的食品。向食品中加入硫脲可阻止褐變，表觀光亮，略帶半透明。硫脲被人體攝入后危害健康，抑制甲狀腺和造血器官的機能，引起中樞神經麻痹及呼吸和心臟功能降低等，甚至導致死亡。由于硫脲毒性大，我國已不允許其作為食品添加劑使用。近年有報道，我國東南沿海曾有用硫脲作為面條的增白劑、增筋劑，而目前我國尚無食品中硫脲測定的相關標準方法。在當今食品安全問題嚴峻的狀況下，迫切需要盡快建立其檢測方法。
目前，空氣、水、土壤和生物等材料中硫脲的檢測方法已有報道[1～4] ，通常采用高效液相色譜法;Raffaelli等[5]報道了用大氣壓化學電離質譜法測定廢水中的硫脲。但至今未見食品中硫脲檢測的相關報道。由于食品基質復雜，采用液相色譜法干擾很大，且靈敏度較低。本研究采用液相色譜串聯質譜(LCMS/MS)法檢測面條和米粉中的硫脲，考察了樣品的提取方法，優化了色譜條件和質譜條件。本方法簡便快速、準確可靠，檢出限為0.5 mg/kg;定量下限為5 mg/kg，適用于面條、米粉等米面制品中硫脲的測定。
2 實驗部分
2.1 儀器與試劑
Agilent 1200LC/6410B MS液相色譜/串聯四級桿質譜聯用儀;AS 3120超聲波發生器(Auto Science公司)， 功率250 W，頻率33 kHz。
硫脲(Thiourea，純度≥98.0%);硫脲標準溶液的配制：以水為溶劑配制質量濃度為1000 mg/L的標準溶液，經0.22 μm濾膜過濾后作為儲備液。使用時用水逐級稀釋至所需濃度;乙腈和甲醇(HPLC級);乙酸、乙酸胺、乙醇等(分析純，廣州化學試劑廠);實驗用水為二次蒸餾水。
2.2 樣品預處理
將樣品用粉碎機粉碎，取 2.0 g 粉碎后的樣品置于具塞三角瓶中，加入20.0 mL 80%乙醇溶液，蓋上蓋，超聲波振蕩提取15 min，將超聲波提取后的樣品混合物全部轉移至離心管中，以3500 r/min離心15 min。移取上清液10.0 mL 至50 mL燒杯中，在68 ℃水浴上濃縮至約1 mL。然后轉移至5 mL刻度試管中，用水洗滌燒杯多次，洗滌液合并入1.0 mL刻度的梨形瓶中，在50 ℃下吹氮濃縮定容至1.0 mL。
2.3 LCMS/MS測定
2.3.1 HPLC條件 色譜柱：NUCLEOSIL 1005SA 陽離子交換柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm); 流動相：乙腈(1% 乙酸+0.2% 乙酸銨)水溶液(30∶70， V/V)，流速0.5 mL/min。進樣量5.0 μL。
2.3.2 質譜條件 電噴霧(ESI)正離子電離模式。干燥氣(N2)溫度350 ℃;霧化氣(N2)壓力276 kPa;干燥氣(N2)流量9.00 L/min;電噴霧電壓4000 V;檢測離子對為 m/z 77/60和m/z 77/43，其中m/z 77/60為定量離子對;采集時間 200 ms;碎裂電壓 80 V;碰撞能量 36 V(m/z 77/60)和48 V(m/z 77/43)。
2.3.3 測定方法 取樣品溶液和標準溶液各5.0 μL注入液相色譜串聯四級桿質譜儀進行分析，以其標準溶液峰的保留時間和質譜檢測離子對 m/z 77/60 和 m/z 77/43 為依據進行定性分析，以定量離子對 m/z 77/60 的峰面積計算樣品中硫脲的含量。
3 結果與討論
3.1 液相色譜條件的優化
考察了C18柱、C8柱、NH2鍵合相柱及陽離子交換柱對硫脲分離的影響。結果表明：采用C18色譜柱時，當流動相為乙腈水體系時[4]，硫脲幾乎無保留;當乙腈比例降低至10%時，硫脲僅有少許保留，保留時間為2.7 min(色譜柱規格為250 mm×4.6 mm，流速為1.0 mL/min，下同);當在流動相中添加庚烷磺酸鹽離子對試劑時，硫脲的保留時間并無明顯增加。采用C8色譜柱時，當流動相為乙腈庚烷磺酸鹽體系時，隨著乙腈比例從65%，40%至5%逐漸減少，硫脲的保留時間從2.9 min， 3.0 min至3.3 min逐步增加，但保留時間仍太短。采用NH2鍵合相色譜柱時，當流動相為乙腈水體系時，隨著乙腈比例依次從70%， 80%， 90%增加到100%，硫脲的保留時間也從3.47 min， 3.55 min， 3.65 min延長到3.79 min，但增加幅度不大，保留時間較短，且峰形較寬。采用陽離子交換色譜柱時，當流動相為乙腈磷酸鹽緩沖液和乙腈乙酸銨緩沖液體系時，乙腈比例為30%時，硫脲的保留時間為3.4 min，峰形較理想;隨著乙腈比例的減少，硫脲的保留時間雖逐步增加，但增加幅度不大且色譜峰展寬嚴重;改變緩沖液的濃度和pH值，硫脲的保留時間并無明顯改變。
以上實驗表明，硫脲由于相對分子質量很小，極性較強，在各類型的色譜柱上保留時間均較小，用液相色譜紫外檢測法測定實際樣品時受到的干擾較嚴重。因此采用液相色譜串聯質譜法測定?？紤]到質譜法測定不能使用離子對試劑、磷酸鹽緩沖液作流動相，并綜合考慮保留時間和色譜峰形，故選擇陽離子交換色譜柱和乙腈乙酸銨緩沖液體系。經實驗本方法最終選擇的色譜柱為NUCLEOSIL 1005SA 陽離子交換柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)，流動相為乙腈(1%乙酸+0.2%乙酸銨)水溶液(30∶70，V/V)，流速0.5 mL/min。此條件下硫脲的保留時間為6.7 min，峰形較好。
3.2 質譜參數的優化
用0.5 mg/L硫脲標準溶液，采用ESI正離子模式進行一級質譜掃描，得到硫脲準分子離子峰m/z 77，即[M+H]+。以m/z 77為母離子作二級質譜，得到硫脲碎片離子峰m/z 60和43，即[M+H-NH3]+和[M+H-H2S]+。選擇m/z 77/60和m/z 77/43離子對進行MRM模式檢測，并對各質譜參數進行優化。優化后的質譜條件見2.3.2節。硫脲的(+)ESI二級質譜圖見圖1。優化后的硫脲標準溶液的HPLCMS/MS色譜圖見圖2。
3.3 樣品前處理條件的優化
3.3.1 不同提取劑對硫脲提取效果的影響 比較了用氯仿、甲醇、乙醇、乙腈和水作提取劑的提取效果。在2.0 g 粉碎后的面條樣品中加入11.6 mg/L硫脲標準溶液1.0 mL，待溶液完全被樣品吸收后，再分別用氯仿、甲醇、乙醇、乙腈和水進行超聲波振蕩提取。按前述LCMS/MS方法測定硫脲的提取效率。結果表明，氯仿幾乎無法提取出硫脲，甲醇、乙醇、乙腈和水的提取效率分別為 86.5%， 70.0%， 67.1%和88.3%，可見以水作提取劑的效率最高。但用水提取時，樣品中的淀粉及其它添加劑也會被提取出來，導致提取液混濁且粘稠，后續處理很麻煩;而用甲醇和乙醇提取雖然效率略低，但提取液較干凈，處理過程簡便快捷。因此結合二者的優點，考慮用甲醇或乙醇和水的混合溶劑進行提取。分別考察了甲醇比例為20%～80%時的提取效果和乙醇比例為20%～80%時的提取效果，結果見表1。由表1可見，80%乙醇水混合溶劑的提取效果最佳。表1 不同比例的醇和水對硫脲的提取效果
3.3.2 提取時間對硫脲提取效果的影響 考察了超聲波提取10， 15， 20， 25和30 min時的提取效果，其回收率分別為87.3%， 88.1%， 86.3%， 85.6%和85.8%?？梢姵暡ㄌ崛r間對硫脲的提取效果影響不明顯，超聲10 min后提取率已基本穩定。本實驗選擇超聲波提取時間為15 min，可滿足分析要求。
綜合以上結果，確定樣品的最佳前處理條件為2.2節所述。由于采用MRM方式測定，避免了樣品基體雜質的干擾，故樣品提取后無需凈化即可直接上機分析，簡便快速，回收率較高。
3.4 線性范圍、線性方程與檢出限
取硫脲標準儲備液逐級稀釋成0.501，1.002，2.004，5.01，10.02和20.04 mg/L的系列標準溶液，進行LCMS/MS分析。以峰面積(A)和質量濃度(ρ，mg/L)作定量工作曲線，線性方程為A=1209ρ-30.91，相關系數為0.9999，在0.5～20 mg/L濃度范圍內線性關系良好。當樣品中的硫脲超過此線性范圍時，可適當加大樣品的稀釋倍數。以信噪比S/N=3確定樣品的檢出限為0.5 mg/kg，采用標準添加法進行實測確定硫脲的定量下限為5.0 mg/kg，可滿足米面制品中對硫脲的檢測要求。
3.5 回收率和精密度
取不含硫脲的面條和米粉樣品各3組，分別加入5.01，10.02和50.10 mg/kg硫脲標準溶液，待完全被樣品吸收后，按實驗方法測定硫脲的回收率，每組樣品平行測定6次，結果見表2。由表2可見，面條樣品中硫脲在添加水平5～50 mg/kg，其回收率為83%～89%，相對標準偏差為0.8%～4.0%;米粉樣品中硫脲在添加水平5～50 mg/kg，其回收率為88%～90%，相對標準偏差為1.7%～3.3%。面條空白及加標樣品的HPLCMS/MS總離子流色譜圖見圖3a和b。本方法回收率較難達到90%以上，可能是基質表2 標準加入樣品中硫脲的回收率和相對標準偏差
參考文獻
1 Stuttgart， Hirzel S， BUA (1995) Thiourea. German Chemical Society (GDCh) Advisory Committee on Existing Chemicals of Environmental Relevance (BUA). Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft(BUA Report 179)
2 Hashimoto A. Anal. Chem.， 1979， 51(3): 385～387
3 Kobayashi H， Matano O， Goto S. Journal of Chromatography， 1981， 207: 281～285