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對標學習計劃范文1
一、新課程標準下高中化學教學的目標和意義
高中化學是全國在九年義務教育的基礎上設置的較高層次的基礎學科，滿足學生自身發展所需要的化學基礎知識和化學技能，促使學生的全方面發展，更能培養學生的創新精神和實踐能力。
高中化學學科有助于學生對物質世界的認識，學生通過在學習過程中的探究和實踐，加深學生對科學本質的認識，有利于學生形成嚴謹的求學態度，明確科學和實際生活之間的聯系。
高中化學注重培養學生的知識技能，知識是指化學科目中的一些基礎知識，技能是指學生在實際操作上的技術能力，培養學生知識技能，是因為這樣更有助于學生了解化學學科的重要作用。
高中化學也培養了學生的能力，包括學生的觀察力、動手能力、實際操作能力和學習能力。培養學生能夠運用化學知識解決一些簡單的實際問題，并把化學和其他學科綜合，對學生的知識進行綜合，培養學生潛能，同時高中化學還有助于學生個性和特長的發展。
高中化學培養了學生的情感態度，激發學生對化學的興趣，更有助于加強學生對現如今社會存在的某些問題的關心，比如能源問題、環境污染問題、衛生問題和健康問題等等?；瘜W學科結合實際生活，不但對學生進行了情感上的培養，而且讓學生體會到實際生活和化學課程的設置是不可分割的，從而激發學生的學習興趣，培養學生的愛國主義情懷。
二、新課程標準下高中化學教學設計的探究
（一）情景教學，引人入勝?；瘜W這門課程是以實驗為基礎的自然科學，高中化學也將實驗作為教學中的重點，所以在實施教學的過程中，將學生帶到氛圍中去至關重要。
在課堂上要給學生充足的自由發揮時間，培養學生的問題意識，讓學生自主發現問題并解決問題。教師不要將固定的實驗步驟告知學生，而是啟發學生自己開動腦筋，通過自己動手實驗得出相應的結論。
（二）教師教學理念的更新。教師的教學模式一定要符合新課程標準，傳統的教學模式，教師為了節省時間，增加教學內容。為了完成大綱要求，經常會將結論直接傳授給學生，或者實驗教學時將實驗步驟直接告知給學生，學生按部就班的進行試驗，學生失去了對知識探索的樂趣。
作為教育者，要跟著新課程的標準走，所以一定要解放應試教育思想，突出學生是課堂的主體，尊重學生的個體差異，對學生多用鼓勵的言語，要積極看到學生努力的一面，用客觀正確的眼光對待所有的學生。在教學中，更應該多引導學生自主探究，多進行合作交流，不僅要注重學生掌握的效果，也要注重學生探究的過程，培養學生自主學習能力和探究問題能力。
（三）創造新型的師生關系，營造和諧愉快的學習氛圍。教學成果是否高效，很大一部分原因取決于課堂氛圍。傳統教學中教師占主導地位，在學生心中大都是嚴師的形象，學生懼而遠之，造成師生間最基本的交流都成為問題，自然而然教學成果不會非常理想。
在新課程的背景下，新型師生關系是一種必然的產物，因為師生關系直接影響到教學的質量。在這種新型關系中，教師不再是高高在上，而是更貼近于學生，和學生站在同樣的立場。
（四）教師要豐富教學方式，教學可以和現代化信息技術相結合。在高中化學科目中，大部分都是非常抽象的，僅限于文字式難以理解的。教師除了要鼓勵學生通過實驗證明觀點外，還可以借助強大的多媒體進行教學，圖片的展示和動畫展示都是很好的例子，不但直觀，而且還可以三百六十度全面觀察。例如在進行“晶體的結構和性質”的教學時，教師可利用多媒體將金剛石、石墨、CO2等晶體的內部空間結構用立體圖形展示出來，從不同的角度都可以觀察到內部結構，教師還可以通過動畫形式，配以簡單的講解，和學生共同分析晶體形成的原因、結構和晶體的性質。
對標學習計劃范文2
關鍵詞：話語標記語，語用功能，語言學習，就是說
中圖分類號：H0-05 文獻標識碼：A 文章編號：1006-026X（2013）10-0000-01
緒論
話語標記詞是指那些被用來標示會話語段之間的各種邏輯或時空關系的詞或者短語。它的主要作用可看作說話者用來促進受話者對語句，交際情景的理解。按照Levinson（2001）的話來說，話語標記語的作用在于“通過各種方式來標明話語標記語所在的話語是如何與前面的話語互相照應，彼此延續的”。見下例：
這個是回民的，這個死人哪，是比較省錢，就是比漢民的這個省錢了。哎，就是你，你比如說吧，過去就是說白崇禧，那個大軍閥，他是回民。什么馬洪奎， 哎，就是這些大軍。
由于話語標記語對會話的推進具有十分重要的作用，國內外越來越多的學者對其進行了大量的研究。如Schiffrin（1987）對oh，well，and，but等11個話語標記語進行的研究，以及Fraser（1996），Blakemore（1987）從語法或語義特征及語用角度對話語標記語進行的研究。國內學者如，熊學亮（1999），何自然（1999）以及冉永平（2000，2002，2003）等也對話語標記語進行了研究，并探討了you know，well，and，I mean等的語用功能。亦有眾多學者對漢語中的話語標記語進行了探討，諸如“幸虧”（楊亦鳴等，2004）、“我想”（郭昭軍，2004）、“其實”（王江，2005）。盡管研究的角度和方法各有不同，但就話語標記語的基本特征而論，學者們業已達成共識，即：①功能上具有連接性；②語義上具有非真值條件性，即話語標記的有無不影響語句命題的真值條件；③句法上具有非強制性，即話語標記的有無不影響語句的句法合法性；④語法分布上具有獨立性，可見于句首或句中，不與相鄰成分構成任何語法單位；⑤語音上具有可識別性，可以通過停頓、調值高低等來識別。
從前文對“就是說”進行的分析來看，“就是說”顯然符合了話語標記語的這五項基本特征。那么，“就是說”作為話語標記語又有怎樣的具體特點以及語用功能呢？
話語標記“就是說”語用特點研究
目前各類主流中文詞典均未收錄“就是說”這一詞條，因此對話語標記語“就是說”的主要相關研究還仍見諸于學者文章中，如下：
盛新華，邱野（2009）總結了“就是說”在語篇中所發揮的作用，認為：“就是說”作為話語單位之間的連接成分，它所標示的前行句A和后續句B之間具有解釋與被解釋、抽象與具體、深奧與淺顯、補充與被補充、強調與被強調、限制與被限制、概括與被概括、前提與結論等關系。
郭莉琳則對“就是說”的詞匯化過程進行了研究，探究了它從最初的連詞副詞和動詞組合，到成為解釋說明的話語標記、話語組織功能的話語標記、停頓填充功能的話語標記。
H？lker（1991，cf.[6]）指出，話語標記語或語用標記語的功能主要體現為這樣四個方面：（a）不對話語的真值條件產生任何影響；（b）不會增加話語的命題內容；（c）與說話時的情景有關；（d）具有一定的情感功能或表達功能。
以下是筆者基于北京大學語料庫“就是說”的語料，總結的“就是說”作為話語標記語的幾個語用功能。
1.延緩標記語
延緩標記語，顧名思義，是說話者用來避免在會話中可能出現的過長的停頓、同時標示說話者對下文的內容還沒有完全想好而用以爭取時間，填補空缺的詞語。如下面例子中的“就是說”：
一直在天津呢，所以這點兒音呢也不，也不是太純正北京音。另外呢就是說，哦，怎么說呢，在我們那時候就已經，雖然家庭還是老家庭
上例中，說話人在談及天津口音和北京口音的不同之處過后，另起了一個小話題，但是在小話題的內容上，或者表達方式上還有不確定的地方，因此，說話人在這句話中連續用了兩個表示延緩的話語標記語（“就是說”和“怎么說呢”）來拖延話題的推進，為自己爭取時間。再如下例：
不是說說是個別的這個迷信事兒，這不是。就過去我們吧哈，就是說燒， 北京吧就是沒燒香啊磕頭哇，這些個不要，這些都是迷信的
上面例子中說話者便是利用“就是說”來延緩節奏，爭取時間。但此類用法不甚多。
2.解釋說明的作用
口語會話帶有很重的即時、不連貫、所含信息較亂等特點，因此在會話中常常會出現講話者提供的信息與聽話者的預期不一致，或者講話者對聽話者就信息各成分的重要程度理解不一的情況，因此當講話人意識到后可能會立即對話語內容進行修正。筆者發現，“就是說”也具備了充當解釋說明標記語的功能，表示對前面信息的進一步說明或指示，比如：
所以根據這個我上一輩兒的，我的父親叫存琦，就是說姓存名琦；
同時，講話者為了更準確、明顯地表現出自己考慮到雙方的認知差距而做出了進一步的說明，話語標記語“就是說”往往會變體為“也就是說”，更體現解釋的功能，見于下例：
決定：“力爭于1968年進行氫彈裝置的爆炸試驗?！币簿褪钦f，要以比美、英、蘇都快的速度把氫彈研制出來。
“就是說”的作為話語標記語的這種用法體現了口語會話中的連貫性原則，這一用法是“就是說”作為話語標記語而言比較普遍的用法，因此這一用法對于英語學習而言具有十分重要的作用。
“就是說”對語言學習的意義
前文說到“就是說”作為話語標記語具有解釋說明的功能，在結構上起著聯系、銜接的作用，內容上則是更進一步的解釋說明。會話實際上是一個動態的交流過程，在這個過程中會話雙方互相施加影響，說話者會根據語境、上下文內容或者認知預期通過補充的方式解釋話語，幫助聽話人的理解。也就是說，在會話中，“就是說”后面的內容更詳細、更細節，前面可能語焉不詳，或者簡單明了，但“就是說”后面的內容是說話者在考慮到聽話者的認知差距后補充進行的解釋。從這個意義上講，在語言的學習中，受話者只要著重理解到“就是說”后面的內容，便不影響對整個內容的把握。對中國學生而言，“就是說”的作用在英語學習的聽力理解和閱讀理解中尤為如此。
結論
本文探討了“就是說”的語用功能和效用，并提出了其對于語言學習，尤其是對于外語聽力理解和閱讀理解學習具有重要作用。從銜接和連貫的角度來說，語言學習者掌握“就是說”的此項語用功能，在學習中能取得事半功倍的效果?！熬褪钦f”的此種功用與語篇連貫究竟如何作用，還有待進一步的研究。
參考文獻
[1]Halliday & Hassan.Cohesion in English[M].London：Longman，1976.
[2]Schiffrin，D.Discourse Markers[M].Cambridge：Cambridge University Press，1987.郭莉琳.“就是說”的話語標記功能及其詞匯化過程[J].牡丹江師范學院院報，2012，（5）.
[3]劉麗艷.作為話語標記語的“不是”[J].語言教學與研究，2005，（6）.
[4]莫愛屏.話語標記語的關聯認知研究[J].語言與翻譯，2004，（3）.
[5]冉永平.話語標記語 well 的語用功能[J].外國語，2003，（3）.
[6]盛新華，邱野.“就是說”所標示的A、B之間的語義關系及語用特點[J].延安大學學報，2009，（1）.
對標學習計劃范文3
【關鍵詞】血標本；放置時間；放置方式；生化指標
臨床上待檢測的血液標本的保存是醫學檢驗分析中質量控制的一個十分重要的組成部分，常規生化檢驗由于血液標本量較大，標本采集后往往不能及時上機檢測，從采樣到上機檢測耗時較長，這是否對生化檢驗結果有影響，是分析前質量控制中需重點關注的問題之一。有研究顯示血液標本的不同放置時間以及放置方式，會對各項生化指標的檢測結果具體值產生十分顯著的影響[1]。為了探討標本放置時間和方式對生化檢驗結果的影響，本研究隨機選取2013年4月――2013年5月在我院住院的62例患者，每例患者抽取血液標本5ml，對采集到的血液標本進行分組檢測，并對不同放置時間和方式下血液標本的各項生化檢測結果進行比較分析，現報道如下。
1資料與方法
1.1一般資料選取2013年4月――2013年5月在我院住院并進行生化檢測的62例患者的血液標本為研究對象。
1.2方法所有人員于清晨采取空腹血5ml，分別注入3支干凈試管中。待凝固后以3000r/min離心10min，即刻取血清進行生化指標測定。剩余血液貼好標簽，注明時間，其中1管血放置室溫下（20℃），另l管血放置4℃冰箱內存放，第3管采血后即刻離心取血清放置于4℃冰箱內。分別在2h、12h、24h后對3種存放方式下的血液標本的生化指標展開檢測，并對檢測結果進行對比分析。
1.3儀器與試劑采用日立7600全自動生化分析儀及其原裝配套試劑、標準品和質控品。標本采集使用浙江拱東醫用塑料廠生產的一次性真空促凝管。
1.4檢測項目谷丙轉氨酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、尿素氮（BUN）、二氧化碳（CO2）、葡萄糖（GLU）、血鉀（K+）。所有操作均嚴格按照說明書進行。
1.5統計學分析采用SPSS14.0統計學軟件進行處理，計量資料以均數±標準差（χ±s）表示，比較采用t檢驗，以P
2結果
與即刻檢測的生化指標結果比較，室溫放置2h后，GLU、K+結果降低，12h后及24h后，GLU持續下降，而K+重新升高；4℃冰箱存放12h、24h后GLU下降，K+逐漸升高；離心分離血清放置于4℃冰箱2h后K+結果降低，12h、24h后又逐漸升高；在3種存放方式下，CO2從2h后就開始持續降低，以上變化與采血后即刻離心分離血清進行檢測的結果相比較，差異具有統計學意義。ALT、AST、BUN在3種存放方式下隨時間不同結果無明顯變化，結果見表1。
3討論
在臨床上，血液化驗結果的準確性對于指導臨床診斷和治療具有十分重要的意義。研究顯示，血液標本放置時間及放置方式的不同會對檢驗結果產生一定程度的影響[2]。在實際檢測工作中，為保證生化指標的準確性，檢驗人員一定要嚴格按照操作規程進行，合理安排檢測順序，對于不穩定的檢測項目一定要在短時間內測定，對于暫時不能上機的標本，應針對不同的需要采取不同的保存措施。
參考文獻
對標學習計劃范文4
鑒定是否學好一門外語需要從學習目的方面來檢驗?！队⒄Z課程標準》指出：“此次英語課程改革的重點是發展學生的綜合語言運用能力，使語言學習的過程成為學生形成積極的情感態度、主動思維和大膽實踐、提高跨文化意識和形成自主學習能力的過程……要幫助學生了解世界和中西方文化的差異，拓展視野，培養愛國主義精神，形成健康的人生觀，為他們的終身學習和發展打下良好的基礎”。而我國中小學英語教學中，割裂了語言和文化的關系，認為只要進行聽、說、讀、寫的訓練，掌握了語音、詞匯和語法規則就能理解英語和用英語進行交際，這種教學存在的顯著問題就是缺少了對目標語言的文化內涵教育。中小學英語教育都是英語教學中不可或缺的重要組成部分，小學英語教育是基礎中的基礎，而初中英語教學更是英語教育的起步和發展階段。在新課程標準的宏觀目標指導下，當前中小學生英語教育中的文化教育不可或缺，其重要性不言而喻。
一、中小學英語教育中文化教育缺失現狀的表現及原因
1.學生學習片面，忽視文化內涵
在中小學英語學習中，有此學生不了解英美文化習俗，因而與外國人交流時會問許多可能會誤解甚至涉及個人隱私的問題，對國人來說不過就是嘮嘮家常，拉近對方距離的問題，但在外國文化中，這種涉及隱私的問題是不禮貌的舉動，會引起了外國人的不快，最后導致交際失敗。這種失敗其實正是一種語言學習的失敗，試想，一門語言若失去其文化內涵，導致交際失敗，那學習該門外語的目的就亟需考證了。
2.教師的文化涵養需要提高
英語教學中的文化教育不像聽、說、讀、寫、譯那樣可以單獨設課以進行專門學習。文化知識的導入和文化意識的培養，貫穿整個教學過程，縱橫交錯在各個環節之中，而這一重任則主要落在教師身上。在這一逐漸滲透過程中，英語教師肩負著“匯通中西”的重任，因此，只有提高自身的英語文化知識，教師才能在教授學生的時候注重文化知識的傳授。教師應該言傳身教，處處做學生的楷模，處處留心關于英語的文化知識，提高自己的能力。我國的英語教學中一個比較大的問題就是忽略文化教學。長期以來，我國的中學英語教師一直重視的是學生語言能力的培養。在中學英語課堂上，很多教師經常講的就是單詞和語法，卻沒有認識到英語作為一門語言，其最終的日的是用來交流，忽略了英語和我們母語之間是有文化上的差別的，也就是忽略了對學生語用能力的培養。
二、目標語言的文化教育在外語學習中的重要性
著名學者胡文仲在其1999年出版的《跨文化交際學概論》一書中指出：“只注意形式，而不注意語言的內涵是學不好外語的”。語言是文化的載體，文化的任何內容都可通過語言來反映。英語教學是語言教學，當然離不開文化教育。然而當前我國中小學學生的英語語言學習現狀卻是盡管學生可以說出非常完美的口語，然而無法理解中間的文化背景含義；或者是學生會讀寫英語詞語，但無法理解詞語背后獨特的文化背景意義，很多時候往往根據母語翻譯機械的理解。由于沒有文化教育，很多學生學會與掌握的只是英語詞匯與短語，可以熟練閱讀，背誦與記憶英語詞匯，然而無法真正理解其中的內在含義與文化背景，僅僅是掌握了英語形式上的“含義”，沒有融入到英語語言文化中去。由于英語教學中缺乏文化的內涵，所以導致了中學生在英語學習后出現了能“說”卻不會“道”――學生能夠“說”一口流利的英語，但卻“道”不出其中的文化內涵。
三、針對文化教育缺失現狀的對策研究及提高文化教育質量的方法和途徑
1.轉變“老師單一教”和“學生盲目學”的觀念
在中小學英語教育中必須加入文化元素，轉變老師教學和學生學習的觀念，注重文化素養的培養。其次，要將英語文化教育作為重要的教學內容對待。在語言學習領域，學生要面對來自不同文化之間的沖突，因此，就必須幫助學生堅定一個信念：任何文化都有其存在的理由，都是可以理解和掌握的。在日常教學過程中，教師要針對不同家庭背景的學生給予包容心，要從他們的實際情況著手，為他們創造良好的語言學習條件。
2.寓教于樂，改變傳統教育方式
在中學英語課堂上很多教師經常講的就是單詞和語法，卻沒有認識到英語作為一門語言，最終的日的是用來交流，忽略了英語和我們母語之間是有文化上的差別的，也就是忽略了對學生語用能力的培養。日常學習生話中善于利用一切機會進行英語口語的練習，樂于用英語與他們進行交流，做到“潤物細無聲”的導入英語文化。教師配置一定的教具和配套的音像資料等，可以引起學生的興趣，從而達到更好的教學效果。
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[關鍵詞] 葛根素;溶血磷脂酰膽堿;動脈粥樣硬化;基質金屬蛋白酶-9;平滑肌細胞
[中圖分類號] R285.5[文獻標識碼]A [文章編號]1673-7210(2010)04(b)-015-03
Effect of Puerarin on the expression of matrix metalloproteinase-9 induced by lysophosphatidylcholine in vascular smooth muscle cells
CAI Zhichun1, WANG Songqing1, FANG Yunxiang2
(1.Changde Vocational Technical College, Changde 415000, China; 2.Department of Pharmacology, Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410078, China)
[Abstract] Objective: To observe the effect of Puerarin on the expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) induced by lysophosphatidylcholine (LPC) and investigate the anti-atherosclerosis mechanism of Puerarin. Methods: The vascular smooth muscle cells (VSMCs) were incubated with different concentrations of LPC (1.0-10.0 mg/L) for 24 h to detect the level of MMP-9 in supernatants. The VSMCs were treated with LPC (5.0 mg/L) for 24 h following pretreatment with various concentrations of Puerarin(10-6-10-4 mol/L) for 4 h. The level and mRNA expression of MMP-9 were determined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (real-time RT-PCR) respectively. Western blot analysis was used to investigate the activity of nuclear factor kappa B p65 (NF-κB p65). Results: LPC significantly increased the level of MMP-9. The increased level and mRNA expression of MMP-9, and the activity of NF-κB p65 were markedly inhibited by different concentrations of Puerarin in a dose-dependent manner. Conclusion: LPC enhances the expression of MMP-9 by activating NF-κB p65 in VSMCs, while Puerarin is able to inhibit these effects.
[Key words] Puerarin; Lysophosphatidylcholine; Atherosclerosis; Matrix metalloproteinase-9; Smooth muscle cells
在動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的形成過程中,氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)是重要的損傷因素[1],除可通過促進內皮細胞(endothelial cell,EC)凋亡和平滑肌細胞(smooth muscle cell,SMC)增殖外[2-3],還能誘導基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)的產生而參與AS的發生及發展[4]。研究表明,溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine,LPC)是ox-LDL的主要脂質成分,能模擬ox-LDL的主要作用[5],其在AS發病中的作用也越來越受到重視。
葛根素是從中藥葛根中提取的有效成分之一,具有調節血管活性物質、改善微循環、減輕鈣超載等作用,已廣泛應用于各型心血管疾病的治療。研究發現,葛根素通過調節糖尿病腎病大鼠腎組織MMPs的表達而具有改善腎功能的作用[6],但是其在SMCs中的作用的研究較少。因此,本實驗用LPC處理體外培養的SMCs,觀察葛根素對MMP-9表達的影響,并初步探討其機制。
1 材料與方法
1.1 主要試劑、儀器及藥物
胎牛血清、DMEM培養基、胰蛋白酶、Trizol Reagent均購自Gibco公司;LPC和PDTC(NF-κB特異性阻斷劑)購自Sigma公司;MMP-9 ELISA試劑盒和SYBR Green Ⅰ RT-PCR試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司;NF-κB p65單克隆抗體購自武漢博士德公司;葛根素注射液(東藥欣舒)由山東方明藥業股份有限公司生產;其余試劑均為國產分析純。主要儀器有5% CO2恒溫培養箱(SANYO,日本),細胞超凈工作臺(北京昌平長城空氣凈化工程公司),倒置顯微鏡(Olympus,日本),7500型實時熒光定量PCR儀及分析軟件SDS(Applied Biosystems,美國)。
1.2 SMCs的原代培養
原代培養采用組織貼塊法,培養液為20%胎牛血清加DMEM培養液。取大鼠胸主動脈,中間剪開,放入D-Hank液中沖洗,剝凈外膜后用彎頭吸管輕輕刮除內膜,撕取內2/3層中膜組織,剪成約1 mm2的小組織塊接種于培養瓶內。培養瓶至于37℃、5% CO2培養箱內,待SMCs貼壁4 h后加培養液1 ml,然后置于37℃、5% CO2培養箱內培養24 h后補液至5 ml,以后每隔3~5 d換液,倒置顯微鏡下動態觀察細胞生長情況。細胞生長融合出現“峰與谷”后,用含0.125%胰蛋白酶和0.01% EDTA的混合消化液傳代培養。第三代細胞用抗α-actin肌動蛋白免疫組化進行鑒定。實驗用第3~7代細胞,按5×105個/ml接種于6孔板中培養。待細胞融合后,換用無血清的DMEM培養液培養24 h,使細胞同步化,然后即可進行分組實驗。
1.3 實驗分組
實驗共分為四組,正常對照組:SMCs中不加任何試劑;LPC處理組:不同濃度(1.0~10.0 mg/L)的LPC孵育SMCs 24 h;葛根素組:根據葛根素濃度(10-6~10-4 mol/L)的不同分為三個亞組,在每個亞組中先加入葛根素預處理4 h,然后加入5.0 mg/L的LPC孵育24 h;PDTC組:PDTC預先孵育SMCs 2 h,然后加入5.0 mg/L的LPC作用24 h。
1.4 實時熒光定量PCR檢測MMP-9 mRNA的表達
細胞完成相應處理后,用Trizol提取各處理組細胞總RNA,逆轉錄合成cDNA第一鏈,取cDNA進行PCR擴增。MMP-9引物序列,上游:5’-CTT CGA GGG CCA CTC CTA CT-3’,下游:5’-CAG TGA CGT CGG CTC GAG T-3’(129 bp);GAPDH引物序列,上游:5’-CCT CAA GAT TGT CAG CAA T-3’,下游:5’-CCA TCC ACA GTC TTC TGA GT-3’(141 bp)。
1.5 Western blot 檢測核提取物NF-κB p65蛋白的表達
細胞處理完畢后,用胰酶消化收集細胞,PBS沖洗、離心,將沉淀重懸于500 μl低滲液中,冰浴15 min,加入25 μl 10% NF-40溶液,振蕩、離心,沉淀重懸于100 μl裂解液中,再次振蕩、離心,取上清即為白,分裝并保存于-70℃冰箱中備用。取核提取物與等體積的2× 電泳加樣緩沖液混合后煮沸。配制10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠,每一泳道上加40 μl進行凝膠電泳分離蛋白,然后將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上過夜。將轉印蛋白質后的硝酸纖維素膜置于非特異性血清封閉液中,室溫封閉1 h,繼之將膜與用封閉液稀釋的NF-κB p65單克隆抗體(1∶100)4℃過夜,漂洗后與1∶500稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG室溫反應1 h?；瘜W發光法顯色,X線片曝光。將X線片用掃描儀采集圖像,用Geipro軟件系統分析平均灰度值,以同一標本β-actin的產物灰度值作為內參,并計算相對值。
1.6 ELISA法檢測培養上清液中MMP-9的含量
操作嚴格按照說明書進行。
1.7 統計學分析
采用SPSS 11.0軟件進行統計學處理,數據以均數±標準差(x±s)表示,多組間差異比較用方差分析,組間比較用q檢驗,P
2 結果
2.1 不同濃度LPC對SMCs培養上清液中MMP-9含量的影響
正常情況下,SMCs分泌的MMP-9水平極低。不同濃度(1.0~10.0 mg/L)的LPC作用24 h后,MMP-9明顯升高,與正常對照組比較,差異有統計學意義(P
表1不同濃度的LPC對SMCs分泌MMP-9的影響(x±s)
與正常對照組比較,*P
2.2 葛根素對上清液中MMP-9含量、SMCs MMP-9 mRNA和NF-κB p65蛋白表達的影響
由于LPC在5.0 mg/L時對SMCs分泌MMP-9具有最強的誘導作用,因此本實驗選擇LPC 5.0 mg/L這一濃度來觀察葛根素對LPC誘導SMCs MMP-9含量、mRNA和NF-κB p65蛋白表達的影響。結果顯示,正常對照組細胞MMP-9含量、mRNA和NF-κB p65蛋白表達水平均較低,LPC(5.0 mg/L)作用24 h后,MMP-9含量、mRNA和NF-κB p65蛋白的表達明顯升高(P
表2葛根素對上清液中MMP-9含量、SMCs MMP-9 mRNA
和NF-κB p65蛋白表達的影響(x±s)
與正常對照組比較,**P
圖1 Western blot檢測SMCs核提取物NF-κB p65蛋白的表達
[1:正常對照組;2:LPC組;3:葛根素(10-6 mol/L)組;4:葛根素(10-5 mol/L)組;5:葛根素(10-4 mol/L)組;6:PDTC組]
3 討論
MMPs是一組同源的以無活性酶原形式分泌的Zn2+依賴性肽鏈內切酶,能分解細胞外基質(extracellular matrix,ECM),并參與胚胎正常發育及組織重塑。激活后的MMPs參與多種病理過程,如炎癥反應、腫瘤轉移和腦血管疾病等。另外,大量研究證實,激活后的MMPs在AS的發生和發展中起著重要的作用[7-8]。MMP-9即明膠酶B,是MMPs家族成員之一。研究證實,MMP-9可加劇炎癥反應,從而促進AS的形成[9]。MMP-9的高表達可降解細胞外基質,促進血管平滑肌細胞的增殖和移行。另外,過度分泌的MMP-9也可通過降解纖維帽內的膠原,促進動脈粥樣硬化斑塊的破裂[10],從而增加惡性心血管病事件的危險[11]。臨床研究表明,冠狀動脈內徑狹窄程度與MMP-9呈正相關,冠心病患者血清MMP-9水平高于正常人[12],提示MMP-9與AS的發生、發展、斑塊破裂、冠狀動脈血管閉塞以及急性心血管事件的發生有著密切的關系。因此,如能抑制MMP-9的過度合成,將有可能延緩AS的形成和降低急性心血管事件的發生。
葛根素是豆科屬植物葛根中異黃酮的主要有效成分,其化學名為4,7-二羥基-8-β-D-葡萄糖基異黃酮。研究發現,葛根素具有抗心律失常、降血壓、擴張冠狀動脈、減輕缺血-再灌注損傷、影響血流動力學等作用,因而在心血管系統疾病中廣泛應用。
本實驗觀察到,LPC能夠增加SMCs MMP-9 mRNA表達和培養上清液中的MMP-9含量,而預先應用不同濃度的葛根素處理后,SMCs MMP-9 mRNA表達和上清液中的MMP-9含量均明顯降低,并且隨著葛根素濃度的升高,上述抑制效應也逐漸增強,即具有劑量依賴性。由于NF-κB是調節基因轉錄的關鍵因子之一,參與許多基因特別是與機體防御功能及炎癥反應有關的基因的表達調控,因此推測,本實驗中MMP-9表達的變化可能與NF-κB活性變化有關。筆者用Western blot檢測了SMCs核提取物中NF-κB p65蛋白的表達水平,以此來反映NF-κB的活性。結果顯示,LPC能明顯增加NF-κB p65蛋白的表達,而預先應用不同濃度的葛根素干預后,在顯著降低NF-κB活性的同時,SMCs MMP-9 mRNA表達和上清液中MMP-9含量也明顯減少,這與預先應用NF-κB特異性阻斷劑PDTC得到的結果一致。以上結果說明,葛根素可能通過抑制NF-κB的活性而抑制MMP-9的過度合成,進而延緩AS的形成和降低急性心血管事件的發生。
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對標學習計劃范文6
【關鍵詞】 二烯丙基三硫化物；，血管成形術；，支架；，iNOS蛋白;，，一氧化氮
Effect of diallyl trisulfide coated stents on iNOS protein expression and NO level in canine models of coronary restenosis
【Abstract】 AIM: To investigate the effect of diallyl trisulfide coated stents on iNOS protein expression and NO level in the canine models of coronary restenosis， and to explore the mechanisms of diallyl trisulfide coated stents inhibiting neointima formation. METHODS: The diallyl trisulfide coated stent and the control stent were implanted into distal and proximal left circumflex coronary arteries of 20 dogs， respectively. They were sacrificed 1， 3， 10 and 28 d after stenting. The expression of iNOS proteins was assessed by Western blot and the NO level was measured by nitrate reductase. RESULTS: Expression of iNOS proteins was seen on day 1 following the control stent implanting， developed on day 3， peaked on day 10 and lasted till day 28. iNOS expressions at all time points in diallyl trisulfide coated stent group were higher than those in control stent group. Compared with normal blood vessel tissue， the NO production after stenting decreased on day 1， increased on day 3， maximized on day 10， went down to its prestenting level on day 28. At all time points， NO levels in allitridistented sites were higher than those in controlstented sites. CONCLUSION: Diallyl trisulfide coated stent could significantly enhance the iNOS expression and NO production， which may play an important role in inhibiting neointimal hyperplasia.
【Keywords】 diallyl trisulfide；angioplasty; stent; iNOS proteins; nitric oxide
【摘要】 目的：研究二烯丙基三硫化物涂層支架對犬冠狀動脈損傷后血管壁內誘導型一氧化氮合酶（iNOS）蛋白表達及NO水平的影響. 方法：進行冠狀動脈左回旋支支架置入術的犬，將二烯丙基三硫化物涂層支架和對照支架分別置入左回旋支的遠端和近端. 術后1，3，10和28 d分別處死動物，蛋白質印跡雜交法測定血管壁中iNOS蛋白的表達、硝酸還原酶法檢測NO水平. 結果： 對照支架組術后1 d血管壁中有少量iNOS蛋白表達，3 d表達增加，10 d達高峰，28 d時仍有表達，二烯丙基三硫化物涂層支架組iNOS蛋白在各時間點的表達量均高于對照支架組；對照支架組術后1 d時NO生成量低于正常組織，3 d時NO水平升高，10 d時最高，28 d時降至基線水平，二烯丙基三硫化物涂層支架組各時間點的NO水平明顯高于對照支架組. 結論：二烯丙基三硫化物涂層支架可顯著增加iNOS表達，并提升NO產量，提示二烯丙基三硫化物涂層支架可能是抑制內膜增生的一個重要機制.
【關鍵詞】 二烯丙基三硫化物； 血管成形術； 支架； iNOS蛋白; 一氧化氮
【中圖號】 R541.405
0引言
研究已證實血管損傷后誘導型一氧化氮合酶（iNOS）在血管平滑肌細胞（VSMC）中大量表達［1-4］，但這種高表達對內膜增殖的意義尚處在爭議之中. 先前的實驗結果表明二烯丙基三硫化物涂層支架可顯著抑制犬冠狀動脈損傷后內膜增生［5］. 我們通過觀察二烯丙基三硫化物涂層支架對犬冠狀動脈損傷后血管壁內iNOS蛋白表達及NO水平的影響，來探討iNOS在內膜增生中的作用，并進一步闡明二烯丙基三硫化物涂層支架的作用機制.
1材料和方法
1.1材料苯甲基磺酰氟（PMSF）、十二烷基硫酸鈉（SDS），Tris，NP10，Leupeptin和蛋白標準品均為Sigma公司產品；Lumiol發光底物和iNOS多克隆抗體為Santa Cruz產品；HRP耦聯山羊抗兔IgG購自北京中山公司；NO試劑盒，南京聚力生物醫學工程研究所；密度掃描儀，美國BioRad，Model GS700；顯微鏡微機彩色圖像處理系統，BHEC型，北京惠中公司.
1.2方法
1.2.1模型的建立雜種犬，體質量25~30 kg，呈仰臥位縛于導管床，建立靜脈通道并予以心電監護. 戊巴比妥鈉麻醉后右股動脈穿刺，插入自行塑型的7F冠狀動脈導引管進行冠狀動脈造影，將支架用生理鹽水濕潤后固定在PTCA球囊上（球囊/動脈直徑之比為1.3∶1），將二烯丙基三硫化物涂層支架和對照支架（制作方法同二烯丙基三硫化物涂層支架，只是不浸泡二烯丙基三硫化物液）分別植入左回旋支的遠端和近端. 術后口飼阿斯匹林250 mg/d至處死.
1.2.2病理學檢查術后28 d，取出支架置入處冠狀動脈血管于40 g/L甲醛中固定，帶支架的血管用塑料包埋，碳化鎢鋼刀切片，HE染色，光鏡下觀察. 計算機圖像分析系統測量內膜面積平均的內膜（每個支架絲至管腔的距離）和中膜厚度（相鄰兩個支架絲之間的中膜的厚度）.
1.2.3蛋白質Western blot支架置入術后1，3，10和28 d（n=8）分別處死動物，取出支架置入處冠狀動脈血管. 剝離血管外附著的結締組織，剪碎，加入1 mL裂解液（10 mmol/L Tris和10 g/L SDS），冰浴條件下進行組織勻漿. 用考馬斯亮藍方法測蛋白質的濃度. 根據標準曲線計算樣本蛋白濃度. 取15 μg蛋白，加入上樣緩沖液，煮沸5 min后進行120 g/L SDSPAGE電轉膜，用1∶1000的抗iNOS多克隆抗體進行雜交，采用1∶5000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，利用化學發光法進行顯色反應，用圖像分析系統對所得區帶積分光密度進行掃描.
1.2.4一氧化氮（NO）水平測定標本處理、儲存和組織勻漿液提取同Western blot，-80℃保存. 按照試劑盒說明測定NO水平.
統計學處理: 數據用x±s表示，SPSS統計軟件處理，兩組數據間比較采用t檢驗，多組比較采用多個樣本均數比較的ANOVA方差分析，兩兩比較采用NewmanKeuls法q檢驗. P
2結果
2.1病理學術后28 d，對照支架組血管內膜明顯增生，支架絲處中膜受壓，輕度萎縮；二烯丙基三硫化物支架組血管內膜增生較對照組顯著減輕（圖1），計算機圖像分析結果有差異（表1）.
2.2支架置入術后iNOS蛋白表達Western blot及其積分光密度分析結果顯示，正常動脈的iNOS蛋白表達量為0.80±0.12，對照支架置入術后1 d血管壁中有少量iNOS蛋白（4.3±0.6）表達，術后3 d（14.1±2.7）表達增加，術后10 d（37.3±2.5）達高峰，28 d（11.5±1.3）時仍可檢測到iNOS蛋白表達（圖2）. 二烯丙基三硫化物涂層支架組iNOS蛋白表達的動態變化規律同對照支架組，但在各時間點的表達量（1 d：29±4；3 d：49.9±3.0；10 d：101±12；28 d：38±3，P均＜0.01）均高于對照支架組.
圖1病理學觀察支架置入28 d后內膜增生情況HE ×200（略）
表1術后28 d， 二烯丙基三硫化物涂層支架組和對照支架組結果比較（略）
圖2對照支架和二烯丙基三硫化物涂層支架置入犬冠狀動脈后iNOS蛋白表達（略）
2.3支架置入術后一氧化氮水平支架置入后血管組織中一氧化氮水平變化與iNOS蛋白變化基本一致，術后1 d時一氧化氮生成量［(42±7) μmol/L］低于正常組織［(110±12) μmol/L］，3 d時一氧化氮水平［(126±17) μmol/L］升高，10 d時［(396±39) μmol/L］最高，28 d時為［(195±41) μmol/L］降至基線水平. 二烯丙基三硫化物涂層支架組術后1， 3和10 d時一氧化氮水平［(170±29) μmol/L，P＜0.05；(393±58) μmol/L，P＜0.05；(780±115) μmol/L，P＜0.01］明顯高于對照支架組，28 d時一氧化氮水平［(278±37) μmol/L］與對照支架組無明顯差異(P>0.05).
3討論
血管損傷后iNOS高表達已成共識. 血管損傷后iNOS高表達、NO大量產生，因NO具有舒張血管，抑制血小板粘附、血栓形成，抑制VSMC增殖和細胞外基質合成以及促進VSMC凋亡等作用，故有利于防止損傷后血管收縮和血栓形成［1-4］；但也有研究者發現去除iNOS基因的小鼠在血管損傷后內膜增生程度反而比正常小鼠減輕［6］，從而認為iNOS基因的高表達可能促進了內膜增生. 本研究結果首先證實了支架置入后iNOS大量表達這一觀點，還發現二烯丙基三硫化物涂層支架可使損傷局部iNOS蛋白表達進一步增加的同時抑制了內膜增生，表明iNOS的高表達可減輕血管損傷后內膜增生.
那么為何血管損傷后iNOS高表達，NO大量生成，VSMC增殖仍然旺盛呢？Yan等［1］解釋了這一看似矛盾的現象，他們發現血管內膜和中膜SMC在受到誘導后均可表達iNOS，并產生NO，但相同濃度細胞因子刺激下，內膜SMC表達iNOS和產生NO量遠高于中膜（8~10倍），然而內膜SMC增殖被抑制程度卻遠低于中膜，這表明內膜SMC不僅具有在受刺激后表達更多iNOS的能力，而且對iNOS的產物―NO的抗增殖作用具有抗性. 這就解釋了為什么內膜SMC可以在高濃度NO環境下仍然存活并具有較高的增殖特性. 也就是說，雖然血管損傷后iNOS大量表達可產生高水平NO，但對于“遲鈍”的內膜SMC來說依然是不夠的. 我們觀察到支架置入損傷血管后雖然iNOS高表達，NO水平上升，但內膜增生非常顯著，二烯丙基三硫化物涂層支架進一步增加損傷局部iNOS蛋白表達量，提高NO水平后，內膜增生受到抑制也證實了這一發現.
二烯丙基三硫化物具有抗血栓、擴血管以及抑制VSMC增殖等多種生物學作用，而這些生物學效應也被NO所具有的，提示二烯丙基三硫化物可能通過NO途徑發揮作用. 為此，研究者分別從體外、體內和臨床觀察等不同角度研究了二烯丙基三硫化物與NO，iNOS的關系［7-12］，發現二烯丙基三硫化物在體外可通過NO產生舒血管作用、提高血小板內和胎盤絨毛膜組織和絨毛膜癌組織中iNOS和NO水平，進一步體內研究表明二烯丙基三硫化物的舒血管作用與增加NO產量有關，臨床試驗也發現，二烯丙基三硫化物治療冠心病心絞痛的作用與升高患者血漿中NO水平有關. 以上資料顯示了二烯丙基三硫化物的治療效應與iNOS和NO密切相關. 我們首次觀察了二烯丙基三硫化物在體內抑制血管損傷后內膜增生的作用與iNOS和NO的關系，結果顯示二烯丙基三硫化物涂層支架植入血管后iNOS蛋白的表達明顯增加，NO水平顯著升高，提示這可能是二烯丙基三硫化物涂層支架抑制內膜增生的一個重要機制.
支架置入術后血管壁iNOS動態高表達和NO水平的變化，是機體的一種保護性代償反應；二烯丙基三硫化物涂層支架可顯著增加iNOS表達，提升NO產量，這可能是大蒜素涂層支架抑制內膜增生的一個重要途徑，表明血管損傷后提高局部NO濃度可減輕再狹窄，這為將來開發新的支架提供了思路.
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