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摘要:依托教師科研項目，以典型環境內分泌干擾物雙酚A(BisphenolA，BPA)為實驗對象，基于高效液相色譜技術設計并開展創新實驗，引導學生自主思考及實驗探索，從分散液液微萃取前處理及高效液相色譜儀器分析兩大方面，摸索并優化各項參數條件，建立高效、便捷的檢測方法用于定量分析水樣中BPA。創新實驗設計結合了新穎的科研內容，激發學生主動探索的興趣，不僅強化了學生的基本實驗技能，而且培養和提升了學生的科研思維及綜合運用知識的能力。
關鍵詞:創新實驗;實驗教學;高效液相色譜
2016年召開的全國科技創新大會提出，我國要在2030年進入創新型國家前列，2050年成為創新強國。實驗室是高等學校實施素質教育，培養學生創新精神與實踐能力的重要基地［1］，但常規的學生實驗教學往往不能充分培養學生的創新能力。在當前國家大力推進大眾創新創業的背景下，開設創新實驗項目是高校培養學生協作能力、科研能力、創新能力以及綜合素質的重要環節［2］。同時，教學和科研相輔相成，基于科研過程和科研成果的創新實驗教學更有助于激發學生對知識的探索欲，加深學生對專業學科領域的認識，強化學生的創新意識，提升學生的創新思維［3］。促進科研與教學互動，把科研成果轉化為實驗教學內容，使實驗教學從傳統的“知識傳授”轉變為“知識、能力、思維、素質”綜合素質培養，對推動大學生參與科學研究、營造良好的學術氛圍、培養學生的創新精神具有深遠意義，具有廣闊的發展空間。
1創新實驗的設計背景及意義
合適的實驗項目是創新實驗開展的重要基礎，創新實驗設計結合新穎的科研內容，教學內容尚未涉及，具有一定的前瞻性，能引起學生主動探索未知的興趣，并有利于培養學生的創新能力和綜合素質，實現學生“高分高能”的培養目標［4］。BPA在工業上常被用來合成環氧樹脂和聚碳酸醋等材料，從塑料袋、塑料飯盒、礦泉水瓶等日常用品，到醫療器械、食品包裝的內襯等，生活中到處都有BPA的身影。BPA的大量生產和使用使它不斷轉移至環境，且大量研究已證明即便在極低劑量(ng/L)的存在下，BPA也能干擾人體及動物正常的內分泌系統，從而影響生殖功能，導致惡性腫瘤的產生等一系列嚴重損害，甚至具有遺傳效應［5］。然而，在對環境樣品中痕量的BPA進行分析的過程中，往往由于BPA的濃度較低甚至是微量、基質組成復雜而被干擾，常規檢測方法達不到檢測要求。因此，高效、靈敏、便捷的檢測方法是開展BPA環境行為研究的基礎和保障，同時，環境樣品中BPA有效分離和富集的前處理至關重要。分散液液微萃取(Dispersiveliquid-liquidmicroextraction，DLLME)技術作為一種新型的樣品前處理手段，自Rezaee等人于2006年首次提出以來迅速成為研究熱點［6］。Leong等在此基礎上建立了上浮溶劑固化分散液液微萃取技術(DLLME-SFO)，采取低密度有機萃取劑，并在萃取離心后結合冷凍固化使萃取相凝固以方便移取。DLLME-SFO進一步簡化了操作，具有樣品需求量小、有機溶劑用量少、操作簡便、萃取時間短、環境友好等突出［7］。本創新實驗結合分散液液微萃取上浮溶劑固化(DLLME-SFO)的樣品前處理方法和高效液相色譜法(HPLC)定量分析技術的聯用，指導學生全程參與實驗的各個環節，設計并優化樣品前處理及HPLC儀器分析的各項參數，建立快捷高效的水樣BPA檢測方法。教師全程指導，學生全程參與實驗設計及開展，全方位培養學生的“知識、能力、思維、素質”。同時，注重培養學生掌握文獻查閱和Word、Excel等文本編輯方法，以及SPSS、ORIGIN等數據統計分析軟件的使用，學習科研論文的基本組成和撰寫。
2實驗原理及核心內容
本創新實驗的核心內容是從兩個方面進行參數優化確定:其一是BPA定量分析的HPLC儀器檢測條件;另一方面是樣品的DLLME-SFO前處理條件?；诃h境介質的復雜性以及環境樣品中BPA濃度通常較低的特點，通過樣品前處理需要達到分離和富集的目的，將BPA從樣品中分離出來并去除基體干擾，同時還要達到一定程度的富集效果以滿足后續定量檢測方法的檢出濃度。在進行樣品中BPA檢測的DLLME-SFO前處理條件優化時，主要通過富集倍數(ExtractionFactor，EF)和萃取回收率(ExtractionRecovery，ER)兩項指標進行萃取效果的考察和比較［8］，進而確定優化的萃取條件。EF為上浮萃取相中BPA的濃度與水樣中BPA濃度的比值，Cfloated為萃取所得上浮相中BPA的濃度，C0為水樣中BPA的濃度。萃取回收率ER(%)為萃取相中BPA的量占水樣中BPA量的百分比例，Mfloated為上浮萃取相中BPA的質量，M0為水樣中BPA的質量。Vfloated和V0分別為萃取相的體積和水樣體積。樣品經過DLLME-SFO前處理，其中的BPA分離富集至萃取相，并經由離心冷凍后取出，所得到的萃取相融化后即可進一步結合檢測儀器進行定量分析。與氣相色譜(GC)和氣相色譜/質譜(GC/MS)等相比，高效液相色譜(HPLC)具有操作方便、測定時間短等優勢。在確定BPA檢測的HPLC色譜條件時，需重點考察并確定流動相的種類及流量、檢測波長、柱溫、進樣量等參數;并建立優化條件下BPA測定的標準曲線，用于BPA的定量分析。最后，還需對實驗所建立的DLLME-SFO-HPLC檢測方法進行評價。采用逐步稀釋法結合高效液相色譜工作站，確定方法的檢出限和定量限。結合加標回收實驗，分析加標回收率和相對標準偏差。從方法的線性范圍、檢出限、實際樣品加標回收率等方面進行所建檢測方法的綜合評價。
3創新實驗的整體設計
在教師的引導下，學生需全程參與文獻查閱、實驗詳細設計、實驗開展及實驗總結匯報的各個環節，整體設計見下圖，將復雜的綜合性實驗分解為幾個步驟逐步開展。教師主要指導實驗的整體思路及技術要點，并及時解答學生的疑問，詳細的實驗方案及操作由學生具體開展。創新實驗設計框架圖首先查閱相關文獻，對BPA、DLLME-SFO、HPLC等背景信息進行梳理。進一步細化實驗方案，對BPA的HPLC檢測條件進行確定，從流動相、檢測波長、柱溫、進樣量等因素進行條件優化，并基于優化的儀器條件進行標準曲線的建立。在HPLC檢測條件確定的基礎上，進一步開展DLLME-SFO樣品前處理方法的條件優化。結合實驗，對萃取劑和分散劑的類型及萃取時間進行初步篩選，利用全因子實驗以萃取回收率和富集倍數為指標對DLLME-SFO過程的萃取劑用量和分散劑用量進一步確定，再結合單因素實驗考察pH值、鹽離子強度、超聲輔助條件的優化確定。采取上一步實驗所確定的HPLC條件，定量檢測各實驗所得萃取相中的BPA，并結合萃取回收率ER和富集倍數EF進行萃取效果的評價和優化萃取條件確定。最后根據實驗過程及實驗記錄，形成實驗報告，并針對其中的要點和亮點以PPT形式進行匯報及交流。
4創新實驗的開展
本創新實驗項目采取學生組建團隊的模式申請參加，按“項目背景調研—問題分析—文獻查閱—實驗方案細化—實驗開展—數據分析—匯報總結”的順序開展，并以科研論文的規范要求提交實驗報告。
4．1實驗準備
教師下達“實驗任務書”，簡要介紹本創新實驗的研究背景，實驗的整體思路，實驗過程需重點關注的因素。要求學生充分開展資料查閱和交流討論，了解BPA及其研究現狀，理解DLLME-SFO前處理的基本原理，掌握高效液相色譜法的基本原理和HPLC儀器的基本操作。在此基礎上，由學生自行擬訂詳細實驗方案，內容包括方法綜述、理論依據、研究內容、實驗步驟、操作方案、可行性分析、注意事項及參考文獻等，并經教師審閱。
4．2實驗過程
采用“引導—設計—探索—交流—引導”的模式，指導學生逐步細化實驗方案并分步推進。先后依次開展BPA的HPLC檢測條件確定及標準曲線建立，DLLME萃取劑、分散劑的選用及用量確定，萃取條件的參數優化確定，所建立DLLME-HPLC方法的評價及水樣中BPA的測定。每部分實驗分別由小組的一名同學主要負責，并做到全員參與。實驗過程充分調動學生的主動性，充分發揮學生的自主思考能力，盡量按照自己的思路開展實驗。教師僅提供技術指導和整體進度把控，且指導方式多樣化。比如，本實驗的開展過程需大量使用高效液相色譜儀，教師制作了“HPLC的操作及應用”等教學微視頻，輔助指導學生進行儀器操作，取得了較好的效果。又如，在HPLC流動相的選擇和確定方面，由學生自行查閱資料提出幾種備選方案，與教師討論交流后，篩選出幾種最可行的方案，再由學生展開實驗進一步結合實驗結果進行優化確定。同時，在實驗過程中特別強調認真進行實驗原始數據的記錄，以便及時發現問題解決問題，并及時與指導教師匯報交流。
4．3實驗總結
學生在實驗后進一步梳理實驗過程與結果，對異?，F象進行討論或提出創造性建議，將實驗過程中遇到的問題及實驗結論的得出過程進行詳細分析。在此基礎上，以論文的形式對實驗結果歸納、總結與討論，最后以PPT形式匯報交流。
5結語
創新實驗相較常規實驗教學費時費力，但參與該實驗的學生由被動參與者轉變為實驗路線的設計者和實驗方案的制訂者，學生積極思考、主動參與、相互探討。實驗過程有效激發學生的研究興趣，充分發揮了學生的主動性和創造性。創新實驗的開展，使學生對相關專業知識有了更深刻的理解，操作技能及合作精神得以強化，信息獲得及利用的能力有所提高，創新思維及表達能力得到鍛煉，視野進一步開闊，學習動力及學習方向更加明晰，為后續的學習及工作奠定了較好的基礎。
作者：胡鶯 孫姣霞 劉雪蓮 潘瑾 單位：重慶交通大學河海學院環境科學與工程系