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表觀遺傳學研究方法范文1
近年研究表明，高等生命遺傳信息的復雜性不僅在于基因組有更多的結構蛋白基因編碼，還在于基因表達調控機制的復雜性。因此基因表達調控是現代分子生物學的核心。其主要探討在不改變DNA序列的條件下改變基因的表達，這種改變不僅可以影響個體的發育，還可以遺傳，因此表觀遺傳學(epigenetics)應運而生。表觀遺傳是指DNA序列未發生改變，而基因表達發生了可遺傳的改變[1]。表觀遺傳改變從3個層面上調控基因的表達[2]，
1.DNA修飾：DNA共價結合一個修飾基團，例如甲基基團(CH3)，使具有相同序列的等位基因處于不同的修飾狀態;
2.蛋白修飾：通過對蛋白進行修飾或者改變蛋白的空間構象來調控基因的表達，例如組蛋白乙酰化等;
3. 非編碼RNA的調控：由非編碼的RNA通過某些機制對基因轉錄或轉錄后進行調控，例如RNA干擾(RNA interference，RNAi)。
表觀遺傳學研究的內容非常廣泛，涉及染色質重塑、DNA甲基化、X染色體失活和非編碼RNA調控等[2]，目前研究最充分的表觀遺傳改變是DNA甲基化。
表觀遺傳學被Feinberg[3]認為是現代醫學的中心，這是因為其有助于解釋個人的遺傳背景、環境因素、老齡化和疾病發生之間的關系。表觀遺傳學可以完成這樣的工作是因為雖然DNA序列沒有發生改變，但是表觀遺傳狀態在人的一生中和不同的組織中是不同的，并且隨著細胞逐漸適應人體內部環境和外部環境的改變，表觀遺傳機制將會通過對基因表達的編程和再次編程過程將這些改變記錄下來[3]。
對于人類疾病，表觀遺傳學認為那是由于正常表型可塑性被破壞的結果。表型可塑性是指同一基因型受環境的不同影響而產生的不同表型，是生物對環境的一種適應。表型的改變包括行為、生理、形態等[4]。第一個由表觀遺傳學機制引起的人類疾病的例子就是癌癥。1983年，研究發現與同一個患者正常的粘膜組織相比，結腸癌細胞DNA存在全面的去甲基化改變[5]。去甲基化被認為可以導致癌癥基因的異?；钴S，同時引起遺傳不穩定性和染色體重組[6]。接著在癌癥抑癌基因的啟動子上發現存在高度甲基化[7～9]。
流行病學是關于人群疾病的研究，而疾病表觀遺傳學的進步只能來源于一門新興的交叉學科，即表觀遺傳流行病學[3]。目前對表觀遺傳流行病學還沒有公認的定義，Waterland and Michels[10]認為表觀遺傳流行病學是研究疾病發生危險與表觀遺傳變異之間關聯的科學，而Jablonka[11]認為暫時的，表觀遺傳流行病學可以被定義為“研究可遺傳的表觀改變對疾病發生和分布的流行病學分支”。表觀遺傳流行病學在傳統的流行病學病例對照研究、暴露測量和風險評估上做了一些改進。其所增加的表觀遺傳測量和統計學上的革新，主要是為了解決某些表觀遺傳方式不符合孟德爾遺傳定律的問題。例如，某些印跡基因，其等位基因表達與否與其是來自于父親還是母親有關，這需要新的模型分析技術。
在表觀遺傳流行病學領域進行的第一項研究，是由De Baun等[12]建立的一個以人群為基礎的臍疝巨舌巨人癥綜合征，beckwithwiedemann syndrome，BWS)登記系統。BWS臨床表現為胚胎和胎盤過度增長、正中腹壁缺陷、耳垂皺紋或耳輪小凹、新生兒低血糖癥、Wilms瘤和其他胚胎腫瘤的發生危險增加，例如腎上腺皮質癌、胚胎性橫紋肌肉瘤和肝母細胞瘤等。BWS是了解腫瘤表觀遺傳學的經典范例，因為它是由少數幾個基因發生表觀遺傳改變而導致的罕見家族性疾病。DeBaun等[12]設計了一個BWS登記系統，由一組專家通過對臨床癥狀、家族史資料和醫院病歷進行嚴格調查，最終獲得了數百個BWS家庭。研究將BWS每個臨床體征發生的危險與每個遺傳缺陷聯系起來，第一個遺傳缺陷就是胰島素樣生長因子II(insulinlike growth factorII， IGF2)基因發生印跡丟失(loss of imprinting，LOI)的改變。IGF2是一個印跡的生長因子基因，正常情況下只有遺傳自父親的等位基因才會表達，但是在BWS中，來自父親和母親的等位基因都表達了。這項研究最重要的結果是，雖然只有大約15 %的BWS患者出現IGF2基因的LOI改變，但是該研究將癌癥的發生與表觀遺傳改變特異的聯系在一起[12]。這是第一個以人群為基礎將表觀遺傳暴露與腫瘤的發生特異的結合起來的范例，從流行病學角度探討表觀遺傳學改變導致人類腫瘤發生機制的實例[12]。同時研究還將其他的表觀遺傳改變與BWS其他表型聯系起來，將長QT內含子轉錄子1基因(long QT intronic transcript1，LIT1)基因的印跡丟失和細胞周期素依賴性激酶(cyclindependent kinase inhibitor，P57KIP2)基因突變與過度增長和正中腹壁缺陷聯系起來，將單親二倍體本身與低血糖癥聯系起來[12]。
二、表觀遺傳流行病學假說
由于表觀遺傳流行病學是一門新興的交叉學科，其學科定義、發展方向和基本理論受到其前身學科流行病學和表觀遺傳學的影響。流行病學的發展方向雖然不斷擴展，但其根本的學科定義和基本理論已經相當成熟。而表觀遺傳學這個學科名稱雖然已經沿用了大約60年，但是學科領域正在不斷擴展，其學科定義的內涵比較大而外延還在不斷延伸中。因此作為下游學科的表觀遺傳流行病學的理論也在不斷更新。目前表觀遺傳流行病學有若干假說，但是這些假說之間關系究竟是何種關系，還有待于進一步驗證，本文僅提出兩個相對成熟的假說。
1.年齡相關性疾病和常見疾病遺傳和表觀遺傳學假說:現代醫學更多關注的是減緩或減輕衰老造成的結果，而不是逆轉和消滅疾病，因為對人類所有組織和器官的功能將隨著時間的推移而逐漸衰退。有人將衰老定義為在相當一段時間內的表型可塑性的缺失[2]。這種可塑性的缺失會使得一些與潛在的與遺傳變異相關的疾病的作用被加強，表現為部分與年齡相關常見疾病的發生，例如心臟病、糖尿病等。但是什么導致了這種表型可塑性缺失?這種缺失與疾病易感性位點的DNA甲基化水平是否存在相互關聯?
Bjornsson等[13]提出了一個模型，可以從表觀遺傳學角度回答上述問題，這就是常見疾病遺傳和表觀遺傳學模型(common disease genetic and epigenetic model，CDGE)。這是一個疾病遺傳易感性模型，同時包括一個表觀遺傳因素與其相互作用。環境因素作用改變了DNA和染色質上的表觀遺傳學標志，例如DNA甲基化依賴于從膳食攝入的蛋氨酸和葉酸，后二者都受到個體營養水平的影響。對小鼠的研究發現，降低膳食中蛋氨酸的水平，可以通過改變agouti基因的DNA甲基化水平而改變其毛發的顏色[14]。給大鼠簡單地攝入低蛋氨酸水平的膳食，可以通過導致其DNA發生去甲基化的方式，誘導其更容易發生肝癌[15]。
在CDGE模型中，表觀遺傳學組還可以間接地與基因組相互作用。一些因素如DNA甲基化轉移酶I和MeCP2蛋白是由基因表達產生，如果基因存在變異，可以通過影響DNA甲基化機器的保真度來影響疾病的易感性。這一機制來自新桿狀線蟲蠕蟲實驗。研究發現，遺傳變異可以影響很多信號途徑，這些途徑似乎與編碼染色質重塑的基因有關[16]。反過來，一些常見的DNA變異所編碼的突變蛋白，如果由于表觀遺傳學原因沒有被表達，也不會產生生物學作用。一個非常明顯的例子是Rutherford和Lindquist[17]進行的果蠅實驗，通過熱休克。這一種外界刺激，可以提高果蠅表觀遺傳學的篩選能力，從而允許一些潛在突變基因表達的頻率更高，但是對生物體本身不會產生嚴重影響。
對一組不同年齡的同卵雙生子同胞的研究發現，提示與年輕的同胞對相比，年齡較大的同胞對個體之間表觀遺傳學標志物，例如DNA甲基化水平的不一致性更大[18]。但是，這項研究沒有探討同一個個體不同時期的表觀遺傳改變情況，所以我們不知道這是由于DNA甲基化水平的變化，還是他們本身就有差異。后來的一項研究沒有發現DNA甲基化水平的變異與年齡之間存在相關，但是這項研究同樣的也沒有分析單個個體的甲基化水平是否隨時間發生變化[19]。
CDGE提供了一個流行病學框架，通過這個框架將表觀遺傳學引入到疾病年齡相關易感性的遺傳研究。在CDGE模型中，表觀遺傳學編碼可以修正有害基因的效應或者受到異常環境因素的影響。因此，將表觀遺傳學引入到人類疾病的流行病學研究中，有助于解釋基因組和環境因素之間的關系，還可以為疾病預防和治療提供新的線索。
2.疾病和健康的發育源性假說:在近40年內，越來越多的流行病學研究提示胎兒宮內生長環境對其一生健康和疾病狀況有著重要的作用。Forsdahl[20]首先通過隊列研究發現，挪威40～69歲人群年齡調整心血管疾病(cardiovascular disease， CVD)死亡率與同一人群嬰兒死亡率呈正相關關系。這一結果提示宮內環境因素決定了個體今后發生CVD的風險。隨后Barker和Osmond[21]發現，在英格蘭和威爾士，新生兒死亡率高的地區，成年人冠心病(coronary heart disease，CHD)死亡率也比較高，提示宮內環境是一個重要的中間變量。
在英國赫特福郡進行的一次回顧性研究發現，新生兒出生體重與CHD病死率之間存在負相關[22]。隨后大量的研究結果都提示，新生兒低出生體重與心臟病[23]、高血壓[24]、II型糖尿病[25]的發病危險增加有關，此外新生兒低出生體重還與異常的血糖胰島素代謝[25]和血清膽固醇濃度[26]變化有關。
宮內環境除了與上述成年期慢性疾病發病危險增加有關，還有假說認為與成年期癌癥的發生有關。1990年Trichopoulos[27]認為，乳腺癌的發生可能與個體胎兒時期宮內因素暴露有關。新生兒高出生體重與其今后發生乳腺癌的危險性增高有關[28，29]。此外，兒童白血病和癌也與新生兒高出生體重有關[30]。因此，有學者提出，胎兒在宮內暴露于較高的生長激素水平，可能會啟動一些潛在的生物學機制，使得新生兒的出生體重和細胞增殖增加，為成人期發生心腦血管疾病、癌癥和其他慢性病設定了相應的風險[29]。
不同的研究采用不同的觀察終點都提示了胎兒早期宮內環境暴露與其今后的疾病狀況存在關聯。Lucas[31]用“編程”一詞來描述在胎嬰兒發育的關鍵或敏感時期，外界的刺激或傷害將對個體出生后造成永久的或長期的影響。Waterland和Garze[32]采用“代謝性印跡”來描述在生命的早期，胎嬰兒在特定的敏感時期，對特定的營養水平的適應性反應，這種反應將會在該個體的成年期長期存在。此外代謝性印跡還提出宮內暴露和結局之間的關系是特異的和可測量的，并且可以用劑量反應關系或閾值關系來表示。
2004年，Lucas和Gluckman等[31～34]提出了人類健康和疾病的發育源性假說(developmental origins of health and disease，DOHaD)，即在哺乳動物出生前和出生后發育的關鍵時期，營養和其他環境刺激將對哺乳動物的發育進程產生影響并且在代謝和慢性疾病易感性上引起永久的改變。盡管很多人群流行病學和動物模型實驗數據支持這個假說，但是關于該假說的生物學機制目前還不清楚。Waterland等[10]認為要理解DOHaD的生物學機制，就需要對表觀遺傳學的定義有個清晰的界定，應當接受Jaenisch和Bird[35]關于表觀遺傳學的新定義，即表觀遺傳除了遺傳基因表達的改變外，還應當包括遺傳基因表達改變的可能性。這個定義上的微小改變是非常關鍵的，這樣表觀遺傳不僅能遺傳基因的表達情況，還可以將應對細胞外信號反應而改變基因表達水平的能力進行遺傳。Waterland等[10]認為，不同的引起個體間表觀遺傳變異的因素都可以導致疾病的發生，除了遺傳和表觀遺傳外，隨機性也可以影響個體表觀遺傳調控的建立。在表觀遺傳機制建立和成熟過程中，環境刺激對出生前和出生后早期的表觀遺傳水平有著重要的影響，所產生的錯誤信息在以后的表觀遺傳復制中被不斷積累，最終導致個體隨著年齡的增長而表觀差異變得越來越大，一些個體更容易發生疾病。
目前大多數關于DOHaD的人群流行病學研究，都是采用出生體重作為新生兒營養水平和宮內發育的標志，盡管出生體重的結果很容易獲得，但是對宮內發育來說這個指標還比較粗，會受到很多因素的影響。今后需要采用一些能夠反映代謝性印跡的分子生物學標志物對DOHaD假說進行研究。
三、表觀遺傳流行病學研究常用的指標
前面已經提及，表觀遺傳學涉及的研究內容非常廣泛，目前研究最充分的是DNA甲基化水平的改變，這也是表觀遺傳流行病學最為常用的指標。DNA甲基化是一種可遺傳的表觀遺傳改變，并且在基因的轉錄表達抑制、X染色體失活、基因印記和基因組穩定中發揮作用。異常的甲基化水平改變與許多疾病的發生有關，包括出生缺陷、腫瘤、糖尿病、心臟病和神經系統疾病[36]。甲基化反應通常發生在DNA序列中位于鳥嘌呤之前的胞嘧啶堿基上，后者通常被稱為CpG雙核苷酸。DNA甲基化是在DNA復制后形成，在胞嘧啶環的第5位碳原子上共價結合的一個甲基，從而形成甲基化胞嘧啶。發生這種表觀遺傳學改變的胞嘧啶占到了哺乳動物基因組總胞嘧啶數的5 %，并且這種改變雖然不是DNA序列的改變，但是可以遺傳。DNA甲基化反應是由一組DNA甲基化轉移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)催化，并且利用S腺苷蛋氨酸(SAM)和DNA作為反應的底物。蛋氨酸、膽堿、葉酸和維生素B12可以直接的提供或者再生甲基單位，并且被證實可以影響DNA的甲基化水平[37]。
對于DNA甲基化的研究，目前有很多方法，黃瓊曉等[38]將這些方法大致分為兩類：一類是從DNMTs的角度，另一類是從DNA甲基化水平的角度進行研究，后者又分為全基因組甲基化水平和位點特異性甲基化水平。目前表觀遺傳流行病學較多采用全基因組甲基化水平作為指標。
由于葉酸可以作為一碳單位的載體參與蛋氨酸循環，為甲基化反應提供甲基單位[37]，因此很多表觀遺傳流行病學研究開始探討葉酸增補對甲基化水平的影響及與腫瘤發病危險之間的關系。例如Rampersaud等[39]的研究發現，葉酸缺乏會顯著降低全基因組甲基化的水平。Pufulete等[40]研究發現，與安慰劑組相比，結腸癌病例每日增補400 μg/d葉酸可以使得白血球全基因組甲基化水平升高31 %，結腸粘膜組織細胞全基因組甲基化水平升高25 %。
除了DNA甲基化外，研究比較充分的表觀遺傳學改變還有染色質重塑，例如絲氨酸的磷酸化、賴氨酸的乙酰化和賴氨酸的泛素化等[3]。但是，目前這些指標在哺乳動物的研究還很少，因此還未被表觀流行病學所利用。
四、表觀遺傳流行病學的未來研究方向
現在越來越多的研究圍繞著疾病表觀遺傳學進行了更加深入的分析，包括全基因組分析和更大人群的研究。這些研究依賴于分析技術的發展，這些技術可以在上百萬個位點深入評價表觀基因組的變化。Feinberg[3]研究常見疾病，如精神分裂癥和孤獨癥所采用的方法是基于全基因組高通量芯片的相對甲基化水平分析(comprehensive high throughout arraybased relative methylation analysis， CHARM)。該方法用于分析全基因組兩百萬個以上CpG雙核苷酸位點。
表觀遺傳流行病學目前仍然存在很多待解決的問題，例如在人群研究和動物模型中應當收集怎樣的科學信息?發生改變的表觀遺傳狀態是否穩定?它們是通過生殖細胞傳遞的嗎?如果是，這種表觀遺傳改變將會持續多少代人?這些表觀遺傳改變是否可以被逆轉?等等[11]。盡管表觀遺傳流行病學非常復雜，但是作為一個新興的領域，豐富了經典流行病學研究的內容，使我們對人類疾病的病因和分布情況有了更加深入的了解，最終可以幫助解釋基因組和環境因素之間的關系，為疾病預防和治療提供新的線索。
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表觀遺傳學研究方法范文2
題目：表觀遺傳學調控NK細胞分化及功能的研究進展
表觀遺傳學 (epigenetics) 是指在基因核苷酸序列不發生變化的情況下, 通過對轉錄表達的調控和轉錄后的調控使基因表達發生變化, 包括DNA甲基化、組蛋白共價修飾、染色質重塑、基因印記、及非編碼RNA、微小RNA (miRNA) 、反義RNA轉錄后調控等[1]。環境、年齡改變、壓力、疾病狀態等, 均可以引起免疫細胞表觀遺傳學改變, 造成免疫系統功能紊亂, 導致疾病的發生與進展。因此, 表觀遺傳學逐漸成為免疫學研究的熱點。
自然殺傷細胞 (natural killer cell, NK) 是天然免疫細胞, 主要來源于造血干細胞, 全身廣泛分布。NK細胞通過一系列細胞生物學過程獲得激活信號, 包括胞外鈣離子內流、細胞骨架重排以及與靶細胞接觸部位免疫突觸形成, 最終通過分泌細胞因子、趨化因子及釋放毒性顆粒執行清除病毒、腫瘤細胞以及發揮免疫調節功能。NK細胞功能異常導致多種疾病發生, 包括感染、腫瘤及自身免疫疾病[2,3]。近年來, 有很多學者先后報道了表觀遺傳學改變對NK細胞增殖、分化及功能的影響, 為NK細胞研究提供了新思路, 為新藥的臨床應用奠定了理論基礎。本文對NK細胞的表觀遺傳學研究進展作一綜述。
1 表觀遺傳學對NK細胞分化的影響
人類NK細胞表面特異性表達CD56或CD16分子, 根據其表達水平將NK細胞分為CD3-CD56bright CD16- (CD56bright) 、CD3-CD56dimCD16+ (CD56dim) 、CD3-CD56-CD16+3個亞群[4]。其中CD56bright亞群為調節性NK細胞, 可以參與適應性免疫調節, 通過分泌細胞因子和趨化因子 (IFN-、TNF-、IL-10、IL-13和GM-CSF) 對樹突狀細胞 (DCs) 、調節性T細胞 (Tregs) 、輔T細胞 (Ths) 及細胞毒性T細胞 (CTLs) 等進行免疫調控[5]。在類風濕關節炎中, NK細胞可以通過分泌IFN-誘導B細胞活化, 促進DC細胞成熟, 并可抑制T細胞向Th17細胞分化[6]。NK細胞分泌IFN-可以促進DC細胞分泌IL-27, 而IL-27可促進IFN-分泌, 這種正反饋參與抑制Th17介導的自身免疫疾病[7]。人和小鼠NK細胞均可通過分泌IFN-可以抑制CD4+T細胞向Tregs分化[8]。CD56dim為功能性NK細胞, 通過穿孔素/顆粒酶途徑、Fas/FasL途徑、TNF-а/TNFR-1途徑、以及抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用 (ADCC) 完成對靶細胞的直接殺傷。近期也有研究者發現, 功能性NK細胞參與適應性免疫的調節, 直接殺傷適應性免疫細胞, 如Th17及濾泡輔T細胞 (Tfh) [9]。而CD3-CD56-CD16+亞群目前研究較少, 目前認為主要發揮ADCC作用。
表觀遺傳學修飾在NK細胞的分化、成熟中發揮了重要作用。早期的研究顯示, IL-15受體信號通路對NK細胞的分化成熟至關重要, E4BP4 (NFIL3) 在其中發揮調節作用, 促進了造血干細胞 (HSC) 向NK細胞分化。動物實驗顯示, E4BP4基因缺陷小鼠NK細胞減少、功能下降, 而過表達E4BP4可增加Id2和Gata3的轉錄, 從而促進HSC向NK細胞分化增加[10]。在NK細胞發育中, 組蛋白甲基化也具有重要調控作用。Yin等[11]研究了zeste基因增強子同源物2 (EZH2) 對早期NK細胞分化的影響。EZH2作為重要的表觀遺傳修飾酶, 是PcG (polycomb group) 蛋白家族的重要成員, 在調控基因表達的過程中起關鍵作用[12]。EZH2主要對組蛋白H3K27進行甲基化, 從而沉默下游基因, 在細胞增殖、分化及腫瘤形成方面都有重要作用[13]。研究者[11]發現, 在小鼠及人中, 選擇性失活EZH2或用小分子抑制其活性后, 可以增加IL-15受體 (CD122+) 陽性的NK祖細胞數量, 并促進成熟NK細胞增殖。NK細胞的擴增及殺傷作用還與CD122及NKG2D有關, NKG2D缺失可降低EZH2抑制劑對促進NK細胞增殖及分化的作用。另外, Tsuyama等[14]研究報道, NKT細胞淋巴瘤患者存在組蛋白去甲基化酶KDM6A基因突變, 此基因與血液腫瘤關系密切, 可能影響NK細胞的增殖。
FcRIIIA (CD16a) 由FCGR3A編碼, 為NK細胞在成熟過程中獲得。研究發現, 在CD16a+細胞中, FCGR3A啟動子中轉錄起始位點的甲基化水平較CD16a-細胞和中性粒細胞明顯降低。此外, 研究者還發現miR-218是NK細胞CD16a轉錄后的負調控因子。在NK細胞中過度表達miR-218可降低CD16a的mRNA和蛋白表達水平, miR-218在CD16a-細胞中水平明顯高于CD16a+細胞。因此, 研究者推斷, FCGR3A的轉錄起始位點甲基化及轉錄后miR-218的調控作用可以通過改變CD16a的表達來調節NK細胞的分化成熟[15]。
記憶性NK細胞的概念由Sun等[16]最早提出。這類NK細胞可以長期存活, 具有免疫記憶功能, 當再次接觸到記憶抗原時被激活。多種病毒可以誘導記憶性NK細胞產生, 目前報道的有巨細胞病毒, 單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒等[17,18]。記憶性NK細胞表達CD57和NKG2C, 不表達FcR、SYK、DAB2、ETA-2、PLZF和ILZF2。FcR、ETA-2、SYK的缺乏均有表觀遺傳學機制的參與[19,20]。IL-12信號通路通過其下游轉錄因子信號和轉錄因子4 (STAT4) 的激活影響記憶性NK細胞的擴增。Rapp等[21]發現Runx1和Runx3的啟動子區域是STAT4的結合位點, 在NK細胞活化過程中, STAT4的結合會誘導RUNX基因位點的表觀遺傳學修飾, 從而導致表達增加。在病毒感染中, Runx1和Runx3或它們的伴侶分子表達減低是影響NK細胞擴增及記憶NK細胞形成障礙的原因。該研究證明, STAT4介導的Runx轉錄因子表觀遺傳學修飾可以調節NK細胞對病毒的適應行為。
2 表觀遺傳學對NK細胞功能的影響
NK細胞的功能主要包括殺傷及免疫調節作用。有研究顯示, 在NK細胞活化過程中, 81%的主要位點出現CpG去甲基化, 生物學分析顯示差異甲基化位點主要集中在免疫調節功能中 (如TNFA、LTA、IL-13、CSF2等) [22], 這提示表觀遺傳學修飾參與了NK細胞的活化, 并與NK細胞功能關系密切。
2.1 表觀遺傳學修飾對NK細胞表面受體的調節作用
NK細胞表面激活性受體與抑制性受體的相互平衡, 在NK細胞功能中發揮了重要調節作用。如激活性受體表達占優, 則NK細胞活化, 反之, NK細胞處于靜止狀態。
有學者[23,24,25]檢測了NK細胞免疫球蛋白樣受體 (KIR) 啟動子的甲基化水平, 結果發現, 處于靜息狀態的人NK細胞92細胞系中KIR2DL1、KIR2DL2/L3高甲基化, 同時, 細胞表面的KIR表達降低。當應用5-氮雜胞苷進行去甲基化處理后, KIR啟動子去甲基化, NK細胞表面KIR表達明顯增加。另外, KIR的表達受miRNA調節。PIWI樣RNA可以誘導KIR雙向啟動子KIR3DL1產生KIR反義轉錄本, 影響雙鏈DNA的合成, 可減少90%的KIR表達[25]。
NKG2D是NK細胞激活性受體, 其表達增加可增強NK細胞功能。NKG2D通過識別不同的配體家族 (MICA、MICB、ULBPs 1-6等) 參與激活效應細胞、溶解靶細胞。NKG2D基因在NKG2D+NK細胞中去甲基化, 并與組蛋白H3賴氨酸9乙?；?(H3K9Ac) 相關。用組蛋白乙酰轉移酶 (HAT) 抑制劑 (姜黃素) 可以明顯下調NKG2D基因H3K9乙?；? 進而下調NKG2D的轉錄, 導致NKG2D表達減低, NK細胞殺傷功能下降。此研究提示NKG2D在NK細胞表面表達差異是由表觀遺傳學機制調節的, 并可以通過表觀遺傳治療改善[26]。組蛋白去乙?；敢种苿┍焖?(VPA) 通過激活基因啟動子中組蛋白K9的高甲基化和DNA甲基化, 從而下調NKG2D的表達[27]。同樣, miRNA也可發揮對NKG2D的調節作用。在HCV感染患者的NK細胞中, miR-182與對照組相比過表達, miR-182表達升高可降低NKG2D的mRNA水平, 而miR-182抑制劑能降低抑制性受體NKG2A的mRNA水平[28]。
2.2 表觀遺傳學修飾對NK細胞細胞因子分泌水平的調節作用
NK細胞分泌細胞因子同樣受到表觀遺傳學修飾的調節。Luetke-Eversloh等[29]報道, NK細胞受到刺激后, IFN-及T-bet位點轉錄增加, 并發生去甲基化, 從而增加IFN-的分泌。Li等[30]發現, 在NK細胞激活過程中, 組蛋白去甲基化酶及甲基轉移酶發生明顯變化。在NK92細胞系中, 與NK細胞激活密切相關的PI3KCA, 、NFATC1及TNFSF9等基因, 經PMA和依諾霉素刺激可出現H3K4me3和H3K27甲基化修飾, 從而調控上述基因表達。采用H3K4和H3K37的特異性抑制劑可以增加NK細胞脫顆粒及IFN-、TNF-的分泌[22,30]。Cribbs等[31]用染色質甲基化及乙?；男》肿右种苿┻M行篩選, 并通過基因敲除方法確定了Jumonli型組蛋白H3K27脫甲基酶是NK細胞分泌細胞因子的關鍵調節因子。JMJD3/UTX (含有Jumonji結構域的蛋白3) H3K27去甲基化酶抑制劑GSK-J4可引發細胞因子轉錄起始位點H3K27甲基化, 并造成NK細胞IFN-、TNF-、GM-CSF、IL-10分泌下降。GSK-J4可以明顯抑制類風濕性關節炎患者外周血或組織中分離出的NK細胞的細胞因子分泌, 抑制破骨細胞形成及骨破壞。除甲基化外, 組蛋白乙?；揎椧矊K細胞細胞因子分泌起調節作用。VPA可抑制NK細胞對白血病細胞的溶解, 并且有劑量依賴性。VPA預處理可降低NK細胞IFN-分泌, 破壞CD107A脫顆粒, 并通過激活PD-1/PD-L1途徑誘導細胞凋亡[27]。
H3K4me3脫甲基酶KDM5A調節基因轉錄并參與腫瘤的發生。Zhao等[32]研究證明KDM5A缺陷使IFN-產生減少, 并損害NK細胞的活化。KDM5A (-/-) 小鼠對單核細胞增生李斯特氏菌 (LM) 感染高度敏感。在NK細胞活化過程中, KDM5A的缺失影響STAT4磷酸化和核定位, 并增加了細胞因子信號轉導抑制因子1 (SOCS1) 的表達。進一步研究揭示其機制為KDM5A與P50結合, 并與靜止NK細胞中的SOCS1啟動子區結合, 抑制染色質重塑, 導致在SOCS1啟動子中H3K4me3修飾顯著減少。
另外, Lee等[19]在研究記憶性NK細胞時發現, 人巨細胞病毒感染后, NK細胞Syk轉錄起始位點甲基化, Syk基因沉默, 可引起表達IFN-水平升高。BHLHE40為轉錄調節因子, 在活化的NK細胞中去甲基化, 誘導細胞因子分泌 (如IL-2、IL-12、IL-15、IFN、TNFA等) , 增強NK細胞功能。NFAT轉錄因子家族通過與啟動子及增強子區域結合來增加NK細胞因子的表達。在活化的NK細胞中, NFATC1內含子9明顯去甲基化, 可調節NK細胞分泌細胞因子[22]。
3 引起NK細胞表觀遺傳學變化的因素
多種疾病狀態下, NK細胞的表觀遺傳學修飾會發生變化, 如巨細胞病毒感染會激活NK細胞, 引起81%的位點發生DNA去甲基化[22]。在兒童哮喘患者中, NK細胞DNA去甲基化, 引起NK細胞活性升高[33]。在類風濕關節炎及強制性脊柱炎中, NK細胞均存在表觀遺傳學改變[31,32,33,34]。
一些藥物可以引起NK細胞的表觀遺傳修飾變化。Misale等[35]報道, 糖皮質激素可以通過影響H3K27me3來降低IFN-的表達, 從而抑制NK細胞的免疫功能。5-氮雜胞苷可引起NK細胞DNA去甲基化, 誘導相關基因激活, 促進NK細胞活化[36]。
運動也可以引起NK細胞表觀遺傳學修飾發生改變。Zimmer等[37]選取30例非霍奇金淋巴瘤患者及10名健康人, 干預組每人每天騎車運動30min。運動組的患者血清巨噬細胞游走抑制因子 (MIF) 及IL-6水平升高, NK細胞組蛋白H3、H4乙?；浇档汀＝? 研究者再次證明運動可以通過升高組蛋白乙?；郊癗KG2D的表達, 改善正常人NK細胞活化狀態[38]。
壓力及年齡的增長對NK細胞的表觀遺傳學也有明顯影響。創傷后應激綜合征可以加速NK細胞由年齡造成的甲基化水平升高, 從而影響機體免疫狀態[39]。
綜上所述, 表觀遺傳學修飾影響著NK細胞的增殖、分化、殺傷、免疫調節等, 在NK細胞調控中, 扮演重要角色。但目前, NK細胞表觀遺傳學研究多集中在基礎實驗階段, 在臨床疾病中的應用很少。NK細胞參與腫瘤、自身免疫疾病及感染的發病, 其異常是否與表觀遺傳學修飾有關?進一步研究NK細胞表觀遺傳學異常在疾病發生中的作用, 將基礎研究向臨床應用轉化, 開拓疾病中NK細胞功能異常的新思路, 并為新型藥物在臨床中的應用提供研究基礎, 將是本課題組今后努力的方向。
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表觀遺傳學研究方法范文3
隨著對白血病發病機制的深入研究及其治療方案的改進,白血病的完全緩解率也有明顯的提高,但仍有一部分患者最終會復發。近年來的研究發現, 白血病的復發與微小殘留病密切相關。微小殘留病(minimal residual disease, MRD )是指經過誘導治療達臨床緩解時，白血病患者體內殘留的少量白血病細胞。對患者進行微小殘留病監測對白血病的治療和預后判斷具有非常重要的意義。檢測MRD的關鍵是尋找分子基因標志。細胞免疫表型及遺傳學的異常改變在急性白血病MRD 檢測中占有重要地位。令人遺憾的是，這些方法只適用于少數患者，大多數患者并不具備遺傳學的預后指標。隨著對急性白血病分子生物學發病機制研究的進步，人們把急性白血病的發生歸結為抑癌基因和原癌基因通過遺傳學和表觀遺傳學機制的發生異常改變［1］。DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳調控機制，其與腫瘤發生、發展以及檢測相關機制的研究逐步成為研究的熱點。表觀遺傳學生物標記（Epigenetic biomarkers），特別是DNA 甲基化相關標記檢測擁有遺傳學標記、抗體等標志不具備的優勢。本文就MRD細胞分子遺傳學的檢測方法及DNA甲基化檢測MRD的臨床應用進行綜述。
1 常用白血病MRD檢測方法的研究進展
1.1 分子生物學方法：遺傳學的改變，包括染色體易位/缺失、基因突變等是白血病發生的基礎，其所導致的正?；虮磉_調控紊亂和功能異常是白血病發生的主要原因。異常的遺傳學改變，已成為急性白血病臨床檢驗資料的重要組成部分。
實時定量聚合酶鏈反應( RQ-PCR ) 方法結合了PCR和熒光探針兩種技術，通過定量檢測白血病細胞中標志性基因實時觀測MRD，是目前檢測MRD最為敏感的方法，靈敏度可達10-4-10-5，已成為臨床實驗室建立MRD檢測方法的首選。其檢測的基因標志包括：（1）染色體異位形成的融合基因。如t(9:22), t(15;17),inv(16), and t(8;21)，T 細胞受體（T-cell receptor ，TCR）重排等，常見的融合基因包括: TEL /AML1、BCR /ABL、E2A /PBX1、MLL /AF4等。（2）在白血病中表達增高的腫瘤基因(如PRAME、 WTI 、PRAME、NPM1、STC- 1 等基因。（3）發生突變的基因(如FLT3 /ITD)。融合基因直接反映了白血病的病理特征,他在疾病發展過程中比較穩定,以其作為PCR檢測MRD的分子標志具有特異性強、敏感度高的優點［2］。但是這些檢查不僅價格昂貴，其檢測的標本為RNA，存在不易保存，結果不穩定的缺點。更令人遺憾的是,由于白血病是一組異質性很大的惡性血液病，各亞型之間遺傳背景不同，這些遺傳學基因標志只能覆蓋1/3的白血病類型，還有2/3類型的白血病不具備遺傳學基因標志，無法在臨床上進行MRD的檢測。即使聯合應用多種基因仍有40%～50%的患者無法找到適當的基因標志檢測MRD，使其疾病狀態缺乏準確的判斷依據。
1.2流式細胞術( FCM)：FCM是通過檢測在正常細胞上不表達或低表達而在白血病細胞上表達或高表達的白血病相關免疫表型來定量檢測MRD，能夠準確定量殘留白血病細胞數，并且還能了解殘留白血病細胞的凋亡情況［3］。其優勢是每秒可檢測5 000～10 000個細胞,并能用計算機記錄處理,快速地對各個細胞進行多參數定量分析,靈敏度達到10- 4。但應用此法必須要對患者初發時的免疫表型特征有詳盡了解,以便選擇適當的標志檢測MRD。因為白血病細胞與正常細胞相比, 通常低達10- 5～10- 6, 可能低于FCM檢測范圍而使這種方法缺乏特異性; 而且隨著病程發展, 細胞表面的抗原發生改變, 會導致假陰性結果。
2 異常DNA甲基化檢測白血病MRD的臨床研究進展
DNA甲基化是指在DNA序列不變的情況下，通過影響基因轉錄活性以調控基因的表達。DNA甲基化作為一種表觀遺傳學改變與白血病的發生密切相關，在不改變遺傳信息的前提下導致細胞遺傳特性改變，作為腫瘤性疾病"二次打擊"經典假說的重要補充，已成為白血病研究的新熱點。DNA異常高甲基化導致抑癌基因的失活在白血病發生發展、診斷、監測微小殘留病、預測病情以及指導治療方面都有重要作用，這些表觀遺傳學標志作為MRD監測標志物的臨床研究逐漸引起大家的關注。
P15基因甲基化與白血病的關系目前研究最為深入。73%～93%的急性髓系白血病(AML)和57%的急性淋巴細胞白血病(ALL)患者發生p15基因高甲基化，且持續p15基因高甲基化預示疾病復發。與p15基因甲基化患者相比，p15基因非甲基化患者5年DFS明顯延長（15% v 62.5%；p＝0.02）［4］。
Au等［5］檢測了l7例t-MDS/AMI 患者，l5例存在pl5甲基化。其中5例在發展為治療相關的t-MDS/AML前即已存在pl5甲基化，最早為兩年前。提示pl5甲基化發生在t-MDS/AMI 早期，檢測p15甲基化有助于判斷預后、指導治療。在一組65例急性早幼粒細胞白血病的研究中，31例存在p15甲基化的患者5年無病生存率僅為29．64％ ，顯著低于34例無甲基化的患者79%。p15基因甲基化與預后不良相關。
Id4和zo-1是我室新發現的兩個血液系統相關候選基因，并對其在白血病發生、復發中的作用及應用于MRD檢測進行了系列基礎與臨床研究。
采用MS-PCR的方法對完全緩解期白血病患者骨髓標本檢測id4基因甲基化狀態，結果發現：（1）58例完全緩解的急性白血病人MRD的檢出率為41%，MRD陽性的患者12個月內復發率為62.5%，而非甲基化的患者12個月內復發率僅為10%。（2）16例異基因外周血干細胞移植后的白血病患者中，5例檢測到MRD的患者中有4例在1年的隨訪期出現復發，而11例移植后MRD持續陰性的患者無一例復發。
研究對26例完全緩解的急性白血病患者進行zo-1基因甲基化檢測，MRD檢出率為34.6%，MRD陽性的患者12個月內復發率為57.1%，而非甲基化的患者12個月內復發率僅為15.4%，MRD陽性病人復發率明顯高于陰性者。Id4和zo-1基因甲基化檢測可能成為急性白血病新的生物標記用于預測疾病的預后以及復發。
隨著PCR 技術的進步，將實時定量PCR（real-time PCR）與MSP 結合提高了甲基化分析檢測的特異性和敏感性。高敏感性的甲基化定量PCR為MRD檢測開辟了另一種解決方法。甲基化定量水平的變化對于細胞修復、腫瘤預后、腫瘤化療后的耐藥等提供了新的研究指標，可以從另一個層面上揭示其發生機制。因此，甲基化定量PCR技術被應用與臨床各領域的研究。
Shuchi等［6］以啟動子區高甲基化狀態的雌激素受體α（estrogen receptor α;ER-α）和 p15INT4B 基因做為MRD標志，采用定量甲基化特異性PCR對180例急性白血病患者骨髓標本進行檢測，結果發現：（1）臨床緩解期的AML患者中, ER-α和p15INT4B基因啟動子區呈現高甲基化狀態的患者較低甲基化狀態的患者有更高的復發風險，而且ER-α和p15INT4B基因啟動子區甲基化水平的增高與患者無病生存期（disease free survival,DFS）縮短有明顯相關性。（2）對5名兒童ALL患者ER-α基因啟動子區甲基化程度進行了自誘導緩解后的追蹤檢測，結果提示疾病復發狀態較緩解狀態ER-α基因啟動子甲基化水平增加。其結果與目前常用的MRD監測標志TCR/免疫球蛋白重排水平結果基本一致。
另一研究以啟動子區高甲基化狀態的p73、p15、p57KIP2基因為MRD標志，通過對199例Ph染色體和MLL陰性的處于完全緩解狀態（complete remission,CR）的成人ALL標本進行定量甲基化特異性PCR檢測，研究結果提示p73基因啟動子區甲基化水平與第一次CR持續時間及無病生存期（DFS）及總生存期（overall survival, OS）縮短間有顯著相關性［7］。因此，特定基因的定量甲基化PCR檢測有可能成為一種評估急性白血病復發風險及MRD檢測的有效手段。
結語
白血病作為一種惡性腫瘤，復發是影響其患者生存的主要問題?；颊唧w內白血病微量殘留病是復發的主要根源，對患者進行微量殘留病監測在白血病的治療和預后判斷中具有非常重要的意義。遺憾的是，由于絕大多數患者缺乏明確的遺傳標記作為早期檢測和準確評估MRD的標志，在臨床上常因治療不足導致疾病復發或治療過度引起嚴重并發癥，絕大多數患者在發病后1~3年內死亡。因此，要在白血病MRD早期檢測和指導治療上有所突破，就必須尋找能夠早期診斷白血病MRD的特異性強、通用性好的分子標志物。DNA 甲基化作為腫瘤相關標記，與遺傳學標記、細胞表面抗體等標志具有更多的優勢。首先，臨床常規的腫瘤標記檢測以蛋白或者RNA為對象，必須采集新鮮樣本以確定檢測結果的準確性。而甲基化檢測則以DNA 為樣本，很容易從各種體液中，甚至石蠟包埋組織中得到，極大地擴展了研究資源。其次，甲基化以DNA作為研究對象，較RNA 和蛋白更穩定，更容易保存。進而保證了檢測結果的可靠性。因此，DNA甲基化定量水平的變化對于腫瘤預后、腫瘤化療后的耐藥等提供了新的研究指標，可以從另一個層面上揭示其發生機制。
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表觀遺傳學研究方法范文4
心肌缺血時,有氧代謝發生障礙,葡萄糖利用減少,脂肪酸利用增多,使氧利用率下降,心臟供能不足;同時,無氧代謝導致的酸性代謝產物增加,引起細胞內酸中毒。此外,心肌缺血還能引起氧自由基及鈣離子超載,誘導心肌細胞凋亡,導致嚴重的臨床癥狀。因此,改善能量代謝,清除自由基,減輕鈣超載,抵抗細胞凋亡,實現心肌保護作用成為改善心肌缺血的重要途徑[10]。研究表明,針灸在實現心肌保護方面具有自身的優勢。一方面,針灸可通過改善能量代謝,實現心肌保護。心肌缺血時,能量代謝相關酶發生改變,電針能提高心肌組織糖原、琥珀酸脫氫酶和三磷酸腺苷酶的活性,糾正心肌相關酶的異常,增強能量代謝,改善心肌缺血。另一方面,針灸可減少自由基,緩解心肌缺血癥狀。熱休克蛋白(HSP)屬應激蛋白,能減少氧自由基釋放,減輕心肌缺血損傷,從而保護機體[11]。研究證明電針“內關”穴可以增強缺血心肌細胞HSP90和HSP70mRNA表達,以減少氧自由基的釋放,從而緩解家兔心肌缺血癥狀[12-13];而且,針刺“內關”穴能抑制細胞內Ca2+超載,實現心肌細胞保護,電針“內關”通過上調心肌鈣泵和鈉泵基因表達,增強鈣泵和鈉泵活性,降低心肌細胞內Ca2+含量,從而達到抑制鈣超載,實現對心肌組織的保護作用,表現為促進心電活動、改善心肌組織形態和超微結構[14]。大量研究表明,針刺可以調控凋亡基因的表達水平,延長細胞周期,減少細胞凋亡,保護缺血心肌細胞。有研究指出電針可以調節誘導細胞凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2在家兔缺血心肌中的表達,即抑制凋亡基因Bax和促進抗凋亡基因Bcl-2的表達,抑制心肌細胞凋亡,從而達到保護心肌細胞的作用[15]。c-fos基因是一種原癌基因,參與調節體內許多過程,如細胞周期、細胞分化、腫瘤轉化及細胞凋亡等,正常情況下細胞內c-fos表達呈低水平狀態,心肌缺血可激活c-fos基因的表達從而啟動心肌細胞凋亡。研究表明,電針可降低c-fos基因表達,改善急性心肌缺血的過程[16-17]。所以不難看出,針灸能通過多種途徑實現心肌細胞保護?？傊?針灸干預心肌缺血的療效和機制已初步得到證實和揭示,但尚未完全闡明,在一定程度影響了針灸治療心肌缺血在臨床的應用和推廣。因此,需要引進新的理念、新的方法技術進行深入探索。
2表觀遺傳調控在針灸治療心肌缺血的機制研究中的應用
目前主要涉及的表觀遺傳調控包括CG輔酶甲基化、組蛋白轉錄后修飾、RNA干擾等,具體可分為DNA甲基化、蛋白質共價修飾、染色質重塑、微小RNA調控4個方面[18-19]。越來越多的研究表明,表觀遺傳調控在心肌缺血過程中扮演重要角色,參與了疾病的發生、發展及預后的全部過程,因此,我們探討從該角度開展針灸治療心肌缺血機制研究的新方向。2.1表觀遺傳調控與心肌缺血的相關性以動物和人為載體的研究都表明,心肌缺血與表觀遺傳調控密切相關。表觀遺傳標記物在心肌缺血發生發展過程中的變化,反映出DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑及微小RNA是調控心肌缺血的關鍵因素。大鼠神經甲基化系統在心肌缺血中受到抑制,可導致缺血部位的兒茶酚胺濃度升高,作用于心臟,使心率加快,收縮力增強,心輸出量增加;懷孕期間的營養不良會改變DNA甲基化,增加成年后患心血管病的風險,且DNA甲基化在6個特殊位點對產前環境很敏感,可能提高婦女患心肌缺血的風險[20-22]。同時,有研究認為,組蛋白H3賴氨酸4甲基化(H3K4me)轉移酶和它們的輔助因子是調控胚胎發育及細胞特異性的重要因素[23];而Smyd2作為一種組蛋白甲基轉移酶,介導H3K4甲基化,改變心肌細胞組蛋白甲基化修飾和心肌細胞靶基因的轉錄調控,促進心肌細胞分化和發育[24-25]。最新研究報道組蛋白H3賴氨酸27去甲基化酶賴氨酸K特異性脫甲基6A(UTX)可以促進心肌細胞生長發育,UTX基因敲除小鼠因心臟發育障礙死于胚胎發育早期[26]。除甲基化之外,組蛋白的乙酰化在心肌缺血中的作用受到廣泛關注。發生心肌缺血后,心肌細胞蛋白發生了去乙?；?抑制去乙酰化則能減少其損傷,組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑通過組蛋白去乙酰化酶Sirt1介導,后者含量增加,能有效促進心肌缺血耐受,誘導心肌保護[27-29]。HDAC-7抑制劑可與缺氧誘導因子(HIF)結合影響基因轉錄,增強HIF活性,從而促進心臟血管新生[30-31]。同時,HDAC抑制劑曲古柳菌素A可降低缺血心肌凋亡基因Caspase3表達,抑制心肌細胞凋亡,也可促進干細胞向心肌細胞分化,介導心肌細胞再生[32-33]。進一步研究發現,組蛋白H3賴氨酸9乙?；?H3K9ace)與缺血心肌保護密切相關,通過調節血管再生因子、細胞凋亡因子和HSP基因表達達到抗缺血性損傷效果。其中VEGF、Sirt1與組蛋白賴氨酸乙?；P系最為密切[34-39]。除組蛋白修飾之外,microRNA上調或下調通過作用于靶基因激活相應的分子信號通路參與心肌保護,調控心肌缺血損傷。染色體重塑也被證明與心肌細胞生長發育相關[40-41]。
總之,DNA甲基化、組蛋白修飾、微小RNA等表觀遺傳調控在心肌缺血過程中具有重要意義。2.2表觀遺傳調控與針灸防治心肌缺血機制研究從上述表觀遺傳調控與心肌缺血的相關研究成果可知,表觀遺傳調控介導細胞凋亡、心肌細胞保護和心臟血管再生,在心肌缺血發生發展過程中具有特殊地位,是目前醫學研究的熱點。從該角度切入進行針灸防治心肌缺血研究,必然是今后研究的一個新方向。同時,結合表觀遺傳調控自身特性,即強調除了DNA和RNA序列以外,還有許多調控基因信息,雖然本身不改變基因的序列,但其通過基因修飾、蛋白質與蛋白質、DNA和其它分子的相互作用,多層次、多途徑影響和調節遺傳基因的功能和特性,這些調節同時存在可逆性。這與針灸作用整體性、綜合性、雙向性、多靶點的特點具有一定的相似性。因此,將表觀遺傳學的理念和技術引入針灸抗心肌缺血機制研究,乃至整個針灸研究領域,都具有較強的可行性。結合針灸自身優勢特點,以及其抗心肌缺血研究現狀,融合上述表觀遺傳調控在心肌缺血發生發展過程的作用特點,我們認為,今后的研究可從兩個方面進行,一是針灸對心肌缺血疾病的預防。治未病思想歷來是中醫理論的核心,早在《黃帝內經》中就強調“不治已病治未病”。現代研究證實,針刺具有提高機體機能的作用,如實施心肌缺血再灌注手術前針灸“內關”穴,能提高心肌細胞耐缺血能力,延長動物生存期,這無疑為心肌缺血患者贏得了寶貴的搶救時間[42]。而表觀遺傳調控與之密切相關,HDAC直接參與耐缺血,如果以此進行深入研究,一旦得以證實,將為臨床進行再通手術前實施針灸干預的應用提供科學依據[43]。另一方面,則是在現有的研究基礎上,繼續深入探討針灸抗心臟缺血機制研究。根據心肌缺血的不同階段,有重點地開展相應研究。如急性期、亞急性期,主要圍繞針灸促心肌細胞存活、抑制細胞凋亡,以及改善能量代謝,從而實現心肌細胞保護進行研究。針灸能有效調控心肌組織中Sirt1、HSP70、Caspase3、c-fos、Bcl-2等物質的表達,實現保護心肌目的,但其背后的調控機制如何,尚未得到證明。研究表明,HDAC能有效調控Caspase3表達,H3K9ace能影響HSP70水平等,從這些角度深入揭示針灸促心肌保護機制,將為針灸的更廣泛應用提供基礎。在慢性期,則主要圍繞促進血管新生開展。已有的研究證實針灸能促缺血區域的血管新生,且與VEGF密切相關,但調控VEGF表達發生改變的機制并未得到證明。腫瘤存在大量的新生血管,研究中發現,H3K9ace在此過程中扮演重要角色,我們可以推測,在針灸促VEGF表達,介導血管新生過程中,H3K9ace可能具有重要意義。同時,也可以充分結合針灸抗心肌缺血機制研究成果,著重篩選出相應優勢靶點,進行新藥開發,或許可能成為新藥開發的新靶點。除此之外,還可進行相應的拓展。研究表明,心臟中存在心肌干細胞,在某些影響因素干預下,能不斷增殖、分化形成新的心肌干細胞。這個過程中表觀遺傳調控發揮重要作用[44]。針灸有促體內干細胞增殖、分化的能力,比如促腦內神經發生,實現腦保護[44-45]。那么針灸是否也能促進心臟干細胞增殖、分化,實現心肌保護?從表觀遺傳學的角度研究,也將成為我們關注的方向。
表觀遺傳學研究方法范文5
【關鍵詞】釘螺；血吸蟲病；生物學特性；人工培養；綜述
【中圖分類號】R532．21【文獻標識碼】A【文章編號】1673－5234（2015）12－1148－03
血吸蟲病（schistosomiasis）是一種嚴重的共患寄生蟲病，呈全球分布。在我國主要流行的是日本血吸蟲病。2013年全國共報告血吸蟲病感染184943例，晚期血吸蟲病患者29796例［1］，血吸蟲病的流行位居水傳播疾病之首，嚴重影響我國的社會經濟發展和人類健康。釘螺（Oncomelaniahupensis）是日本血吸蟲的唯一中間宿主，主要分布在亞洲東部和東南部，中國內地僅有湖北釘螺一種，釘螺分布與血吸蟲病的流行息息相關。目前防控該病最常用的方法是消滅釘螺，人工培養釘螺對研究釘螺的生物學特性和篩選滅螺藥物具有重要意義。本文對釘螺的生物學特性和人工培養的方法進行綜述。
1釘螺的生物學特性
1．1形態學
釘螺為水陸兩棲，常棲息于田間、池藻等淡水水域。它主要由螺殼和軟體兩部分組成，軟體部分的前部為頭、頸、足和外套膜，后部是內臟；表面有縱肋者稱“肋殼釘螺”，殼長約10mm，寬約4mm。殼面光滑者稱為“光殼釘螺”，比肋殼釘螺稍小，長、寬分別為6mm和3mm，多見于山丘地區。釘螺形態學特點主要包括形態特征、解剖結構等方面。釘螺早期的研究重點集中在釘螺內外部的形態結構變化，如螺殼形狀、螺肋的數目及厴核的旋數［2］，并以此來認識與鑒別釘螺，如巴西釘螺被認為是光殼釘螺的一種，螺殼黑色，螺殼外唇無隆起線，殼光滑有黃色“假眉”，厴與齒舌與湖北釘螺相同［3］。釘螺的形態特征是研究釘螺的分類、遺傳和進化的基礎，分布于山區的光殼釘螺和分布于湖沼水網地區的肋殼釘螺生存條件不同。湖北釘螺具有遺傳多樣性，而且具有不同程度的遺傳變異［4］。石朝輝等［5］通過對湖北廟河上下游釘螺調查發現，兩個地區釘螺分別為光殼釘螺和肋殼釘螺，上下游螺群的遺傳距離并無明顯差異。
1．2分類學
釘螺俗稱釘螺螄，為動物界第二大動物門－軟體動物門腹足綱中的一類，有雌雄之分。早期對釘螺分類的研究主要是以釘螺形態學和解剖學為依據的，自1913年宮入慶之助和鈴木稔在日本證實光殼釘螺為日本血吸蟲的中間宿主以來，對釘螺分類的依據主要是根據形態和解剖結構，如螺殼、螺厴和螺肋數目及齒舌形態特征。美國Bartsh根據螺旋數、齒式將釘螺分為Oncomelania、Katayama和Schistomophora［6］。有學者發現螺殼顏色、螺厴、齒舌等差異不大，認為釘螺的分類以形態結構為依據并不嚴謹［7－8］。近年來分子生物學技術的發展對釘螺分類的研究起到了重要作用。George等［9］通過對中國大陸不同地區、不同種群釘螺的同工酶進行比較，再結合螺殼形態學的基礎將湖北釘螺再分成3個亞種：滇川亞種（O．h．robertsoni）、福建亞種（O．h．tangi）和湖北亞種（O．h．hupensis）。牛安歐等［10］利用單重復序列錨定PCR技術（SSR－PCR）將中國大陸7省的湖北釘螺分為4類。周藝彪等［11］采用微衛星錨定PCR分子技術對19個種群釘螺的基因DNA進行分析，進一步驗證了中國大陸湖北釘螺分為滇川亞種、廣西亞種、福建亞種和指名亞種等4個亞種。
1．3遺傳學
釘螺的生物特征、地理分布以及日本血吸蟲和釘螺之間的相容性都與釘螺遺傳學特性密切相關。表觀遺傳學、分子遺傳學和景觀遺傳學的研究應用在生物滅螺中起著不可替代的作用。早期，表觀遺傳學常用來作為釘螺分類依據，劉月英等［12－13］認為中國大陸釘螺屬于一屬一種，世界各地釘螺作為同一種屬只有種下亞種和地理株之分，但種下具體如何分類尚未得到解決。隨著分子生物學的發展，釘螺種群同工酶譜的分析、DNA基因序列的研究進一步得到發展。日本血吸蟲與釘螺之間的相容性主要取決于兩者之間的同工酶等位基因［14］，而且不同種群的釘螺對日本血吸蟲的相容性不同［15］。周曉農等［16］研究了中國9省34個地區螺群的同工酶，結果表明釘螺種群間的變異程度較大，而同種群內的變異較小，肋殼釘螺的遺傳變異分化程度小于光殼釘螺，且釘螺從喜馬拉雅山脈擴散至世界各地，因環境變化，基因也發生了劇烈漂移。景觀遺傳學是在2003年由Manel［17］首次提出，其結合了景觀生態學和種群遺傳學的特點，意義在于研究物種微進化與景觀環境之間的關系，為研究釘螺遺傳變異分化提供了新的研究方法［18］。崔斌等［19］采用微衛星錨定技術對湖北松滋地區不同景觀環境下釘螺遺傳特性進行分析，結果表明湖北釘螺種群間遺傳變異并不明顯，而釘螺個體間變異顯著。景觀遺傳學作為一門新興學科，將人類及其活動納入了研究范疇，在理論和方法方面有很大的發展空間。
1．4生態學
釘螺繁殖、分布及擴散等生態學特征與血吸蟲病的流行息息相關。釘螺生態學的研究對血吸蟲病的傳播和預防可以起到理論指導作用。釘螺的生長繁殖易受滅螺藥物和環境改變的影響，其分布密度與植被蓋度有關［20］。林丹丹等［21］對鄱陽湖的自然環境進行研究發現植被總蓋度與釘螺分布成正比，總蓋度越高釘螺分布越廣。地形是影響釘螺分布重要的因素之一，楊慧等［22］對云南地形的考察，發現云南地形以山區為主，呈孤島性分布，擴散不明顯，建議滅螺范圍應以陽性釘螺分布地區為主，并適當擴大范圍。釘螺的擴散方式主要以主動擴散和被動擴散為主，水流、光照強度、釘螺吸附能力以及水中障礙物均可影響釘螺的擴散［23］。此外，自然因素和社會因素如水災、水利工程建設及旅游開發等也可影響釘螺分布與擴散。
1．5生理生化
釘螺的生理生化對研究滅螺藥物的作用機制以及滅螺效果具有重要意義。杜小華等［24］用不同濃度的水和乙醇提取物配置成不同濃度的羊躑躅溶液進行滅殺釘螺實驗，結果顯示濃度不同的提取物處理釘螺后的滅殺率不同，其中以70％乙醇提取物滅殺釘螺的效果最佳。周康等［25］通過實驗發現瑞香狼毒同上述幾種藥物一樣對釘螺的主要能量代謝物質糖原有較強的抑制作用，而且以濃度為70％乙醇提取物的效果最好。黃春蘭等［26］用硫酸、蒽酮比色法鑒定湖北釘螺各月份的肝、頭足部肌肉和整體軟體組織的糖原含量，結果表明整體軟體組織和肝的糖原含量隨著時間的推移而下降。吳明煜等［27］用不同濃度的蛇床子總香豆素處理液浸泡釘螺，在浸泡液處理的前96h內，釘螺體內糖原的含量隨著浸泡時間的延長而降低，說明蛇床子總香豆素可以影響釘螺的糖原含量。胡彥龍等［28］研究發現田皂角甙當濃度超過0．80g／L時可以明顯降低釘螺體內糖原含量，降低的幅度達12．49％～73．16％。劉金濤等［29］發現濃度大于0．85g／L的苦楝子可以降低釘螺內的糖原含量，降低幅度為10．78％～69．94％。過氧化物酶、三磷酸腺苷酶、琥珀酸脫氫酶、乳酸脫氫酶是釘螺進行有氧呼吸的關鍵酶，抑制這些酶的合成可以有效地殺滅釘螺。顧文彪等［30－31］用苦楝葉提取液浸泡釘螺發現三磷酸腺苷酶、琥珀酸脫氫酶和乳酸脫氫酶降低，而一氧化氮合成酶增高，一氧化氮合酶的升高可以使NO合成增加，破壞釘螺機體內的線粒體氧化磷酸化，使能量合成受抑制，達到殺滅釘螺的效果。王萬賢等［32］分別采取樟樹的新鮮葉、莖皮和根皮調配成1％、0．5％、0．1％、0．05％等4個不同濃度的溶液處理釘螺，結果顯示釘螺體內的過氧化物酶的活性隨著浸泡的時間延長活性降低，其中以根皮的效果最好，葉的效果較差，建議大量種植樟樹作為生態林可達到較好的抑螺效果。
2釘螺的人工培養研究
2．1釘螺螺卵的孵化和幼螺的生長
對于釘螺螺卵的孵化和幼螺的生長，主要的影響因素為溫度、水和食物。釘螺螺卵的正常孵化需要在水中或是濕潤的泥面上［33］，飼料以奶粉及復合動物飼料為主，其中藻類喂養幼螺存活率較高，達90％以上，且生長良好［34－35］。田建國等［36］采用了收集螺卵恒溫孵化法、直接恒溫孵化法和自然狀態孵化法三種方法對釘螺螺卵進行孵化，結果顯示泥土也可以影響釘螺螺卵的孵化。
2．2成螺的人工培養
成螺培養因實驗目的不同，室內培養方法也不盡相同，常用室內培養感染性釘螺是泥盤草紙飼養法［37］。成螺培養主要為感染性釘螺，其中毛蚴感染釘螺的比例至關重要，張聰等［38］采用泥缽內鋪細土泥法，按毛蚴與釘螺數量比為5：1、10：1、20：1三種不同比例進行感染，結果顯示毛蚴感染的比例為10：1時，釘螺陽性感染率最高。
3結語
表觀遺傳學研究方法范文6
1 miRNAs與食管癌
miRNAs已經在食管癌組織樣本中得到了廣泛的研究（見表1）。
miR-21是較早發現的miRs，其基因位于染色體17q23上。Feber等[10]分析了一個小樣本，分別來源于新鮮凍存正常上皮（n=9）、ESCCs（n=10）、BACs（n=10）和前期病變（n=6），方法為miRNA芯片和生物信息學聚類分析，他們檢測到腫瘤中miR-21的表達量比正常上皮細胞增加了五倍。Akagi等[11]應用定量逆轉錄PCR發現miR-21在ESCCs中升高，特別是在那些伴有淋巴結轉移的患者中。由于ESCCs和BACs不僅由腫瘤細胞組成，還有不同比例的浸潤白細胞，在以上所有研究中測到的miR-21的特異性，需要根據所選腫瘤細胞和miR定位以及下游分析物的精確度來重新考慮。
2 DNA甲基化與食管癌治療
只有少數研究關注或檢測了ESCCs中DNA的低甲基化，Lima等[12]通過10個ESCCs病例，選取新鮮凍存腫瘤組織和正常鱗狀上皮，分析其DNA甲基化模式，數據顯示腫瘤高度甲基化基因有BCL3，屬于κB家族抑制劑，調節NFκB活性，以及TFF1，一個三葉草因子家族成員。BCL3或TTF1DNA甲基化以及蛋白質表達改變產生的功能上的結果仍然需要闡明。在另一項BACs全基因組甲基化研究中，Alvarez等[13]把一小組經組織學證實為BACs的新鮮冰凍組織樣本和與之相關的前期病變進行平行分析，分析內容包括：①全基因組胞嘧啶甲基化；②RNA文庫；③基于測序的比較基因組雜交。DNA甲基化檢測法是基于Hpall小片段富集連接介導的PCR，候選軌跡通過基于質譜的高通量定量甲基化PCR分析來驗證。值得重視的是，該研究揭示了與DNA高甲基化相比，DNA低甲基化在早期BAC致癌作用中的優勢。此外，文章作者檢測了一系列基因的DNA低甲基化，它們與免疫系統例如趨化因子（如CXCL1，CXCL3）有關。在BAC致癌作用過程中，DNA甲基化也發生在CpG島之外的基因區域。再有，通過結合DNA甲基化、RNA文庫、aCGH分析和體外功能試驗，Alvarez等人很好地支持了一個事實，即單個候選位點和/或DNA甲基化分析不足以揭示表觀遺傳、基因和功能性結果之間的復雜聯系。
總的來說，盡管受DNA甲基化調節的許多基因已經確定，但ESSCs和BACs中DNA甲基化和與之相關生物學效應和功能仍需進一步研究，期望能夠從分子病理學角度認識它們的致癌作用，進而在未來的工作中將靶向于DNA甲基化的藥物變成現實。
3 食管癌致癌作用和組蛋白修飾
食管癌組織樣本的組蛋白修飾研究局限于一系列排除ESSCs并且涉及到免疫組化染色得到的特異性組蛋白標志。另外兩個結合了ESCCs中幾種組蛋白標記的全方位研究也已經進行。Tzao等[14]檢測了組蛋白3賴氨酸18（H3K18ac）、乙酰化組蛋白4賴氨酸12（H4K12ac）、二甲基化的組蛋白3賴氨酸4（H3K4me2），以及三甲基化組蛋白3賴氨酸27（H3K27me3）。在他們的研究中，組蛋白標記物與腫瘤分化（H3K18ac， H4K3me2， H3K27me3）、腫瘤階段和淋巴結狀態（H3K27me3），以及改善的預后（低H3K18ac， 低H3K27me3）有關。
考慮到HDACs對食管癌治療的潛在作用，它的幾種抑制劑起著越來越受重視，但目前這方面研究很少。Toh等[15]描述了ESCC中HDAC1下調和正常鱗狀上皮的比較。在一個更為全面的研究中，Langer等[16]收集了180例BACs，其中2/3患者的主要治療是切除腫瘤，另外1/3先接受化療。大體上，分別有50%和30%患者觀察到HDAC1和HDAC2表達減少。只有HDAC2與病理指標（腫瘤分化、淋巴結分期）有關，HDAC1和HDAC2都沒有顯示出對預后有影響。
我們相信，隨著研究的不斷深入，表觀遺傳治療將有望為食管癌的治療帶來新思路及方法，對預防及改善預后、減少復發等起到關鍵作用。
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