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基因治療范文1
基因治療(GeneTherapy)是指將外源正?；驅氚屑毎?，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，而達到治療目的。1991年美國實施了人類第一個對遺傳病進行體細胞基因治療的方案，科學家W.FrenchAnderson等將含有正常ADA（AdenosineDeaminase，腺苷脫氨酶）基因的逆轉錄病毒轉入一個4歲患有ADA-SCID（SevereCombinedImmunodeficiency，嚴重復合免疫缺陷綜合征）的女孩的白細胞內，并用白細胞介素Ⅱ(IL-2)刺激其增殖，經10天左右再經靜泳輸入到此患兒體內。大約1－2月治療一次。8個月后，患兒體內ADA水平達到正常值的25％，兩年后基本恢復正常，未見明顯副作用。此后又進行第2例治療并獲得類似的效果[1-2]。
這是基因治療史上的里程碑，迅速引起了全球基因治療的研究熱潮。然而，基因治療的發展并不是一帆風順的。1999年，美國一名年僅18歲的青年JesseGelsinger因患鳥氨酸轉氨甲酰酶不足癥（一種遺傳性疾?。┰诿绹e夕法尼亞大學人類基因治療中心接受基因治療時不幸死亡，這一事件震驚了當時的科技界?；蛑委熞欢鹊氲凸龋鲊鴮蛑委熍R床試驗的資助大幅減少[3]。基因治療在爭議中不斷地前進，最近幾年已取得不俗進展，重新成為各國研究的熱點。RNAi（RNAinterference,RNA干擾）是基因治療的又一亮點，其在神經性、遺傳性、病毒性等疾病中的治療研究已經展開[4]。2009年，針對X-連鎖型腎上腺腦白質營養不良癥(X-linkedAdrenoleukodystrophy，X-ALD)的基因治療初見成效，并被《Science》評為年度十大科學發現之一[5]。正如《Science》評論指出：在飽受科學界質疑以及制藥業遺忘多年后，近幾年基因治療在應對嚴重遺傳性疾病方面取得了重大突破，再次優雅的回歸[6-7]。在我國，基因治療也有一定發展。1991年，復旦大學薛京倫教授研究小組進行了國內首例基因治療臨床試驗。
2003年，人類首例商業化基因治療產品“重組Ad-p53腺病毒注射液”在深圳誕生。目前，我國已在在遺傳病、腫瘤、神經系統疾病及細胞因子基因治療的臨床前研究取得了一定成績[7]?；蛑委煱窗屑毎愋头譃樯臣毎?Germ-lineCell)基因治療和體細胞(SomaticCell)基因治療。廣義的生殖細胞基因治療以、卵子和早期胚胎細胞作為治療對象。由于生殖細胞基因治療涉及一系列倫理學問題，如人權問題、阻礙人類多樣性的問題以及基因歧視等，生殖細胞基因治療仍屬[8]。體細胞基因治療是當前基因治療研究的主流，但是仍處于臨床試驗階段，存在較高的風險性和不穩定性?；蛑委熡捎谧陨砑夹g的高度復雜和難以控制，同時涉及一定的社會倫理學問題，應用于臨床醫學必然會引起相關的法律問題。
二、基因治療在臨床醫學應用中的法律問題
（一）隱私權
基因(Gene)是指攜帶有遺傳信息的DNA序列，是控制性狀的基本遺傳單位?；蛴袃蓚€特點，一是能忠實地復制自己，以保持生物的基本特征；二是基因能夠“突變”，突變絕大多數會導致疾病，另外一小部分是非致病突變。非致病突變給自然選擇帶來了原始材料，使生物可以在自然選擇中被選擇出最適合自然的個體?；蚺c人類的健康密切相關?；虻奶攸c決定了基因具有特殊的地位①，基因治療過程中必然涉及到患者基因的隱私權保護。一是基因隱私保密權。保護個人隱私的隱蔽性、不公開性是使個人隱私保持其受法律保護狀態的前提?；蛐畔⒉粌H與個人密切相關，而且與個人的后代相關。因而,個人享有對其基因信息進行保密,不為他人所知的權利。[9]二是基因隱私的知曉權。獲取基因進行基因研究必須向基因的所有者進行告知，讓基因所有者知情，使其知道自己的基因作何用途。[10]三是基因隱私利用權。是指自然人依法對自己的基因信息進行積極利用,以滿足自己精神、物質等方面需要的權利。[9]四是基因隱私支配權。這是基因隱私權的核心內容。任何單位或個人未經基因提供者本人的同意或授權，不得隨意公開、使用或處置基因提供者的基因信息。[10]如利用基因信息進行相關科研等活動時，必須征得提供者的同意。五是基因隱私維護權。是指自然人對于自己的基因隱私所享有的維護其不可侵犯性,在受到非法侵害時可以尋求司法救濟的權利。[9]例如，非經基因提供者的同意，將其基因信息進行商業活動時，基因提供者有權依靠法律得到相關賠償。
（二）知情同意書的簽訂
任何醫療活動都會存在風險，為保護醫患雙方的權益，大部分臨床醫療活動均要簽訂相關知情同意書，并受法律保護?；蛑委煈玫脚R床醫學，簽訂知情同意書同樣至關重要。我國1994年頒布的《醫療機構管理條例實施細則》第六十二條和八十八條以及2002年頒布的《醫療事故處理條例》第十一條規定，患者在醫療過程中對自己的病情、診斷、治療享有知情權。醫方施行手術、特殊檢查或特殊治療時，必須征得患者同意。概言之，患者知情同意權包括了解權、被告知權、選擇權、拒絕權和同意權，但不宜告知患者的（仍應告知其家屬）除外。特殊檢查、治療系指該檢查、治療具有一定危險性，或因患者本質特殊、病情危急可能產生不良后果，或系臨床試驗性，或收費較多。基因治療治療顯然屬于上述法律規定中的特殊檢查和治療范疇?；蛑委煵煌趥鹘y的醫療活動，其高科技、高要求及高風險等特點必然決定此類知情同意書的特殊性。受試者有權利要求被告知基因治療實施單位及人員的資格以及經驗、風險效益比、其他可替代的保守治療途徑、保密問題、受傷害時的賠償等等。實施單位還必須有一份針對使用的基因產品的專業醫師的指示說明，包括依實驗所知的產品藥性、毒性和治療效果等。[11]考慮到基因治療的復雜和難以理解性，一般人不是很容易透徹理解，應當成立相關部門，如基因治療專家咨詢委員會等，幫助患者及家屬真正了解基因治療及知情同意書的內容，真正維護患者及其家屬的利益。
（三）治療方案的規范
基因治療現在還大多仍處于臨床試驗階段，還不是一種成熟和穩定的治療技術，存在較多不宜克服的難題，其中最為突出的是：
1.效率問題
基因治療的時效比較短暫?；蛑委煶晒Φ那疤崾菍胫委熜訢NA的靶細胞能發揮功能，并且能夠在體內長時間存活并且性能穩定。然而，導入的外源性的DN段會導致許多細胞快速分化從而很大程度上可能基因治療的持續性?；颊弑仨毥涍^多輪治療，如前所述的第一例成功的基因治療病例中，1-2月就要進行一次，每次費用大概兩萬多美元，代價相當昂貴。[1-2]此外，任何外物進入人體組織后，人體的免疫系統就會被激發產生免疫應答以防御入侵者，而這種免疫應答在某種程度上也會降低基因治療的效果。
2.安全性問題
病毒是大多數基因治療研究中選擇的載體，會對病人帶來許多潛在危險，比如其毒性、免疫和炎癥反應以及基因控制和定位的問題?；蛑委煹陌踩允悄壳盎蛑委煚幷撟顬榧ち业膯栴}，比較著名的是前文提到的那位18歲美國病人死于基因治療。患者死亡的主要原因是基因治療對象選擇有誤及用藥劑量過大，盡管病毒載體進入細胞后是隨機整合至宿主細胞染色體的，但其仍具有潛在的插入突變可能性。[12]基因治療屬于高端的新醫療技術，存在相當高的風險。由于技術的限制性以及可能涉及相關的社會倫理問題，基因治療在實施時必須遵循一定規范，必須由相關部門進行管制和監督。1993年，我國衛生部頒布了《人的體細胞治療及基因治療臨床研究質控要點》，將人的體細胞治療及基因治療的臨床研究納入《藥品管理法》的法制化管理。2003年，我國藥監局又頒布了《人基因治療研究和制劑質量控制技術指導原則》，較為詳細地規定了基因治療研究的技術標準和操作規范。
三、我國臨床基因治療的立法思考
（一）國外基因治療的立法經驗
1.美國
1976年，美國國立衛生研究院(NationalInstitutesofHealth,NIH)成立了重組DNA咨詢委員會(RAC)并制定世界上第一個實驗室基因工程應用法規《重組DNA分子實驗室準則》，首開了政府對生物技術發展進行控制的先例。隨后，在基因治療進入臨床研究前的1985年，美國NIH制訂了針對體細胞基因治療的指導準則《人類體細胞基因治療的設計和呈批考慮要點》，是這一領域里第一個系統的成文規章。[13]美國對基因治療臨床試驗的監督由健康和人類服務部的食品與藥品管理局和人體研究保護辦公室兩個法定機構負責。所有從事人體研究的研究者，無論是來自學術機構還是工業界，都必須遵循上述機構的監督管理[14]。
2.英國
1989年，英國政府成立基因療法倫理委員會，作為臨床治療的審批和監督機構。1993年成立基因治療咨詢委員會，對基因治療臨床方案的可接受性進行審查和管理，協調與其他相關機構的關系。[13]
3.奧地利
奧地利基因治療的管理要遵循基因技術法的有關規定。體細胞基因治療只能在被批準的醫院里由特定的醫療小組進行，并要得到相關政府機構和倫理委員會的同意。[14]
4.德國
德國1984年由司法部和科研部召集醫生、生物學家、哲學家、法學家、宗教代表組成了一個基因分析和基因治療的研究小組，為政府的立法提供咨詢報告，并基于報告提出了一系列相關的法律法規。[13]德國1990年制定世界上第一部“基因技術法”，分七部分四十二節。[14]
（二）我國臨床基因治療的立法建議
基因治療對個體及人類生命的影響程度遠遠超過了傳統醫療技術，其風險也是目前的醫療經驗知識無法掌控的。同時，基因治療還可能引發不少社會倫理問題。這些問題的解決離不開法律的支持。就本人觀點而言，我國臨床基因治療的立法至少應包括以下內容：
1.治療范疇的立法
首先要確定臨床基因治療的范疇，何種基因治療可以在人體內進行等基本問題。最為典型的是生殖細胞基因治療，它涉及平等問題和其他個人侵害問題，如優生主義、基因歧視等，各國對其一般都持反對態度。[8]就我國目前而言，可以通過法律規定臨床醫學基因治療的基本范疇，同時規定設立相關倫理委員會進行協助管制。
2.治療方案審核的立法
除了涉及相應的社會倫理問題，基因治療還存在高風險且費用昂貴，如何權衡“受益/風險”的比例也相當重要。我國可以指定或成立相關機構或部門，進行臨床基因治療方案的嚴格審核。
3.規范化治療方面的立法
臨床基因治療，從方案的選擇、實施到最后的療效評估等，都應嚴格按照一套規范化的程序進行。美國的基因治療臨床研究倫理審查已制度化。美國食品和藥物管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)生物制品評估和研究中心(CBER)負責對基因治療、細胞治療的安全性和有效性的評價。美國國立衛生研究院下設的生物技術活動辦公室(OBA)執行對基因治療研究的監管。人體研究保護辦公室側重于對受試者的保護，而所有涉及人類受試者的臨床試驗都要接受地方倫理委員會審查。英國參與基因治療監管和審查相關的政府部門包括醫學和醫療產品管理局(MHPRA)、轉基因作物(GMOs)科學咨詢委員會、基因治療咨詢委員會(GTAC)、地方倫理委員會。[7]就我國而言，關于臨床基因治療規范化方面的立法，至少考慮以下幾方面內容：首先，臨床基因治療資格的審查機制。基因治療資格的獲得必須通過嚴格審查，包括相關的治療設施及人員配備是否達到必需的標準。其次，獲得資格后的施行人必須嚴格按照標準的基因治療方案進行治療?，F在可參照的是《人的體細胞治療及基因治療臨床研究質控要點》以及《人基因治療研究和制劑質量控制技術指導原則》這兩份文件，之后可隨著基因治療的日趨成熟作相應修改補充或專門立法規定。[15]再者，應當成立或指定相關部門對臨床基因治療規范化的實施進行不間斷的監督和管制，及時發現并處理基因治療過程中的問題。同時，還應追蹤患者的治療效果，作相應的評估分析。最后，應當建立基因治療數據庫。數據庫的數據應準確詳實，并配有相應的對照、評估以及傳播信息的保護機制。[14]
4.侵權方面的立法
基因治療的技術高難度性以及涉及相關社會倫理學問題等特點使得它在臨床醫學操作過程中更易發生醫患矛盾。我國2010年7月開始施行的《侵權責任法》專設第七章規定醫療損害責任相關問題?；蛑委煈糜谂R床醫學，同樣將涉及相關的侵權問題。一是隱私權。由于基因治療的特殊性，基因治療過程中患者的隱私權保護尤為重要?！肚謾嘭熑畏ā返诹l是患者的隱私權保護相關規定，臨床基因治療在這方面的立法可參照此法并結合自身特點作相應補充。二是知情同意書的簽訂。除了《侵權責任法》第五十五條關于患者知情權的相關規定外，基因治療作為一種特殊治療，其知情同意書中還應詳細闡述基因治療實施單位和個人的資格及經歷、基因治療的詳細過程及療效、可能產生的各種風險、治療費用等內容。由于基因治療的復雜和難以理解性，還應指定或成立相關部門，如基因治療專家咨詢委員會等，幫助患者及家屬真正了解基因治療和知情同意書的內容再做出是否簽訂的決定，真正維護患者及其家屬的利益。臨床基因治療在這方面的法律規定應該進行全面的考量。三是規范化治療。《侵權責任法》第五十八條第一款規定，違反法律、行政法規、規章以及其他有關診療規范的規定導致患者有損害，推定醫療機構有過錯?；蛑委熥鳛橐环N高難度、高風險的治療方案，施行規范化的保守治療將更加安全，因此應該制定相應的法規進行管制。
5.對治療方法本身保護的立法
基因治療自身能否依法得到保護，尤其是能否通過被授予專利權得到保護，一直是全球爭論的焦點?；谌说乐髁x的考慮以及疾病治療方法因人而異缺乏重復性的考慮，大多數國家對疾病治療方法不予以專利保護。基因治療屬于疾病治療的方法，所以目前大多數國家都同樣不予以專利保護。[16]《歐洲專利公約》(EuropeanPatentConvention,EPC)對授予專利的要求是新穎性、實用性以及創造性，其中第52(4)條指出，通過外科手術等治療和診斷人類或動物疾病的方法不符合其工業化實用性的要求，不應被授予專利?；蛑委熥鳛橐环N疾病治療方法，在歐洲同樣不被授予專利保護。此外，其真正目的還在于保護公共利益，使公眾避免花費昂貴的醫療服務費用。然而，并不是所有基因治療相關的發明都被EPC排斥在專利保護范圍之外。EPC為用于基因治療方法的產品，特別是物質或其化學成分提供專利權保護，這些產品的新穎性可參照EPC第54(5)條規定確定。即使這些物質或化學成分以前就被人知曉，但只要作為一種治療、手術或者診斷的方法第一次被發現，仍然可以被授予專利。[16]例如，在ADA-SCID基因治療中，導入含有缺陷基因正確拷貝數的病毒顆粒到體內的治療方法并不能被授予專利，但治療過程中用的這種遺傳學已發生改變的病毒可以被授予專利，這個病毒將被授予治療ADA-SCID醫學使用的專利保護，即使它之前已被授予別的非醫學使用專利保護。專利法對于技術發展的推動作用不容小覷，生物技術也不例外。作為這個領域的領先者，美國和歐盟都不否認這個觀點。根據美國專利法的規定，疾病治療的方法包括基因治療，是可以被授予專利保護的。這樣勢必促進本土對基因治療的深入研究，最終在這一領域處于壟斷地位。關于這一點，對基因治療專利化保護限制的歐盟也已日益意識到來自美國的競爭壓力，并且意識到自身的法律規定已經限制了本土在這一領域的發展，現已采取相關措施逐漸擴大對基因治療的保護范圍。我國專利法第二十五條明確規定，對“疾病的診斷和治療方法”不授予專利權。因此，我國對基因治療本身不應給予專利保護。然而，用于基因治療的藥物或器械等產品，則應該按照現行《專利法實施細則》等法律授予專利保護，以維護發明者的利益和刺激我國基因治療的研究，從而促進我國基因治療技術水平的發展。
基因治療范文2
關鍵詞：RNA干擾；小干擾RNA；基因沉默；腫瘤
中圖分類號：Q522文獻標識碼：A文章編號：1672-979X(2009)01-0054-04
RNA Interference and Tumor Gene Therapy
JU Ji-yu, LI Zai-lian
(Department of Immunology, Weifang Medical University; Key Laboratory of Immunology in Universities of Shandong, Weifang 261042, China)
Abstract：RNA interference is a mechanism for controlling normal gene expression, which has been employed as a potential technology for a wide range of disorders such as tumors, infectious diseases and metabolic disorders. This paper reviews the discovery, mechanism of RNA interference and its application in tumor diagnosis and prevention, as well as some challenges.
Key words：RNA interference; small interfering RNA; gene silencing; tumor
基因治療是一種特異性的治療方法，可用在疾病早期。基因治療一般是通過一定的技術把遺傳物質轉入細胞并永久改變細胞表型，例如通過替換變異的腫瘤抑制基因（如p53）、抑制基因轉錄、引入能編碼治療物質（如scFv）的新基因或者使特定的靶基因沉默（如反義技術）等。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是控制基因表達的特異有效方法。近年RNAi已成為研究根據基因功能合理設計藥物的重要工具。本文現簡要介紹RNAi的發展史和近來在腫瘤基因治療中的應用。
1RNAi的發現及作用特點
1.1概述
RNAi是指小分子雙鏈RNA抑制同源序列基因的表達，是生物進化過程中保留下來的機制。像反義技術一樣，RNAi可以特異的抑制基因的表達。RNAi最早在秀麗新小桿線蟲（C. elegans）中發現可以抵御外來基因的入侵。此后陸續在昆蟲、植物、真菌和脊椎動物中也發現了該機制。
1.2干擾RNA的分類及作用特點
目前，已知具有功能作用的小分子干擾RNA主要包括小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）和Piwi-interacting RNA（piRNA）3類。
1.2.1siRNA的發現及作用機制1993年學者們發現秀麗新小桿線蟲中微小RNA和反義互補RNA抑制基因的表達。1995年Guo等[1]用反義RNA技術阻斷秀麗新小桿線蟲中par-1基因表達時發現，正義RNA和反義RNA均能阻抑基因功能表達，且兩者的作用是相互獨立的，機制也各不相同。1998年Fire等[2]首次發現雙鏈RNA（dsRNA）能夠特異性地抑制秀麗新小桿線蟲的紋狀肌細胞unc-22基因表達，dsRNA引起的基因沉默效應要比單用反義RNA或正義RNA強十幾倍。注入秀麗新小桿線蟲的性腺后，在其第一子代中也誘導出了同樣基因的抑制現象，表明RNAi有可遺傳性。此現象稱為RNAi。因為RNAi作用發生在轉錄后水平，又稱為轉錄后基因沉默（PTGS）。1999年Hamilton等[3]在植物基因沉默研究中首次發現，21~25 核苷酸（nt）的dsRNA出現對轉基因導致基因沉默十分重要，同時指出RNAi作用是由部分純化的核酸酶中所含siRNA介導的。2000年首次在果蠅中發現，通過核糖核酸酶可將長的dsRNA處理為21～23 nt的短片段[4]。2001年，首次報道了哺乳動物細胞中也有RNAi。2002年證明了用短的發夾結構RNA（shRNA）在哺乳動物細胞中可以誘導特異性的基因沉默[5]。2003年首次用RNAi技術對模型動物進行了治療研究[6]。
哺乳動物體內RNAi的作用機制與植物及果蠅等RNAi的機制相似，體外研究證實，RNAi是一個ATP依賴性的過程。首先，dsRNA通過細胞膜進入細胞，在胞質內的Dicer（一種序列特異性的核酸內切酶，屬RNA酶家族III成員）的作用下，分解成21～22 nt；3’端帶有2～3個末端突出堿基的dsRNA分子，這種小的dsRNA分子稱為siRNA[7]。siRNA與Agonaute2等蛋白酶結合，形成由RNA介導的沉默復合物（RNA-induced silenceing complex，RISC）。RISC大約500 kb，在ATP供能的條件下，RISC可以把其攜帶的雙鏈siRNA分子變成單鏈siRNA。含單鏈siRNA的RISC有活性，可與目的mRNA結合，導致其斷裂、降解，從而導致目的基因沉默[8]。
1.2.2miRNA的發現和作用特點miRNA是一種內源性的非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA），由大約2l～23 nt組成單鏈RNA分子。miRNAs廣泛存在于植物、線蟲和人類細胞中，可能是一類進化上保守的、在生命中起重要調控作用的分子[9]。它們能有效地抑制相關蛋白質的合成，導致靶mRNA降解，或者以其他形式的調節機制抑制靶基因表達，產生基因沉默。Lin-4和Let-7是最早在秀麗新小桿線蟲中發現的能時序性地調控胚胎后期發育的基因，這些基因編碼一類長度約21 nt的小分子短暫RNA（small temporal RNA，stRNA）[10] 。后來，又相繼在線蟲、果蠅、HeLa細胞、擬南芥和水稻等許多真核模式生物和細胞中找到了幾百個相似的小分子RNA，將其統稱為miRNA，Lin-4和Let-7基因編碼的stRNA則認為是miRNA的代表[11]。
與siRNA一樣，miRNA也可以引發RNAi現象。在miRNA生成過程中，編碼miRNA的基因首先轉錄產生幾百至幾千核苷酸的初級產物（pri-miRNA），在核內被核酸內切酶Drosha酶切割成約70 nt的發夾狀前體（pre-miRNA）。pre-miRNA在Ran-GTP和轉運蛋白Exportin-5的協同作用下轉運出細胞核，經Dicer酶切割成約22 nt的成熟miRNA。成熟miRNA可通過兩種機制調控靶基因表達：一種是和siRNA一樣，與靶mRNA結合，促進其降解；另一種是結合到靶mRNA的3＇UTR部位抑制其翻譯。如果miRNA與靶序列互補配對高則可能切割mRNA，配對低的可能只是抑制[12]。
1.2.3piRNA的發現2006年由4個獨立的研究小組[13，14]在小鼠實驗中分離得到一種能與piwi蛋白相互作用的小分子RNA，稱為piRNA，由30 nt組成。piwi基因為Argonaute基因家族成員之一，科學家們推測，這類小分子RNA可能與動物體的發育和維持功能相關。實驗結果表明，每個精母細胞或完整的細胞中大約含有100萬個piRNA[13]。同時，經過克隆也觀察到大量26～31 nt的小分子RNA。根據RNA的長度大小，piRNA可分為2種：第1種長29～31 nt，可以和MIWI蛋白連接；第2種長26～28 nt，可以率先與MILI蛋白結合。在成年小鼠體內，第1種比第2種含量高。但由于某些piRNA探針可以檢測出30 nt和26 nt區帶，所以2種piRNA均可形成相同的分化過程。利用cDNA末端快速擴增技術確定它們的5’端相同，而3’端相差2 nt。這2種piRNA是否發揮不同的作用有待進一步研究。
2在腫瘤學中的應用
最初RNAi在腫瘤學的應用主要是針對突變的腫瘤基因、增生、轉位和病毒基因，闡明其功能以及和其它基因之間的相互聯系。應用RNAi技術探索各種基因的功能及相互作用為篩選新的藥物靶基因提供了便利。RNAi已用來加強現存藥物如伊馬替尼（imatinib）和雷帕霉素的作用，這是通過沉默抗性相關基因實現的[15]。當用siRNA抑制Prkdc基因（與DNA修復有關的基因）后，人成纖維細胞對射線的敏感性明顯增強[16]。抗凋亡基因survivin被認為是診斷和治療腫瘤的一個很有價值的基因，是RNAi治療的候選基因[17]。融合癌基因BCR/ABL在人白血病細胞系中成功地被人工合成的siRNA抑制，不但減少了相應基因蛋白的表達，而且誘導靶細胞發生凋亡[18]。用RNAi方法抑制融合基因ALM1/MTG8可增強細胞因子驅動的淋巴母細胞在骨髓中分化。有趣的是，癌基因轉錄被抑制可以長達5 d。相似的情況是，用RNAi方法抑制培養的EWS/Fil肉瘤細胞癌基因表達可以使細胞生長減慢長達3周[19]。現在已有多種基因用于RNAi治療腫瘤的研究，如bcl-2、fas、k-ras、myc、p53等。這一方法的前景依賴于siRNA或shRNA能否使癌基因轉錄沉默并帶來相應的生物學效應[20]。
3RNAi所面臨的問題
RNAi用于臨床腫瘤治療要解決兩個問題，首先如何把有效的干擾RNA帶到腫瘤細胞內，對特異性靶基因產生特異性的抑制作用；其次，如何避免RNAi帶來的副作用。
3.1載體問題
以前的研究表明，血流中的siRNA或DNA很難通過細胞膜屏障和逃避內體溶酶體的降解作用[21]。為了提高siRNA的運載效率，學者們發展了很多病毒和非病毒運載體系，大大提高了運載siRNA的效率。如基于逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒的運載系統在體內外均實現了RNAi介導的基因沉默[22]。腺病毒由于基因在細胞內表達短暫，應用受到很大限制。逆轉錄病毒由于其復制過程中要經過DNA中間體過程，能把前病毒整合到宿主細胞基因組上，從而實現穩定表達。用表達siRNA的逆轉錄病毒加上一些調控元件可實現組織特異性基因沉默[23]。然而，逆轉錄病毒基因治療的主要問題是插入變異的問題。腺相關病毒載體可以實現外源基因宿主基因組的定點整合，也可以實現外源基因的穩定表達，但純化仍然是需要突破的一道障礙[24]。除了病毒載體以外，非病毒載體也用于腫瘤的基因治療。如陽離子脂質體或聚乙醇胺均用作siRNA運載體。這些載體均已用作體內siRNA實驗并在靜脈給藥或鼻內給藥后實現了目的基因沉默。但是，這些載體在體內均表現出毒性和激發機體免疫應答的能力[25]。因此，需要改進這些載體和進一步尋找更加安全的載體。另外一種值得注意的載體是殼聚糖。殼聚糖是一種陽離子多糖，已廣泛用于藥物的運載，特別是DNA介導的基因治療藥物的運載。殼聚糖的胺帶有正電荷，可與核酸上的磷酸形成聚合電解質絡合物。而且，這種質子化的胺還有利于復合物與細胞膜結合并被內吞入細胞?，F已證明，殼聚糖/siRNA微?？稍隗w內外介導基因沉默。而且，已證明殼聚糖是生物相容的、非致炎、非毒、可降解的材料。因此，殼聚糖/siRNA運載系統可能具有良好的發展前景[22]。
3.2脫靶效應
如果考慮將siRNA作為治療藥物，須考慮它的序列特異性和評估它的脫靶效應的危險性。例如，必需保證只有目的基因mRNA被降解而其它必需基因不受影響。siRNA產生脫靶效應主要基于以下3個方面：（1）由于shRNA和siRNA均含有dsRNA序列，因此它們可能會誘發機體的天然免疫應答，如干擾素應答。（2）轉染或表達的siRNA可能會產生一些非特異性效應。（3）盡管設計的siRNA與目的基因互補，但也可能和非靶基因mRNA互補[26]。
研究表明，dsRNA的長度大于30 bp可以導致非特異性抑制基因表達，大部分是由于激活了dsRNA依賴性的蛋白激酶PRK和隨后的磷酸化以及滅活eIF2a 所引起。RNA的長度（siRNA或shRNA）與此有關，即使11 bp的siRN段也可誘導微弱的干擾素應答。有些措施可以減輕干擾素應答，如減少轉染siRNA的量，也可通過檢測干擾素應答基因如寡腺苷合酶-1的方式預防干擾素應答發生[27]。除了干擾素應答外，另一個脫靶效應就是由于外源siRNA的導入使細胞內RNAi機制飽和，從而抑制內源性RNAi（miRNA）發揮作用，產生非特異性的毒性反應。這就要求在進行外源siRNA轉染時盡可能減少外源siRNA的用量[27]。最近用基因芯片進行的研究表明，用RNAi方法抑制慢性髓性白血病細胞中BCR-ABL融合蛋白表達可啟動細胞內其它沉默的癌基因、抗凋亡基因和細胞因子的表達[28]。因此，RNAi技術在真正應用到臨床之前，需要更加嚴格的評估。
4展望
把RNAi技術從研究工具轉變為治療手段所遇到的主要問題是載體系統。我們需要更加特異、有效的運載系統，如可以特異性腫瘤靶向的載體或者帶有腫瘤細胞特異性啟動子的載體系統。由于RNAi主要與細胞胞漿成分作用，這是優于其它基因治療方法之處。盡管攝取效率和穩定性是建立RNAi治療方法所遇到的主要問題，但這一領域的飛速發展表明，也許在幾年之后，我們就能找到較好的解決辦法。
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基因治療范文3
論文關鍵詞：基因治療,移植靜脈,再狹窄
隨著醫療水平的發展，像靜脈移植等手術方法治療包括冠狀動脈在內的血管狹窄等疾病給病人生活帶來新的希望，但術后通暢率逐年下降又給病人帶來新的憂慮。目前對預防移植靜脈再狹窄主要手段有放射、藥物、物理治療，雖然有一定成效，但效果還是不佳，隨著生物科學技術的發展，人們將希望寄托于基因治療。下面將對基因治療中目的基因和載體的選擇進展進行綜述。
1.目的基因的種類靜脈橋再狹窄主要機制就是內皮細胞的損傷；血栓形成；平滑肌細胞的遷移和增殖。這為我們目的基因的選擇提供依據。
1.1促進內皮細胞修復的基因。
1.1.1內皮型一氧化氮合酶(eNOS)一氧化氮（NO）是體內重要的生物信使分子和效應分子，它具有抑制vsmc增殖、遷移，抑制血小板聚集等功能。而eNOS是NO合成的關鍵酶，通過將eNOS基因局部轉移，是防止移植血管狹窄的有效手段。王曉明等通過給靜脈橋轉染帶有eNOS基因的復制缺陷型重組腺病毒，再旁路移植到動脈后得出其加速內皮細胞再生、抑制血栓形成，進而抑制內膜增生。
1.1.2血管內皮生長因子(VEGF)VEGF能高效的刺激內皮細胞的增殖，使損傷的內皮盡快得到修復，也可以間接抑制血管平滑肌細胞遷移和增殖。VEGF165是最主要的異構體，是其生物學作用的主要形式，也是目前的基因治療中主要選用的異構體。有研究表明通過腺病毒介導的VEGF過度表達可以使球囊損傷的動脈內皮細胞再生，抑制血管內膜增殖。
1.1.3肝細胞生長因子(HGF):HGF是一種間質細胞衍生的多功能細胞因子，能刺激血管內皮細胞分裂和增殖,促進血管內皮細胞損傷的修復，但不引起VSMC的增殖。有研究表明轉染HGF基因可增強球囊損傷后血管內皮組細胞的功能，有效抑制損傷血管的狹窄。
1.2抗血栓形成的基因。
1.2.1組織因子途徑抑制物(TFPI)TFPI是相對穩定的糖蛋白，是廣譜的Kunitz類型絲氨酸蛋白酶抑制物，其具有很強的抗凝作用。有研究表明通過腺病毒介導TFPI基因局部轉染可以顯著抑制PICA術后血栓形成和內膜增厚，主要是通過促進血管平滑肌細胞（VSMC）凋亡而抑制血管的狹窄的。
1.2.2組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)t-PA纖溶酶原激活劑主要物質之一，主要有血管內皮細胞合成。其主要功能就是裂解纖溶酶原肽鍵，形成具有活性的纖溶酶。Ross報道t-PA減少能使經皮冠狀動脈成形術(PTcA)后血管狹窄,可見t-PA在預防血管狹窄中起到比較重要的作用。t-PA不僅能預防血管狹窄，有項研究也表明tPA基因逆轉錄病毒載體直接注入介入手術后再狹窄動物模型的血管壁可以減輕狹窄面積，甚至能達到30%。
1.3抑制VSMC增殖遷移的基因。
自體移植靜脈再狹窄的主要病理特征為內膜顯著增厚。增厚內膜主要是由血管平滑肌細胞增殖、遷移等因素形成，其中有很多調節步驟參與當中。這為我們抑制VSMC增殖、遷移提供許多候選基因。單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）是一種能使無活性的核昔類似物輕甲基無環鳥苷轉化為磷酸化的細胞毒性形式，誘導DNA鏈合成中止引起細胞死亡。實驗研究表明HSV-tk基因能抑制新生內膜形成、降低內膜面積與中膜面積的比值(I：M)。FAS是一種凋亡受體，在VSMC中表達較多，當FAS配體在血管壁上表達也可以降低新生內膜的形成?？辜毎w移金屬基質蛋白酶(MMPs)基因在VSMC的遷移中有十分重要的作用,組織型金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP1)及其同家族成員都有顯著減低I:M比例.
1.4聯合基因治療
由于預防移植靜脈狹窄干預靶點太多,而誰是關鍵基因尚未確定,又加上單一靶點效果并不理想,于是有人聯合多個基因進行干預,證明比單一基因干預更有效。Gunn等用C-myb的反義核酸得出能抑制豬經皮冠狀動脈成形術后的內膜增生.VanBelle等在兔股動脈上給予VEGF165質粒可以加速內皮化,減少附壁血栓和新生內膜形成。張鐵民等實驗顯示,反義寡核苷酸與VEGF聯合應用較兩者單用更能顯著預防再狹窄。
2.載體的種類為了獲得一個好的臨床治療效果，載體的選擇是重要的一步。載體就是將目的基因導入特殊部位的工具，通常分為病毒載體和非病毒載體，它們各有自己的優缺點。
2.1病毒載體的種類
2.1.1腺病毒載體腺病毒是無包膜的線性雙鏈DNA病毒，目前的腺病毒載體大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）為基礎。腺病毒主要優點有轉染細胞廣泛、攜帶的DNA量大、感染效率高、重組病毒滴度高、不整合到宿主細胞、理化性質穩定等。以腺病毒介導的基因治療預防血管狹窄的研究層出不窮。體內轉基因表達時間短暫、病毒基因表達的產物引起的毒性反應限制腺病毒這個載體的應用。正因如此，對腺病毒載體的改進正在進行，如經RGD-4C整合素靶向多肽改良后的腺病毒在靜脈橋中有更好的轉染能力
2.1.2腺相關病毒載體（rAAV）rAAV源于非致病的野生型腺相關病毒，由于其安全性好、宿主細胞范圍廣、免疫源性低，在體內表達外源基因時間長等特點，被視為最有前途的基因轉移載體之一。
通用的AAV載體都是基于血清型2，即AAV2。因為rAAV感染效率低、制備成本高且只能包裝小于4.7kb的基因序列而在基因治療中受到限制。
2.1.3慢病毒載體慢病毒載體（LVs）是在HIV-1病毒基礎上改造而成的病毒載體系統，它能高效的將目的基因導入動物和人的原代細胞或細胞系。LVs具有免疫原性低、整合到細胞上長期表達、可感染非分裂期與分裂期細胞等優點.已有研究表明慢病毒載體應用于球囊損傷致血管狹窄研究的可行性。但慢病毒仍具有潛在的產生復制型慢病毒（RCL）和致癌的風險，相關的研究還是有待加強。
2.2非病毒載體非病毒載體是通過哺乳細胞攝取和細胞間轉運大分子物質的機制來把目的基因轉入靶器官。雖然非病毒載體具有安全、易得、無免疫源性等優點，但是他們基本上轉染效率不高，因此早期在基因治療研究中沒有太高的地位。隨著技術的進步，非病毒載體在基因治療載體選擇上占有一定份額，尤其表現在納米粒子、超聲微泡載體上。
2.2.1超聲微泡載體：它的作用原理是通過超聲的物理效應使細胞膜上產生可逆的小孔，借助此孔外源性物質進入細胞內。Taniyama等通過超聲微泡載體將p53的cDNA轉入球囊損傷大鼠頸動脈，得出血管內膜和中膜面積的比值顯著降低。雖然超聲微泡靶向釋放技術的靶向性及無創性的優點已達到大部分實驗的認可，但其轉染效率不高仍是需要大力研究的。
2.2.2納米粒子：它是現在研究比較熱門一種非病毒載體，主要是可以使被包裹的目的基因免受水解酶的降解，將目的基因運載到血管平滑肌上，達到治療疾病的目的。胡新華等通過納米粒子介導的反義雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因抑制移植靜脈內膜增生得出納米粒子在血管狹窄治療中是可行的。現在用的納米粒子主要是PLGA，它有很好的組織相容性，產物沒有任何毒性。
3.總結和展望
這些年來盡管科研及醫務工作者在移植靜脈獲取技術、藥物防治、應用血管外支架和放射治療等方面做了大量的工作并在預防移植靜脈再狹窄上取得一定成效，但是總體效果還是不理想。移植后的靜脈因為內皮細胞損傷、炎性細胞浸潤、平滑肌細胞遷移增殖、細胞外基質增加等一系列病理改變導致移植靜脈再狹窄。隨著分子生物學技術的發展，安全、高效的載體出現、多基因聯合等綜合治療必將能有效預防血管再狹窄。
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基因治療范文4
用于傳遞藥物的磁性納米粒子直徑通常為5-20nm，這些晶體一般是鐵的，最常見的是磁鐵或磁赤鐵。有幾種方法合成這些晶體，最常用的是共沉淀Fe（III）和Fe（II）。磁性納米粒子與被傳遞的基因和藥物混合封裝以促進細胞吸收。用于磁性納米技術的有聚合物、病毒和非病毒，此外，還有形成這些復合物的輸水相互作用和靜電作用。由于要靶向體內，被處理的納米復合物通過靜脈注射、動脈注射或腹腔內注射，用一個外部磁場（通常用一個小的稀土磁體）附近的目標區域以創造一個局部磁場。隨著藥物在血液中流動，磁場對帶藥的磁性納米粒子產生作用，驅動它們分布到目標組織中。與其它傳遞方法相比，磁性納米粒子對藥物的傳遞有許多優勢，它顯示出了外部磁場的反應，相對安全，用途更廣。磁性納米粒子被批準應用于臨床作為磁共振成像的造影劑已有十多年了，因此，是一種能根據病人安全性來被更好理解的納米技術。此外，磁性納米粒子與現有藥物具有廣泛的兼容性，能被用于有效傳遞各種各樣的治療藥物。
2使用磁性納米粒子的體內基因靶向傳遞
磁性靶向傳遞技術是1978年被首次提出來的,這種方法類似于藥物傳遞，對治療基因的傳遞有著巨大的潛力，盡管該技術的應用必須適應核酸分子的大小和電荷數。有趣的是，磁性傳遞為解決當前基因治療中的有效傳遞問題提供了很大的可能性。例如，將磁性納米粒子與基因載體混合，治療基因通過外部磁場被選擇性地輸送到腫瘤部位，增加了治療基因的濃度，同時也減少了治療基因在身體其它部位的停留。
2.1局部給藥系統臨床試驗中腫瘤靶向給藥一直是在腫瘤內或腫瘤附近注射給藥，磁轉染在腫瘤局部給藥中有兩個可能的優勢：第一、它能增加注射部位細胞對藥物的吸收和滯留；Bhattarai等人通過直接在空腸和氣管內注射的方法向體內傳遞經過修飾的腺病毒載體表達結合了磁性納米粒子的LacZ基因，發現在磁性組中的肺部和空腸內β-半乳糖苷酶的活性明顯高于對照組。這表明在外部磁場下基因的滯留和表達都有所增強。雖然這種方法可能不適用于非侵入性腫瘤的治療，但也顯示了磁轉染有提高注射基因在腫瘤內的滯留效果的可能。在局部傳遞中磁轉染的另一個優勢就是對腫瘤的穿透性。目前的傳遞方法不能有效的將治療基因傳遞到腫瘤塊的所有區域，尤其是低氧中心，部分是由于許多腫瘤內部有復雜的脈管系統。另外，這被認為是一個進步，考慮到耐藥性的問題。已證明磁轉染粒子的局部傳遞能增加靶組織內的基因積累和基因對腫瘤內較小動脈的穿透力。Krotz等人采用靶向提睪肌的股動脈注射帶有熒光標記的寡聚脫氧核苷酸后發現磁性組的熒光強度增加，此外，在較小動脈內有很強的熒光。較小動脈內的熒光增強顯示磁靶向能增加基因和藥物的組織滲透性，說明了這種方法可能會增加經血液傳遞給腫瘤組織的基因和藥物的滲透力。
2.2全身給藥系統全身給藥系統是研發新的傳遞技術的最終目標，因為它能被廣泛的應用于各種臨床適應癥，也方便治療。此外，小鼠的人類腫瘤移植模型提供了一種在活體內測試靶向給藥以及在外部控制磁轉染的簡單方法。盡管人類移植腫瘤能提供寶貴的信息，便于深入了解全身給藥系統的效果，但是這些模型可能大大低估了在病人體內靶向給藥的復雜性。迄今，已被驗證的磁轉染作為活體內癌癥治療最有前途的應用是在人類腫瘤移植的小鼠模型中。用磁性納米粒子-脂質體復合物傳遞熒光素酶質粒，Namiki等人發現外部有磁鐵并經過納米粒子處理的動物組有很強的熒光素酶活性，傳遞相同劑量基因的其他的對照組卻沒有明顯的表達。這個結果在腫瘤組織勻漿中的二次試驗得到證實，那個實驗是用siRNA干擾磁性組中的EGF受體，而在非磁性組中沒用siRNA。與有外部磁鐵靶向的控制組相比，對照組中腫瘤塊EGF受體的siRNA傳遞減少了50%。還有一項研究也顯示了不同的納米復合物組分與療效之間的差異。相比于之前使用的磁性復合物，新配方在非目標器官中siRNA的積累量減少10倍，提出增加配方的選擇性可以提高對器官的靶向性。這可能是由于新配方的尺寸較小的緣故。總之，這些結果都是磁轉染具有明確療效強有力的證據，除了用傳遞報告基因來證實外。單核細胞由于其具有與腫瘤細胞天然的親和力，也被用來作為癌癥治療的基因載體。一種方法是先將單核細胞在體外轉染，再經過血液注射將治療基因傳遞到腫瘤組織。這種方法雖然避免了非內源性載體引起的組織毒性，但問題一直是沒有靶向足夠數目的腫瘤細胞。Muthana等人最新的研究檢查了傳遞磁性納米粒子基因的單核細胞在腫瘤組織中的生長能力。作者發現磁性組中16.9±4.2%的腫瘤細胞表達GFP，而在非磁性組中腫瘤細胞GFP的表達大量增加，增量超過4.9±3.5%。沒有數據顯示這是否會導致單核細胞在肝臟中的減少，這項研究也沒有顯示任何治療效果，它傳遞的是一個標志基因，它證明了磁性納米粒子能被用于改善細胞作為基因載體的功能。
3小結與展望
基因治療范文5
1基因治療的途徑和常用載體
基因治療技術，一種新的治療策略在口腔再生醫學領域中的應用發展迅速?；蛑委熗ǔ２捎脙煞N途徑，體外間接基因治療(ex vivo)和體內直接基因治療(in vivo) [3,6]。無論間接還是直接基因轉移都需要借助載體才能將外源基因轉入靶細胞內。目前載體系統主要分為病毒和非病毒兩種[3]，常用的病毒載體有腺病毒（AV），腺相關病毒（AAV），逆轉錄病毒（RV，包括慢病毒載體），單純皰疹病毒（HSV），雜合病毒等[7-9]。非病毒性載體有裸DNA、脂質體與脂質體復合物、納米顆粒等[3]。
2基因治療在口腔再生醫學中的應用
2.1 頜面骨組織再生：用于治療頜骨缺損的靶基因很多，作用機制和環節不盡相同，目前的研究主要集中于骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)基因。Park等[10]應用脂質體和腺病毒載體分別將BMP-2基因導入大鼠骨髓基質細胞(BMSC，bone marrow stromal cells)，比較了兩種載體的體外、體內成骨能力。體外實驗結果顯示腺病毒組的轉染效率是脂質體組的兩倍。當將基因修飾細胞復合明膠海綿植入大鼠下頜骨的骨缺損區，BMP-2可以在體內表達2 周以上，促進了下頜骨骨缺損的修復，其中腺病毒組4周后骨缺損幾乎完全愈合，而脂質體組相對新骨形成速度較慢，6周后骨缺損基本愈合，陰性對照組8周時仍未見骨愈合。Zhao等[11]用腺病毒介導的BMP-2轉染BMSC細胞，結合磷酸三鈣支架材料可以修復下頜骨的缺損，獲得礦化密度較高的新生骨。Chang等[12]應用腺病毒載體攜帶BMP-2，體外修飾BMSC，并植入小型豬的上頜骨缺損區，實驗組的骨缺損在3個月后完全修復，組織學觀察顯示新生骨為成熟的編織骨且鈣化良好。近期，Ke等[8]應用安全性較好的AAV病毒載體介導BMP-2體外修飾BMSC，并將其植入兔子的上頜骨缺損，頜骨缺損的修復能力顯著提高。Ashinoff等[13]研究通過腺病毒介導的BMP-2 對大鼠下頜骨牽張成骨的影響。實驗結果表明，實驗組在牽張成骨部位新骨形成量顯著增加。
BMP基因治療在促進頜骨組織再生中的應用非常廣泛，近來也有一些研究報道了其他治療基因的應用，例如堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor， bFGF），音波刺猬因子（sonic hedgehog，SHH）等。Jiang等[14]將腺病毒介導的bFGF基因修飾的骨髓基質干細胞移植入兔子下頜骨牽張成骨區域，可以有效地促進更多的新骨形成。Edward等[15]將逆轉錄病毒介導的Shh修飾的三種細胞(牙齦纖維細胞、間充質干細胞、脂肪來源細胞)復合I型膠原植入兔的顱骨缺損處，6周后通過X線片、組織學觀察，骨組織缺損區域幾乎完全修復，同時機體沒有出現任何不良反應。
頜骨的生長調控需要多因子的協同作用，多個治療基因的聯合應用也取得了一定進展。Koh等[16]的研究證實通過基因治療的同時表達兩種成骨因子BMP2和BMP7，表現出了更強的骨組織再生能力。通過X線片，Micro CT和組織學切片進行檢測，4周后 BMP2和BMP7的聯合基因轉染組，其成骨能力顯著高于單個基因轉染組，表現為顱骨缺損區域幾乎完全修復，甚至個別缺損區的成骨量更致密，顯著高于陰性對照組。另外，將促血管生成因子與成骨因子聯合應用，可以更好地協同促進頜骨組織再生。Peng等[17]的研究表明單獨應用VEGF并不能促進骨的再生，但是將VEGF和BMP4基因共同修飾MDSC，并與明膠海綿共同植入小鼠的顱骨缺損區域后，血管新生和新骨形成能力顯著增強。
2.2 顳下頜關節組織再生：顳下頜關節的組織工程需要促進功能性骨和軟骨組織再生，并需要建立適當的骨-軟骨交界區。 Schek等[18-19]將分化的豬軟骨細胞和Ad.BMP7基因修飾的人牙齦纖維細胞復合到生物支架中，并將復合物移植到免疫缺陷小鼠的皮下，4周后構建了一種骨-軟骨組織，包括血管化骨，成熟的軟骨以及清晰的礦化界面。另一項研究進展是將基因直接導入下頜髁突，1999年，Kuboki等[20]用腺病毒載體攜帶B-半乳糖苷酶基因直接體內法注射到豚鼠顳下頜關節上腔，4周后發現，關節軟骨表面和滑膜均有B-半乳糖苷酶的穩定表達，從而證明了腺病毒介導基因治療顳下頜關節疾病的可行性。Rabie等[21] 用AAV病毒載體介導了治療基因VEGF感染了大鼠的髁突組織，體內試驗證明VEGF的表達增強，促進了下頜髁突的軟骨內成骨進程。Li等[22]用AAV病毒載體攜帶Vastatin基因，局部注射到顳下頜關節后區，進一步證明轉基因不僅表達在髁突軟骨，而且在關節盤和關節窩都有持續的表達。這些研究為生理性骨-軟骨結構的構建以及TMJ局部基因治療的應用前景提供了實驗依據。
2.3 牙周組織再生：牙周病造成牙周支持組織破壞及牙周附著喪失，是導致牙齒缺失的最主要原因。牙周病治療的目的不僅在于控制炎癥，更在于使已經破壞的牙周組織再生以形成新附著。牙周組織再生包括因炎癥破壞吸收的硬組織(牙槽骨與牙骨質)和軟組織(牙周膜與牙齦)。Jin等[23]將攜帶血小板衍生生長因子-B（plateletderived growth factor-B，PDGF-B）的腺病毒直接注射于牙周缺損處，結果顯示，病毒感染組牙槽骨的修復4倍于對照組，而牙骨質的修復則6倍于對照組，提示應用PDGF- B 基因治療可以促進牙周的修復潛能。Chang等[24]的進一步研究證實在牙周骨缺損處直接局部注射腺病毒介導的PDGF-B 是安全可靠的，沒有發現治療引起的機體不良反應。盡管2周內在缺損局部可以檢測到病毒載體的DNA, 隨著時間的推移病毒載體的量逐漸衰減?？梢奝DGF-B基因轉染可有效地促進細胞增殖和缺損的充填，證實了基因轉入牙周細胞可以為牙周再生提供一個便捷的途徑。
2.4 牙體組織再生：牙再生的研究是口腔再生醫學研究中最為活躍的領域。Rutherford等[25]采用了體外間接基因轉染方式，將攜帶BMP-7的腺病毒載體感染培養的成體纖維細胞，然后將修飾后的細胞與膠原復合植入白鼬炎性牙髓組織中，研究發現BMP-7的基因轉染促進了修復性牙本質的形成。Nakashima等[26-27]用電穿孔（Electroporation）的方法將分化因子（Gdf1）轉染到培養的小鼠牙髓細胞中可以在體外促進其向成牙本質細胞轉化。Nakashima等[28]又用超聲波的方法轉染Gdf1，發現它還可以促進犬的自體牙髓干細胞分化為成牙本質細胞，同時在犬的模型上修復性牙本質的形成增加，其中管狀牙本質的再生最為明顯?？梢?，通過轉染特異性基因和生長因子進入成體牙細胞，為促進組織工程牙的形態發生提供了新的思路。
3基因治療的前景展望
成功的基因治療必須包括選擇適當的治療基因、適當的轉導，使其在體內獲得安全、持續和可調控的表達。口腔再生醫學領域的基因治療，雖然在動物試驗上取得了一些初步經驗，但是離真正的臨床推廣應用還有相當長的一段距離。將來的研究將著眼于以下幾個方面：①對于目的基因，仍需進一步明確何種基因或多種基因的聯合應用；②選擇與構建一個安全、高效、可調控的甚至是具有組織特異性的靶向基因載體仍是基因治療面臨的重要問題；③在基因轉導方法上仍需決定最佳基因載體或者靶細胞的數量、最佳轉入體內的時機，以及減少不良反應以達到最佳治療效果。隨著現代分子生物技術日趨成熟和基因工程研究的深入，相信這些問題在不遠的將來都會得到解決。
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基因治療范文6
椎間盤退變性疾病(disc degeneration disease，DDD)是一種發病率及致殘率極高的疾病，常引起以頸肩腰腿疼痛為主要表現的臨床癥候群，據資料表明，DDD患者占美國骨科住院人數的1/3以上，目前對DDD的常規治療方法包括藥物治療、理療、臥床休息、類固醇注射封閉以及手術治療等。但是，這些措施僅能夠改善疾病的臨床癥狀，并不能從根本上減緩或終止退變的進程。因此，進一步研究椎間盤退變的發生機制，試圖從分子水平上對椎間盤退變進行調控，從而對椎間盤退變進行治療是非常有價值的。以往對DDD發生機制的研究主要集中在椎間盤的生物力學改變、椎間盤的自身免疫因素、炎癥反應、細胞凋亡失衡及椎間盤的營養障礙等幾方面。近期的研究顯示，Sox家族的Sox9基因很可能與椎間盤退變有著密切的關系，現將其相關研究情況作一綜述。
1椎間盤退變與膠原改變
椎間盤內含有大量的膠原，其中Ⅰ、Ⅱ型膠原是最主要的膠原，約占總量的80%，其次是Ⅵ型膠原，占10%~20%。在正常情況下，Ⅰ型膠原主要存在于外層纖維環，Ⅱ型膠原則主要分布在髓核和軟骨終板。Ⅱ型膠原，在椎間盤中央含量最高，到邊緣則逐漸減少，而Ⅰ型膠原則剛好相反。而且膠原在椎間盤內的分布情況并不隨年齡的增長而改變。但是，隨著椎間盤的退變，膠原的構成情況卻發生了變化。在退變的早期，正常類型的膠原在它們的分布范圍有增加的趨勢，提示在退變早期椎間盤存在一過性修復反應，這一點已經在核中軟骨細胞的Ⅱ型膠原mRNA增強表達得到證實［1］。髓核中，Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅵ型膠原含量也有增加，Ⅰ型膠原在纖維環中也呈增加趨勢。隨退變程度的加重，膠原的性質發生了改變，Ⅰ型膠原開始出現在髓核中，軟骨終板喪失了Ⅱ型膠原的表達。Ⅳ型和Ⅹ型膠原也在髓核中出現，膠原成分的改變說明髓核內軟骨樣細胞表型發生變化，可能失去了軟骨特征而出現骨化現象。最后，膠原的翻譯后修飾出現非酶糖化或脂質過氧化作用，交聯增加。以上種種變化最終導致椎間盤細胞外環境的破壞，椎間盤的彈性和膨脹時的抵抗力減弱，這種改變極難自行修復。
2Sox家族及Sox9基因
1990年，Berta等［2］在人類和小鼠中克隆了決定因子SRY基因，人們發現SRY基因產物含有的一個保守區與一種染色體蛋白HMG-1和HMG-2中的DNA結合基序非常相似。HMG框是一個長約79個氨基酸的DNA結合基序，根據該HMG框的保守性，由此命名了編碼一類新的轉錄因子的基因家族，稱為Sox家族，該家族特點為其所編碼的蛋白質與HMG框有60%同源性。2000年，Girard等［3］人利用已經克隆的Sox基因全長序列和大量的完整的HMG基序對Sox基因家族的分類進行了詳細的研究，他們提出Sox基因家族可以分為A~J十個亞族。同一亞族內不同基因間在HMG基序內的相似性在80%以上；不同亞族間的相似性就低于這個數字。另外，同一亞族中同一Sox基因在脊椎動物中不僅在HMG基序區存在同源性而且在其他區也存在較大的相似民生。在哺乳動物發育過程中，Sox基因在廣泛范圍內表達。Sox1，Sox2，Sox3，Sox9和Sox11在神經組織中主同水平表達；Sox9在軟骨組織中和性腺中表達；Sox2亦在雞胚胎的晶狀體和腸的表皮細胞中表達。
Sox9基因是Sox基因家族成員之一，1994年，Zanaria等［4］克隆了Sox9基因，發現它與SRY的HMG框區域的同源性大于60%，基因定位于染色體17q24Ⅱ~25Ⅰ區段內，在男性的發育中與SRY基因相同，作為轉錄因子而調控其下游基因的表達。SRY基因并不是直接調節的發育而是通過Sox9共同作用才發生作用。Foster等［5］將從三個獨立文庫中分離得到的cDNA克隆序列組裝出Sox9的復合轉錄單位，其長度為3934 bp，Sox9基因具有一個開放閱讀框架（ORF），該框架能夠編碼509個氨基酸，其中104~182位的79個氨基酸殘基編碼HMG盒，與SRY基因的HMG盒編碼序列同源性高達71%；除此之外，在其所編碼的Sox9蛋白C端約1/3處有一富含脯氨酸、谷氨酰胺和絲氨酸的區域，該區域類似于某些轉達錄因子的反式激活域（transactivation/transcription activation domain，TA域），這一非酸性區域在進化上相當保守，很可能Sox9蛋白因含有HMG盒樣DNA結合基序及該TA域而具有轉錄因子活性。
3Sox9基因與椎間盤退變
椎間盤的退變與其內部的細胞外基質的改變有密切的聯系。椎間盤的細胞外基質主要由抵抗張力的膠原和抵抗壓力的蛋白多糖共同組成，而細胞外基質的穩定是椎間盤結構和功能的基礎。因此椎間盤內膠原變化，包括膠原的成分和構象改變必將影響椎間盤的生物學性質，并且更易造成椎間盤退變［6、7］。Nerlich［8］和Ahsan等［9］的研究發現，隨著年齡的增加，椎間盤髓核中膠原的類型發生變化，最初為Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ型膠原的增加，隨后為Ⅱ型膠原的喪失；椎間盤內蛋白聚糖含量逐漸下降，呈聚集狀態的蛋白聚糖下降尤為明顯，非聚集蛋白聚糖比例相對增加，這種變化在髓核更為顯著。同時，伴隨蛋白聚糖的下降，含水量明顯降低。Oegema等［10］發現，間盤退變后，椎間盤細胞產生的基質金屬蛋白酶（matrix metallporoteinases，MMPs）增多，抑制了基質合成。其它的研究結果還顯示［11］，椎間盤的退變過程是由于細胞因子的減少和致炎因子的增多，導致MMPs活性增加，椎間盤軟骨樣細胞分泌蛋白聚糖和Ⅰ、Ⅱ型膠原能力下降、降解加速。進而使椎間盤軟骨樣細胞賴以生存的細胞外環境被破壞，髓核內水分喪失，不能維持椎間盤內應有的張力，加劇細胞退變，并且這種改變很難自行修復。有資料顯示Sox9、Ⅱ型膠原、aggrecan是最主要的三種軟骨細胞因子［12~14］，并且Sox9被當作Ⅱ型膠原mRNA轉錄中的正向操縱了［15~17］；Sive等［18］用原位雜交方法分析了正常與退變椎間盤內Sox9、Ⅱ型膠原和蛋白多糖三種軟骨因子的表達狀況，發現在退變的椎間盤的髓核與纖維環中Sox9與Ⅱ型膠原mRNA的表達明顯降低。通過免疫定位分析方法發現椎間盤纖維環組織中Sox9的表達水平與年齡呈反比［19］。Paul等［20］在體外實驗中發現Sox9腺病毒載體能夠增加細胞內Sox9與Ⅱ型膠原的表達。同時在纖維環穿刺法制備的兔椎間盤退變的病理模型中注射重組腺病毒載體，發現注射Sox9腺病毒的椎間盤與注射病毒對照組相比仍能維持更好的軟骨細胞表型。有學者更進一步的對不同時期椎間盤（包括新生兒椎間盤，正常椎間盤，退變各個時期椎間盤）應用RT-PCR、Westernblot和免疫組化方法檢測髓核中Sox9、Ⅱ型膠原基因的表達，并分析兩者的相關性，發現Sox9 mRNA在椎間盤髓核細胞中的表達從新生兒到嚴重的椎間盤退變的病人逐漸降低，且它在人的椎間盤退變過程中也有表達，從新生兒到嚴重退變的椎間盤細胞中，Ⅱ型膠原下降的幅度與Sox9降低的幅度基本一致，這表明椎間盤退變的發生一定與Sox9的表達降低有關系，Sox9在正向調控Ⅱ型膠原的合成方面發揮了重要的作用。另外，1993年，Tommerup等［21］通過對染色體易位斷裂點定位作圖，提出17號染色體短民Sox9如果發生突變，就可以導致軀干發育異常（campomelic dysplasia，CD）。CD是一種罕見的可致死先天性軟骨骼發育異常綜合征（國外報道發病率為05~1/10萬），其典型病狀是先天弓形和長骨扭曲，常合并四肢骨骼異常如先天性脊柱裂、多趾畸形和軟骨形成障礙，患者常因呼吸衰竭而死于出生后的第一個月內，因為疾病的嚴重程度不一，極少數病人能活到成年。Lefebrve等［22］亦推測在CD患者中Sox9基因活性的降低將抑制Ⅱ型膠原的產生而導致嚴重的骨骼發育障礙。昆士蘭大學的Wright等認為小鼠中的一種“短尾突變”實際上代表一種潛在的CD模式，Sox9是“短尾”鼠中有缺陷的基因，雖然不表現性反轉，但這些小鼠應當也還有一系列其它骨骼發育上的異常。目前可引起椎間盤退變的各種因素恰恰也是可以誘發Sox9基因突變的因素，因此我們有理由懷疑，在椎間盤退變過程中，很可能也象“短尾突變”或“CD”一樣，存在Sox9基因的突變。或者即使沒有Sox9基因編碼序列上的突變，也可能存在調控方面的缺陷。這些都十分值得我們進行更深入的研究探索。
4Sox9對Ⅱ型膠原的調控機制
雖然，當前已經確認Sox9是Ⅱ型膠原合成過程中的一個重要的轉錄因子，且其在軟骨的發育、成熟過程中對Ⅱ型膠原的正向調控作用已十分明確，但其中確切的調控機制是什么呢？亦即Sox9是通過什么機制正向調控二型膠原蛋白表達呢？Lefebvre V等［22］在研究中發現，Ⅱ型膠原基因（Co12al）的內含子Ⅰ中一個最小的DNA元件引起了轉基因小鼠中軟骨特異性細胞的表達，并發現該元件在瞬時細胞轉染實驗中也是一個軟骨細胞特異性的強增強子。Co12al的表達與軟骨細胞中所表達的高水平Sox9 RNA和Sox9蛋白密切相關，實驗證實這個最小的Co12al增強子是Sox9作用的靶序列，Sox9直接結合到這個最小的Co12al增強子的一段序列上并將該軟骨細胞增強子激活，共轉染實驗中發現，在非軟骨細胞中，Sox9也是作為一個有效地增強子激活劑而發揮作用。Lefebvre V設計出該增強子的突變體，使其不能與Sox9相結合，結果發現軟骨細胞中增強子的活性消失，共轉染的非軟骨細胞中由Sox9引起的增強子的激活亦受到抑制。Lefebvre V將Sox9蛋白截短，去除其反式激活域（transactivation domain，TA域）部分但保留其與DNA結合能力，發現與全長的Sox9蛋白相比，增強子的活性受到了明顯的抑制。以上試驗結果強烈的表明Sox9參與了軟骨細胞中Co12al的細胞特異性激活作用以及Ⅱ型膠原合成的調控，且其調控機制是通過Sox9蛋白的DNA結合域與Co12al增強子直接結合而發揮作用，而Sox家族的其他成員對該增強子并無激活作用。除了與DNA直接結合，Sox9是否還通過其他的方式（如信號通路等）調控Ⅱ型膠原的表達呢？目前并無相關報道。
總之，椎間盤退變的基因治療正處于早期的實驗階段，對Sox9基因在椎間盤退變中作用和機制的研究亦剛剛展開。隨著分子生物學技術的發展和對椎間盤退變的生物學機理研究的不斷深入，相信Sox9基因終將廣泛應用到椎間盤退變的臨床治療中。
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