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林業生產是我國主要的基礎產業之一，它既有重要的經濟效益，又有重要的生態效益。提高森林生產力（或經濟與生態效益）的主要途徑有兩種：好的栽培方法和優良品種，其中特別是優良品種是一種投資少、見效快的途徑；所以，長期以來，世界各國均把林木優良品種培育作為自己林業生產和科研工作的一個重要組成部分。林木優良品種（無性系）培育的傳統方法主要有選擇、雜交、誘變及多倍體培育等；人們用這些方法成功的培育出了大量的林木優良品種。但是，隨著分子生物學、分子遺傳學及生物技術的發展以及這些學科研究成果大量地引入到林木優良品種培育過程中，人們發現，現代生物技術與常規林木育種技術相結合可以擴大新創種質的變異幅度、縮短創造新種質的時間，大大縮短育種周期、加速林木優良品種培育進程；因此，林木遺傳轉化及轉基因林木潛在生態風險的研究近些年來得到了迅速發展；及時總結分析這些發展的成果對于進一步開展林木遺傳轉化及轉基因林木應用的研究工作具有重要意義。關于林木遺傳轉化研究進展的綜述性文章已有一些，為避免重復，本文將僅就林木遺傳轉化技術、林木遺傳轉化目的基因及轉基因林木潛在生態風險三個方面近些年的研究進展作一評述。 1林木遺傳轉化研究 1．1林木遺傳轉化技術 目前闊葉樹種主要采用根癌農桿菌（Agrobacte－riumtumefaciens）介導進行遺傳轉化。并且隨著對農桿菌分子生物學，特別是對Vir基因在轉化中的重要功能的深入研究，使農桿菌介導轉化頻率得以極大提高，攜帶經修飾過的Vir基因的農桿菌成為針葉樹遺傳轉化的最佳途徑之一。目前，通過農桿菌介導的挪威云杉（Piceaabies）、火炬松（Pinustaeda）［1］和白皮松（Pinusbangeana）［2］遺傳轉化頻率極高，并且得到穩定表達。Hu等［3］采用胚狀體再生系統，通過農桿菌介導的轉基因植株形態和核型正常，轉基因胚性愈傷組織長時間保持高效體胚分化頻率和植株再生頻率?；驑寣τ谑荏w材料沒有局限性，在很多禾本科農作物上取得成功。許多針葉樹種也通過基因槍法將目的基因打入不同組織并且得到表達，如白云杉（P．glauca）、黑云杉（P．mariana）、輻射松（P．radi－ata）、火炬松（P．taeda）和美洲黃杉（Pseudotsugame－nziesii）等。近年來，在提高林木遺傳轉化效率方面發展了一些新技術，如超聲波輔助農桿菌介導法（SAAT）、低能離子束與農桿菌介導結合法，基因槍與農桿菌介導結合法以及負壓與農桿菌介導結合法等，均可增強農桿菌浸染，提高轉化效率，在農作物遺傳轉化方面有較多成功的報道。而SAAT法在林木遺傳轉化方面也取得了一定的進展，Santarem等［4］在gus基因和hpt基因轉化棕櫚（Trachycarpusfor－tunei）的研究中發現，采用SAAT法的轉化效率比采用農桿菌介導法提高30％～45％；這可能由于超聲波處理可在受體材料表皮和深層造成許多微損傷，有利于農桿菌進入組織內部，同時從傷口處分泌出較多的酚類物質，有助于提高農桿菌的轉化活力，明顯地提高農桿菌的感染效率；Zaragoza等［5］用SAAT法成功地將抗除草劑基因bar轉入刺槐（Robiniapseudoacacia），獲得轉基因植株。 1．2目的基因 應用于林木遺傳轉化的目的基因很多，關于抗病基因、抗蟲基因、抗逆基因已有很多綜述，本文不再贅述；而主要探討與林木木質素改良、縮短育種周期、促進開花、生長性狀改良以及抗環境污染有關基因的研究進展。 1．2．1與木質素改良有關的基因 目前林木木質素改良遺傳轉化所用的基因主要有：4CL，CAD，COMT和CCoAOMT等基因。在林木木質素改良基因工程中第一次真正提高木質素質量，具有生產應用潛力的是轉CAD基因楊樹。Baucher等［6］將從毛果楊×歐洲黑楊（Populustrichocarpa×P．deltoides）分離出來的反義CAD基因轉入雜交楊樹歐洲山楊×銀白楊（P．tremula×P．alba），結果表明，3個反義轉化和2個共抑制品系的木質部組織CAD活性減少70％，CAD活性的降低不僅可使制漿業能耗和生產成本降低，還可以減少制漿過程中有害物質的產生。4CL是催化羥基肉桂酸形成G或S型單體途徑中的關鍵酶。Hu等［7］從白楊中克隆到2個4CL基因Pt4CL1和Pt4CL2，通過對楊樹雜種（Ptrem－celoides）的Pt4CL1的反義抑制，轉基因植株木質素含量降低45％，纖維素則補償性地增加了15％。賈彩紅等［8］將反義4CL基因轉入三倍體毛白楊（triploidP．tomentosa），轉基因株系木質素含量比對照下降41．73％。COMT主要參與S木質素的生物合成，CCoAOMT則參與S和G木質素的生物合成。利用反義RNA技術抑制COMT和CCoAOMT基因的表達可以調整木質素的結構，降低轉基因植株的木質素含量。魏建華等［9］從毛白楊（P．tomentosa）中克隆了CCoAOM基因的cDNA片段，進一步構建出該基因的反義表達載體，并用其轉化雜交楊（歐洲山楊×毛白楊，P．tremula×P．tomento－sa））；轉基因株系的Klason木質素含量比未轉基因對照楊樹下降17．9％。趙華燕等［10］也將CCoAOMT反義基因導入毛白楊，轉基因毛白楊內源CCoAOMT基因的表達在轉錄和翻譯水平均受到抑制，Klason木質素含量有所降低。 1．2．2與花發育有關的基因 縮短林木發育周期，促進林木提早開花對林木遺傳改良有積極作用。雖然采用嫁接和施用化學試劑方法也有一定的促進作用，但通過遺傳轉化卻有著更為廣闊的應用前景。目前主要有如下幾個基因：LEAEY（LFY），AP－ETALAI（AP1），CAULIELOWER（CAL），AP－ETALA2（AP2），UNUSUALFLORALORGANS（UFO）和TERMINALFLOWER（TFL）。LEY是控制頂端分生組織進行成花轉變的一個主要基因，其強突變體基部花完全轉變為葉芽，頂部花表現出部分花的特性。轉LEY基因的楊樹過量表達LEY基因，大大縮短了從生長期到成熟期的時間。一般野生型楊樹需8～20a才能開花，而轉LEY基因的楊樹僅5個月就可開花［11］。AP1的功能與LPY部分冗余，其表達時期晚于LPY，二者具有加性效應，能相互促進表達，表達擬南芥（Arabi－dopsisthaliana）LPY或AP1基因的柑橘（Citrusreticulata）實生苗童年期縮短，提早開花，并且轉基因植株的花器官正?？捎?，果實中有種子，這些性狀可通過種子傳給后代，實生苗1a即可發育成熟等［12］。這說明通過AP1基因的遺傳轉化，可縮短林木的發育周期，加快林木育種進程，也為成熟性狀的鑒定提供了一個極有價值的快速途徑。最近，從林木中也鑒定和分離了許多LPY、AP1的同源基因，為開展轉基因研究奠定了基礎。#p#分頁標題#e# 1．2．3與林木生長有關的基因 調節林木內源激素的基因主要有來自于根癌農桿菌的Ti質粒iaaM、iaaH和來自于發根農桿菌的Ri質粒rolA、B、C基因。許多研究表明，將rolA、B、C基因轉入植物，不僅可促進根的形成和發育，同時對促進轉基因植株的地上部分的生長、發育和其他性狀的改變也有一定的作用。Strobel等［13］將發根農桿菌與油橄欖（Oleaeuropaea）實生苗共培養，可促進實生苗生根和莖的伸長，提高開花率、結實率和產油率。Nilsson等［14］和Tzfira等［15］的研究均表明，轉rolA或B或C基因的雜種楊樹生長和發育速度、生根能力均發生改變。其中轉rolC基因的楊樹不僅表型發生改變（如頂端優勢降低、植株矮化和節間縮短），同時植物內源激素含量下降、赤霉素合成發生變化，而細胞分裂素水平卻升高。因此可通過轉rolC基因選育果樹矮化砧木，對林木種子園經營也有一定價值。Tzfira等［16］發現將rolA、B、C基因置于它們自身的啟動子調控下，轉rolA、B、C基因楊樹生長速度提高、生根能力增強、莖及根生產量指數提高、抑制腋芽生成，并且在第一和第二個冬天推遲休眠；這可能是因為rolA、B、C基因在自身啟動子調控下表達量較低，這種轉基因林木表型的變異恰好符合林木遺傳改良的方向。蘇彥蘋等［17］將rolC基因轉入三倍體毛白楊（已經被轉Ri質粒的）后，部分個體發生了形態特征變異：葉片由原來的皺縮變為平展，莖由原來的直立變為彎曲，側枝增多，節間距明顯縮短等。 1．2．4與林木抗污染有關的基因 利用轉基因技術提高主要闊葉樹種（以楊樹為代表）抗污染能力的研究主要集中在闡明林木抗污染的機理和抗性基因的遺傳轉化上。將來自于細菌的解毒基因轉入楊樹，轉基因植株可降解土壤中的氯苯類化合物，如三氯乙烯等。汞抗性細菌表達merA基因，即汞離子還原酶基因，其蛋白質產物可將劇毒的Hg2＋轉換為毒性較低的Hg，從植物體中揮發，增強植物對汞的抗性［18］；據Summer［19－20］報道，merA基因不僅可以還原Hg2＋，對Au3＋和Ag1＋也有微弱的還原作用。因此轉merA基因植物為生物降解汞污染提供了一條可行的途徑。Rugh等［21］將merA進行改造，使其能在植物體內高效表達，并將改造好的基因轉入黃楊，轉基因植株在含有正常毒性水平的汞離子培養基中萌發和生長良好，汞離子污染的抵抗能力提高了3～4倍，并且釋放汞原子的量是非轉化對照植株的10倍。臭氧可以通過破壞植物體內抗氧化劑的防御機制，影響植物的正常生理生化活動。植物體氧化劑脅迫試驗證明，抗氧化劑對臭氧的氧化破壞作用能起到了很大的緩沖作用。如超氧化物歧化酶和谷胱甘肽在植物體內抗氧化過程中起到清除自由基的作用。Strohm等［22］利用谷胱甘肽合成酶（GshS）基因和谷胱甘肽降解酶（GR）基因轉化雜種楊樹（P．tremula×P．alba），結果表明GshS基因和GR基因的過量表達并不能緩解暴露在高濃度臭氧環境中轉基因楊樹受到的傷害。Foyer等［23］將谷胱甘肽還原酶基因轉入雜種白楊（P．tremula×P．alba），得到了過量表達谷胱甘肽還原酶的轉基因植株，大大提高了雜種白楊對氧化劑的抗性，同時也解除了光合作用中產生的氧自由基對植物體的光合抑制現象；胡楊Na＋／H＋逆向轉運蛋白基因（PeNhaD1）編碼一種質膜Na＋／H＋逆向轉運蛋白，在胡楊細胞拒鹽機制中具有重要作用；陳彩霞等［24］利用農桿菌介導的葉盤法將PeNhaD1基因轉入鹽敏感且速生的派間雜種110楊（P．deltoides×P．maximow－iczii‘Eridano’）中，經PCR和PCR－Southern檢測，已獲得轉PeNhaD1基因的110楊再生植株。 2轉基因林木潛在生態風險的研究 隨著轉基因技術的日益成熟，遺傳轉化的植物種類和目的基因數量越來越多，這些轉基因植物在不斷的進行大田釋放試驗。由于轉基因植物是一新生事物，人們對其對人類和人類生存環境的影響方向知之甚少，對其潛在的生態風險進行研究具有重要的意義。轉基因林木潛在生態風險的研究近些年來取得了一定的進步，主要集中在以下幾個方面。 2．1基因的水平轉移 Hofinann等［25］首先證實了轉基因植物中的外源基因能夠水平轉移到其它微生物中，如轉基因青菜（Brassicachinensis）、黑芥菜（Brassicanigra）、蒺黎（Tribulusterrestris）和甜豌豆（Pisumsati－vum）中抗生素基因均可通過轉基因植株的根系分泌物轉移到一種能與植物共生的黑曲霉中。許多木本植物的根部都能與土壤真菌發生很強的共生作用，兩者通過菌根相互提供養分；因此，轉基因樹木通過共生的各種真菌發生基因水平轉移的可能性是存在的。雖然一些研究表明基因水平轉移很難發生［26－27］，但在現有的試驗條件下，檢測到的基因水平轉移的頻率可能會遠遠低于其實際發生的頻率［28－29］。 2．2基因的垂直流動 外源基因也可以通過花粉和種子垂直流動到轉基因林木的近緣種中。樹木是植物生態系統的主體，由于其馴化程度很低，絕大部分栽培樹種在其種植區內都存在同類的天然野生種群，而且大多數林木為風媒傳粉，其花粉存活時間較長，有些樹種的花粉還具有氣囊，甚至可飛揚到數百公里以外的地方，影響面極廣［30］。因此轉基因林木基因漂移對物種多樣性的影響很大。世界野生動物基金會的一份調查報告指出：目前有些進行田間試驗的轉基因樹種，其目的基因己逃逸到自然界中［31］。人們普遍認為，轉基因林木的外源基因一旦滲入到近緣種而被固定下來，就會形成一定的群體，如果這個帶有污染基因的群體具有很高的生態適應性，那么就會迅速地發展起來而在數代之后對其他的物種，特別是稀有（或處于瀕危）的近緣野生種造成危害，甚至導致該稀有近緣種的滅絕［32－33］，從而產生樹木中的“超級雜草”。#p#分頁標題#e# 2．3對昆蟲的影響 目前，對轉基因林木對昆蟲產生影響的研究主要集中在轉Bt基因的林木上。研究表明，轉Bt基因楊樹會改變林內的昆蟲群落結構。張真等［34］研究發現，由于Bt蛋白主要作用于鱗翅目昆蟲，對膜翅目昆蟲影響不大，在抑制鱗翅目昆蟲的同時有利于其它食葉昆蟲種群的發展，因此轉基因純林中以楊葉蜂（Stauronematuscompressicornis）為優勢種，而在轉基因與非轉基因混交林中以楊扇舟峨（Clos－teraanachoreta）為優勢種。高寶嘉等［35］對轉基因741楊（［P．alba×（P．davidiana＋P．simonyi）］×P．tomentosa）的研究結果表明，轉基因楊樹林的昆蟲群落中食葉害蟲的數量明顯降低，群落中食葉害蟲優勢種的優勢度也同時降低。不同抗蟲性的轉基因741楊，抗蟲性越強的無性系，其林下節肢動物群落與未轉基因林下節肢動物群落的相似性越低。高素紅等［36］研究了轉雙抗蟲基因741楊不同抗蟲無性系林下節肢動物群落的垂直結構和組成，發現轉基因無性系林下土壤節肢動物亞群落對抗蟲基因的靈敏性較高。與化學農藥一樣，昆蟲對Bt殺蟲蛋白也會產生抗性。McGaughey［37］首次報道了印度谷螟（Plodiainterpunctella）對Bt制劑產生抗性。1996年，美國Monsanto公司種植的8萬hm2轉基因棉花中，有10％被發現不抗棉鈴蟲，只能通過噴灑化學殺蟲劑防蟲。為防止昆蟲抗性的產生，農業上提出了“庇護所”策略。該措施也可用于轉基因林木中，即營造轉基因與非轉基因林木的混交林，以達到避害趨利，可持續控制森林害蟲的目的［38］。同時將多個抗蟲基因轉入樹木中，也可達到延緩昆蟲抗性產生的目的。 2．4對土壤生態的影響 土壤是生態系統中物質循環和能量轉化的重要場所，轉基因植物體內外源基因的表達產物有可能通過植物殘留物及根系分泌物對土壤生態系統造成影響［39］。胡建軍等［40］分析了田間試驗達7a的轉Bt基因歐洲黑楊（P．deltoides）的基因穩定性，并對其林地和非轉基因林地的土壤微生物進行了類群數量分析。分析結果表明，轉基因與對照無性系林地間土壤3大類微生物（細菌、放線菌和霉菌）數量無顯著性差異，說明轉基因歐洲黑楊對土壤微生物系統尚未有明顯影響。魏冰［41］等采用平板稀釋法對轉AhDREB1基因毛白楊雜交種［（毛新楊×毛白楊）；（P．tomentosa×P．bolleana）×P．tomentosa］與非轉基因同類植株的根系土壤（已栽植3a）微生物進行種群數量分析，計數結果也表明轉基因植株與非轉基因植株間根系土壤3大類微生物（細菌、放線菌和真菌）數量也無顯著差異；并利用AhDREB1基因特異引物對土壤總DNA以及菌株DNA進行PCR擴增，均未檢測到外源基因擴增產物；說明轉AhDREB1基因毛白楊雜交種對土壤微生物系統也無明顯的影響。但是，Saxena等［42］對轉Bt基因玉米進行了盆栽與大田栽培的對比試驗，發現根系分泌的Bt殺蟲晶體蛋白能很快被土壤中的表面活性顆粒吸附，其殺蟲活性可保持180d以上。Bt蛋白一旦轉移到土壤生態系統中并經過一段時間的積累，就可能會對土壤非靶標生物（如土壤微生物和有益昆蟲等）產生不利影響，特別是對土壤微生物活動過程造成影響［43］。 轉基因植物殘留物及根系分泌物也會對土壤酶活性造成影響。孫彩霞等［44］研究了不同處理所導致的土壤殘留Bt毒蛋白對土壤磷酸酶活性的影響，結果表明，不同Bt蛋白殘留量間的土壤磷酸酶活性存在顯著性差異。 3結束語 由于林木繁殖周期長，遺傳雜合性高，許多性狀的遺傳機理不明，性狀分析困難及種間地理隔離、生殖隔離等因素的限制，使得遺傳轉化逐漸成為人們看好的林木新品種培育途徑。因此，林木遺傳轉化技術近些年來得到了較大的發展，集中表現在轉基因技術和目的基因兩個方面。轉基因技術方面主要表現為多種措施聯合使用，提高了遺傳轉化率；目的基因方面主要表現為應用于林木遺傳轉化的目的數量逐年爭多，從原來的抗蟲基因發展到現在的：木質素改良基因、花發育相關基因、生長相關基因及抗污染基因等。這些基因在不同的樹種均有遺傳轉化成功的例子，其中以楊樹為受體的成功例子較多。 轉基因林木潛在生態風險研究也有了較大的發展，研究點主要集中在：基因的水平轉移、基因的垂直流動及轉基因對昆蟲的影響等方面。初步的試驗結果和理論分析認為，轉基因林木的大田釋放具有一定的生態潛在風險，需要對這種風險進行更深入、精確的評估。 雖然林木遺傳轉化及其生態安全性的研究取得了一定的進展，但也存在一些需進一步努力解決的問題：1）林木遺傳轉化效率相對較低，特別是針葉樹種，建立轉基因體系還比較困難；2）林木樹體高大，生長周期很長，外源基因在轉基因植株中的時空表達特性還有待繼續深入研究；3）比較系統的轉基因林木田間釋放和生態安全性試驗數量還很少。因此，今后一方面要采取積極的態度去開展林木轉基因技術和理論的研究，另一方面也要加強轉基因林木生態安全性的評價和監控，降低其可能對生態環境造成的風險，使轉基因林木揚長避短，開創更廣闊的應用前景。