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干細胞培養技術范文1
【摘要】
目的： 建立胎鼠大腦皮層神經干細胞體外分離、培養、分化及鑒定的方法，探討神經干細胞的基本生物學特性。方法： 取孕14 d胎鼠大腦皮層，吸管吹打機械分離制成單細胞懸液，采用無血清培養和胎牛血清誘導分化， 應用免疫熒光技術鑒定神經干細胞及其分化的子代細胞。結果： 從胎鼠大腦皮層分離的細胞呈神經巢蛋白（Nestin）免疫陽性并能在體外傳代培養，血清誘導分化后的細胞可表達神經元、星形膠質細胞的特異性抗原微管相關蛋白2和膠質纖維酸性蛋白，誘導分化成的神經元能表達突觸的特異性標志Synatophymin。結論： 分離和培養的細胞能表達神經干細胞的特異性標志物Nestin，并且具有很強的增殖能力和多向分化潛能，屬于中樞神經系統的神經干細胞。
【關鍵詞】 干細胞 大腦皮質 細胞培養 細胞分化 胚胎 大鼠 Sprague Dawley
［Abstract］ Objective: To establish a method for isolation， cultivation， differentiation induction， and identification of neural stem cells (NSCs) from embryonic rat in vitro， and explore the basic biological features of these cells. Methods： The mesencephalon of rat with conceptus age of 13 days was taken out and dissociated into single cell suspension mechanically， and then cultured in serumfree medium. Fetal bovine serum was used to induce cell differentiation. The isolated cells and their progeny were observed by using immunofluorescence technique. Result： The isolated cells showed nestin positive reaction and could be cultured in vitro in series. After being induced by fetal bovine serum， microtubuleassociated protein 2 (MAP2) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) which are specific antigens in neuron and astrocyte expressed in these cells， and synatophymin， a specific signal of synapse， was also expressed in the differentiated neurons. Conclusion： The isolated and cultured cells are NSCs of central nervous system， and possess strong capability of proliferation and potency of multidirectional differentiation.
［Key words］ stem cells; cerebral cortex; cell culture; cell differentiation; embryo; rats， spraguedawley
傳統觀念認為，哺乳動物的神經組織只有死亡，沒有再生能力。自從上世紀90年代初科學家們分離、培養出神經干細胞(Neural stem cells，NSCs）以來，人們相繼從各種動物及人的中樞神經系統分離、培養了NSCs[1，2] 。NSCs的發現不僅打破了神經元不會再生的傳統觀念，而且為許多以往難以治療的神經系統疾病提供了新的治療思路和途徑。2007年6月利用細胞分離、無血清培養、血清誘導分化及免疫熒光等技術，證明了本實驗所分離的細胞群為NSCs，以期為進一步使用和研究NSCs奠定理論及實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
DMEM/F12、B27、胎牛血清購自GIBCO公司，bFGF、Nestin抗體、突觸素抗體Snaptophysin購自SIGMA公司，MAP2抗體、GFAP抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司，倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡為NIKON公司產品。
1.2 NSCs的分離培養[3～5]
成年雌性和雄性SD大鼠各1只，體重220～260 g，雌雄合籠后，檢查陰栓，見陰栓計為孕0 d；孕14 d時取胎鼠，在解剖顯微鏡下仔細分離獲得胎鼠大腦皮層，再用DHanks液漂洗，用眼科剪反復切割組織，再用200目細胞篩過濾，收集入離心管中，反復吹打，制成單細胞懸液，經細胞計數后，分裝入50 ml培養瓶中，細胞數約為1×106/ml。培養條件: DMEM/F12 6 ml+B27120 μl + bFGF12 μ1，37 ℃， 5%CO2; 每6～7 d傳代1次。
1.3 NSCs的誘導分化
取第4代傳代培養的NSCs，將其吹打成單細胞后，以5×104/片細胞密度種于經0.1%多聚賴氨酸處理過的蓋玻片上，培養條件為: DMEM/F121.5 ml + B2730 μl + FBS 150 μl， 37 ℃，5%CO2，培養7 d。
1.4 免疫熒光單標法鑒定NSCs及其子代細胞
1.4.1 Nestin免疫反應陽性細胞
將懸浮培養的細胞團用4 %多聚甲醛固定30 min后涂在載玻片上，37 ℃烘干，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，加入一抗Nestin（1∶100）后4 ℃過夜，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，加入二抗兔抗羊TRITC(1∶100)后37 ℃孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，熒光顯微鏡下觀察。
1.4.2 MAP2 、GFAP、Snaptophymin免疫反應陽性細胞
取誘導分化的NSCs的細胞蓋玻片用4%多聚甲醛固定30 min，37 ℃烘干，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，分別加入一抗MAP2（1∶100）、GFAP（1∶100）和Snaptophysin（1∶100）后4 ℃過夜，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，分別加入二抗羊抗兔FITC(1∶100)和羊抗兔Cy3(1∶100)后37 ℃孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，熒光顯微鏡下觀察。
2 結果
2.1 NSCs的形態學特征及鑒定
由孕14 d胎鼠大腦皮層分離培養的原代細胞， 接種后立即在相差顯微鏡下觀察，細胞呈懸浮的圓形狀，邊界清楚，折光性強，絕大部分單個存在。經6～7 d無血清加bFGF培養后，細胞呈球狀集落， 95 %以上的NSCs球呈懸浮生長，細胞增殖旺盛（圖1）。原代培養時，培養瓶中可見一些細胞碎片和一些貼壁的雜細胞，但經傳代后，這些雜質均減少甚至消失，且生長狀態良好。在相差顯微鏡下，NSCs呈球形或橢圓形，大小不一。經Nestin免疫熒光染色鑒定顯示神經干細胞球呈紅色熒光（圖2）。
2.2 NSCs的誘導分化及其鑒定
胎鼠大腦皮層神經干細胞的分離培養、分化及鑒定在NSCs培養液中加入10%胎牛血清3 h后，NSCs球即開始貼壁和分化，6 h后即可明顯發現有突起從團塊邊緣長出，24 h后有少數細胞分化為有突起的細胞，以后分化的細胞逐漸增多，從細胞球周圍遷移出，呈放射狀排列（圖3）；隨著時間的推移，突起不斷增粗與延長并互相連接成網狀，7 d時在相差顯微鏡下NSCs球周圍可見分化成胞體圓形豐滿的神經元樣細胞和突起粗大的膠質細胞樣細胞。免疫熒光染色顯示，在胎牛血清的誘導分化下NSCs能分化成表達各種相應特異性標志的終末細胞，即表達MAP2的神經元（圖4）、表達GFAP的星形膠質細胞（圖5）；同時，從NSCs分化而來的神經元能表達突觸素（圖6）。
3 討論
NSCs是指在哺乳動物中樞神經系統內具有多向分化潛能和自我復制能力的一群細胞，由于具有廣闊的應用前景而受到神經科學領域眾多研究者的關注，在治療惡性膠質瘤、神經系統損傷、中樞神經系統慢性退行性疾病（帕金森病、亨廷頓病）等方面已取得豐碩的成果[6～8]。
NSCs在哺乳動物中樞神經系統內分布非常廣泛，本實驗從大腦皮層取材，采用機械分離法來制備NSCs懸液，實驗效果比較理想。NSCs懸液的制備有酶消化法和機械分離法，但以酶消化法使用居多。由于在實際操作中很難從客觀上準確地把握酶作用的最佳時間點，往往導致消化不足而不易獲得單細胞懸液；或消化過度造成細胞受損而導致細胞活力下降甚至死亡。并且，在NSCs表面具有針對許多神經生長因子的受體[9]，當采用酶消化法來獲取NSCs時， 可能會引起細胞表面受損而致使一部分受體丟失，而這些受體對于NSCs 維持其干細胞的未分化狀態是必需的。所以采用顯微解剖和吸管吹打等機械分離方法來制備NSCs懸液是神經干細胞分離中較為理想的方法。
本實驗發現在原代培養時，培養瓶中可見大量的細胞碎片和一些貼壁的細胞，但經傳代3～5代后，這些雜質逐漸減少甚至消失。這主要是由于培養液中所含的bFGF只對NSCs具有促進分裂和增殖作用[10，11]，而其他雜細胞在該培養液中無法生長。因此，原代細胞中大部分非NSCs會發生死亡，而NSCs不僅可以存活，還可以分裂和增殖，形成神經干細胞球，從而經過多次傳代后， NSCs可以得到純化。
Nestin是神經干細胞的一個標志物，本實驗培養的細胞通過免疫熒光觀察培養的細胞球均呈Nestin免疫反應陽性，提示組成細胞球的細胞為NSCs。當在培養液中加入10％的胎牛血清后，NSCs可以分化為神經元樣細胞和膠質細胞樣細胞。免疫熒光顯示，誘導分化7 d后NSCs可以分化為表達MAP2的神經元和表達GFAP的星形膠質細胞，證明了NSCs具有多向分化潛能。同時，本研究觀察到從NSCs誘導分化成的神經元突起上有分化較好的串珠樣排列的膨體，突觸素免疫熒光染色陽性，顯示其已經具備接受信息的結構基礎，表明分化的神經元能夠合成和運輸神經遞質，行使可能的生理功能[12]。
實驗從孕14 d胎鼠大腦皮層分離培養的細胞團具備NSCs的三大特征：Nestin免疫反應陽性、分裂增殖能力和多向分化潛能，由此證明了所分離培養的細胞是NSCs。并且，由血清誘導分化而來的神經元具備一定的生理功能，可以用于進一步的實驗研究。
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干細胞培養技術范文2
【關鍵詞】 骨髓基質干細胞;誘導分化;成骨細胞
【中圖分類號】R414.1【文獻標識碼】B【文章編號】1005-0515(2010)009-0010-01
骨髓基質干細胞(bone marrow stromal stem cells, BMSCs)是一類具有分化潛能的成體干細胞,在特定條件下可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肝細胞、神經細胞等多種細胞,被認為骨組織工程中的最佳種子細胞。本實驗通過貼壁培養法和密度梯度離心法分離成年大鼠骨髓基質干細胞,定向成骨分化,并檢測細胞表面標志、堿性磷酸酶活性和細胞礦化作用。
材料和方法
1 材料
1.1 實驗動物。成年wistar 大鼠,雌雄不限,體重150~180 g ,由浙江大學華家池動物實驗中心提供。
1.2 實驗試劑。胎牛血清,胰蛋白酶(Hyclone),(杭州四季清生物技術有限公司),B一甘油磷酸納(Sigma,USA),地塞米松(Sigma,USA),維生素C(Sigma,USA),小鼠抗大鼠OC單克隆抗體(R-D,USA),兔抗大鼠CD4(BA0532)、CD44(BA0321)、CD54(BA0541)、CD105(BA1725)、Fibronectin(BA1772)、Collagen Ⅰ(BA0325)、EGFR1(B0485)親和純化抗體(武漢博士德公司)
2 方法
2.1 BMSCs的分離和培養:成年wistar大鼠麻醉后處死,無菌條件下取股骨.用含10%FBS的高糖DMEM培養液沖洗骨髓腔.制成骨髓單細胞懸液。接種于培養皿中,置37℃、5%CO2培養。于72h半量更換培養液,以后每3d半量換液1次。加入成骨誘導培養液進行分化培養.對照組加入等量基礎培養液。
2.2 免疫細胞化學檢測rBMSCs的表面標志: 取生長良好的3~5代rBMSCs以1.2×105/ml細胞懸液以1ml接種于蓋玻片,待細胞單層融合至65%左右時,細胞爬片采用SP檢測。
2.3 rBMSCs成脂向誘導分化:取生長良好的3~5代rBMSCs接種培養,貼壁24h后換用成脂誘導劑,取誘導30d后的細胞進行蘇丹Ⅳ染色。
2.4 rBMSCs骨向誘導分化:取生長良好的3~5代rBMSCs接種培養,貼壁24h后換用成骨誘導劑,取誘導15d、30d后的細胞進行礦化結節染色。
3 結果
3.1 原代培養的BMSCs接種24h后,即出現零星貼壁細胞。72h后開始增殖,生長良好,貼壁較均勻。BMSCs呈紡錘狀,有突起。約10d時,細胞匯合成片,其融合率可達到80%~90%,有接觸抑制現象。
3.2 rBMSCs表達出許多的非特異性的表面標志物。DAB顯色CD44、CD54、CD105、Fibronectin、Collagen Ⅰ、EGFR1陽性,CD34陰性。
3.3 rBMSCs脂向誘導分化培養中細胞形態出現明顯的變化:扁平,多為原盤狀,可見細胞突起。細胞誘導10d后胞漿中出現致密的黑色點狀物,被大量的“小白點”狀的脂滴前體分割。14d后,出現少量高折光性脂滴,隨著時間推進,不斷增多并形成大脂滴。綠色濾光片下可見清晰的脂滴;蘇丹Ⅳ染色顯示紅色脂滴。
3.4 rBMSCs骨向誘導分化培養中,誘導15d就有較多高折光性小顆粒沉積,并可見局部融合,30d時,可見大量結節,幾乎覆蓋整個細胞層。
4 討論
骨髓基質細胞又被稱為“間充質干細胞”或“骨源性干細胞”。近年來研究發現還可以分化為星形膠質、少突膠質細胞及神經元,所以又稱為多潛能成體干細胞。分離骨髓間充質干細胞有多種方法:免疫磁珠分離法[1]和流式細胞儀法[2]因費用高、需骨髓量大、操作復雜而較少應用。全骨髓法[3]即貼壁細胞分離法雖方法簡單但所獲細胞純度不高;密度梯度離心法[4]是根據骨髓中各細胞成分比重不同離心分離培養,簡單易行,所獲得的細胞純度較高。
本實驗選用密度梯度離心法分離培養的細胞經過3~5代的傳代,細胞形態趨于一致;免疫熒光檢測顯示培養的細胞CD44、CD54、CD105、Fibronectin、Collagen Ⅰ、EGFR1陽性,CD34陰性。于文獻報道[5]相一致。雖然這些不是特異性的細胞表面標志物,但可以用以鑒別參考。
多向分化潛能是骨髓基質干細胞最重要的生物學特性[6~7]。本研究表明分離培養的細胞在體外誘導的情況下,既可以誘導為脂肪細胞,又可以誘導成為成骨細胞。因此,體外誘rBMSCs骨向分化可以很好地模擬骨髓基質干細胞向骨祖細胞、成骨前體細胞、成骨細胞、骨細胞分化的整個過程,是體外研究成骨功能及骨代謝的理想細胞生物模型。
參考文獻
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干細胞培養技術范文3
【關鍵詞】 消化液； 添加物； 牛胚胎干細胞； 克隆效率
胚胎干細胞（ES細胞）是具有全能性的哺乳動物早期胚胎細胞或原始細胞。胚胎干細胞在分化抑制的培養條件下，可以未分化狀態無限增殖。近年來有關牛類ES細胞分離與克隆的研究已經取得較大進展[1-2]。筆者為探討添加物和消化液對牛胚胎干細胞克隆效率的影響，通過從牛鮮胚內細胞團（ICM）中分離獲得牛類ES細胞后進行克隆，在培養細胞中添加胰島素生長因子和消化液，現報道如下。
1 材料與方法
1.1 牛胚采集 在自然期，對健康經產黑白花奶牛母進行人工受精后68 d經非手術方法從牛子宮取胚胎。將待采集胚胎的母牛固定在床位上，在尾椎硬膜外腔注射 2% 鹽酸利多卡因麻醉。按規定方法在沖洗兩側子宮角。沖出的胚胎要在立體顯微鏡下檢查。在100倍實體解剖顯微鏡下觀察受精卵的形態、色調、分裂球的大小、均勻度、細胞的密度、與透明帶的間隙以及變性情況等[3-4]。
1.2 溶液配制 細胞基礎培養液：DMEM+0.1 mM 2-mercap-toethanol（在此基礎上，添加不同濃度的血清及各種細胞因子）；細胞基礎消化液：胰蛋白酶+EDTA（在此基礎上，兩者濃度有所調整）。
1.2.1 飼養層制備 選取新生健康黑白花牛犢制備成纖維細胞，取3代內對數生長期MEF， 終濃度10μg/ml 絲裂霉素C處理 3.5 h， D-PBS充分洗滌，消化細胞調整細胞濃度為1×105個/ml，種植在經 0.1%明膠包被的4孔培養板中，置37 ℃、5% CO2培養箱培養待用，用前更換成胚胎干細胞培養基。
1.2.2 胚胎處理和胚胎培養條件 基礎培養液為DMEM培養基+15%NBS+0.1mmol/L 0.1 μmol/L Na2SeO3+β琉基乙醇。室溫下培養牛胚胎及ES細胞。
1.2.3 ICM初次傳代 將ICM細胞體外培養6～7 d后，當細胞繁殖到一定數目時，選擇未分化的細胞進行傳代。操作如下：用玻璃針剝離覆蓋在ICM表面的滋養層細胞后挑出ICM，用PBS洗滌液清洗后，置入0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液中處理后，將細胞轉入15%的血清培養液中，制備細胞團懸混液。培養條件同上。
1.2.4 牛ES細胞繼代克隆 ICM細胞培養35 d后，飼養層表面可出現類似ES細胞的集落。棄去培養液，用PBS液洗滌集落，再用玻璃針剝脫隆起明顯、排列緊密的ES細胞集落，再用毛細吸管將集落移入培養液中。
1.3 研究方法 在DMEM培養基中加入10 ng/ml的IGF（設為IGF組）觀察牛ES細胞的克隆結果與未加IGF（設為對照組）時做比較，在離散ICM和ES集落時，分別用0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液（A組）和0.04%EDTA消化液+0.25%胰蛋白酶消化液（B組），作用時間控制為2 min，溫度37 ℃。
1.4 統計學處理 采用SPSS 16.0統計學軟件對數據進行統計處理，計數資料采用 字2檢驗，以P
2 結果
不同條件對牛ES細胞克隆的影響情況，具體結果見表1。
3 討論
胚胎干細胞具有全能性，能再體外條件下分化為各器官系統細胞，亦可在分化抑制的情況下進行未分化狀態克隆，胚胎干細胞克隆技術廣泛運用于轉基因動物、嵌合體的制作和克隆動物的生產，目前有關牛胚胎克隆的研究取得了重大進展[4-5]。為探討不同條件對牛ES細胞克隆的影響，筆者探討了在不同濃度消化液及在胰島素生長因子作用下，牛ES細胞克隆的變化。牛ES細胞在以上配置的培養液中培養形成ES細胞集落胚數/枚ES 2枚，細胞最大傳代數2代。在培養液中加入10 ng/ml的IGF牛ES細胞集落胚數為3枚，細胞最大傳代數4代，可見IGF對牛ES細胞克隆有促進作用。在ICM細胞與ES細胞分離時用0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液處理2 min，形成ES細胞集落胚數/枚ES 9枚細胞最大傳代數4代。用0.04%EDTA消化液+0.25%胰蛋白酶消化液分離牛ES細胞集落胚數為8枚，細胞最大傳代數4代。因此，在分離ICM細胞和ES細胞時注意，選擇適當濃度的消化液，且作用時間不宜過長[6-8]。通過本實驗可得出在進行牛ES細胞培養時，可利用一定的添加物促進ES細胞克隆，促進其繁殖，而對于分離ICM和ES細胞的消化液，須嚴控其濃度和作用時間。
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干細胞培養技術范文4
【關鍵詞】 骨髓基質干細胞；CD分子；5-溴脫氧尿嘧啶核苷
DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2016.32.091
【Abstract】 Objective To briefly research culture， identification and mark of rabbit bone marrow stroma stem cells. Methods Bone marrow cells of young rabbits were cultured by adhesion method for purification by repeated passage， and cell surface antigen was detected by flow cytometry. Bone marrow stroma stem cells marked by 5-bromodeoxyuridine （BrdU） was injected into rabbit brain for immunofluorescent staining of brain paraffin section after 2 weeks. Results Bone marrow cells cultured by adhesion method provided purified cells suitable for long-term culture in vitro. CD31 had negative rate as 5.67%， CD34 had negative rate as 4.31%， CD45 had negative rate as 4.42%， CD44 had positive rate as 98.82%. CD71 had positive rate as 99.17%. CD90 had positive rate as 98.23%. CD31， CD34 and CD45 showed negative outcome， and CD44， CD71 and CD90 showed positive outcome. BrdU was suitable to be taken by bone marrow stroma stem cells in DNA synthesis. Conclusion Adhesion method provides bone marrow stroma stem cells with high purification， and BrdU can be used as ideal marker for in vivo tracking bone marrow stroma stem cells.
【Key words】 Bone marrow stroma stem cells； CD molecule； 5-bromodeoxyuridine
骨髓基質細胞是一種不具有造血功能的細胞， 由于該細胞容易取材， 并且可以體外擴增以及多向分化等優點， 逐漸成為受到廣泛研究[1-4]。本文作者主要對兔骨髓基質干細胞的培養、鑒定以及標記作簡單探究。
1 材料與方法
1. 1 材料與試劑 ①材料：本文選擇的研究對象為幼兔， 主要來源于內蒙古實驗動物中心。②試劑：主要有Gibco生產的胎牛低血清糖DMEM， 由Serotec公司生產的CD71、CD31、CD45mAb， 由Sigma生產的MTT、BrdU， 由Biolegend公司生產的經異硫氰酸熒光素（FITC）標記的CD45和CDmAb， 剩余試劑則由我國生產。
1. 2 方法
1. 2. 1 原代培養骨髓基質干細胞 將幼兔采用脫頸的方式將其處死， 在充分消毒以后取出兩側的股骨， 中斷股骨并反復用肝素生理鹽水進行沖洗， 主要是將骨髓細胞沖出， 將沖出的骨髓細胞加入至容量為200 ml的LG-DMEM培養液中， 將其在室溫為37℃環境中進行培養， 培養2 d后更換一半培養液， 以后每隔1～2 d在更換一半的培養液， 等到7～8 d后便可以實現1次傳代[5-8]。
1. 2. 2 骨髓基|干細胞鑒定 將經上述步驟培養出的第六代并且已純化的骨髓基質干細胞消化， 在計數之后將其倒入離心管內， 使用磷酸鹽緩沖液（PBS） 0.01 mol/L洗滌1次， 離心的時間控制在5 min， 離心的轉速為800 r/min， 離心成功后， 再將其加入至200 μl的PBS重懸細胞中， 加入FITC分別標記出小兔的CD31、CD34、CD45、CD90、CD44、CD71， 在室溫為37℃以及無關的環境下反應1 h， 待反應結果后， 在使用聚甲醛40 g/L進行固定， 最后檢測流式細胞數[9-12]。
1. 2. 3 BrdU標記骨髓基質干細胞的體外研究 選擇處于對數生長期的骨髓基質干細胞開展細胞爬片， 等到細胞生長到一半時加入BrdU， 待2 d后取出玻璃片用PBS 0.01 mol/L洗滌， 運用多聚甲醛固定好后開展免疫組化和免疫熒光染色， 最后封面進行觀察。
1. 2. 4 BrdU標記骨髓基質干細胞的體內研究 在幼兔顱內注射經過BrdU標記的骨髓基質干細胞， 3周后脫頸處死并取出腦， 在穿刺點附近開展石切片后開展免疫熒光染色。具體步驟為：首先， 常規脫蠟至水， 分別用30 ml/L 過氧化氫（H2O2）、2 mol/L 氯化氫（HCl）、4 g/L的胃蛋白酶、10 g/L
牛血清白蛋白室溫封閉約10 min， 加入2 mol/L HCl， 室溫下孵育30 min， 再將4 g/L的胃蛋白酶室溫孵育30 min， 然后兔抗BrdUmAb（1∶100）在濕盒中孵育過夜， 溫度為4℃；然后將TRITC標記抗兔免疫球蛋白G（IgG）（1∶100）在室溫下孵育40 min， 最后在用PBS和蒸餾水洗滌， 封片觀察[13-16]。選擇同一個組織切片隨機選擇6個不同的視野分別計算陽性率， BrdU標記陽性率=6個不同的視野分別計算陽性率/6個視野細胞總數×100%。
2 結果
2. 1 骨髓基質干細胞培養結果 在對小兔骨髓基質干細胞培養的初期， 能夠看見很多懸浮的細胞， 再培養2 d后發現了一些形狀為紡錘形的貼壁細胞呈分散狀態， 在經過數次更換培養液后， 貼壁上的細胞數量不斷減少直至消失， 4 d后可以發現貼壁的紡錘細胞數量增加， 并且呈成簇分布， 但是依然含有其他細胞， 但是在經過數次傳代培養以后， 混雜細胞逐漸純化， 細胞初期的以集落增長， 但是在第六代之后均為均勻分布的紡錘形。
2. 2 骨髓基質干細胞的鑒定 經鑒定發現， CD31的陰性率為5.67%， CD34的陰性率為4.31%， CD45的陰性率為4.42%， CD44的陽性率為98.82%， CD71的陽性率為99.17%， CD90的陽性率為98.23%。
2. 3 骨髓基質干細胞體內外標記 將小兔的骨髓基質干細胞免疫組化以后， 結果可以觀察到呈棕色的陽性細胞分布， 選擇相同的組織片中6個視野不同進行觀察， 并將陽性率計算出來， 然后再分別計算不同的標本， 經計算， BrdU標記的細胞所占的比例為87.6%。在運用免疫熒光染色之后發現細胞核染色顯著， 但若將BrdU標記骨髓基質干細胞注入體內， 3周以后依然可以看到明顯的BrdU著色， 并且在穿刺位置還發現密集的細胞。
3 討論
骨髓基質干細胞屬于一類具有多向分化潛能的干細胞， 當理化環境不同和受到細胞因素誘導時， 可以進一步向成軟骨、成骨、脂肪以及纖維細胞系等[17-19]進行多方向性擴增和分離， 并且骨髓基質干細胞還容易被外源基因感染， 因此當前成為基因治療和組織工程的較理想的靶細胞。因此如何獲取并純化骨髓基質干細胞已經成為醫學界研究的重大課題。分離和純化骨髓基質干細胞的基本原則為細胞的粘附性。當前， 從骨髓中獲得基質干細胞常采用兩種途徑[20]：①為梯度離心法獲得干細胞；②為全骨髓細胞培養。
本研究通過貼壁法培養幼年兔骨髓細胞可獲得較純化的細胞， 并能在體外長期培養， 結果提示：骨髓基質干細胞培養在對小兔骨髓基質干細胞培養的初期， 能夠看見很多懸浮的細胞， 再培養2 d后發現了一些形狀為紡錘形的貼壁細胞呈分散狀態， 在經過數次更換培養液后， 貼壁上的細胞數量不斷減少直至消失， 4 d后可以發現貼壁的紡錘細胞數量增加， 并且呈成簇分布， 但是依然含有其他細胞， 但是在經過數次傳代培養以后， 混雜細胞逐漸純化， 細胞初期的以集落增長， 但是在第六代之后均為均勻分布的紡錘形。骨髓基質干細胞的鑒定：經鑒定發現， CD31的陰性率為5.67%， CD34的陰性率為4.31%， CD45的陰性率為4.42%， CD44的陽性率為98.82%， CD71的陽性率為99.17%， CD90的陽性率為98.23%。骨髓基質干細胞體內外標記：將小兔的骨髓基質干細胞免疫組化以后， 結果可以觀察到呈棕色的陽性細胞分布， 選擇相同的組織片中6個視野不同進行觀察， 并將陽性率計算出來， 然后再分別計算不同的標本， 經計算， BrdU標記的細胞所占的比例為87.6%。在運用免疫熒光染色之后發現細胞核染色顯著， 但若將BrdU標記骨髓基質干細胞注入體內， 3周以后依然可以看到明顯的BrdU著色， 并且在穿刺位置還發現了密集的細胞。
綜上所述， CD31、CD34、CD45 的結果為呈陰性， CD44、CD71、 CD90的結果為陽性。BrdU可摻DNA合成期的骨髓基質干細胞， 由此得出貼壁法可獲得高純度的骨髓基質干細胞， BrdU可作為骨髓基質干細胞體內示蹤的理想標記物， 依此可以作為檢測骨髓基質干細胞的一個依據。
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干細胞培養技術范文5
試管和女性
卡里姆等人提取帶有XY男性染色體的胚胎干細胞作為“種子”，置入維生素A酸和其衍生物的溶液中，結果發現約有20％的細胞會轉變成早期的細胞或者是精原細胞。經過進一步培養，一些細胞繼續分裂、成長、延長，并且長出尾巴，可以自由游動，最后形成可辨認的細胞。卡里姆認為，這些細胞是“完全成熟，有用的”，還給它們取了一個名字――試管。
卡里姆等人培養試管的過程是，先提取男性的胚胎干細胞，然后將其轉換成生殖系干細胞，再把后者培養成精原干細胞，最后把精原干細胞轉換成單倍體的精母細胞，即只有23條染色體的細胞，最后成為成熟的。
這些人造看起來具有的一些特點，如某些蛋白質形態是獨有的，其中一種處于尾部的蛋白質對于卵子的分裂至關重要。有尾巴和頭，在顯微鏡下可以_清晰地看見用尾巴進行運動。
這一成果意味著可以從新的途徑上幫助不育患者，甚至從根本上改變人類生殖的方式，不需要男人也可以繁衍后代。例如，不需要男性的生殖細胞?？梢蕴崛∧行缘钠つw細胞，植入4個基因，使細胞的基因重新編排，變成具備胚胎干細胞功能的皮膚干細胞，也稱為誘導性多能干細胞。這種細胞與胚胎干細胞一樣，可以誘導分化為多種細胞，同樣也可能誘導分化成，從而利用這種來治療不育。
當然，如果研究順利，未來也許可以提取女性自身的胚胎干細胞、骨髓干細胞或皮膚細胞，誘導其分化，成為，再用這樣的與卵子結合，用以繁衍人類。此時，人類社會就可以不需要男性了。不過，目前這只是一種設想，因為在一年前卡里姆的研究小組就做過類似的研究。2008年1月，卡里姆提出申請，打算從女性捐贈者的骨髓中取出干細胞，然后使用現在試管內培養的方法將女性的骨髓干細胞轉變成，并認為這種“女性”可以在兩三年內培養成功。但迄今這種研究一直沒有成功。
當然，即使“女性”還沒有培育出來，也并不意味著未來不可能出現，而且現在出現的試管也已經是人工生殖技術的進步了，至少從試管嬰兒再向前邁出了一步，到達了試管的新階段。
真“精”需要“火”來煉
即便用胚胎干細胞培養出了，但這樣的是真還是假，是具有的功能，還是徒有其表的假?
英國劍橋大學生理學及生殖學教授阿奇姆?蘇拉尼認為，卡里姆所培養出來的那些不過是“類似的細胞”，“要成為真正的細胞還有很長的路要走”。
人造或試管的本質在于，是否與男性自然生成的一樣有生殖功能?，F在看來這是一個未知數，但基于過去的研究，試管很有可能不具備真正的的功能。
胚胎中基因的開啟與甲基有關，因為甲基可能阻止許多基因的表達。早在兩年多前，同樣是卡里姆的研究小組就利用小鼠的胚胎干細胞培養出了小鼠的。為了驗證這些試管是否具有真正的功能，卡里姆研究小組把培育出的小鼠的試管注入母鼠的卵子，成功地形成胚胎，并把這些胚胎植入代孕母鼠體內培養，最后成功地孕育出了小老鼠。但結果是，那些小老鼠后來全部死亡。研究人員推測，可能是人造中的甲基阻斷了一些關鍵基因的表達，從而造成小鼠后代的死亡。大量研究已經發現，DNA(染色體)的甲基化能引起染色質結構、DNA構象、DNA穩定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，從而控制基因表達。DNA的甲基化可引起基因的失活。因此，這一次卡里姆想在人造的試驗中驗證是否是因甲基的原因造成孕育后代的不成功。
另外，即使人造(試管)培育出來了，而且也有正常的經過減數分裂后的23條染色體，但也并非是有正常功能的。例如，正常的需要有一些幫助其完成正常功能的基因。例如，其中一種叫做動力蛋白基因，如果沒有這個基因或該基因失活，的尾部不能彎曲，就不能讓正常游動去與卵子結合。
還有一種情況是，和卵子表面質膜上都有一種能分別識別對方的識別蛋白，雙方中任何一方的識別蛋白缺失或不正常，也會讓和卵子相見但不能相識，也就不能懷孕?？ɡ锬费芯啃〗M的試管是否缺失某些蛋白，或只是因為甲基化的原因而阻止了一些關鍵基因的表達，從而讓人造不具備正常的功能，這只能用受精實驗來驗證。
而且用試管培育試管小鼠的成功率極低。卡里姆研究小組在大約400個受精卵中僅培育出7只鼠崽。而且，即使成功孕育后，幼鼠的存活時間也極短。其中1只幼崽出生后很快死亡，其余6只在5個月后死亡，但正常老鼠平均壽命約為2年。因此，用老鼠的試管孕育的后代即使可以存活，也逃不過夭亡的命運。以此推論，即使卡里姆研究小組培育出的人的試管能孕育出后代，也很有可能壽命不長。
不要行不通
雖然很多專家對卡里姆等人的試管表示了極大的懷疑，而且以往的研究結果也證明目前的試管并不安全，但這并不意味著紐卡斯爾大學完成的這項研究是毫無意義的。相反，很多研究人員認為，這項研究不僅有意義，而且令人感興趣。因為這有利于今后對產生過程的探索，了解的功能和功能缺失的秘密，也因此有助于治療不育男性，但是現階段還不可能取代男性自然生成的。
早在卡里姆之前，有更多的研究想要證明繞過男(雄)性也可以孕育后代，克隆(無性繁殖)就是一種典型方法，但這種方法以克隆羊多莉的失敗而遭到普遍反對。此后，日本研究人員在英國《自然》雜志發表文章稱，他們未用雄性而只用兩只雌鼠的卵子就孕育出了一個正常的后代，取名叫做Kaguya(月亮女神)。這也是繁衍后代不需要雄性的極好例子。
但是，多莉與月亮女神的單性生殖不完全一樣。多莉是由一只母羊的乳腺細胞核植入另一母羊的去掉細胞核的卵子中孕育的，而月亮女神是由兩個不同的卵子融合創造的。而且這一研究用了598個老鼠的卵子制造出了足夠多的能生長發育的胚胎，然后植入26只雌鼠體內，最后只有24只雌鼠懷孕。這些雌鼠妊娠的結果是，有18個胚胎胎死腹中，同時也成活了10個胎兒，但其中只有兩只分娩下來。最后，只有一只是正常的幼鼠，即月亮女神。
顯然這個過程比克隆多莉耗時耗錢，也耗精力。當然。這種單性生殖研究唯一的意義是證明單性也可以創造生命，也即不用雄(男)性也可以繁衍后代，但是，這樣的技術可以用于人類或其他高等生物嗎?不要說倫理和法律上會有很多阻力，就是這種技術產生出來的后代結果也與多莉一樣，身上充滿多種遺傳缺陷，早衰并提前死去(多莉是因多種絕癥和頑癥而被處以安樂死的)。那么，用這樣的技術產生的生命有什么用呢?
干細胞培養技術范文6
[關鍵詞] 骨髓; 間充質干細胞; 兔; 細胞培養
[中圖分類號] R329.2+8 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)05-29-03
Effects of Adherence and Density Gradient Centrifugation Methods on Biological Characteristlcs of Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells Cultured in Vitro
LI Ting1 SUN Jinhu1 ZHAO Liang2 LI Shuai1
1.College of Stomatology,Guangxi Medical University,Nanning 530021,China;2.The people’s Hospital of Hechi City,Hechi 546300,China
[Abstract] ObjectiveTo study the effects of adherence and density gradient centrifugation(DGC) methods on biological characteristics of rabbit marrow mesenchymal stem cells cultured in vitro. MethodsRabbits aged 2 months were used to isolate marrow mesenchymal stem cells(MSCs). MSCs with adherence and DGC methods were cultured,passaged,amplified and purified in vitro. The living characteristics and adhesive rate of the primary and generations were observed respectively. The growth curve was drawn. The cell cycles and cystoskeleton were tested to study the different MSCs separated methods on the proliferation and metabolism of MSCs. ResultsMSCs were intact and fibroblast cell-shaped. Adhering spindle-shaped cells with higher cytoactive were observed in the adherence and DGC separation groups. The MSCs of primary culture in the adherence group showed more rapid proliferation,earlier colony confluence and shorter time for passage compared with DGC separation group. ConclusionThe MSCs separated by adherence showed a rapid proliferation,earlier colony confluence and shorter time for the first passage.
[Key words]Marrow; Mesenchymal stem cells; Rabbit; Cell culture
骨髓基質中存在骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs),其具有向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞等多向分化潛能,是組織工程學技術的重要的種子細胞[1]。目前,國內外已分離培養出骨髓間充質干細胞(MSC),但尚無統一的分離培養方案。雖然有多種MSCs的分離方法,但密度梯度離心法和貼壁分離法是目前骨髓間充質干細胞最常用的分離培養方法。本實驗應用密度梯度離心分離法與貼壁分離法對骨髓間充質干細胞進行分離培養,并比較分析這兩種分離法對MSC生物學特性的影響,為選擇對MSCs損傷小、易于貼壁生長和操作簡單的MSCs分離方法提供理論指導。
1 材料與方法
1.1 材料
DMEM/F-12培養基(Gibco,USA),胰蛋白酶(Gibco,USA),EDTA(sigma,USA),胎牛血清(Gibco,USA),其他均為國產分析純試劑。碘化丙啶、噻唑藍和二甲基亞砜均為SIGMA產品,Percoll為Pharmacia公司產品。實驗動物日本大耳白兔12只,體重2kg左右,雌雄隨機,動物飼養條件為25℃,濕度60%~ 70%。
1.2 方法
1.2.1 骨髓細胞的制備 用3%戊巴比妥鈉將兔全身麻醉,用脫毛劑脫去兔后下肢的毛發,用3%的碘酊和75%酒精徹底消毒兔后下肢后移入工作臺,鋪無菌巾,解剖出脛骨上、下端,用骨鉆分別在脛骨上端和下端打孔,暴露骨髓腔。用7號針頭刺入兩側骨端的骨孔內,用加有肝素的DMEM 培養基反復沖洗骨髓腔,收集骨髓細胞懸浮液備用。
1.2.2 離心分離法制備MSCs 將骨髓細胞懸浮液貼壁加入到預置等體積1.077g/L的Percoll淋巴細胞分離液的離心管中,2000r/min離心20min。吸取中間乳白色的界面層,與5倍體積的生理鹽水混勻后1000r/min離心5min,除去殘留的Percoll成分。用磷酸鹽緩沖液洗滌1次,然后均采用F12-DMEM 培養液(含體積分數為0.1的進口胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L鏈霉素)重懸細胞,按1×105的密度接種于25mL培養瓶中,37℃、0.05%的CO2飽和濕度下培養,3d后首次更換培養液,棄去未貼壁細胞,此后2~3d換液1次。
1.2.3 貼壁分離法制備MSCs 將骨髓沖洗液放入平皿,再抽出平皿中液體對髓腔進行二、三次沖洗。用吸管反復吹打呈單細胞懸液,每個脛骨的骨髓單細胞懸液經接種入一個25mL培養瓶中,于37℃ 、體積分數為0.05的CO2孵箱飽和濕度培養,5d后首次更換培養液,棄去未貼壁細胞,此后每三四天換液1次。
1.3 細胞計數、細胞形態學觀察
在倒置顯微鏡下,每天觀察貼壁分離培養、密度梯度離心培養條件下的原代及傳代細胞的生長情況和活體形態特征。MSCs活力測定取1～3代傳代細胞,制成單細胞懸液,以0.4% 臺盼藍作為染色劑,用細胞計數板計數活細胞和死細胞,共3次,取3次平均值,計算細胞活力:活細胞率(%)=活細胞數/(總細胞數-著色細胞數)×100。骨髓間充質干細胞按2×104/孔接種于24孔培養板中。分別于接種后第2,3,4,5,6,7天收集4個復孔細胞(注:原代培養細胞于接種后4d換液時開始,即4,5,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15,16),用酚酞藍拒染法計數活細胞。根據計數結果繪制生長曲線。取MSCs按2×104個細胞/孔接種于24孔培養板內,從接種后第2天起,每日隨機收集4個復孔細胞用計數,取均數描記生長曲線。
1.4 MSCs傳代培養
原代細胞長滿單層后,即可進行傳代,首先棄去培養液,用CMF-PBS液洗細胞兩次后,加入消化液(0.25%胰蛋白酶+0.01% EDTA)約1mL,消化約5min,倒置顯微鏡下證實細胞已完全分離(此時鏡下可見細胞呈圓球形),加入4mL含血清培養基,反復輕輕吹打成單細胞懸液,離心并用無血清培養基洗滌1次后重新加入含血清培養基計數,按所需密度傳代培養或冷藏。
1.5 MSCs細胞的HE、Gimas染色及細胞骨架制備
Gimas及HE染色采用文獻報道方法,細胞骨架制備按參考文獻[2]方法。
1.6 MSCs流式細胞儀觀察制樣
按文獻[2]的方法制備觀察樣本,用流式細胞光度計(FCM)檢測,采用激發波長為488nm的氬離子激光,DNA被PI著色成紅色熒光,蛋白質被FITC著色成綠色熒光,打印出各組細胞周期所占百分比,計算增殖指數(proliferation index,PIX)衡量細胞的增殖活性,PIX=(S+G2M)/(G0/G1+S+G2M)×100%。兩組檢測數據用均數±標準差(χ±s)表示,各項指標差異顯著性用t 檢驗。
2 結果
2.1 細胞形態學觀察
2.1.1 密度梯度離心法 細胞培養24h后,均可見大圓形細胞與少量小圓形細胞懸浮于培養液中,4d首次換液后可見少量細胞呈短梭形、多角形細胞及三角形,培養到12~14d細胞增殖鋪滿至80%左右,15~16d細胞增殖逐漸匯合成單層細胞。傳代后至第3代時細胞形態較均勻,呈長梭形集落狀分布。
2.1.2 貼壁分離法 細胞培養24h后,均可見數目較多的小圓形細胞、血細胞懸浮于培養液中。4d時首次換液后可見到梭形、多角形細胞及三角形的貼壁細胞;第7~ 8天可見這些細胞呈集落樣分布;至第10~12天細胞增殖鋪滿至80%左右,14~15d時增殖逐漸匯合成單層細胞。Gimas 染色可見細胞核為紫紅色,圓形或橢圓形,鏡下可見分裂相細胞,兩種分離方法未見不同。(圖1)
2.2 細胞活性檢測
密度梯度離心法:活細胞率為96.2%,貼壁分離法:活細胞率為98.7%,組間比較差異無顯著性(P>0.05)。
2.3 細胞生長曲線
見圖4,應用密度梯度離心法與貼壁分離法第1代細胞生長曲線測定結果是密度梯度離心法的MSCs生長期比貼壁分離法MSCs的生長曲線延遲1~2d。第2、3代細胞生長曲線測定結果,細胞生長曲線基本相似,在培養1d時,細胞量稍有減少;第2天開始至第6天,細胞呈指數生長,細胞數迅速增長,7d進入平臺期,此后細胞數目無顯著改變,細胞增殖減慢(圖2)。
2.4 培養MSCs細胞骨架觀察
鏡下可見細胞骨架主要結構形式為環形排列,貫以輻射狀微管組成圓形蜘蛛網形,細胞間有角形的突起。隨著細胞傳代次數的增大,細胞骨架逐漸過渡到以梭形細胞骨架為主要形式(圖3)。
2.5 培養MSCs的細胞周期
第3代MSCs培養72h后,經PI和FITC雙染在流式細胞儀下觀察分析可見細胞增殖活躍,細胞蛋白質含量較豐富。貼壁法MSC:G1期細胞為67.5%,G2期細胞為28.9%,S期細胞為3.6%,細胞增殖指數為(PIX)32.5%,離心法MSC:G1期細胞為68.2%,G2期細胞為28.1%,S期細胞為3.7%,細胞增殖指數為(PIX)31.8%,經統計學分析貼壁法和離心法MSC的PIX差別無意義(表1)。
3 討論
骨髓間充質干細胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)是具有不斷增殖和自我更新能力的成體干細胞之一,在適當的條件下,可分化為成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、脂肪細胞[3-7]。獲得大量高純度的MSCs是將MSCs用于研究或臨床治療的基礎,目前用于分離MSCs的方法主要有貼壁分離法、密度梯度離心法、流式細胞儀分離法和免疫磁珠分離法。其中后兩者由于所需儀器昂貴、對MSCs損傷較大加之骨髓間充質干細胞尚未發現其特有的表面標志,故較少應用[3]。目前常用方法仍為貼壁法和密度梯度離心法。
本實驗采用貼壁法分離培養小鼠骨髓間充質干細胞,隨著細胞傳代,去除其它可貼壁的雜質細胞,傳過三代后細胞形態趨向一致,獲得較為純化的梭形成纖維樣細胞(MSCs)。應用密度梯度離心法在原代培養獲得的細胞,仍需用貼壁法進一步純化,并且其操作步驟復雜,離心過程中不可避免地造成細胞損失或損傷,同時發現其原代培養時細胞的活性和生長曲線都遲于貼壁法分離的MSCs,而且MSCs貼壁所需的時間較貼壁分離法長,這可能與離心過程中丟失了骨髓微環境中對骨髓間充質干細胞生長有利的細胞因子和促貼附物質有關。原代培養中可見離心法的MSCs純度較貼壁法的MSCs大,但隨著細胞的傳代,兩者之間的差別逐漸消失。本實驗發現應用離心分離法與貼壁分離法經過傳代都可獲得活性好、形態均一的骨髓間充質干細胞,但在實驗過程中要避免軟組織的細胞污染沖洗出的骨髓細胞,對所用試劑盡量做到現用現配。同時應用離心分離法時應注意時間不能過長,離心力不能過大,盡量減少細胞的損傷。本研究揭示雖然密度梯度離心法理論上可在原代獲得較純化的細胞,但仍需用貼壁法進一步純化,而且容易發生細胞污染和損傷等,因此其并不具有明顯優勢,相反貼壁分離法具有方法簡單、細胞損傷小等優點。
總之,本實驗應用的兩種方法均可獲得可靠的MSCs。對原代培養的MSCs,貼壁分離法具有對MSCs損傷小、易于貼壁生長和操作簡單等優點,但其MSCs純度較離心分離法稍低。經過多次傳代后采用兩種方法所獲得的MSCs的生物學特性已無區別,均可獲得具有良好的活性的MSCs。
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