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簡述生物技術制藥的特征范文1
關鍵詞：大型真菌；野外采集；顯微觀察；分子生物學研究
中圖分類號：Q34文獻標識碼：A文章編號：16749944（2016）18017606
1引言
真菌是一個古老的生物類群，4億多年前泥盆紀時期的化石中就發現有真菌。大型真菌是菌物中的一個重要類群，指菌物中子實體大型的一類真菌，泛指廣義上的Mushroom 或Macrofungi，即譯為蘑菇或蕈菌，地球上的大型真菌資源非常豐富，很多種類是十分美味的食用菌，具有較高的營養價值和藥用價值，是目前菌物中最有開發應用前景的一類，但是也有很多種類具有劇毒，所以受到廣泛的關注。
自16世紀以來，各國科學家就廣泛開展了對大型真菌的研究。1735年，在林奈建立的兩界分類系統（動物界和植物界）中，把真菌列入植物界；1860年Hogg和1866年Haeckel在先后建立的三界分類系統（原生生物界、動物界和植物界）中，把真菌列入原生生物界；在Copeland（1938）建立的四界分類系統（菌界、原生生物界、動物界和植物界）中，把真菌列入原生生物界；在1969 在Wittaker建立的五界分類系統（原核生物界、原生生物界、植物界、真菌界和動物界）中，才把真菌單獨作為一界處理。1851～1950年間是近代真菌學全面發展的時期，20世紀50年代以來，現代真菌學飛速發展，有關真菌的研究著作層出不窮。據估計，全球共有真菌150萬種以上，而目前僅知其中的4.6%，約7萬種，其中大型真菌約有 1萬種[2～3]。我國相關研究開展較晚，但在廣大真菌學者研究的基礎上，也已摸索出一套野外采集及分類研究分析的方法。20世紀40年代開始對大型真菌進行研究，已記載了大型真菌1200屬、5000多種[4～6]，我國目前已知的各類大型真菌約3萬多種，其中食、藥用菌近1000種，已經人工栽培的約100余種[7]。隨著分子生物學技術的迅猛發展，真菌分類學已經從表型分型進入了基因分型的新時代，為方便廣大真菌愛好者及初學者迅速掌握大型真菌野外采集及研究方法，本文將在中國科學院昆明植物研究所期間所學到的研究方法介紹如下。
2野外采集
2.1采樣策略
大型真菌的分布和它們的生長習息相關，例如有些子實體有著朝生暮死的特性，這為研究帶來很多不確定性，在一年中的某些時候，采樣地點的很多物種并不會結實，因此單次采集所得的結果并不可靠，為了對采樣地點的大型真菌生態學特性做出正確的估計，在每年結實期內的多次采集是必不可少的。再例如有些子實體如乳牛肝菌等與針葉樹有嚴格的共生關系，故在采樣前可依照中國植物志[8]針葉樹的分布進行有針對性的設計路線。中國的大型真菌分布較廣，根據南北不同的出菇季節，可每年進行多次出菇采集。
2.2大型真菌野外采集的準備
自制子實體干燥烘箱（包括聯創牌PCT取暖器、定制鐵板防風罩和網眼托盤）、吸水紙、自封袋、硅膠、裝有Buffer 的離心管、酒精燈、鑷子、小勺、GPS 定位儀、數碼相機、腳架、采集刀、記錄筆、記錄紙、反光板、遮陽傘、采集籃、記錄紙。
2.3野外工作
在野外采集過程中，為了更準確的反映真菌的生境及子實體的新鮮特征，對子實體進行拍照時建議使用腳架固定數碼相機，以保證照片的清晰度，光線不足時使用反光板，光線太明亮時使用遮陽傘，拍照時盡量連同生境一同體現，同時還要用采集刀挖出完整的子實體進行拍照，注意動作要輕，不能把菌根或者假菌根挖斷以保證子實體基部及菌根的完整性，以方便對其描述和研究的完整性和準確性。另外，菌蓋上的附著物如落葉、小蟲等也不要彈掉，可判定是否有毒；菌蓋上的鱗片、絨毛等應保持完整，蓋緣的菌幕殘片也要注意保護，作為鑒定的重要依據；菌柄上的絨毛、鱗片等均要保持其完整；腹菌類基部有菌索深入土中，要注意采??；肉質、膠質和蠟質的菌類，保持各部完整[9]。隨后用GPS 定位儀定位海拔并記錄，同時記錄子實體所處的生態環境，如果是共生型真菌要盡可能詳盡地記錄共生樹種，土壤等條件。因為野外采集時間有限，更詳細的記錄需要回到營地進行補充，另外，建議兩人一組，當發現目標，一人進行拍攝，另一人記錄信息，以節省時間和精力。最后，將挖出的完整子實體置于不沾的吸水紙中，輕輕包裹好后編號置于采集籃中帶回。
當日采集結束后要及時打開吸水紙將菌物取出通風，按照編號在記錄紙上對子實體新鮮狀態作詳細的記錄，主要包括：菌蓋的形狀、大小、顏色，是否粘，有無斑點或疣突，菌蓋中部及邊緣的特征；菌蓋菌肉的厚度、顏色、味道、氣味、受傷是否變色；菌褶的形狀、大小及著生方式，有無分泌物如乳滴，有無殘留菌幕；菌褶與菌柄的連接方式，柄受傷或觸摸后顏色的變化，上下部的顏色過渡，是否中空或半中空，柄內菌肉的的顏色，有無腺點及菌環，基部是否膨大或有假根，菌柄的長短粗細等，這些都是極其重要的分類依據，尤其需要注意顏色的變化。同時，還要記錄采集地、采集人、采集時間、種名等信息。
記錄完成后進行標本的制作，首先將自制子實體干燥烘箱準備好：將鐵板防風罩支好，插入網眼托盤，將烘干用的PCT取暖器置于底層，風口向上，圍上布簾，但注意留上部通風。用酒精燈滅過菌的鑷子從每一號標本上撕取或用小刀切取子實層的一小塊，再用裁好的吸水紙包好后置于盛有硅膠干燥劑的2號自封袋中制作成分子材料，或者同樣的方法獲得一小塊置于盛有Buffer的離心管中保存，此兩種方法用于進一步的分子系統學研究。剩下的子實體縱向剖開掛上標簽（與記錄紙上的號必須一致）后置于網眼托盤上，打開熱風開關進行烘干，一般為6～8 h，之后通風回潮20 min左右，根據大小裝入合適的自封袋中，野外采集任務結束后帶回存放于標本館中作為憑證標本。存放之前為每一份標本制作一個貼有標簽的標本袋，標簽上需登記標本館號、標本名稱、采集地、采集日期、采集人、采集號及鑒定人等完整信息，并在標本袋中附上標本記錄紙的復印件，然后將標本袋整理裝箱，用特大號自封袋將箱子連同里面的標本一并密封放入標本館的冰柜中冷凍兩個星期，目的是殺死蟲卵，最后從冰柜中取出去掉自封袋放置一天進行回潮，待回潮完畢將標本按照標本館號存入標本庫中永久保存。同時，要在標本館的登記簿上登記相應的入館信息。特別注意的是，定學名和顏色時，可以參考《中國的真菌》（ 鄧叔群，1963） 、《中國大型真菌》（ 卯曉嵐，2000）[7]、《中國大型真菌原色圖鑒》（ 黃年來，1998）[10]、《中國藥用真菌圖鑒》（ 應建浙）[11]、《中國野生大型真菌彩色圖鑒》（ 劉旭東）[12]、《Farver I Farver》（Andrea kornerup og Johan Henrik Wanscher）色譜[13]等工具書。
3顯微觀察
3.1顯微觀察準備
顯微鏡（DM-2500 of LEICA in Germany，帶顯微鏡DFC-450C成像繪圖管，用于子實體的顯微形態觀察和繪圖）、刀片（上海吉列刀片有限公司“飛鷹牌”S-74 型不銹鋼雙面刀FC片）、電腦、拍照軟件（Leica Application suite V4.3.0）、載玻片、蓋玻片、鑷子、吸水紙、鉛筆。
3.2顯微觀察用試劑
KOH：將5 g或10 g的氫氧化鉀溶解于95 mL或90 mL蒸餾水中至完全溶解，制成5%或10%的氫氧化鉀溶液，常溫放置，用于干燥的子實體標本的組織恢復，便于顯微鏡觀察。
剛果紅：用鈍頭鑷子夾取少許剛果紅棕紅色粉末溶于盛有蒸餾水的滴瓶中，混勻置于棕色瓶中常溫放置（以防止時間長了產生沉淀影響觀察），用于子實體組織的染色，便于觀察和顯微繪圖。
蒸餾水：均為蒸餾兩次的ddH2O。
3.3顯微觀察
顯微觀察是系統分類的關鍵環節，切片時，左手持干標本，右手握刀片，用手臂的力量帶動刀片切取要觀察的組織結構，切取的組織盡可能要薄，以方便觀察。觀察內容主要包括：擔子的形狀、大小、化學特征；擔子小梗的大?。粨咦拥男螤?，大小；側生囊狀體、緣生囊狀體和柄生囊狀體的有無、形狀、大小、是否含有內含物及在KOH溶液和梅試劑中的成色反應；蓋表結構和柄表結構；菌髓菌絲等。將切取的待觀察組織塊放入載玻片上滴有5%或10%KOH溶液的液滴中，趕走組織塊中的氣泡，浸泡1～2 min使其組織恢復后，蓋上蓋玻片。然后在載玻片的一端滴一滴剛果紅溶液，用吸水紙從另一側吸引，使組織塊染色，或者在蓋蓋片之前，在有組織塊的KOH溶液旁邊滴一滴剛果紅溶液，用刀尖使其混勻，這樣可以使要觀察的組織塊更為均勻地染色。連接電腦與顯微鏡，觀察時先用10×低倍鏡進行觀察，然后在10×100 油鏡下觀察并詳細記錄各部位的特征，再用Leica Application suite V4.3.0軟件分別對蓋表皮、菌肉、孢子、擔子、囊狀體、柄表皮等進行拍照和測量，如果需要手繪圖的，可以按比例借助繪圖管繪制圖像，繪制完成后再用硫酸紙印描一遍，掃描至電腦中，用Adobe photoshop CS3修圖后方可在文中使用。具體操作如下。
以切蓋表皮為例，如果是完整的子實體，先將子實體沿縱軸剖開，但是為方便烘干，多數情況在野外已將子實體縱向剖為兩半，然后在蓋緣至中心的1/2 處可將刀片與菌蓋表面垂直，沿菌蓋徑向做切片，盡可能越薄越好，一次可多切幾片組織塊，或者用鑷子在蓋表皮上撕取，注意撕取時鱗片和表皮分開撕取。先在5%KOH中觀察，然后用剛果紅染色后進行繪圖或者拍照。根據菌物的不同，可適當延長組織塊復水時間，保證觀察效果。蓋表皮菌絲及一些簇生或叢生的結構一般會比較聚集不方便觀察，可以用橡皮或筆輕壓臨時裝片，使其結構散開，方法是按住蓋玻片的兩個對角，以穩定待觀察的組織塊，右手用橡皮或筆末端輕敲玻片。由于菌絲長度一般較長無法測得，可進行拍照并測量菌絲的寬度，將比例尺調至10 μm，需要測得一個最粗菌絲的寬度，再測一個最細的寬度，最后測10個均勻大小的菌絲的寬度，算出均值。其他部位的觀察類似，可以測量長度的結構需要同時測量長度和寬度。注意擔孢子在測量時因隨機尋找至少10-20個靜止不動的成熟孢子，選取孢子的側面觀（看到孢子的臍突位于孢子頂端，孢子兩端都清晰），測量其長和寬并繪圖或拍照，注意臍突不在測量范圍內，孢子的大小以長乘以寬表示：（a）b-c（d）；Q 表示擔孢子的長寬比，Q = a±b，a 表示擔孢子長寬比的算術平均值，b 為標準差；＼[n/m/p＼]表示測量了p 份標本的m 個子實體上的n個擔孢子。
4分子生物學研究
4.1研究材料及實驗準備
研究所用的分子材料主要來自于野外采集時所保留的分子材料及標本館的標本。所用工具設備有記號筆、研磨棒、離心管、錐形瓶、石英砂、液氮、鑷子、酒精燈、移液槍、槍頭、冰浴盒、微波爐、高壓蒸汽滅菌、SCILOGEX離心機、METTLER TOLEDO pl203電子天平、SORVALL離心機、WD-9403C紫外成像儀、TaKaRa PCR熱循環儀、DRY BATH干式恒溫器、Thermo Gene company limited DNA檢測儀。
4.2分子實驗用試劑
1mol/LTris-Hcl：將12.11g Tris （三羥甲基氨基甲烷）充分溶解于90 mL ddH2O 中，加入濃鹽酸調節pH值至所需值，加ddH2O定容至100 mL，使最終濃度為1 mol/L，1.034×105 Pa 高壓蒸汽滅菌15min。
0.5 mol/L EDTA（pH8.0）：將46.5 g EDTA?Na?2H2O（二水乙二胺四乙酸二鈉）充分溶解于200 mL ddH2O中，用NaOH 調節溶液的pH 值至8.0，然后用ddH2O定容至250 mL，1.034×105 Pa高壓蒸汽滅菌15 min。
50×TAE：將242 g Tris （三羥甲基氨基甲烷）溶于500 mL ddH2O中，加入57.1 mL冰醋酸，100 mL 0.5 mol/L EDTA（pH8.0），然后用ddH2O定容至1000 mL。
4×CTAB 緩沖液： 將100 mL 1 mol/L Tris-HCl，40 mL 0.5 mol/L EDTA（pH8.0），82 g NaCl，40 g CTAB充分溶于800 mLddH2O中，定容至1000 mL，1.034×105 Pa 高壓蒸汽滅菌15 min。
去多糖Buffer：將100 mL 1 mol/L Tris-HCl，50 mL 0.5 mol/L EDTA（pH8.0），7.305 g NaCl，充分溶于300 mL ddH2O中，定容至500 mL，1.034×105 Pa 高壓蒸汽滅菌15 min，備用。
5 mol/L CH3COOK：將49.1 g KAc（醋酸鉀）充分溶解于90 mL ddH2O中，加ddH2O定容至100 mL，1.034×105 Pa 高壓蒸汽滅菌15 min。
1 mol/L CaCl2：將11.1 g CaCl2充分溶解于80 mL ddH2O中，定容至100 mL，-20 ℃保存。
50 mg/mL 氨芐青霉素：將5 g氨芐青霉素充分溶解于80 mL ddH2O中，然后加ddH2O定容至100 mL，用孔徑為0.22 μm濾器過濾除菌，分裝成1 mL小份貯存于-20 ℃。在使用時，每100 mL LB培養基加入貯存液100 μL，使工作濃度為50 μg/mL。
TE 緩沖液：80 mL ddH2O 中加入1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）1 mL 和0.5 mol/LEDTA（pH8.0）200 μL，充分混勻，加ddH2O定容至100 mL，1.034×105 Pa 高壓蒸汽滅菌15 min，備用。
1%溴酚藍（1% bromophenol blue）：1 g溴酚藍溶于100 g水中。
4.3分子研究方法
4.3.1DNA 的提?。–TAB 法[14]）
獲取高質量的總DNA是進行分子生物學研究的前提和基礎，大型真菌的細胞壁主要由幾丁質和纖維素組成，以幾丁質為主，幾丁質具有保護作用，使得細胞壁堅實，不易裂解[15]，因此在研磨過程中，需要把樣品磨至細粉狀，否則會影響DNA產量及質量；但研磨時間不宜過長，樣品會因長時間研磨而發生褐變反應，最終也會影響DNA產量及質量，故操作時應盡量在最短時間內迅速把樣品研磨成細粉狀，以便提高DNA產量和質量[16]，可以利用液氮快速冷凍進行研磨，如果是比較容易研磨的樣品或者新鮮的樣品也可以不用液氮。下面介紹一種本實驗室常用的DNA 提取法。
（1）根據實驗需要準備1. 5 mL離心管數個，用記號筆在離心管蓋上標記樣品號。用滅過菌的鑷子夾取適量干燥的分子材料放入離心管中，用移液槍加入500 μL4×CTAB緩沖液浸泡半小時左右，再加入少量石英砂，用研杵充分研磨，或者先加入200 μL4×CTAB緩沖液和少量石英砂研磨至糊狀，再加入300 μL4×CTAB 緩沖液繼續研磨液直至材料細膩均勻；也可利用液氮快速冷凍進行研磨；
（2）提前10 min將置于-20 ℃保存DDT取出，常溫下融化，每管30 μL加入離心管中，充分混勻；
（3）將離心管放入調至65 ℃的干式恒溫器中，放置3 h（老材料5 h），期間不定時輕搖；
（4）取出離心管，在離心管中加入200 μL 3M的CH3COOK溶液，充分混勻，置于冰浴盒中冰浴30 min；
（5）冰浴后取出離心管，加入500ìL氯仿-異戊醇（V∶V=24∶1），輕搖2～3 min，置于離心機中10000 r/min離心10 min，從離心機中輕輕取出離心管，避免劇烈震蕩，吸取上清液導入新的離心管中并用記號筆標注對應的號，盡量避免吸到下層沉淀；
（6）在離心管中加入等體積的氯仿-異戊醇（V∶V=24∶1），輕搖2～3 min，置于離心機中10000 r/min離心10 min，從離心機中輕輕取出離心管，吸取上清液棄下清液導入新離心管，注意盡量不要取到下層的沉淀；
（7）向盛有上清液的離心管中加入2/3 體積-20 ℃下預冷的無水乙醇，輕搖，放于-20 ℃的冰箱中，沉降過夜；
（8）第二天從冰箱中取出離心管，置于離心機中10000 r/min 離心10 min，棄上清液，注意動作要輕，防止DNA丟失；
（9）加入200 μL 70%的乙醇洗兩次，然后再用無水乙醇洗一次，每次加入酒精洗滌時都要置于離心機中13000 r/min離心2 min，注意棄酒精時避免DNA丟失；
（10）將開口的離心管放于調至37 ℃的烘箱或干式恒溫器中約0.5 h，使乙醇徹底揮發，可以聞一下無酒精味證明酒精已揮發；
（11）干燥后，加入200 μL滅過菌的ddH2O溶解DNA，搖勻，制成原液，保溫30 min，置于冰箱-4 ℃冷藏備用。
4.3.2DNA含量檢測
首先將DNA檢測儀與電腦連接上，然后點擊電腦桌面上的NaNoDrop 2000/2000C軟件，在打開的窗口中點擊Nuclic Acid按鈕，進入到測試頁面。浸泡于酒精中的酒精棉擠干，擦拭儀器的探頭，酒精揮發干后先用移液槍滴1 μL的ddH2O，蓋上蓋子，然后單擊對話框中的Blank按鈕，進行調試，沒有問題后可以開始測DNA樣品的含量。注意每次測之前都要用酒精棉對探頭進行擦拭以免污染，酒精揮發干凈后再在探頭上滴1 μL 的待測樣品，取樣前搖勻，每次換槍頭避免污染。測試后得到吸收曲線及DNA含量，做好記錄，含量和峰值均達標的進行下一步操作，反之摒棄。
4.3.3PCR（Polymerase Chain Reaction）擴增
（1）PCR原理。在DNA聚合酶的催化下，以特定的DNA為模板和特定的核酸片段即PCR引物為擴增起點和終點，通過變性、退火、延伸等步驟，在體外體系中復制出大量與母鏈模板中所需的DN段互補的子鏈DNA的過程。
（2）所需引物。在對大型真菌進行分子系統學研究時，引物的主體通常是一段5’3’的與靶序列嚴格互補的寡核苷酸短鏈，根據實驗的不同目的，所選取的基因片段不同，一般可以選取ITS、mtLSU、mtSSU、nLSU、1 EF1a 等多基因片段進行篩選和分析。由于ITS的序列分析能實質性地反映出屬間、種間以及菌株間的堿基對差異，此外ITS序列片段較小，人們可以從不太長的序列中獲得足夠的信息，易于分析，目前已被廣泛應用于真菌屬內不同種間或近似屬間的系統發育研究中[17]，并作為主要的分析方法應用于大型真菌研究中。比較常用的ITS通用引物是：ITS1/ITS4；ITSF/ITS4；ITS5/ITS4。
（3）PCR 擴增反應體系。一般選用25 μL體系，包括10×Buffer（withMg2+）2.5 μL，2.5mM dNTPs 2.0 μL，0.1%BSA 2.5 μL，10 μM引物各1.5 μL，5U/μL 的TaqDNA聚合酶0.2 μL，DNA 模板5 μL，最后用ddH2O定容至25 μL。
（4）PCR 擴增反應熱循環參數。PCR反應過程實際上是一個溫度循環變化的過程，一般包括變性―退火―延伸三個基本反應步驟，其基本步驟如下：94 ℃變性5 min，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，連續35個循環；94 ℃變性1 min，48～53 ℃退火90 s，使寡核苷酸引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；72 ℃延伸2 min，在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈；循環結束后72 ℃延伸10 min，最后4 ℃或12 ℃保存。經過一定數量的循環之后，待擴目的DN段的數量將被擴增放大幾百萬倍。
4.3.4瓊脂糖制膠電泳檢測PCR 擴增產物步驟
（1）在電子天平中稱量瓊脂糖粉0.5 g，倒入錐形瓶中；
（2）量取1×TAEBuffer 50 mL，倒入錐形瓶中，搖勻；
（3）將錐形瓶放入微波爐中，調至解凍檔加熱2～3 min使瓊脂糖粉充分溶解于1×TAE Buffer中；
（4）用棉手套從微波爐中取出錐形瓶，室溫冷卻至50～60 ℃，避免劇烈震蕩產生氣泡；
（5）向冷卻后的錐形瓶中加入Gold view核酸染料3 μL搖勻，避免產生氣泡；
（6）將膠液倒至電泳小槽底托中，在具有黑條帶的一側插入梳子，室溫冷卻凝固；
（7）凝固后拔出梳子，將底托連同凝膠一同移至電泳槽中；
（8）向電泳槽中加入1×TAE緩沖液直至沒過凝膠；
（9）依據需要擴增的DNA樣的個數在塑料盒上點1%溴酚藍各1 μL，再將對照（DNA Marker D 2000）和擴增產物分別取3μL 與溴酚藍混勻，注意用移液槍吸取DNA樣時需要更換槍頭，避免污染；
（10）混勻后點樣于制好的瓊脂糖凝膠上，先將DNA Marker 注入到長方形小孔內，再依次按順序點入待測樣，然后在電壓梯度4.5～5.5 V下電泳10～20 min；
（11）取出瓊脂糖凝膠置于紫外成像儀上觀察、照相并記錄結果，陽性產物送樣測序。
4.3.5產物測序
將PCR 擴增產物或克隆后陽性穿刺管送樣測序（上海生工生物工程技術服務有限公司、北京擎科新業生物技術有限公司），測序儀為ABI3730 DNA 測序儀，測序引物分別為PCR 擴增引物和克隆通用引物。
李博，等：中國大型真菌野外采集及分類研究分析方法簡述生物與化工
5序列比對及分子數據分析
測序后，獲得多條相關序列，打開Text文本建成“>種名_標本館號序列”的格式并保存。在電腦中下載BioEdit軟件，可將這些序列建成FASTA格式文本備用。從網頁搜索Blast （ http： // blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. Cgi ），打開后點擊BASIC BLAST下的Nucleotide Blast選項，彈出新對話框，在Enter Query sequence的選項內粘貼FASTA格式文本中的一條序列，點擊Blast按鈕，彈出對話框中就會顯示多條Genbank中相關序列的信息，點擊列表中的Ident選項進行相似度的排序，選取相似度在100%至97%的相關序列并逐條復制這些信息，同樣的方式粘貼至新建的Text文本中；或者另外一種方法是打開BioEdit軟件，點擊Sequence選項，在下拉菜單中點擊New sequence，在彈出對話框中輸入“>種名_標本館號”，再將需要增加的序列粘貼到對話框中，點擊Apply就將Genbank中相關序列最終加入到了實驗得到的序列中，這樣便豐富了相關序列的信息，便于更全方面的研究。所有自測序列和從Genbank中獲得的序列整合在一個Text文檔之后，即構建了一個矩陣，再在BioEdit軟件中打開，點擊Accessory Application，在下拉菜單中單擊Clustalw Multiple alignment，在新對話框中的Number of bootstraps中輸入100-1000，單擊Run clustalw按鈕即可，系統會自動排序。但是系統排序的結果還需要進一步進行手動排序，原則是在“Edit”狀態下通過刪除“D”（Delete gaps with right mouse click）或增加“I”（Insert gaps with right mouse click）選項手動刪除或添加空格以達到縱向對齊的效果，還要對照序列圖譜人工檢查自測序列每一個堿基的準確性，必要時進行簡并堿基替換，方法是在原始序列中查看對應的曲線峰圖，對照峰圖檢查堿基是否異常，如果出現錯誤則回到自己的序列中進行更正。雙向獲得的序列同Chroma人工核對拼接后再用于比對。核對完成之后，以ITS 序列為例， 18s區的“GGAAGGATCATTA”堿基向前的部分和28s區的“TGACCTCAGGCA”以后的部分應該被刪掉，有些序列不足夠長的需在末尾用空格補齊，所有序列做到頭尾完全對齊后，點擊鎖定按鈕將序列鎖定后保存為FASTA格式或者PHILIP格式備用。跑樹一種方法是點擊Clustalx軟件彈出對話框，在File選項中點擊Load sequence選項加載核對好的“FAS.”格式序列，再點擊File選項下的Save sequences as選項，在彈出對話框中選擇NEXUS，然后保存成NEXUS 格式文本文件，雙擊該文件，在對話框最底部粘貼編輯好的“命令”，保存并點擊Start按鈕開始跑樹，即最大簡約性分析（Most parsimony：MP）分析。另一種方法是將PHILIP格式文本文件連同raxml-command軟件和raxmlHPC程序存放入同一個文件中，選中軟件點擊右鍵彈出對話框，在編輯對話框中更改設置，保存后雙擊該軟件即開始跑樹，即最大似然性分析（Maximum Likelihood：ML）。除此之外，比較常用的還有貝葉斯分析（Bayesian Analysis），與最大簡約性分析相比，貝葉斯分析的優點是所需要的運算時間短，可用于快速構建系統發育樹和獲得檢驗概率。
6結語
自然界中真菌種類繁多、形態各異，依靠形態、生化等表型特征來鑒定真菌，既需要豐選項的的鑒定工作經驗又需要較長的檢驗時間，困難較大，尤其是我國有著豐富的植被類群，地理生態環境復雜，故大型真菌種類豐富多樣，對于那些生長條件特殊、形態相似的菌株要通過傳統的表型特征鑒定方法來加以鑒別顯得非常困難，因此，本文結合形態觀察、顯微觀察及分子生物學方法在大型真菌的分子生物學鑒定中的應用作初步的介紹與分析。做好大型真菌的分類，除了對分類學研究具有重要的意義外，還可以更好的服務于人類。例如，大型真菌里很多種類都是美味的野生食用菌，所以很多地區都有采集野生菌食用的傳統[18，19]，常見的有香菇、金針菇、平菇、木耳、銀耳、羊肚菌等，目前很多種類均已人工馴化成功，并投入生產出現在老百姓日常的餐桌，它們既是一類重要的大型食用真菌，又是食品和制藥工業的重要資源；一些大型真菌能夠分解枯死植物，對維持自然界物質循環、生態平衡有重要的作用；此外，很多野生大型真菌都是有毒的，每年全世界都有大型真菌中毒致死事件發生，誤食后會出現腹瀉、嘔吐、精神錯亂等癥狀，嚴重者會出現肝臟、腎臟受損或心力衰竭而導致死亡，出現誤食的原因往往是由于對野生真菌的了解相對缺乏；一些大型真菌能引起樹木病害或損害多種木質產品，對此類病原真菌的認識的加強，有利于預防和減少危害的發生。因此，對大型研究的是十分重要的，相關知識的普及也尤為重要。
致謝
感謝導師孫麗華教授的指導和幫助；感謝中國科學院昆明植物所劉培貴教授提供的科研平臺；感謝實驗室王向華博士在野外采集及科研過程中給予的指導和幫助，感謝時小菲博士前期的工作奠定的基礎；感謝實驗室的同學們在實驗中提供十分有價值的討論和幫助，值此表示誠摯的敬意和衷心的感謝！
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