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細胞生物學的發展歷程范文1
關鍵詞：生物工程;微生物學;教學改革
中圖分類號：G642.0 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2016）05-0056-02
微生物學如今已經成為生命科學類大學生必須學習、掌握的基礎課之一，它的主要任務是使學生系統掌握微生物學基礎知識、理論和實踐操作技能[1]。要提高該課程的教學質量，應緊密跟蹤國際最新前沿，選用和參考國內外優秀教材及研究工具書，從教材建設、課程內容、教學方法等方面進行改革，使課程緊跟學科發展的步伐，使學生及時掌握最新的微生物學理論知識和應用技術。本文以生物工程專業為例，從教學內容、教學方法等方面對《微生物學》課程教學改革進行探討和思考。
一、教學內容的改革
（一）教材的選擇
目前，國內微生物課程有關的教材，其主要內容包括微生物的形態、細胞結構和功能、營養、生長與控制等[2]?？紤]到學生已有的知識基礎，確定選用高等教育出版社出版的《微生物學》（第二版）這本書作為教材。這本書章節分類明確，內容全面，措辭嚴謹，重點、難點突出，且有助于內容選擇和安排，因此可較好滿足理論教學要求。此外，由Pearson Education Inc.出版、Michael T. Madigan等編寫的《Brock's Biology of Microorganism 13ed》一書，則作為本課程的主要參考書，該參考書信息量十分豐富全面，知識概念嚴謹，而且有諸多國內其他同類教材所不具備的彩圖多幅，展現了微生物學的誘人前景，引導學生投身微生物學領域的研究，是一部不可多得的優良工具書。
（二）優化重點，避免重復
在教學中，應根據選定教材的特點和各個章節內容的難易程度，合理分配不同章節的學時數。對在別的課程中涉及到的內容盡量少講或者不講，如《生物化學》、《細胞生物學》和《基因工程》課程中涉及的部分內容可以不講，以便重點突出的安排教學內容。
例如，微生物包含了原核微生物、真核微生物和病毒三類，在講到微生物的細胞結構與功能一章，由于同期開設的《細胞生物學》課程詳細介紹了真核細胞結構，所以在微生物學課程重點講述原核細胞，真核細胞結構只講代表性微生物如酵母、霉菌的細胞形態。再如講到微生物的代謝一章，由于《生物化學》課程會講到通用的生物代謝途徑，如氨基酸、核苷酸和糖類的合成途徑，這些生化代謝在微生物學課程里就不重復介紹了，而重點介紹各種在微生物中獨具或占主導地位的分解或合成途徑，解釋其重要的生理功能，引導出各種微生物工業發酵的產品。還比如，講到微生物基因表達調控和微生物與基因工程這兩章，由于這兩章內容實際應是《基因工程原理》和《基因表達調控》課程的主要內容，所以在本課程中也不宜作過細的介紹，而應該重點描述微生物在基因工程研究過程中起到的重要作用，使學生明確基因工程的發生發展是離不開微生物的。在講基因表達調控時，應重點放在原核微生物轉錄水平的調控，突出微生物學課程的特色和重點。
（三）科學安排
緒論是第一章，萬事開頭難，先講好緒論十分關鍵。緒論概述了微生物的定義、發展歷程、對人類的影響及發展趨勢等內容。講授中以人物和事件為主線，介紹微生物學發展的重要歷史階段、關鍵人物以及微生物在各個生產領域中的應用，激發學生對課程的學習興趣。例如，通過介紹列文虎克給英女王看顯微鏡的故事、巴斯德研究蠶病和制備疫苗的故事以及柯赫、弗萊明的主要貢獻等內容，使學生在理解微生物學發展歷程的同時，直觀的感受前人認真觀察和持之以恒的科學精神。人類目前仍然面對著多種細菌和病毒為病原體的傳染病威脅，另外環境污染物的生物降解、沼氣氫氣等新能源的開發問題，也都與微生物密切相關。闡述以上內容，可使學生明確微生物與人類的密切相關性以及人類認識并改造微生物進而為社會服務的實踐過程，從而端正學習態度，樹立堅定的目標，積極投入到之后的微生物學課程學習中。
緒論之后進入微生物學各專題的分章介紹，根據講授內容的豐富程度、知識難易程度，應該有學時分配上的差異。結構與功能、代謝、生長與控制、病毒、生態進化和物種多樣性這幾章，描述性內容較多，概念名詞豐富，應采用圖片和動畫插放的多媒體教學方式，使學生有直觀的感性認識，便于他們記憶;遺傳、基因表達調控和基因工程這三章，涉及到較多分子遺傳學的知識，且與其他章節的銜接性不大，講授時應該與教材上的章節排列順序有所區別。例如，可以將這三章內容放在進化和物種多樣性一章結束后再講，這樣會使知識銜接更好，同時也使學習的難易程度由容易逐漸過渡到難，符合學生掌握知識過程的客觀規律。
二、教學方法的改革
（一）充分利用多媒體
微生物學課程涉及大量微生物形態和結構的介紹，以及較復雜的代謝反應流程。傳統的教學方法以文字講授為主，輔以十分有限且質量較差的圖片資料，教學效果不理想[3]。因此，在教學過程中合理使用多媒體工具，把抽象性的教學內容轉變為生動形象的感性素材來提高教學質量，是十分必要的。我們的教學實踐表明，多媒體教學這一直觀、準確、豐富、生動的教學方式，在擴大了教學內容信息量、避免乏味的照本宣科的同時，從根本上提高了學生的聽課效率和課后的學習興趣。
多媒體教學的另一大優勢是電子教案可以瞬時拷貝，這個優點可促使學生上課時專心聽講，以免發生因做筆記而漏聽或漏記了上課內容的情形。而且現成的教案相比學生自行記錄的筆記內容而言，有知識的準確率高和字體的清晰度好等優點。因此，多媒體教學最大限度地突破了傳統教學的束縛，在提高教學質量、減輕學生的學習壓力和突出學生的人本效應等方面起了十分重要的作用。
（二）開展課堂討論
為了克服學生上課開小差不專心聽講的常見缺點，充分調動學生主觀能動性的同時并活躍課堂的教學氣氛，在課堂上可安排數次短時間的討論。因為討論促使學生主動思考，通過活躍的聽力和口語交流，提高其分析和解決問題的能力[4]。討論的形式是由老師課前布置習題，學生查閱資料完成作業，教師批改作業之后，根據回答內容進行分類，然后在下一次課的開始將作業題的幾個不同答案在課堂上進行討論，使每個學生都能參與其中，然后最后由教師對正確答案進行講解。課后學生們反映這種上課形式好，既提高了學習興趣，又加深了對知識點的理解。
（三）考核方式的多元化
將學生的課程最終成績分為平時成績和期末成績。在計算最終成績時，期末成績占總成績的80%，平時成績占20%。期末成績指考試的卷面成績，平時成績里面，平時作業占50分，學習交流（包括課堂問答、個別交流、參與討論）占30分，課程學習筆記20分。通過考核方式的多樣化，使學生成績評定更為客觀準確，也提高了學生各方面學習的綜合素質。
（四）將自己的科研成果融于課堂，提升個人素質
筆者在講授微生物學課程的同時，課余時間一直從事環境微生物學方面的科學研究，因此對當前微生物學研究的國際前沿或多或少有所了解。生命科學被譽為21世紀的領頭學科，其科學研究的發展日新月異。將相關領域的國內外研究進展引入到課堂相關知識講授的過程中，可以使青年學生及時了解知識的更新程度和全面、重要程度，對提高學生的聽課積極性和學習甚至研究的主觀能動性，也是十分有幫助的。例如，在講授細菌S層的結構時，結合自己分離菌株的電鏡照片、相關功能基因克隆以及在大腸桿菌中異源表達，使學生對該結構的重要性和在技術領域的應用潛力有一個很全面的了解;在講授氨基酸的合成代謝時，結合自身研究的谷氨酰胺合成酶基因克隆和轉基因植物的生化分析，了解各種氨基酸合成和運輸過程，以及它們在微生物體內的代謝路徑;講授微生物的多樣性時，引入筆者研究過的沼氣池樣本產甲烷古菌的群落結構和多樣性分析，明確這類古生菌在自然界的分布及其在自然生態系統中所起的重要生物學功能。除了教學方法的改革外，同時加強自身的思想修養和職業道德修養，提升教師的各方面素質也不可忽視。不僅在教學過程中要激發學生的學習興趣以取得最優的教學效果，還要做到多與學生交流，及時了解學生的正確想法和思想上的困惑，鼓勵學生熱愛學習，釀造和培育大學課堂上教師與學生生動活潑、互相促進的良好氛圍。
三、結語
當前世界已處于信息化時代，知識的更新快、信息量大。這改變了人們傳統的學習方式，也對大學微生物學的課程教學產生了深刻影響。因此，必須改革傳統的教學內容和手段，建立新的教學理念。在更新教學內容的同時，應重點培養學生掌握科學的方法、自身創新能力和個人綜合素質。微生物學的發展日新月異，教學改革勢在必行，這既是培養創新人才的需要，也是現代社會對高等教育人才的時代需要，是每個教育工作者的職責所在。在教學過程中，只有把知識傳授和能力培養有機地結合起來，同時提高教學效果，才能使學生成為適應未來實際發展需要的高技術、創新型人才。
參考文獻：
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細胞生物學的發展歷程范文2
王遠亮教授是一位頗有成就的科學工作者。他認為,祖國在科學工作者的心中是神圣的,因此時刻惦記著要為祖國的騰飛多做貢獻。在“科學技術是第一生產力”的今天如何多做貢獻,就成為科學工作者常常默默思考的問題。
現代科學知識增長迅猛,科學技術發展飛速,我們的祖國正在按照科學發展觀建設有中國特色社會主義創新型國家。顯然中國特色社會主義國家的科學發展體系,需要中國特色的社會主義政治體系、科學技術體系、經濟體系、教育體系、社會保障體系等等。然而,中國的科學技術體系如何建立才可以再創中國的科學技術偉大輝煌?這是中國科技工作者的歷史使命。
現代科技體系基本上是按照西方科技體系建立的,是否具備中國特色?是值得深思與探討的問題。
由此可見,王遠亮教授是個善于思考的人,他能在生物工程學方面取得輝煌成就也與他善于思考是密不可分的。
善于分析系統把握
迄今,現代西方的科學知識尤其是在物質科學和生命科學領域增長之迅猛,微粒子,時空量子化,特別是基于分子生物學的醫學的知識等等,日新月異,預示著科學將產生巨大的變革。我們正處在科學變革的前夜。在這種背景下,我們如何建設中國特色社會主義國家的科學技術體系?王遠亮教授認為需要冷靜地系統分析。
我國現實的狀況是,西學東遷并且幾乎全盤西化(部分真正的中醫除外)的科學技術體系似乎已經形成。其理由是,西方科學就是先進。西方技術的先進性有目共睹,為何古代中國科學那么的輝煌,近代就落后了呢?
這也就十分奇怪了,表面上看這是所謂的“李約瑟疑難”,實際上是人們賴以“假設+邏輯思維與推理”,有時輔以局部關系的實驗,即注重非真實性的科學(西方科學是必須以假設為前提的科學),卻很少關注真實性的科學(中國古代創立的科學是不需要假設的科學)?？墒鞘返俜?#8226;科維認為需要“根據德爾納的觀點,避免失敗的關鍵在于要用系統,而不要用分量;要以整體,而不要以局部的方式進行思維?！边@正好符合中國先前輝煌的科學觀。所以不必奇怪,西方科學家正在改變自己的思維方式,大勢在中國先哲科學觀領域中淘寶。有很多外國人在中國這里得到了啟示,比如說,玻爾以“太極圖”作為族徽,普里高津在湖南學習了“天人合一”繼而發現了開放式非平衡系統科學,湯川秀樹認為他之所以能提出介子理論與受到莊子餛飩說的啟示有關,哈肯說“協同學和中國古代思想整體性觀念上有很深的聯系?！钡鹊?由此可見,中國的先哲科學觀領域是有很多精華的,后人需要的就是將這些精華加以提煉并正確運用和發展,形成屬于中國自己的科學系統。
愛因斯坦說:“西方科學的發展是以兩個偉大的成就為基礎的,那就是:希臘哲學家所發明的形式邏輯體系(在歐幾里德幾何中),以及發現通過系統的實驗可能找出因果關系(在文藝復興時期)的方式方法。中國的賢哲沒有走上這兩步,那是不用奇怪的。令人驚奇的倒是這些發現(在中國)全部都做出來了?！钡档眯牢康氖?我國很多中西會通者都發現了這一影響我國科學事業發展的關鍵因素. 著名數學家陳省身在1994年吳文俊榮獲香港求是科技基金會頒發的杰出科學家獎時說:“他的機器證明理論,保持了中國數學的傳統?！蓖瑫r,吳文俊院士也說:“最重要的是開拓屬于我們自己的領域,創造自己地方法,提出自己的問題。這就好像別人已經開辟出一片天地,你在這片天地中,即使翻江倒海、苦心經營,也很難超過人家,這片天地終究是人家的”。特別是吳文俊在《中國古代數學對世界文化的偉大貢獻》一文中明確指出“近代數學之所以能夠發展到今天,主要是靠中國的數學,而非希臘的數學,決定數學歷史進程的主要是靠中國的數學,而非希臘的數學?！?/p>
王遠亮教授認為,我們應該以吳文俊先生為榜樣,正視中國的歷史至今的科學發展歷程,《老子》以系統科學觀論長壽之道可以借鑒;《易》學以系統科學觀述太陽系形成論;中醫秉承這兩個系統思維保障人體健康;現代西方科學的非線主要靠中國的系統科學去解決,那么未來的科學應該是以中國系統思維的科學為基調的科學。
所以,王遠亮教授認為,以我國的系統科學思維去融匯中西,就能夠建成世界上最先進的中國特色的科學技術體系,以此建成“中國特色社會主義”的完美大廈。
樸實無華耕耘收獲
我們知道,生物工程學起源于20世紀70年代初,在分子生物學、細胞生物學等的基礎上發展起來的,包括基因工程、細胞工程、酶工程、發酵工程等,他們互相聯系,其中以基因工程為基礎。只有通過基因工程對生物進行改造,才有可能按人類的愿望生產出更多更好的生物產品。而基因工程的成果也只有通過發酵等工程才有可能轉化為產品。
醫學上通過生物工程可以生產出大量廉價的防治人類疾病的藥物,如入胰島素、干擾素、生長激素、乙型肝炎疫苗等。生物工程在食品、輕工中的應用面也很廣。
現在世界各國對生物工程都十分重視,我國也把生物工程列為重點發展的科研項目之一。生物工程學的研究將對人類的生產方式和生活方式產生巨大的影響。
王遠亮教授看到了生物工程對人類的影響,義無反顧的投身到這項偉大的事業當中,多年以來,王遠亮教授兢兢業業的從事研究工作,進行了多個課題的研究,并取得了驕人的成果。他一直從事聚乳酸改性材料及其應用基礎研究,曾負責并完成與本課題有關的項目30多項,包括負責和參加的國家自然科學基金面上和重點項目8項,負責和參加國家“863計劃”課題2項,主持國家支撐計劃項目1項,此外還有教育部和重慶市重點重大科技課題8項。獲得了多項榮譽。
細胞生物學的發展歷程范文3
關鍵詞：反義RNA；RNA干擾；ZFN；TALEN；CRISPR-Cas系統
中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）08-1405-08
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.08.002
Research Progress on Loss of Gene Function Technologies
NING Hui-yua，b，LIU Caia，b，ZOU Hua-wena，b
（a.College of Agriculture；b.Hubei Collaborative Innovation Center for Grain Industry，Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China）
Abstract： Loss of gene function technology is one of the most important and efficient methods to study gene function at present. Now main widely used loss of gene function technologies are anti-sense RNA， RNA interference，ZFN，TALEN，CRISPR-Cas nucleases technology and so on. Those technologies aim to inhibiting or turning off the expression of the target gene， researching the change of the biological phenotype， and thus their related functions were speculated. In the practical studies， loss of gene function is always along with gene overexpression， providing the most direct evidence for gene function research， which was widely used in biology， medicine， agriculture and other fields. This paper systematically introduces the developing history， technological principles and application of some common loss of gene function technologies， and the protest of their future research and application is introduced.
Key words： anti-sense RNA； RNA interference； ZFN； TALEN； CRISPR-Cas nucleases
20世o50年代DNA雙螺旋結構的發現，標志著人們對生命科學的研究進入了分子生物學時代。隨著后基因組時代的到來，基因組學的研究重心從揭示生命的所有遺傳信息結構、組成等轉移到對功能的研究上。除了傳統的轉基因（基因過量表達）外，定向抑制或完全消除特定基因的表達也是目前研究基因生物學功能的重要手段。因此，出現了反義RNA、RNA干擾等技術。隨著研究技術手段的發展，近年來又興起了ZFN技術、TALEN技術、CRISPR-Cas系統等基因功能修飾技術。這些技術不斷被發現及應用，極大地促進了生物學研究的發展。本研究主要對基因功能缺失技術發展歷程、技術原理及應用等方面進行概述。
1 反義RNA技術
反義RNA是指與靶RNA（多為mRNA）具有互補序列的RNA分子，它通過與靶RNA進行堿基互補配對的結合方式影響mRNA的后續翻譯過程。反義RNA最早在原核生物E.coli的產腸桿菌素的Col E1質粒中發現[1]。隨后發現在真核生物中也存在天然的反義RNA，特別是發現了人工構建的反義寡核苷酸在真核生物中具有生物學效應以來，反義RNA技術已成為一種直接有效的人為控制基因表達的方法，并且倍受生物學界關注。
1.1 反義RNA作用機理
反義RNA主要通過與靶RNA以堿基互補配對的方式結合，參與基因表達調控。其作用機理為：①在DNA復制水平上。反義RNA通過與DNA復制時的起始引物RNA結合，阻止RNA引物與模板DNA的結合，抑制DNA的復制。②在轉錄水平上。反義RNA可以直接與mRNA5′端互補，阻止轉錄。③在翻譯水平上。反義RNA通過與mRNA上的特定序列互補配對而結合。結合位置包括起始密碼子AUG、靶mRNA的非編碼區、原核生物的SD序列以及真核生物的mRNA5′端，從而直接或間接地抑制mRNA的翻譯[2]。
1.2 反義RNA技術的應用
目前，反義RNA技術作為一種重要的基因調控手段，在植物、病毒、細菌中得到廣泛應用。在植物中最顯著的應用是果實成熟的控制?？茖W家通過控制乙烯合成途徑中的關鍵酶來限制乙烯的合成，從而達到控制果實成熟的目的[3]。Oeller等[4]利用反義RNA技術抑制ACC合成酶的活性，使果實內的乙烯含量被抑制了99.5%。這為果實的貯藏、加工、運輸等提供了新方法。
反義RNA技術在植物抗病方面也得到了很好的應用。植物病毒是影響植物生長的重要因素之一。由于DNA病毒和RNA病毒在復制和表達的過程中都要經歷RNA生物合成階段，這為利用反義RNA技術進行抗病毒研究提供了理論依據。Nelson等[5]利用TMV 5′端的基因片段作為目的基因，成功構建了反義基因并獲得了表達反義基因的轉基因煙草植株。試驗結果表明，病毒RNA和后代病毒的合成被抑制了25～50倍，病毒侵染癥狀大量減少甚至消失，并且該抗病毒性狀可穩定遺傳。
由于抗生素的濫用，細菌的耐藥性越來越強。為了能夠快速、簡便獲得新的抗菌藥物，反義RNA技術被應用到藥物篩選模型上。2006年科學家在金黃色葡萄球菌體內誘導表達出了針對單功能脂肪酸合成酶FabF的反義RNA，并構建了反義工程菌。研究發現，構建的反義工程菌對FabF（Fatty acidbiosynthesis geneF）的特異性抑制劑非常敏感，通過藥物篩選獲得了能夠有效抑制MRSA（Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus）和VRE（Vancomycin-Resistant Enterococci）的新型抗生素平板霉素[6]。因此，可利用反義RNA技術尋找新型抗生素解決細菌耐藥性的問題。
1.3 反義RNA技術的優缺點
隨著研究的不斷深入，人們對反義RNA技術也有了比較成熟的認識。與傳統的基因敲除技術相比，反義RNA技術具有許多的優越性。①反義RNA技術操作較簡單，適用范圍廣泛。通過靶mRNA的序列就可以合成所需的反義RNA，可用多個反義RNA同時阻斷多個基因的表達。②特異性強[7]。反義RNA技術可以有選擇性的迅速抑制目的基因的表達。該技術不會對蛋白質產生完全抑制，從而能避免致死突變，對細胞的正常生長影響較小。③安全性高[8]。導入細胞的反義RNA不能被翻譯產生蛋白質，因此該技術在基因工程上的應用具有很大的安全性。
眾多的因素限制了反義RNA的發展。主要包括：①成本較高。②靶基因定位困難。由于高等生物的基因組復雜，對特殊基因的靶向定位很困難。③使用效率問題。反義RNA的堿基序列、含量、靶序列結合部位和濃度等都會影響其使用效率[9]。
2 RNA干擾技術
RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指與靶mRNA存在同源互補序列的雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）在細胞內特異性地降解靶mRNA的一種基因轉錄后沉默現象[10]。這一現象在自然界中廣泛存在，是生物體在進化過程中形成的一種進化上保守的用來抵御外來基因或外來病毒侵犯的防御機制。
1990年Napoli等[11]將查爾酮合成酶CHS基因轉入到牽?；ㄖ校噲D獲得開出深紫色花朵的牽?；?，結果卻得到了白色和斑片狀花朵，即轉入的CHS基因和與該基因同源的色素基因的表達均受到抑制，將這種現象稱為轉錄后基因沉默 （Post-transcriptional gene silencing）或者共抑制（Co-suppression）。1994年Cogoni等[12]分別將外源基因albino-1和albino-3轉入粗糙脈孢菌（Neurospora）中，也出現了與植物共抑制相同的轉錄后基因沉默現象，將其稱為基因壓制（Gene quelling）現象。1995年Guo等[13]發現將秀麗新小桿線蟲（Caenorhabditis elegans）par-1基因的正義鏈RNA和反義鏈RNA分別注射到線蟲體內均會抑制par-1基因的表達，但當時的理論無法解釋這一現象。直到1998年Fire等[10]才解釋了這一現象，即RNAi是由于dsRNA引起的轉錄后序列特異性基因沉默，并將其命名為基因沉默（Gene silencing）。
2.1 RNA干_作用機理
RNA干擾作用機理可分為3個過程：siRNA的形成、靶mRNA的降解、RNAi的形成。①siRNA的形成[14]。細胞質中的內源性或外源性的長dsRNA首先與Dicer酶結合，形成Dicer-dsRNA復合物，在Dicer酶的RNase的作用下，長dsRNA被特異性地裂解為21～23 nt siRNA。其5′端為磷酸基，3′端為羥基且含有2個突出的黏性末端。②靶mRNA的降解。siRNA在解旋酶的作用下解鏈，形成正義鏈和反義鏈，其中的反義鏈可指導形成RNA誘導的沉默復合體（RISC）[15]。在siRNA的引導下，RISC通過堿基互補配對的方式識別具有同源序列的靶mRNA并進行剪切，其剪切位點為與siRNA反義鏈互補的第1個核苷酸下游的11或12個核苷酸處，然后降解靶mRNA。③RNAi的形成。在RNA依賴性RNA聚合酶（RdRP）的作用下，以靶mRNA為模板，siRNA為引物，合成dsRNA。合成的dsRNA在Diser酶的作用下，又產生新的siRNA，如此循環多次，可以使RNAi的作用進一步放大。因此，少量的siRNA可以產生高效的基因沉默效應[16]。研究還發現siRNA除了能導致轉錄后基因沉默，還可指導DNA甲基化酶與DNA的特定部位結合，引發該特定部位DNA中的胞嘧啶甲基化，導致轉錄水平的基因沉默[17]。
2.2 RNA干擾技術的應用
雖然人們對RNA干擾的研究只有短短的十幾年時間，但發展卻極為迅速，在生物醫學等領域得到廣泛應用。①疾病治療上的應用。RNA干擾作為一種基因敲除技術，在腫瘤、病毒感染、遺傳病治療方面得到了廣泛應用。An等[18]利用RNA干擾技術構建了卵巢癌OVCAR3細胞IGF-IR基因的siRNA表達質粒，通過脂質體法轉染到人的卵巢癌OVCAR3細胞中，研究發現IGF-IR基因的siRNA能顯著抑制其mRNA及蛋白質的表達，并且還能抑制OVCAR3細胞的增殖。RNA干擾技術為疾病在基因領域的治療提供了新方法。②作為基因研究的新工具。由于RNA干擾能特異性的抑制目的基因的表達，根據其表型等的改變可以分析基因的功能，因此是研究基因功能的一種有效的手段[19]。Yu等[20]通過構建cyclin D1基因的siRNA表達質粒，研究cyclin D1基因對疤痕疙瘩成纖維細胞的細胞增殖和細胞周期的變化。③RNA干擾技術還被廣泛應用于信號傳導通路的研究。通過和傳統的缺失突變技術結合，RNA干擾技術可以很容易確定復雜信號傳導途徑中不同基因的上下游關系[21]。Jin等[22]利用RNAi技術發現argonaute-1在FMRP參與神經元發育和突觸生長過程中起重要作用，證明FMRP能調節信號通路。④藥物的開發與應用。RNA干擾可作為尋找和鑒定新藥物靶標的工具。利用RNA干擾技術可以明顯縮短從鑒定到認識藥物靶基因功能的時間，有助于藥物開發過程中對已知靶基因功能的高通量分析[23]。Duff等[24]利用RNA干擾技術能降低蛋白轉移酶9（PCSK9）的表達量，研究發現PCSK9表達量的降低能明顯降低小鼠血清膽固醇水平，說明沉默PCSK9可成為治療高膽固醇的藥物靶點。
2.3 RNA干擾技術的優缺點
RNA干擾技術具有以下特點：①高效性。RNAi存在級聯放大效應。siRNA在Diser酶的作用下，以靶mRNA為模板可以產生新的siRNA，如此循環多次，可以使RNA干擾的作用進一步放大。因此，少量的siRNA可以產生高效的基因沉默效應。②特異性。siRNA與靶mRNA通過堿基互補配對原則進行結合，只特異性的誘導靶mRNA的降解。研究表明，即使是一個堿基的錯配，也會影響靶mRNA沉默效率[25]。對mRNA前體幾乎沒有影響，以內含子或啟動子構成的dsRNA也不產生RNA干擾現象。③可傳播和可遺傳性。RNA干擾效應可以在不同細胞間進行傳遞，并且可以傳遞到下一代。Fire等[10]通過將dsRNA注射到線蟲體內，發現dsRNA可以擴散到其他細胞中，并且在下一代也表現出了RNA干擾現象。
目前，對RNA干擾的研究仍處于初級階段，還有許多問題亟待解決。主要包括：①存在脫靶現象。siRNA可以引起一些非靶基因的非特異性沉默或表達上調，抑制細胞的正常生長。②穩定性差。siRNA導入受體細胞后RNA干擾效應持續數天后便會消失。③載體的安全性問題。在臨床應用上，載體作為外來抗原可激活機體的免疫應答，使載體失活，甚至可能對機體造成嚴重的不良后果[26]。
3 鋅指核酸酶（ZFN）技術
1983年，鋅指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）首次在非洲蛙蟾轉錄因子IIIA中被發現。隨著研究的不斷深入，人們對ZFP有了進一步的了解。1996年Kim等[27]將鋅指結構域與IIs型限制性核酸內切酶FokⅠ的切割結構域融合，獲得了具有識別特性的人工合成的核酸內切酶。隨后，Bibikova等[28]利用ZFN技術對爪蟾的卵母細胞開展外源DNA修復試驗，并取得成功。Bibikova等[29]又利用ZFN技術成功敲除了果蠅的一個內源基因。ZFN技術的應用實現了對基因的高效定點修飾，對研究基因的功能具有重要意義。
3.1 ZFN的結構及作用機理
ZFN是由鋅指蛋白（ZFP）結構域和核酸內切酶（FokⅠ）的切割結構域兩部分組成[27]。ZFP結構域主要負責識別并特異結合靶DNA序列。FokⅠ的切割結構域主要負責切割靶DNA。
ZFP結構域一般是由3～6個Cys2-His2型的鋅指結構域串聯組成，多個鋅指結構的串聯不僅可識別較長的靶DNA序列，還可以增加其修飾的特異性。每個鋅指折疊成α-β-β（C端-N端）型的二級結構[30]，其中的α螺旋可插入到DNA雙螺旋的大溝，α螺旋中的-1～+6位的7個氨基酸殘基（+4位通常為亮氨酸殘基）決定了對靶DNA識別的特異性[31]。每個鋅指蛋白可識別并結合一個三聯體密碼（圖1a）[32]。
FokⅠ是海床黃桿菌（Flavobacterium okeanokoites）表達的一種限制性內切酶，通過與ZFP的C端融合形成ZFN單體。FokⅠ的切割結構域必須形成二聚體才能發揮內切酶活性[33]。因此，在切割靶位點時，2個ZFN單體按照一定的距離和方向同各自的靶DNA鏈特異結合，2個FokⅠ切割結構域恰好可形成有活性的二聚體，在2個結合位點的間隔區（Spacer，通常為5～7 bp）切割DNA產生DSB切口。細胞再通過非同源性末端接合（NHEJ）或同源重組（HR）等方式對基因進行修復，改變靶DNA序列，從而達到基因敲除的目的[34]（圖1b）。構建能特異性識別靶DNA的ZFP結構域是ZFN技術的關鍵。因此，只需根據目的基因設計出鋅指結構域，再與FokⅠ融合形成ZFNs。然后將融合的ZFNs通^電穿孔、轉染及病毒運輸等方式導入細胞核中完成對靶基因敲除。
3.2 ZFN技術的應用
ZFN作為一種靶向修飾技術，可以精確地修飾基因及其周圍調控元件，在生物體基因組改造與基因功能研究等方面得到廣泛應用。ZFN已經成功應用于線蟲、大鼠、小鼠、中國倉鼠、果蠅、海膽、斑馬魚、家蠶、植物、豬及人類iPS細胞和ES細胞中[35]。主要包括以下兩方面：①對動植物基因組的靶向修飾。Bibikova等[29]利用ZFN技術對果蠅X性染色體的yellow基因進行定點修飾，結果發現50%的雄性果蠅發生顏色的改變。Zhang等[36]設計了針對敲除擬南芥ADH1和TT4基因的ZFN，通過雌激素誘導啟動子表達，研究發現T1代分別有7%和16%的植物含有體細胞突變，并且能穩定遺傳給后代。②疾病的治療。Li等[37]利用ZFN技術治愈了血友病B型小鼠，這為以后利用ZFN技術治療基因疾病提供了新的有效手段。
3.3 ZFN技術的優缺點
ZFN作為第一代人工核酸內切酶技術，打破了只能通過同源重組的方式對基因組進行改造的觀念。ZFN技術的優點包括：①與傳統的方法相比較，ZFN技術提高了基因組的編輯效率，操作簡單，可以快速敲除目的基因。②能夠廣泛地應用于各種生物，并誘導靶位點進行定點突變。
ZFN技術也存在著許多的局限性：①存在脫靶現象。由于ZFN對靶位點進行切割時容易脫靶，導致細胞代謝紊亂，從而對細胞產生毒副作用。②存在上下文依賴效應[38]。ZFN在識別靶DNA位點時，識別靶DNA的重復氨基酸之間會相互作用，導致識別的特異性發生改變，即識別靶DNA的特異性不高，影響基因打靶的效果。③成本高。由于ZFN的特異性不高，很難設計出高特異性的鋅指組合，目前該技術一直被生物公司壟斷。
4 轉錄激活子樣效應物核酸酶（TALEN）技術
1989年一類可以使植物患病的轉錄激活子樣效應蛋白TALE（Transcription activator-like effector）在黃單胞桿菌（Xanthomonas）中分離得到[39]。2007年Kay等[40]發現一種TALE蛋白（AvrBs3）可以被黃單胞桿菌注入到宿主細胞內，然后進入宿主細胞核，與宿主upa20基因的啟動子結合，激活宿主upa20基因的表達。2009年Moscou等[41]發現了TALE蛋白特異結合宿主基因啟動子的機制。隨著對TALE蛋白的深入了解，科學家發現TALE蛋白可以補足第一代人工合成的核酸內切酶（ZFN）技術的許多缺陷。2010年Christian等[42]首次報道了人工構建的TALEN技術。2011年Li等[43]用AvrXa7和PthXo1中天然存在的TALE重復序列進行了類似的試驗，發現FokⅠ結構域連接到TALE結構域的C端的切割效果好于連接到N端。2012年Deng等[44]通過解析TALE蛋白的晶體結構，清晰揭示了TALE蛋白結合DNA的作用機制，為以后更好改造和應用TALEN打下了基礎。
4.1 TALEN的結構及作用機理
TALEN是由TALE結構域和核酸內切酶（FokⅠ）的切割結構域兩部分組成[45]。與ZFN技術原理類似，TALE結構域主要負責識別并特異結合靶DNA序列，FokⅠ的切割結構域主要負責切割靶DNA。
TALE蛋白是由N端的具有分泌信號功能的易位結構域（Translocation domain，TD）、中部DNA特異識別結合域、C端核定位信號（Nuclear localization signal，NLS）和轉錄激活結構域（Activation domain，AD）4部分構成。其中，中部DNA特異識別結合域是由一系列數目不定的串聯重復單元組成。每個重復單元通常由34個氨基酸組成[46]，其中32個氨基酸是高度保守的，只有12位和13位上的氨基酸是可變化的，這2個氨基酸又被稱為重復可變雙殘基（Repeat variable diresidue，RVD）。每個重復單元只識別1個核苷酸，其識別的特異性由RVD決定，并且RVD可與4種堿基有特定的配對關系，即NI特異識別A，HD特異識別C，NG特異識別T，NH特異識別G，NN對應G或A[41，46]。研究發現，第12位氨基酸主要起穩定RVD環的功能，第13位氨基酸是真正識別特異堿基的氨基酸，決定識別的特異性[44，47]（圖2a）。
FokⅠ與TALE的C端融合形成TALEN。對靶DNA進行切割時，FokⅠ也需要形成二聚體發揮切割作用，當兩個TALEN分別結合到各自的靶DNA序列上時，2個FokⅠ會在靶DNA序列的間隔區（Spacer，14～18 bp）處形成二聚體[48]，并對靶DNA進行切割，形成DSB切口，進而引發細胞內的NHEJ和HR修復機制，導致基因沉默（圖2b）?？傊?，通過構建不同的TALE就可實現對不同靶DNA的切割。
4.2 TALEN技術的應用
TALEN技術的發明使得基因組編輯效率明顯提高，因此，在人、小鼠、大鼠、斑馬魚、水稻、擬南芥等物種中得到廣泛應用。①遺傳病治療方面的應用?？蒲腥藛T利用TALEN技術對來源β-地中海貧血病人的非整合型iPSCs進行珠蛋白基因HBB修復，研究發現細胞在修復過程中沒有產生TALEN引發的脫靶突變并且這些修復好的iPSCs具有多能性及正常核型，表明這種方法可作為一種治療地中海貧血疾病的有效途徑[50]。②生物模型的構建。2014年中國科學家利用TALEN技術成功的敲除了食蟹猴基因。首次用該技術成功構建了非人類靈長類動物模型[51]。③新品種的培育。Li等[52]利用TALEN技術剔除掉了水稻基因組中對水稻白葉枯病敏感基因Os11N3，獲得了穩定遺傳的抗病水稻新品種。這也顯示出了TALEN技術介導的基因定點修飾在作物遺傳育種中具有廣闊的應用前景。
4.3 TALEN技術的優缺點
作為第二代人工合成的核酸內切酶技術，與ZFN技術相比，TALEN技術具有明顯的優勢。①與ZFN技術相比，TALEN篩選更為簡便，它不需要復雜的篩選過程，只需要簡單的分子克隆技術就可以獲得高效的TALEN。②脫靶現象減少，降低了對細胞的毒性。③切割位點的特異性強。
TALEN技術雖然有很多優點，但也存在許多不足。主要包括：①TALE蛋白較大，并且序列重復性很強，構建表達載體較為復雜[53]。一般由生物公司合成，r格較貴。②仍然存在脫靶現象。③一對TALEN只能對一個靶基因進行修飾。當對多個基因同時進行編輯時，需要共轉染多個TALEN載體，這樣會導致轉染效率下降，很難獲得所需的陽性細胞[54]。
5 CRISPR-Cas核酸酶（CRISPR-Cas RGNs）技術
1987年Ishino等[55]首先在大腸桿菌的堿性磷酸酶基因下游發現了成簇的短間隔重復序列，但該序列當時沒有引起人們的足夠重視。隨著研究的不斷深入，發現大約40%的細菌和90%的古生菌都存在這種成簇的短間隔重復序列。2002年這種成簇的短間隔重復序列被命名為串聯間隔短回文重復序列[56，57]（Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR）。此外，在CRISPR位點附近還存在著多個與CRISPR相關的Cas（CRISPR-associated genes）基因。隨后的研究又發現，CRISPR中的間隔序列與質?；蚴删w等外源DNA序列高度同源。當病毒入侵宿主細胞時，細菌和古細菌中的CRISPR序列就能夠引導CRISPR相關（CRISPR-associated，Cas）蛋白使外源DNA降解，從而起到免疫保護的作用[58]。
5.1 CRISPR-Cas系統的結構及作用機理
CRISPR-Cas系統主要是由CRISPR序列元件和Cas基因家族蛋白組成[59]。目前，CRISPR-Cas系統一般被分為3種類型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型系統在介導靶DNA雙鏈降解時需要多種Cas蛋白的參與，而Ⅱ型CRISPR-Cas系統只需要Cas9就可完成對靶DNA雙鏈的切割[60]。通過比較，Ⅱ型CRISPR-Cas系統更為簡便，更適合應用于基因編輯。目前，CRISPR-Cas技術主要是Cas9系統的應用，本研究將對CRISPR-Cas9系統進行闡述。
CRISPR序列元件主要是由一個前導序列（Leader）、多個重復序列（Repeats）及多個間隔序列（Spacers）組成，其中重復序列和間隔序列以相互交替的方式連接（圖3）。前導序列是一段富含AT，長度為550 bp的不保守序列，位于CRISPR的上游，可啟動CRISPR序列轉錄；重復序列是一組長度為23～50 bp，平均長度為31 bp的高度保守的短小序列；間隔序列為來源于噬菌體、質粒等的平均長度為36 bp的外源基因片段即原間隔序列（Protospacers）[61]。Cas9是一個多結構域蛋白，主要由α-螺旋組成的識別區（REC）、位于蛋白中間位置的HNH核酸酶結構域、 位于氨基末端的RuvC-like結構域以及位于C端的PAM結合區組成[62]。
CRISPR-Cas9系統[63]的作用機理可分為3個階段：①可變間隔序列的獲得[64]。CRISPR-Cas9系統能夠識別外源核酸中的特殊片段，該特殊片段中存在原型間隔序列毗鄰基序（Protospacer-associated motif，PAM），并將PAM旁的原型間隔序列加工整合入自身基因組中的CRISPR序列中。②crRNA（CRISPR-derived RNA）的形成[60]。在前導序列的啟動下CRISPR轉錄產生前體CRISPR RNA（pre-CRISPR RNA，pre-crRNA），隨后CRISPR轉錄產生的tracrRNA（trans- activating crRNA）與pre-crRNA形成RNA異二聚體，在Cas蛋白的作用下，pre-crRNA被加工成crRNA。③對外源DNA的切割[64]。成熟的crRNA、tracrRNA及Cas9結合形成一個三元的沉默復合物。而后在crRNA的引導下由Cas9蛋白對目的基因進行切割。在切割時Cas9蛋白的HNH能夠特異性識別與crRNA互補配對的模板鏈并對其切割，切割位點位于PAM上游3 nt處；RuvC-1ike參與另一條鏈特定位點的切割，切割位點位于PAM上游3～8 nt處（NGG位點）[65]。Cas9蛋白對外源DNA進行切割后也會產生DSB切口，并通過NHEJ和HR的方式進行修復[66]（圖4）。因此，通過設計不同的crRNA可以使CRISPR-Cas9剪切不同的DNA序列。Jinek等[67]將成熟的crRNA和tracrRNA這兩種RNA構建成一個向導RNA（single-guide RNA，sgRNA）與Cas9融合，發現由sgRNA和Cas9蛋白構成的新CRISPR-Cas系統仍可對目的基因進行切割。所以，可將CRISPR-Cas9系統簡化成Cas9蛋白與sgRNA。
5.2 CRISPR-Cas系統的應用
目前，CRISPR-Cas系統的應用仍處在初級階段，但在基因功能的研究、模式生物的構建、遺傳育種等方面得到廣泛應用。①在基因功能研究中的應用。與傳統的基因敲除技術相比，CRISPR-Cas系統能夠對多種細胞及生物體的目的基因進行高效快速的敲除，是研究基因功能的重要工具。Shalem等[68]構建了一個含有65 000種sgRNA的文庫，這些sgRNA可以靶向人類基因組中18 080種基因，幾乎涵蓋了每個已知的基因。并將編碼這些sgRNA的基因和編碼Cas9蛋白的基因一起轉運到人類細胞中，從而篩選出具有特定功能的基因。②動物模型的構建。2013年Wang等[69]在小鼠的胚胎干細胞中使用CRISPR-Cas9系統，對Tet1、Tet2、Tet3、Sry和Uty-8這5個基因進行同時編輯，產生了基因敲除新個體。這為研究基因家族成員的功能相關性提供新方法。③新品種的改良與培育方面的應用。Shan等[70]利用CRISPR-Cas9技術去掉了一個小麥基因，得到了耐白粉病的小麥新品種。還利用CRISPR-Cas9技術定點突變了水稻和小麥兩種作物的OsPDS和TaMLO基因，發現原生質體中基因突變效率為14.5%～38.0%，水稻轉基因植物中突變效率4.0%～9.4%，并且在T0代獲得了水稻純合PDS突變體，呈現預期的白化和矮小表型。
5.3 CRISPR-Cas系統的優缺點
作為第三代人工合成的核酸酶，與ZFN技術和TALEN技術相比具有明顯的優勢。主要表現在：①CRISPR-Cas系統的切割能力更強。CRISPR-Cas系統可以切割一些ZFN和TALEN不能接近的位點[71]。②操作更為簡便，試驗周期更短，成本更低。突變不同的靶位點只需設計與靶位點互補的sgRNA，然后將sgRNA克隆到表達質粒上即可。③CRISPR-Cas系統可以同時對多個靶基因進行定點修飾，因此大大提高了修飾效率。
CRISPR-Cas系統的應用仍處于初級階段，存在許多不足：①5′-GN19NGG-3′的結構有時會出現限制性，會對靶位點以外的序列進行編輯，產生多余的DNA突變[72]。②CRISPR-Cas系統識別靶序列的長度較短，不能根據需求進行調節。③仍存在脫靶現象。
6 展望
基因功能缺失技術已經在生物學各個領域得到廣泛應用，成為了研究基因的主要方法。隨著基因功能缺失技術的不斷更新，已從反義RNA技術發展到了CRISPR-Cas技術，并且其應用范圍越來越廣泛，對目的基因的編輯效率越來越高，操作越來越簡便。目前基因功能缺失技g仍存在許多不足，限制了其發展。隨著研究的不斷深入與發展，基因功能缺失技術必將得到不斷改進和完善，也一定會對基因功能方面的研究做出更大的貢獻。
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