前言：中文期刊網精心挑選了基因重組范文供你參考和學習，希望我們的參考范文能激發你的文章創作靈感，歡迎閱讀。
基因重組范文1
1.實例
鐮刀型細胞貧血癥：正常人的紅細胞是圓餅狀，而鐮刀型細胞貧血癥患者的紅細胞卻是彎曲的鐮刀狀。這樣的紅細胞易破裂，使人患溶血性貧血癥，嚴重時還可能危及生命。鐮刀型細胞貧血癥是一種由于正常基因發生突變后形成致病基因而導致的遺傳病。正常人的血紅蛋白是由四條多肽鏈共574個氨基酸構成的，檢查鐮刀型細胞貧血癥患者血紅蛋白的氨基酸組成發現，有一條多肽鏈上的某一位置應是谷氨酸（正常人），而被纈氨酸代替了，這種改變最終導致了鐮刀型細胞貧血癥的發生。
2.概念
DNA分子中發生堿基對的替換、增添和缺失，而引起的基因結構的改變，叫做基因突變（gene mutation）。基因突變的類型有四種：（1）堿基置換突變：即一對堿基置換造成的，如鐮刀型細胞貧血癥；（2）移碼突變：即某位點增添或缺失1—2對堿基造成的；（3）缺失突變：即基因內部缺失某個DNA小片段造成的；（4）插入突變：即基因內部增添了1—n個脫氧核苷酸對導致的。例如：在肺炎雙球菌的轉化實驗中，無莢膜菌活化插入一小段有莢膜菌的DNA，突變形成了有莢膜菌。
例1 若生物體的DNA分子增加或減少一個堿基，這種變化是（ ）。
A.細菌轉化 B.基因的自由組合
C.基因突變 D.等位基因分離
解析
基因突變的方式至少有兩大類，一類是堿基的替換，一類是堿基對數目的改變。
答案 C
二、基因突變的結果與特點
1.突變結果
基因突變是染色體的某一個位點上基因的改變。基因突變使一個基因變成它的等位基因，由Aa，叫隱性突變，由aA，叫顯性突變，通常會引起性狀的改變。
2.基因突變的特點
（1）普遍存在，無論是低等生物還是高等生物都可能發生。
（2）隨機發生，它可以發生在生物個體發育的任何時期和生物體的任何細胞。
（3）突變頻率低。
（4）大多數基因突變對生物體是有害的。
（5）基因突變是不定向的，一個基因可以向多個方向發生突變，形成一個以上等位基因。
3.基因突變的意義
對生物來說，基因突變可能破壞生物體與現有環境的協調關系，而對生物有害，但有些基因突變，也可能使生物產生新的性狀，適應改變的環境，獲得新的生存空間。還有些基因突變既無害也無益?；蛲蛔儽M管是隨機的、不定向的，在自然狀態下突變頻率很低，但卻是普遍存在的?；蛲蛔兪切禄虍a生的途徑，是生物變異的根本來源，是生物進化的原始材料。
例2 某二倍體植物的抗逆特性由4個基因A、a1、a2、a3控制，且它們的抗逆作用A>a1>a2>a3，請據所學遺傳學知識回答下列問題：
（1）基因A、a1、a2、a3的根本來源是___，該現象說明變異具有___的特點。遺傳時A與a1、a2、a3之間遵循___定律。
（2）為探究基因之間的顯、隱性關系，某實驗小組將兩純合子a1a1、a2a2雜交，子二代共有__種基因型。若表現型有__種，則表明這兩個基因之間有明顯的顯隱性關系；若表現型有__種，則表明這兩個基因之間無明顯的顯隱性關系。
（3）經實驗驗證，A有顯性作用，a1、a2、a3之間沒有明顯的顯隱性關系，且基因的作用有累加效應（如個體a1a2的抗逆性由兩個基因作用的累加共同決定），則該植物共有__種抗逆類型。
（4）研究得知該植物的抗逆性和細胞內的水楊酸、多胺、脫落酸等物質有關，請據所學知識推測基因控制該植物抗逆性的機理：_____。
解析 本題綜合考查遺傳知識和邏輯分析能力。等位基因的來源是基因突變，等位基因的多樣性體現了基因突變的不定向性（多方向性）。等位基因的遺傳遵循基因的分離定律。a1a1、a2a2雜交，子二代共有a1a1、ala2、a2a2i種基因型，若a1a2單獨表現一種性狀，說明兩基因之間沒有顯隱性關系，若a1a2表現型和a1a1或a2a2中的一種相同，則說明兩種基因之間有明顯的顯隱性關系；若a1、a2、a3之間沒有明顯的顯隱性關系，則該植物的抗逆類型有AA、Aax、a1a1、a2a2、a3a3、a1a2、ata3、a2a3；水楊酸、多胺和脫落酸都不是蛋白質，不會由基因直接決定形成，根據基因對性狀控制的兩種方式，可以推測基因通過控制酶的合成，間接控制這些物質的生成，進而控制抗逆性狀。
答案（1）基因突變 不定向性 分離 （2）3 2 3 （3）8 （4）基因通過控制有關酶的合成，間接控制這些物質的產生，從而控制抗逆性狀。
三、基因重組的概念及意義
1.概念
基因重組是指生物體在進行有性生殖的過程中，控制不同性狀的基因的重新組合。無性生殖不能產生基因重組。基因重組只是后代中生物個休的基因型改變，生物個體的基岡本身的結構并沒有改變?；虻淖杂山M合定律告訴我們，在生物體通過減數分裂形成配子時，隨著非同源染色體的自由組合，非等化基因也自由組合。這樣，由雌雄配子結合形成的受精卵，就可能具有與親代不同的基因型，從而使子代性狀發生改變。另一種類型的基因重組發生在減數分裂形成四分體時期，位于同源染色體上的等位基因有時會隨著非姐妹染色單體的交換而發生交換，導致染色單體上的基因重組。舉例來說，人的同卵雙胞胎，由于基因組成的相同，性狀十分相像。除此之外，沒有兩個同胞兄弟或同胞姐妹在遺傳上完全相同。
2.意義
通常的解釋是，有性生殖的基因重組有助于物種在一個無法預測將會發生什么變化的環境中生存。這是因為，基因重組能夠產生多樣化的基因組合的子代，其中可能有一些子代會含有適應某種變化的、生存所必需的基因組合。所以說，基因重組也是生物變異的來源之一，對生物的進化也具有重要的意義。
四、基因突變和基因重組比較
兩個值得注意的問題：
（1）基因重組與基因突變的區別
基因重組是指在生物體進行有性生殖過程中，控制不同性狀的基因的重新組合。它包括兩種類型：一是由基因的自由組合產生的基因重組，二是由基因的互換產生的基因重組。它們的共同特點是只能產生新的基因型，不能產生新的基因。而基因突變產生的是新基因?；蛲蛔儗е略瓉淼幕蜃優樗牡任换??；蛲蛔內绻l生在生殖細胞，突變基因有可能通過受精作用而傳給下一代，如果發生在體細胞，則只影響當代，不向下一代傳遞。
（2）基岡突變是生物變異的根本來源和生物進化的重要因素
基因突變雖然是多數有害，少數有利，但由于它能產生新基因，從而產生了前所未有的新性狀，為自然選擇提供了大量的變異材料。它與基岡重組的不同之處在于，基因重組僅僅是基因型的改變，而基因突變是基因發生了改變，一個基因變成了新的等位基因，所以基因突變是生物變異的根本來源和進化的重要因素。
例3 下列有關基因重組的敘述中。正確的是（ ）。
A.基因型為Aa的個體自交，因基因重組而導致子代性狀不同
B.基因A因替換、增添或缺失部分堿基而形成它的等位基因a屬于基因重組
C.同源染色體上非姐妹染色單體問的互換可能導致基因重組
D.造成同卵雙生姐妹間性狀上差異的主要原因是基因重組
解析Aa個體自交，后代的性狀分離是由于等位基因的分離和配子間自由組合而形成的；基因A因替換、增添或缺失部分堿基屬于基因突變；同卵雙生是由一個受精卵發育而來的，細胞核內的遺傳物質是一樣的，性狀差異主要是外界環境引起的。
答案 C
例4 下列不屬于人工誘變的實例的是（ ）。
A.一定劑量的γ射線引起變異得到新品種
B.用一定劑量X射線處理青霉素菌株獲得高產菌株
C.玉米單株自交后代中出現一定比例的白化苗
D.激光照射植物或動物引起突變得到新品種
解析
本題主要考查對人工誘發基因突變的理解。人工誘變是指利用物理的或化學的因素來處理生物，使它發生基因突變的方法，而供選答案中的γ射線、X射線、激光都是人工誘變使用的手段之一，所以，A、B、D三項都是人工誘變的實例，只有C項屬于自然突變。
答案 C
練習
1.用紫外線照射紅色細菌的培養液，幾天后出現了一個白色菌落，把這個白色菌落轉移培養，長出的菌落全部是白色的，這種性狀的改變屬于（ ）。
A.染色體變異 B.基因重組 C.自然突變 D.人工誘變
解析 細菌進行無性生殖，在生殖過程不進行減數分裂。因而細菌的變異不可能是由于基因重組而引起。染色體引起的生物變異，它可以改變生物個體的基岡含量、基因的相互關系，但不會產生新的基因，進而不表現出全新的性狀，而且細菌是原核生物，無染色體。在紫外線的作用下，基因內部的堿基種類、數量和排列次序發生改變，產生新的基因，控制合成新的蛋白質，表現出新的性狀。
答案 D
2.在北京培育出的優質甘藍品種，葉球最大的只有3.5 kg，當引種到拉薩后，由于晝夜溫差大，日照時間長，葉球可重達7 kg左右，但再引種回北京后，葉球又只有3.5 kg，從甘藍引種過程可以看出（ ）。
A.甘藍具有遺傳性，而不具有變異性
B.僅由環境條件引起的變異不能遺傳
C.環境的改變可引起生物產生可遺傳的變異
D.甘藍在生殖過程中無基因重組發生
解析 由遺傳物質變化引起的變異能夠遺傳，僅僅由環境的變化引起，沒有涉及遺傳物質的變異不能遺傳。同一品種的甘藍含有相同的遺傳物質，若在相同的環境條件下，其表現出來的性狀是一樣的。同一品種的甘藍在北京和拉薩兩地的低產和高產，是兩地環境因素不同造成的，而非遺傳物質改變引起。而任何生物只要有遺傳性，它一定具有變異性，變異可發生在個體發育過程中，也可發生在有性生殖中。
答案 B
3.蕃茄中紅果（H）對黃果（h）顯性，將紅果蕃茄的花粉授到黃果蕃茄的雌蕊柱頭上，結了一個半邊紅色半邊黃色的果實。產生這一果實最可能的原因是（ ）。
A.最終發育成該果實的那個花芽中某些細胞發生基因突變
B.提供花粉的花藥組織中某個花粉母細胞發生基因突變
C.提供花粉的紅果蕃茄是雜合子（Hh）
D.接受花粉的黃果蕃茄是雜合子（Hh）
解析 本題考查的是基因突變的特點。根據題意可知該果實出現半邊紅色半邊黃色的現象，最可能的原因就是發生了基因突變。而發生基因突變的如果是黃果番茄的整個雌蕊或提供花粉的紅果番茄的花藥組織中某個花粉母細胞，那么就應該是全部紅色或全部黃色。所以最可能是最終發育成果實的那個花芽中某些細胞發生基因突變。
答案 A
4.一株世代都是開紅花的植物，在一次突然性冰凍后，有一個枝條上出現了一朵白花，白花授粉后所結的種子種下去長成的植株都開白花。試分析該白花是來自于___，其原因是____，使發育成該花芽的細胞在_____發生差錯，從而使__的分子結構發生了改變。
基因重組范文2
這一重大發現被美國《科學》雜志列入2007年度十大科技突破之中，同時，英國《自然》雜志將其評為年度十大科技新聞之首。
這項研究對人類有何意義？為何科學界對“胚胎干細胞”不息溢美之辭？記者專訪了中科院上海生命科學院、上海交通大學醫學院健康科學研究所金穎研究員。
另辟蹊徑―――
誘導性多能干細胞由來
人的胚胎干細胞素有“萬能細胞”的美譽，但胚胎干細胞研究面臨巨大的倫理壓力，導致研究之路困難重重。然而，科學界從2006年便開始另辟途徑，試圖尋找一種方法，將人體正常的體細胞直接轉化為具有胚胎干細胞功能的細胞，從而避開倫理之爭。
早在2006年8月，日本京都大學山中教授研究小組發現，只要用4個轉錄因子過量表達就可以把老鼠成纖維細胞逆轉到細胞分化前的狀態，獲得功能與胚胎干細胞類似的準“誘導性多能干細胞(iPS)”，從那時起，全球胚胎干細胞研究界就立刻跟進。
人們通俗地用“皮膚干細胞”來稱呼“誘導性多能干細胞”。這項研究簡單說來，就是把原本不是多能的細胞(已經分化的細胞)，通過誘導，使之成為多能的細胞(未分化的細胞)。所謂多能的細胞，就是具有變成多種細胞能力的細胞。
里程碑式的突破
2007年11月20日，日美科學家同天宣布利用基因重組技術，向皮膚細胞中植入4個基因，將人體皮膚細胞改造成幾乎可與胚胎干細胞相媲美的干細胞。從理論上看，這項研究首次證實了人類已分化的體細胞同樣可以被“重新編程”轉化為類胚胎干細胞，從而成功避開長期以來爭論不休的倫理問題，有望大大推動與干細胞有關的疾病療法研究。
科學界立即對這個結果給予高度評價，致力于人體胚胎克隆技術研究的美國細胞高級技術研究所首席科學家羅伯特?蘭扎甚至將這項研究稱為“了不起的科學里程碑。從生物學意義上講，相當于萊特兄弟制造的第一架飛機”。
但是，日本和美國的發現都有局限。日本研究小組向皮膚細胞中植入的4個基因中，有一個是與癌癥相關的基因。美國研究小組雖然沒有使用這個基因，但是其研究中用于搬運基因的“慢病毒”也會改寫染色體的遺傳信息。這些風險，使得兩個研究小組的成果離臨床應用還有一段距離。
迅速發展―――
小步前進，成果不斷
2007年12月6日，日本京都大學的研究小組改進了研究方法，他們通過改變培養環境而摒棄了那個與癌癥有關的基因，提高了這種干細胞技術在臨床應用中的安全性。
12月7日，美國懷特黑德生物醫學研究所的科學家在美國《科學》雜志上說，他們利用皮膚細胞改造而來的干細胞在治療老鼠的鐮刀狀細胞血癥獲得進展。這是科學界利用誘導性多能細胞進行醫療研究的首次嘗試。12月23日，哈佛大學研究小組在英國《自然》雜志上說，他們直接從志愿者身上提取皮膚細胞，并成功地改造成誘導性多能細胞。而11月20日發表的研究成果是利用實驗室培養過的專用人體皮膚細胞進行的。這個微小的差別，表明了從任何人身上提取皮膚細胞進行該項研究都是可行的。
這些研究雖然都是“皮膚干細胞”研究的小步成果，但卻鼓舞人心。
重大意義―――
解決免疫排除反應問題
誘導性多能干細胞，除了避開干細胞研究的倫理之爭外，將大大促進干細胞在疾病治療方面的應用。
首先，它解決了干細胞治療中的排斥問題。金穎研究員介紹說，人胚胎干細胞來源于人類早期胚胎，其分化的細胞應用于病人時，由于是同種異體移植，植入的細胞會受到病人免疫系統細胞的排斥。為此，建立沒有免疫排斥的人胚胎干細胞系移植是干細胞研究人員的努力方向。體細胞核移植，也就是人們常說的治療性克隆，可以產生與病人基因型基本一致的胚胎干細胞。
事實上，核移植的低效率和人未受精卵母細胞來源的限制，人類在建立體細胞核移植來源的胚胎干細胞系方面尚無成功報道。即使成功，用于臨床疾病的治療也不現實。雖然科學家還在努力進行著其他嘗試，但是尚無令人滿意的途徑。而“誘導性多能細胞”可以來源于任何人的體細胞，經過體外的培養和誘導使這些體細胞成為具有多種分化潛能和大量擴增能力的細胞。當把此種細胞分化為病人所需要的細胞(如神經細胞)再植入病人時，病人的免疫系統細胞不會對它們實行免疫排斥，從而解決了干細胞治療中的排斥問題。
用于人體尚需時日
雖然目前已成功建立了誘導性多能干細胞，但并不意味這些細胞可以立即應用于臨床?！八囊饬x更多在于證明了一個原則，即已經分化的細胞在幾種因子的誘導下，可以去分化成為多能的細胞。這是人們過去一直夢想卻未能實現的事情。但是，在應用于臨床之前，還有許多問題需要解決。找到新的方法將新的基因導入分化的細胞，而不是用病毒載體，這本身就是一個巨大的挑戰。”金穎說。
專家連線―――
記者：干細胞研究的重要性是不是還在于，它可以用于人類疾病的治療和新藥的研究？
金穎（中科院上海生命科學院、上海交通大學醫學院健康科學研究所研究員）:細胞移植是很多疾病的重要治療手段，如糖尿病、神經系統疾病等。但是，供體細胞的不足嚴重限制了細胞替代治療的進行。干細胞能在體外大量擴增，同時又具有分化為多種細胞的能力，可以為細胞移植提供來源。由于藥物篩選和安全性檢驗不可以直接在人體進行，但是可以利用體外培養的人的干細胞。所以，人的干細胞也成為大規模的新藥篩選和藥物研究的理想模型。
記者：能把皮膚細胞轉化為干細胞，是不是就可以對胚胎干細胞的研究不重視了呢？
金穎：應該更加重視胚胎干細胞的研究。這4個基因的發現是源于科學家們20多年來對胚胎干細胞的研究。毫無疑問，沒有胚胎干細胞的研究就不會有誘導性多功能細胞的建立?？茖W家們長期對胚胎干細胞增殖、分化、移植等的研究都是當前和今后誘導性多能細胞研究所不可缺少的寶貴基礎。繼續深入研究胚胎干細胞將無疑大大促進誘導性多能干細胞的研究進程。因此，忽視對胚胎干細胞的研究是極不應該的。
記者：現在很多科學家都在質疑這種研究成果的安全性，您是怎么看的？
基因重組范文3
摘要： 目的 建立一種簡便、快速基因分型方法，對廣西人類免疫缺陷病毒（HIV-1）重組毒株gag基因區進行亞型鑒定。方法 從HIV陽性樣本中提取核酸，使用HIV-1 M組通用引物對gag區進行第1輪擴增，第2輪使用分別檢測C亞型和CRF01-AE重組型的二套特異性引物放入同一反應管中進行擴增，根據不同亞型擴增的目的帶位置不同判斷亞型。另外設計了一套引物，專門用于檢測B'/C重組毒株。擴增出的所有樣本均進行基因測序和系統樹分析以驗證結果。結果 54份樣本中，經基因測序和系統樹分析證實CRF08-BC樣本4份（741%)， CRF01-AE樣本46份（8518%)， 4份（741）無法確定亞型。經亞型特異性引物PCR法檢測出4份（100%) B'/C重組毒株，45份（9783%) CRF01-AE重組毒株，靈敏度為98%，特異性為100%。2種方法檢測結果經差異性檢驗顯示，P>005，差異無統計學意義，結果一致性高達9815%。與基因分析結果吻合。重復實驗顯示，B'/C的平均重復性為100% (20/20)，CRF01-AE為983% (59/60)。結論 該方法具有簡便、快速，高度靈敏度和特異性的特點，可直接對廣西HIV -1重組毒株CRFO 1-AE gag基因區進行分型。
關鍵詞：人類免疫缺陷病毒1型；基因型；聚合酶鏈反應
Rapid identification for gag region of circulating recombinant form of humanimmunodeficiency virus type 1
Abstract： Objective To develope a simple and rapid subtype-screening assay for the gag region of the circulating recombinant form (CRF) of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1）in Guangxi.Methods Proviral DNA from HIV-positive samples were extracted and subjected to the first round PCR with universal primers for the gag region that can detect HIV-1 M group isolates.In the second round PCR，two pairs of subtype-specific primers that were designed to detect subtype C and CRF01-AE respectively were added into one tube.The PCR products of different subtypes could be distinguished in agarose-gel electrophoresis.Another pair of subtype-specific primers exclusively detecting the the prevalent recombinantstrains CRF07-BC and CRF08-BC was designed and used.Additionally，all of these samples were sequenced and analyzed phylogenetically.Results DNA sequencing and phylogenetic analysis of the gag region of the 54 samples showed that 4 samples (7.41%) were infected with CRF08-BC，46 (85.18%) with CRF01-AE and 4 (7.41%) remained unclassifiable.Detection of the subtype-specific primer sets revealed that 4 were B'/C (100%)，and 45 were CRF01-AE (97.83%)，with an adequate sensitivity (98%) and a high specificity (100%).Non-specific bands occasionally appeared but did not interfere with interpretation of the results.The phylogenetic analysis was consistent with subtype-specific primer sets and the consistent rate was 98.15%.The average reproducibility was 100% for B'/C samples and 98.3% for CRF01-AE samples.Conclusion A simple，rapid and low cost assay is developed for subtype-screening of CRFO1-AE in Guangxi.For the B'/C strains in Guangxi，it needs to be verified further by increasing samples.
Key words： human immunodeficiency virus type 1(HIV-1）；genetic subtype；polymerase chain reaction (PCR)
人類免疫缺陷病毒-1（HIV-1）高度變異，不同亞型毒株其生物學特性及；分子流行病學特征均有所不同〔1〕，若能快速、準確地對HIV進行基因分型不僅有助于了解HIV-1轉播規律，而且可為闡明HIV基因型與生物表型關系、藥物耐藥性等研究提供資料。近年來，我國學者〔2〕建立了一種多重巢式PCR法對我國HIV-1主要流行株進行鑒定亞型。然而，由于HIV-1的基因變異度極高，在傳播過程中可產生許多具有相對獨立的基因序列型別，使得不同地區各亞型間具有其自身的特異性。廣西壯族自治區為國內HIV感染的高發區，大部分感染發生在經濟尚不發達地區的人群中。因此，建立廣西HIV-1主要流行株快速基因分型方法十分必要。目前，廣西的優勢流行株為CRF01-AE和CRF08-BC重組毒株〔3，4〕。為此，本研究針對這2種重組毒株gag基因區建立了一種亞型特異性引物PCR法的快速基因分型法。
1 材料與方法
11 樣本來源 從廣西HIV-I主要流行區采集54份樣本，經ELISA初篩和免疫蛋白印跡（WB）確認為HIV陽性樣本。
12 核酸提取 采用QIAamp Bloodes Mini Kit試劑盒（德國QiaGen公司）從每位感染者的抗凝全血中提取細胞DNA，并凍存于-80℃冰柜備用。
13 HIV-1亞型特異性引物的設計 亞型特異性引物的設計是整個方法建立的關鍵。設計的基本原則：設計的引物位點必須在各個亞型間高度特異，而在同一種亞型內部高度保守。在Primer50軟件的幫助下設計出gag區的亞型特異性引物（表1)。
14 HIV-1 gag基因區的擴增 用nested-PCR對HIV-1 gag基因區進行擴增，第1輪使用引物GagF2/Gage2，模板15μl，反應條件：94℃ 5min，52℃ 1min，72℃ 2min 30s，1個循環；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 1min 30s，30個循環；72℃ 10min。第2輪模板5μl，使用分別檢測C亞型和CRF01-AE重組型的2套亞型特異性引物（Cag-c1/Cag-c2，Cag-ae1/Cag-ae2) ，爭套引物放入同一反應管中，為減少非特異性反應，使用熱啟動和降落PCR (TD-PCR）技術〔5〕，94℃ 5min，52℃ 1min，72℃ 2min 30s，1個循環；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 1min，3個循環；94℃ 30s，51℃ 30s，72℃ 1min，3個循環；94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min，3個循環；94℃ 30s，49℃ 30s，72℃ 1min，3個循環；94℃ 30s，48℃ 30s，72℃ 1min，25個循環，72℃ 10min。如果特異性引物PCR擴增出的目的條帶判斷為C亞型，則用專門用于檢測B'/C重組毒株（包括CRF07-BC和CRF08-BC）的亞型特異性引物Cgag-c1/Cgag-bc為內側引物再進行PCR擴增，以判斷是否為重組形式。反應條件：94℃ 2min，48℃ 1min，72℃ 2min，1個循環；94℃ 30s，48℃ 30s，72℃ 1min，35個循環；72℃ 10min。同時使用引物306/Cn-gag擴增所有樣本并進行基因測序，用于系統樹分析及亞型鑒定以驗證特異性引物分型結果是否正確。反應條件：94℃ 2min，50℃ 50s，72℃ 1min，1個循環；94℃ 30s， 50℃ 30s， 72℃ 1min，35個循環；72℃ 10min。第1輪和第2輪PCR反應體系均為50μl，dNT/P濃度為200μmol/L，Taq酶為25U，引物濃度為04μmol/L，MgCl2濃度為15mmol/L。表1 gag區PCR擴增使用的引物 （略）內側特異性引物注：R=A或G
15 PCR產物檢測 取5μl第2輪PCR擴增產物在2％瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠（EB）染色檢測，紫外攝影拍照，根據Markers分子量大小來判定結果。C亞型片段190bp;CRF01-AE片段881bp;B' /C片段1079bp。
16 序列測定 對于全部經引物306/Cn-gag擴增的樣本，經切膠，純化后，以306為測序引物，提純的PCR產物為模板，采用DNA測序試劑盒（美國ABI公司），在PTC-220型多通道PCR儀（美國MJ公司）上進行測序反應。反應產物經提純后，采用310型全自動毛細管DNA測序儀（美國ABI公司）進行序列測定和分析。
17 序列分析 （美國Los Alamos國家實驗室HIV核酸序列庫中提供）基因分型工具BLAST程序進行基因型鑒定；用Clustal X進行排序和MEGA version 21軟件進行分析。亞型分析使用的各個亞型參考序列來自美國Los Alamos HIV基因數據庫。
18 檢測該方法的重復性 在CRF01-AE樣本中隨機選取12份，CRF08-BC 4份，共16份樣本使用上述方法重復5次。
2 結果
21 樣本基因測序和系統樹分析 54份陽性樣本中通過引物306/Cn-gag擴增最終獲得50份樣本的基因序列，經BLAST程序鑒定出4份樣本gxmu0402，gxmu0416、gxmu0418和gxmu0419為CRF08-BC重組毒株，余下46份為CRF01-AE重組毒株。將50份基因序列與國際各亞型標準株的基因序列進行系統樹分析顯示。4份CRF08-BC樣本與CRF08-BC98CN006和CRF08-BC97CNGX7f靠得很近，而46份CRF01-AE中，有44份與CRF01-AE97CNGX2f聚成一簇，另外2份樣本gxmu0432和gxmu0439與CRF01-AE93JPNH 1和CRF01-AE93TH057十分接近。
22 亞型特異性引物PCR擴增 部分樣本經亞型特異性引物PCR擴增后的電泳結果見圖1和圖2。根據不同亞型擴增出的目的帶位點不同，判斷出亞型結果。54份樣本中，采用特異性引物共擴增出49份樣本，其中C亞型4份，CRF01-AE重組毒株45份（9783%，45/46)。進一步使用B'/C重組特異性引物擴增C亞型特異性引物鑒定出來的4份樣本，發現這4分樣本均為B'/C重組毒株（100%，4/4)。以基因測序法為金標準，可知亞型特異性引物PCR法的靈敏度為98%，特異性為100%。
23 亞型特異性引物PCR法的重復性 重復實驗采用4份CRF08-BC樣本和12份CRF01-AE隨機樣本進行5次重復。結果顯示，CRF08-BC重組毒株平均重復性為100%（20/20），而CRF01-AE在5次重復中有1次出現1份樣本檢測不出，其平均重復性為983%（59/60）。M：DNA分子量；1：H2O；2：陰性對照；3：xmu0433;4:gxmu0440;5:gxmu0451;6:gxmu0462圖1 部分CRF01-AE樣本瓊脂糖電泳結果（略） M：DNA分子量；1：H2O；2：陰性對照；3:gxmu0418;4:gxmu0419 圖2 B'/C樣本瓊脂糖電泳結果
24 基因測序法與亞型特異性引物PCR法比較 54份己確認的陽性樣本，基因測序法檢測并正確分型的樣本是50份，檢出率為9260%，特異性引物PCR法為49份，檢出率為9074%。2種方法檢測結果經差異性檢驗顯示，χ2=0，P>005，差異無統計學意義，結果一致性高達9815%。
3 討論
本研究結果表明，亞型特異性引物PCR方法對于亞型的鑒定結果與基因測序、系統樹分析得到的結果是吻合的，該方法的特異性達100%。用亞型特異性引物擴增樣本時，有時一會出現非特異性擴增條帶，干擾實驗結果。非特異性條帶位置一般不在特異性位置。為防止誤判，可以通過跑厚膠并且延長電泳時間，使目的條帶與非特異性條帶充分分開。通常在紫外燈下，非特異性條帶要比目的條帶弱。出現非特異性擴增條帶通常有如下的原因：(1)引物與模板錯配擴增產生，引物與模板亞型相符，不僅能在特異性位點上與模板結合，亦能在遠離特異性位點的地方與模板結合，這種情況錯配通?？拷?′端的位置，電泳時會出現兩條帶；(2)引物之間形成的引物二聚體，一般出現在80bp左右的位置，通過長時間電泳可使此條帶消失；(3)某一亞型的特異性引物與另一亞型的模板錯配擴增產生，因2套引物放入同一反應管中，所以可能出現此情況，為了避免此情況發生，因此，在設計引物時使引物在3′端與別亞型的模板至少有2個堿基產生錯配。用本研究所建立起的方法對54份樣本的gag基因區進行檢測，發現有些樣本在1200bp左右的位置會出現一條非特異性擴增，因第1輪PCR擴增的條帶位置在1242bp，因此懷疑此非特異性擴增條帶為第1輪PCR擴增出的目的帶，將第1輪PCR產物與用亞型特異性引物擴增出的第2輪產物同時進行電泳，證實了這一推測。為了減少此情況的發生，可減少第1輪反應的模板量，同時在加入反應體系、模板和酶后盡量減少室溫放置時間或在冰盒上操作。本實驗結果表明，亞型特異性引物PCR法，靈敏度為98%，特異性為100%，結果顯示，其靈敏度和特異性均較好。重復性實驗顯示，B'/C亞型的平均重復性為100%，CRF01-AE重組毒株為983%，說明一該方法在實際中是可行的。但由于CRF08-BC樣本例數不多，因此，本研究所建立起的方法對于HIV-1 B'/C重組毒株分型的準確性有待擴大樣本量進一步證實。
參考文獻
〔1〕 杰伊A，利維.艾滋病病毒與艾滋病的發病機制［J］.2版.北京：科學出版社，2000：126-132.
〔2〕 Wei M，Guang Q，Liang H，et al.Simple subtyping assay for human immunodeficiency virus type 1 subtypes B，C，CRF01-AE，CRF07-BC，and CRF08-BC［J］.J Clin Microbiol，2004，42:4261-4267.
〔3〕 Yang R，Kusagawa S，Zhang C，et al.Identification and characterization of a new class of human immunodeficiency virus type 1 recombinants comprised of two circulating recombinant forms，CRF07-BC and CRF08-BC，in China［J］.J Virol，2003，77:685-695.
基因重組范文4
[關鍵詞]血管內皮生長因子；預構皮瓣；基因治療；腺病毒
[中圖分類號]R622 Q813 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2009）03-0332-04
Improve survival of prefabricated flap with adenovirus vectors encoding for VEGF in rats
DING Zhi,ZHENG Jiang-hong,DENG Zhi-ming,YANG Song-lin
(Department of Plastic Surgery, the Sixth People′s Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University,
200233,Shanghai,China)
Abstract: Objective This study investigated the feasibility of local administration of adenovirus vectors encoding for VEGF to induce regional angiogenesis and improve the survival of prefabricated flap in rat prefabricated flap model, so as to provide experimental evidence for a new method with which we can accelerate maturation of prefabricated flap in clinics. Methods 40 prefabricated flaps were created on the left and right abdominal walls in 20 SD rats. Two prefabricated flaps in each rat were randomly allocated to experiment group or control group, and each group contains 20 flaps. In all animals, two 3cm×2cm rectangular skin flaps were designed obliquely on the abdominal wall so that the short side would lie parallel to inguinal ligament. Longitudinal incisions were made on both hind limbs starting from the midpoint of the short side down to the ankle. 2cm long femoral artery, vein were dissected as a bundle and ligated distally. A tunnel was created in the subcutaneous tissue between dermis and panniculus carnosus at the central axis of each planned skin flap. The subcutaneous tissue around the tunnel was injected with adenovirus vectors encoding for VEGF(Ad-VEGF) in experiment group, and with saline in equal amounts in control group. The prepared femoral vessel bundle was then turned over and passed through correspond tunnel. Two weeks later, abdominal island flap based solely on the implanted vessel was elevated. Select one flap from each group to observe the expression of VEGF. Other flaps were resutured into position. Flap viability and neovascularisation were evaluated on postoperative day 7 after the second surgical intervention. Results There was a significant increase in mean survival rate of prefabricated flaps in the Ad-VEGF group compared to the control group: Ad-VEGF, (90.48±1.89)%vs. saline, (69.75±2.36)(P
Key words: vascular endothelial growth factor; prefabricated flap; gene therapy; adenovirus
預構皮瓣應用中要解決的重要問題是知名血管植入預構區域后，建立新的血供系統所需時間較長。近年來，有報導一些多肽類生長因子如VEGF（Vascular endothelial growth factor, 血管內皮生長因子）、bFGF、TGF-β等[1-2]通過直接或間接刺激血管生成作用被用于促進預構皮瓣的再血管化進程，特別是VEGF能特異性地促血管內皮細胞分裂增殖、增加血管通透性,為血管內皮的遷移及基質形成創造條件，故備受研究者青睞。但生長因子蛋白半衰期短、療效不穩定、需反復應用、副作用多，本研究應用基因治療技術，將人VEGFcDNA 通過腺病毒載體，一次性注射于大鼠腹部預構皮瓣血管束周圍軟組織內，通過觀察VEGF 的表達情況及對預構皮瓣再血管化進程和成活的影響，探討腺病毒-VEGF基因重組體促進血管化和皮瓣成活的可能性。
1材料和方法
1.1 腺病毒-VEGF基因重組體的制備：重組復制缺陷型腺病毒pcDNA3/hVEGF165由中科院細胞所構建。將hVEGF165插入pcDNA3的EcoRI和HindIII多克隆位點,并轉化DH5進行擴增，凝膠電泳證實hVEGF165已插入pcDNA3多克隆位點，測序證實hVEGF165無突變。以標準的磷酸鈣共沉淀法(Promega, Inc.Kit)轉染20ug pcDNA3/hVEGF165到PA317細胞，通過G418的集落篩選，擴大培養，測定包裝細胞上清中病毒的滴度，計算3個梯度中的cfu（clone forming unit），取最高cfu的包裝細胞系集落，在32℃的條件下培養48h。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示hVEGF16經過EcoI和HindIII雙酶切后產生2個分別約5.4kb和560bp的hVEGF165片段，經測序證實無突變，說明腺病毒-VEGF基因重組體構建成功。
1.2 動物模型的建立：雄性SD大鼠20只，每只體重0.3～0.4kg，每只腹部兩側各構建一個預構皮瓣，共構建40個皮瓣，每只大鼠兩側皮瓣按隨機原則進行不同的處理，分別歸于實驗組或對照組，每組各20個皮瓣。1%的氯胺酮腹腔內注射麻醉(1ml/100mg)、硫化鋇液脫毛及仰臥位固定后，于大鼠腹部兩側各標記3cm×2cm矩形預構區,短邊平行于腹股溝韌帶，自尾側短邊中點向后縱向切開后肢皮膚，在顯微鏡下仔細剝離出長約2cm的股動靜血管束，遠端結扎切斷。在兩側預構區域的中軸線上，用18G注射器針頭于真皮與肉膜層間各制作一長2cm、寬0.3cm的皮下隧道，使用1ml注射器向實驗組的隧道壁皮下組織內注射攜帶有VEGF基因的腺病毒，分4個點，每點注射0.1ml濃度為4×109cfu/L的pcDNA3/hVEGF165，同法向所有對照組的隧道壁軟組織內注射等量生理鹽水。將已剝離好的血管束向顱側翻轉置入相應預構區的皮下隧道內，血管束末端用縫線固定于附近皮膚以防回縮，6-0絲線縫合切口（圖1），動物返回籠中。所有預構區域2周后均沿前述腹部預構區標記線切開皮膚，于肉膜層下方剝離形成以植入股血管束為蒂的島狀皮瓣，從兩組中各選一個皮瓣進行免疫組化染色，觀察有無VEGF生成，其余島狀皮瓣均縫回原處（圖2）。
1.3 檢測指標
1.3.1 免疫組化檢測：血管束植入預構區域后2周，分別切取Ad-VEGF基因治療組和生理鹽水對照組中的一個預構皮瓣進行免疫組化檢測：組織切片經脫蠟、浸水處理后用H2O2處理（室溫，10min），應用羊血清封閉（37℃，30min）,直接滴加濃度為1∶100的抗人VEGF一抗（小鼠來源單克隆抗體，Santa Cruz公司，美國），4℃孵浴12h，PBS清洗，滴加二抗（生物素標記為山羊抗鼠，DAKO公司，丹麥），DAB（DAKO公司，丹麥）染色，光鏡下放大100倍觀察有無棕黃色顆粒表達從而確定有無VEGF蛋白生成。
1.3.2 皮瓣存活率：形成島狀皮瓣后第七天，按前述方法麻醉動物，相同物距下數碼相機拍照后，將圖像輸入KS400 圖像分析系統，經圖像增強、分割、待測面積的二值化處理，精確測量皮瓣存活部分及壞死部分面積，根據公式：皮瓣存活率 = 皮瓣存活表面積/皮瓣總表面積×100%，算出兩組各19個皮瓣的存活率，再計算各組皮瓣存活率的均數。
1.3.3 放射顯影：島狀皮瓣拍照后，從兩組中各選取一個皮瓣，手術顯微鏡下解剖出蒂部股血管束，分別向兩側股動脈內灌注60%泛影葡胺約3ml，結扎蒂部的股動靜脈并切下皮瓣，放射科拍攝鉬靶X光片，獲得植入血管及新生血管的放射顯影圖。
1.3.4 組織學觀察：島狀皮瓣拍照后，從兩組中各選取一個皮瓣，切下其存活部分后立即浸入10%甲醛溶液中固定48h，經酒精梯度脫水二甲苯透明后石蠟包埋，萊卡切片機切成4μm薄片,蘇木精-伊紅染色封片，光鏡下放大100倍觀察植入的血管束周圍新生的小血管情況。
1.4 統計分析：數據表示為x±s,用SPSS 11.0 版統計軟件對數據進行統計，兩兩之間的比較采用t檢驗，P＜0.05示差異有統計學意義。
2結果
2.1大體觀察及皮瓣存活率：制成島狀皮瓣后，多數皮瓣邊緣出現程度不等的青紫腫脹，繼而顏色發黑干性壞死，有的破潰形成形狀各異的創面，一般5～7天后壞死范圍穩定，成活與壞死界限分明，皮瓣成活區質地均柔軟（圖3），兩個實驗組皮瓣局部可見皮下小血腫。VEGF基因治療組與生理鹽水對照組皮瓣平均存活率分別為(90.48±1.89)%、(69.75±2.36)%，兩組存活率差異有統計學意義（P＜0.01）（表1）。
2.2血管新生情況：血管放射顯影顯示，實驗組植入血管周圍見廣泛白色顯影，尤以血管兩端明顯，而對照組新生血管顯影僅局限于植入血管周圍(圖4)；HE染色組織學切片顯示實驗組植入血管周圍新生血管豐富，以毛細血管為主，并見肉芽成份，對照組新生血管相對較少，兩組間新生小血管管腔大小則無明顯差異(圖5)。
2.3免疫組織化學檢查：光鏡下放大100倍觀察來自兩組的免疫組化染色切片，VEGF基因治療組見到大量棕黃色顆粒表達,彌漫分布于新生小血管周圍，對照組切片上未看到棕黃色顆粒（圖6）。
3討論
植入血管與皮膚、皮下組織間建立起新的血液循環是預構皮瓣成功的關鍵，新血管系統形成的速度、數量和范圍直接決定著預構皮瓣的成熟時間和成活范圍，因此如何促進植入血管束多形成新生小血管并與皮瓣的小血管之間建立有效的吻合成為當前預構皮瓣的研究熱點。研究發現，一些多肽類生長因子能通過促進血管新生，從而促進缺血皮瓣的成活，1993年Iwasawa M[3]用TGF-β、 2000年Li QF[4]用VEGF來促進預構皮瓣的成熟，也取得了預期效果。研究顯示，VEGF是迄今發現的作用最強的血管形成因子，能特異性地與血管內皮細胞表面的相應受體結合，通過啟動有絲分裂原活化蛋白激酶來誘導內皮細胞增殖[5]，其家族中VEGF165在體內分布最廣，表達水平最高。由于VEGF在體內的半衰期很短，一般不超過6min，必須反復使用才能發揮其血管生成作用，極為不便，不但增加感染機會，而且蛋白價格昂貴，這些情況限制了臨床應用前景。后來有人曾利用凝膠態的聚乙烯乙醇作為緩釋劑，試圖延長VEGF作用時間，發現并未提高VEGF的療效[6]。近年來，日漸成熟的基因重組和轉染等生物技術為VEGF保持其在局部的持續存在和作用提供了新穎的途徑：將VEGF基因插入到某種載體形成基因重組體，再轉染作用部位細胞，將VEGF基因帶入轉染細胞的細胞核內，使得轉染細胞成為 VEGF 的“緩釋庫”，較長時間內不斷產生VEGF蛋白，充分發揮其生物學效應。目前該基因治療技術已被報道用來改善缺血皮瓣的血供[7]以及提高自體顆粒脂肪移植成活率[8]，也有學者用于治療臨床上一些缺血性疾病[9]，取得了一定的療效。我們在此基礎上設想應用此項技術促進預構皮瓣再血管化和增加皮瓣成活率，以便縮短預構成熟時間。研究結果顯示，注射基因重組體后兩周時的實驗組標本切片免疫組化染色可見大量棕黃色顆粒，證實pcDNA3/hVEGF165已進入血管束周圍細胞內并持久表達了VEGF蛋白，證明基因治療技術同樣能保持VEGF在預構皮瓣中的持久存在。在HE染色組織切片及血管放射顯影的光鏡檢查中，實驗組標本的新生小血管較對照組的豐富，說明Ad-VEGF基因治療組在局部VEGF的持續刺激下，誘導形成了大量的新生小血管，有利于預構皮瓣的存活，表現為治療組島狀皮瓣存活率高于對照組，這些結果說明應用基因治療技術產生VEGF促進預構皮瓣成熟是可行的。
本研究采用腺病毒作為VEGF基因的載體，是因為其轉導效率高，而且腺病毒一般不與轉染細胞的染色體整合，故比較安全[10]。在HE染色組織切片上，治療組見到明顯炎性肉芽成份，這與以前的有關研究報導相符合，可能與腺病毒導致的宿主免疫反應[11]有關。研究中發現治療組一些皮瓣內出現小血腫，可能是VEGF增加了局部血管通透性所致，所以尋找合宜的劑量和用藥濃度以最大程度的發揮其促血管生成作用而盡量避免副作用是今后研究的問題之一。
建立合理的實驗模型是研究預構皮瓣再血管化的前提，以往的預構皮瓣實驗研究中，多是先掀起隨意型皮瓣，然后將血管載體固定于皮瓣肉面，其缺點是手術創傷大，易引起嚴重纖維化影響預構皮瓣的質地；此外，掀起皮瓣還會因手術創傷觸發內源性血管生長因子產生[12]，干擾對外源性VEGF發揮促進血管新生作用的觀察。本研究在一期手術中，并未掀起皮瓣，只是在預構區域形成一包容血管束的皮下隧道，這無疑最大程度地減少了內源性VEGF的產生，而且手術創傷小，保證了皮瓣質地柔軟，操作也簡便，有臨床推廣價值。以往有研究認為，VEGF在非缺血組織中生物活性低[13]，本研究預構區血液循環良好，VEGF同樣顯示了良好的促進血管新生作用，這也許和腺病毒誘發的炎癥反應有關。在剝離股血管束時，我們保留了少許管周組織，以防止損傷血管束內動、靜脈之間的微細血管通道[14]，保證移位的血管束早期不致栓塞，但如果管周組織保留過多，一部分管周組織會因為早期缺血發生纖維化，從而妨礙血管束新生小血管。血管束植入動物肉膜層與真皮層之間，是因為肉膜層內小血管網及真皮下血管網均較豐富，便于新生血管與其吻接溝通，同時制作島狀皮瓣時也提供了解剖標志。
總之，本研究證明基因治療方法能夠保持VEGF在預構皮瓣中的持久存在，從而促進預構皮瓣血管新生和皮瓣成活，未見明顯并發癥，為臨床上加速預構皮瓣成熟提供了新的途徑。但腺病毒作為目的基因載體，是否會使人體基因發生突變，是否會導致病毒感染，以及如何提高基因轉染效率，尋找恰當的給藥途徑、用藥劑量與濃度等問題尚需要繼續研究。
[參考文獻]
[1]Haws MJ,Erdman D,Bayati S,et al. Basic fibroblast growth factor induced angiogensis and prefabricated flap survival[J]. J Reconstr Microsurg,2001,17(1):39-42; discussion 43-44.
[2]Huemer GM,Shafighi M,Meirer R,Debagge P,et al. Adenovirus-mediated transforming growth factor-beta ameliorates ischemic necrosis of epigastric skin flaps in a rat model[J]. J Surg Res,2004,121:101-107.
[3]Iwasawa M.Accelerated maturation in prefabricated flaps by transforming growth factor-beta: an experimental study in the rabbit[J]. Ann Plast Surg,1993,31:7275.
[4]Li QF,Reis ED,Zhang WX,et al. Accelerated flap prefabrication with vascular endothelial growth factor[J]. J Reconstr Microsurg,2000,16(1):45-49.
[5] Gerber HP,McMurtrey A,Kowalski J,et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol232kinase/akt signal transduction pathway[J]. Requirement for flk21/kdr activation[J]. Biol Chem,1998,273(46):30336-30343.
[6]李青峰,平萍,張滌生.血管內皮生長因子促進預構皮瓣成活的實驗研究[J].中華整形外科雜志,2002,18(2):69-71.
[7]Gurunluoglu R,Ozer K,Skugor B,et al.Effect of transfection time on the survival of epigastric skin flaps pretreated with adenovirus encoding the VEGF gene[J]. Ann Plast Surg,2002,49:161-169.
[8]劉宇蘭,張一鳴,聶祝峰,等.重組人VEGF 基因治療提高游離顆粒脂肪移植存活率的實驗研究[J].中國美容醫學,2005,14(3):271-274.
[9]Jewell RP,Whitney TM.TRAM fat necrosis in an yong surgeon′spractice:is it experience,technique or blood flow[J].Ann Plast Surg,1999,42(4):424-427.
[10]Yla-Herttuala S, Martin JF. Cardiovascular gene therapy[J]. Lancet,2000,355:213-222.
[11]Tripathy SK, Black HB, Goldwasser E, et al. Immune responses to transgene encoded proteins limit the stability of gene expression after injection of replication-defective adenovirus vectors[J]. Nat Med,1996,2:545-550.
[12]Kostakoglu N, Manek S, Green CJ. The development of neovascularisation in flap Prefabrication with vascular implantation: an experimental study[J]. Br J Plast Surg,1997,50:428-434.
[13]Padubidri A，Browne E. Effect of vascu1ar endothelial growth factor(VEGF)0n survival of random extension of axial pattern skin flaps in the rat[J]. Ann Plast Surg,1996,37:604-610.
基因重組范文5
【關鍵詞】 NT4ApoptinHA2TAT 重組腺相關病毒 腫瘤 融合基因
近年來不損傷正常細胞的蛋白質和相關肽的發現為腫瘤的基因治療帶來了轉機， 利用重組腺病毒轉導這類基因， 注射實體瘤之后， 可以在一個較長的時間內持續表達殺傷腫瘤的蛋白［1］。體外合成或基因工程表達的CAVVP3蛋白Apoptin能特異地誘導多種人源性惡性腫瘤細胞的凋亡， 但對正常二倍體體細胞無作用［2］。本研究在前期工作的基礎上擬構建神經生長因子4(NT4)信號肽引導的可分泌表達ApoptinHA2TAT的重組腺相關病毒高效表達載體， 為下一步進行Apoptin應用于基因治療奠定基礎。
1 材料和方法
1.1 材料 克隆載體pGEMT/Apoptin質粒有本課題組構建［3］; 限制性內切酶NaeⅠ、 XhoⅠ、 EcoRⅠ、 SalⅠ購自寶泰克生物公司; Taq DNA聚合酶、 T4 DNA連接酶購自華美生物公司; pUC19/NT4質粒、 pGEMT/HA2TAT、 腺病毒穿梭質粒pSSCMV及輔助質粒pAAV/Ad、 腺病毒質粒pFG140， 大腸桿菌DH5α及293細胞系、 小鼠成纖維細胞NIH3T3、 HepG2人肝癌細胞系均由西安華廣生物工程公司提供。
1.2 方法
1.2.1 pUC19/NT4ApoptinHA2TAT載體構建 堿裂解法大量制備重組質粒pGEMT/Apoptin、 pGEMT/HA2TAT， 分別用限制性內切酶NaeⅠ、 KpnⅠ、 XhoⅠ消化， 切取Apoptin、 HA2TAT用T4 DNA連接酶連入帶有相同末端的已線性化pUC19/NT4載體。用連接反應產物轉化制備好的感受態細菌E.coli DH5α菌株， 隨機挑選單個菌落， 接種于含有氨芐西林的LB培養基內， 37℃增殖培養， 堿裂解法小量提取質粒， 用限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切， 篩選出含有約710 bp左右的重組質粒pUC19/NT4ApoptinHA2TAT。
1.2.2 腺病毒穿梭質粒pSSCMV/NT4ApoptinHA2TAT的構建 EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切腺病毒穿梭質粒pSSCMV和EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切pUC19/NT4ApoptinHA2TAT， 低熔點凝膠回收NT4ApoptinHA2TAT和線性化的pSSCMV， T4 DNA連接酶連接， 轉化E.coli DH5α感受態細菌， 挑選轉化的菌落， 提取質粒， EcoR Ⅰ 和Hind Ⅲ 雙酶切篩選并鑒定陽性克隆。
1.2.3 重組腺相關病毒的包裝與鑒定及滴度測定 采用磷酸鈣沉淀法三質粒共轉染HEK293細胞獲取重組腺相關病毒。轉染3 d后， 質粒在細胞內同源重組構建出重組腺相關病毒， 毒斑出現， 反復凍融含病毒栓子的培養基， 提取病毒， 收集含病毒的上清液感染80%成片的HEK293細胞。Dot blot法測定重組病毒滴度。
1.2.4 重組腺相關病毒對HepG2細胞存活率的影響 將HepG2細胞以每孔10 000個細胞的量接種于96孔培養板中， 每孔體積200 μL， 培養24 h后分實驗組、 正常細胞小鼠成纖維細胞NIH3T3組和空病毒組， 各加入10MOI的空病毒或重組病毒， 病毒作用2 h后更換新鮮正常培養液， 在病毒作用后的24、 48、 72 h分別終止培養(以上每組各設3個復孔)， 加入MTT試劑(5 g/L)20 μL， 37℃孵育4 h， 將含MTT的培養液移去， 加入二甲基亞砜150 μL， 搖勻15 min， 使反應產物充分溶解。在測定波長為490 nm的酶標儀上測定光密度A值。
2 結果
2.1 重組質粒pUC19/NT4ApoptinHA2TAT的構建 Apoptin和HA2TAT被酶切后插入pUC19/NT4載體， 轉化E.coli， 挑選克隆， 用限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切， 篩選出含有約710 bp左右的重組質粒pUC19/NT4ApoptinHA2TAT（圖1）。
2.2 重組腺相關病毒穿梭質粒pSSCMV/NT4ApoptinHA2TAT的構建與鑒定 NT4ApoptinHA2TAT插入pSSCMV載體， 轉化E.coli， 挑選克隆， 進行酶切鑒定。重組質粒pSSCMV/NT4ApoptinHA2TAT的大小為5 860 bp。用EcoR I 和Hind Ⅲ雙酶切獲得5 100 bp和760 bp兩個片段（圖2）。
圖1 pUC19/NT4ApoptinHA2TAT重組質粒基因酶切鑒定（略）
Fig 1 The result of pUC19/NT4ApoptinHA2TAT digested with restriction enzyme
1: λDNA/Hind Ⅲ marker; 2: 100 bp DNA marker; 3: Digested with EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ; 4: Digested with EcoR
Ⅰ; 5: pUC19/NT4ApoptinHA2TAT.
圖2 pSSCMV/NT4ApoptinHA2TAT質粒酶切鑒定結果（略）
Fig 2 The result of pSSCMV/NT4ApoptinHA2TAT digested with restriction enzyme
1: pSSCMV/NT4ApoptinHA2TAT; 2: Digested with EcoR Ⅰ/Hind Ⅲ; 3: λDNA/Hind Ⅲ marker; 4: 100 bp DNA marker.
2.3 NT4ApoptinHA2TAT重組腺相關病毒包裝與滴度測定 將構建好的pSSCMV/NT4ApoptinHA2TAT質粒與輔助質粒pAAV/Ad、 腺病毒質粒pFG140， 應用磷酸鈣DNA共沉法共轉染80%融合的293細胞， 包裝得到NT4ApoptinHA2TAT重組腺相關病毒。用收獲的毒種感染293細胞， 至MOI為10時， 加PBS液細胞冰融， 離心取上清-20℃保存備用。將所獲得的病毒液對數比稀釋后， 利用Dot blot法測定滴度為3.14×1015 pfu/L。
2.4 MTT比色法測定重組腺相關病毒對腫瘤細胞的殺傷作用 AAVmock和NT4ApoptinHA2TAT重組腺相關病毒分別感染HepG2細胞和NIH3T3細胞。隨著作用時間的延長， NT4ApoptinHA2TAT重組腺病毒組比AAVmock組的HepG2細胞的存活率明顯降低， 而對NIH3T3組無影響， 說明NT4ApoptinHA2TAT重組腺相關病毒對腫瘤細胞有選擇性誘導凋亡作用（圖3）。
3 討論
目的基因或載體對正常組織的毒性和腫瘤細胞對治療的耐受等是限制腫瘤基因治療臨床應用的瓶頸， 而Apoptin的發現給抗腫瘤的基因治療帶來了轉機。體外合成或基因工程表達的Apoptin能特異的引起多種人源性惡性腫瘤細胞凋亡， 對正常二倍體體細胞無作用; 而且這種選擇性凋亡作用既不依賴于p53的介導， 也不被Bcl2過表達所抑制， 而大部分腫瘤的耐藥產生都是由p53的缺失（突變）或Bcl2的過表達引起。對惡性細胞的選擇性凋亡且對抗耐藥的特點使Apoptin成為基因治療的理想目的基因（蛋白）。近來的大量研究表明， 無論是和免疫制劑［4］還是和化療藥物［5］聯用都能增強治療效果， 顯示出了凋亡素的巨大應用前景。
圖3 AAV/NT4apoptinHA2TAT對HepG2細胞和NIH3T3細胞存活率的影響（略）
Fig 3 The effect of AAV/NT4ApoptinHA2TAT on HepG2 cells and NIH3T3 cells
A: The effect on NIH3T3 cells; B: The effect on HepG2 cells. bP
但是， 現行的Apoptin腫瘤基因治療中， 多數以腫瘤細胞為靶細胞， 在這種治療模式下， 雖然降低毒副作用， 但治療效應往往隨腫瘤細胞的凋亡而終止， 增加了治療的難度和費用?；诖?， 本研究在Apoptin基因的兩端融合進3個基因片段: NT4為信號肽， 可以引導NT4ApoptinHA2TAT通過膜性結構并在經過脂質膜時通過信號肽酶切位點切下信號肽（NT4）， 從而使成熟肽分泌（ApoptinHA2TAT）到細胞外; TAT［6］為HIV中的穿膜肽， 可介導分泌之胞外的ApoptinHA2TAT以巨胞飲作用進入細胞; HA2［7］為流感病血毒凝素2亞單位的NH2的結構域， 為pH依賴性融合胎， 在低pH環境中可增強ApoptinHA2TAT從巨胞飲體中逃逸。
如果應用含有NT4ApoptinHA2TAT的重組腺相關病毒轉染間質干細胞或其他相關細胞會輸體內， 將大大提高治療基因的表達效率和延長分泌時間， 同時依賴于Apoptin的特異性殺傷和對抗耐藥的特性， 則解決了基因治療的有效性和安全性的關鍵問題。
應用MTT法檢測感染重組病毒的人肝癌HepG2細胞和小鼠成纖維細胞NIH3T3活性， 結果顯示分泌表達目的基因的重組AAV對HepG2細胞的誘導凋亡作用， 而對正常細胞無作用， 說明融合蛋白沒有改變Apoptin的腫瘤特異性殺傷特性， 且融合蛋白能夠被分泌表達且發揮了生物活性。其對表達效率和分泌時間的正影響及轉染間質干細胞的在體效應， 則有待于進一步研究。
參考文獻
［1］ Zhang YH， Leliveld SR， Kooistra K， et al. Recombinant Apoptin multimers kill tumor cells but are nontoxic and epitopeshielded in a normalcellspecific fachion［J］. Exp Cell Res， 2003， 289(1): 36-46.
［2］ Yuasa N， Taniguchi T， Yoshida I. Isolation and some characteristics of an agent inducing anemia in chickens［J］. Avian Dis， 1979， 23(2): 366-385.
［3］ 劉德純， 王健生， 王作仁， 等. 雞貧血病毒Apoptin蛋白編碼基因的克隆和序列分析［J］. 第四軍醫大學學報， 2007， 28(11): 961-963.
［4］ Lian H， Jin N， Li X， et al. Induction of an effective antitumor immune response and tumor regression by combined administration of IL18 and Apoptin［J］. Cancer Immunol Immunother， 2007， 56(2): 181-192.
［5］ Olijslagers SJ， Zhang YH， Backendorf C， et al. Additive cytotoxic effect of apoptin and chemotherapeutic agents paclitaxel and etoposide on human tumour cells［J］. Basic Clin Pharmacol Toxicol， 2007， 100(2): 127-131.
基因重組范文6
【摘要】
目的研究南山茶子拮抗孕激素作用。方法用系統溶劑分離法將南山茶子醇提物分成極性不同的組分，利用重組人孕激素受體基因酵母生物檢測法篩選南山茶子拮抗孕激素活性部位。結果5個組分都表現出拮抗孕激素的效應，活性強弱依次為醋酸乙酯層>正丁醇層>石油醚層>水層>醇提物。結論醋酸乙酯部位可能為南山茶子拮抗孕激素的活性部位。
【關鍵詞】 南山茶 重組人基因酵母 孕激素受體 拮抗作用
Abstract：ObjectiveTo study the antiprogestin active parts of the seeds of Camellia serrdserrate Chi.MethodsThe seeds of Camellia serrdserrate Chi. extract was separated into four fractions according to polarity， its antiprogestin active parts was investigated by a recombinant yeast screening assay. ResultsThe five fractions showed antiprogestin activity， and the order of the estrogenic activity of these fractions was ethyl acetate> normal butyl alcohol> petroleum ether > water extract > alcohol extraction.ConclusionThe ethyl acetate is the antiprogestin active parts of the seeds of Camellia serrdserrate Chi..
Key words：Camellia serrdserrate Chi.; Recombinant yeast; Progesterone receptor; Antagonistic effect
正常人骨代謝的平衡是離不開體內一種特殊物質調節的，這種特殊物質就是激素。激素是由內分泌器官所分泌的一種高效能有機化合物，人體內很多種激素，其中目前已經明確與骨質疏松有關聯的8種：雌激素、甲狀腺激素（PTH）、降鈣素、活性維生素D、甲狀腺激素、雄激素、皮質類固醇激素、生長激素。其中前4種更為重要。這些激素或通過影響破骨細胞的數量及活性來調節骨吸收過程，或通過影響成骨細胞的活性來調節骨形成過程，從而調節骨代謝。當這些激素在人體內達到某一濃度時能夠維持骨吸收與骨形成的平衡，但當它們在體內的含量發生異常變化時，便會使骨代謝失去平衡，導致骨量的減少，從而引起骨質疏松。已有大量的文獻報道［1，2］：孕激素受體能夠降低雌激素受體(ER)的轉錄活性，也就是說對孕激素受體活性的抑制能夠增強體內雌激素受體活性的表達。
南山茶Camellia serrdserrate Chi.屬于山茶科山茶屬植物，廣泛分布于我國的西南部和東南部，集中分布于我國長江以南的亞熱帶地區，資源非常豐富［3］，其化學成分主要有黃酮，皂苷和多酚這三大類［4］，我們在對山茶屬植物藥用價值的研究過程中發現，南山茶種子乙醇提取物對維甲酸所致骨質疏松的大鼠有很強的抗骨質疏松活性，并且明顯高于陽性對照藥。為了具體確定南山茶子抗骨質疏松的有效部位，我們首先用95%乙醇提取南山茶子得到醇提物，對其中三類化學成分的含量進行了測定，總黃酮4.07%，總皂苷12.15%，總酚4.30%［5］，并分別依次用石油醚、醋酸乙酯、水飽和正丁醇進行萃取，濃縮至干，再用轉基因酵母的生物檢測方法對它們是否有拮抗孕激素受體的作用進行研究，從而從另一角度來闡明南山茶子抗骨質疏松的作用機理。
1 儀器與試藥
Laborata 4000型旋轉蒸發儀（Heidolph，Germany）；酶標儀（Spectra Fluor plus，TECAN，Austria）；分光光度計（WFZ UV-2000，上海）；恒溫振蕩搖床（HZQ-F，哈東聯）；恒溫平板搖床（Titramax 1000，Heidolph，Germany）；百級超凈工作臺（DL-CJ-1F，哈東聯），旋渦混合器（MS2，廣州IKA Works），96孔培養板，96孔酶標板（比利時 Orange）。ONPG（Sigma，USA），二甲基亞砜（99.9%，Sigma，USA），酵母氮堿（Difco，USA）。
南山茶種子（2006年3月采集于廣西省平南縣六陳鎮，經昆明植物民裴盛基教授鑒定）；重組人孕激素受體（hPR）基因酵母（Gaido贈送）；SC培養基；孕酮（PG）（MP. Bio medical公司）；酶反應底物鄰硝基苯基β－D－半乳糖苷（Sigma）；二甲基亞楓(Sigma)，所用試劑均為分析純，溶于超純水（Milli-Q，USA）。
2 方法
2.1 試劑的配制
2.1.1 SC培養液稱取36 mg賴氨酸，12 mg組氨酸，6.7 g無氨基酵母氮源，20 g葡萄糖溶于1 000 ml超純水中，用0.22 μm濾膜過濾除菌后于4℃下冷藏保存。
2.1.2 基礎緩沖液稱取21.5 g Na2HPO4·12 H2O，6.22 g NaH2PO4·2H2O，0.75 g KCl，0.25 g MgSO4·7H2O溶于1 000 ml超純水中，于4℃下冷藏保存。
2.1.3 鄰硝基苯基β－D－半乳糖苷溶液（ONPG）溶液（13.3 mmol·L-1）稱取0.4 g ONPG溶于100 ml基礎緩沖液中即可（現配現用）。
2.1.4 Na2CO3溶液（1 mol·L-1）稱取10.6 g無水Na2CO3溶于100 ml超純水中，于4℃下冷藏保存。
2.1.5 CuSO4溶液（50 μmol·L-1）稱取1.196 g CuSO4·5H2O溶于100 ml超純水中，于4℃下冷藏保存。
2.2 酵母接種的培養重組人孕激素受體基因酵母由Gaido贈送，培養基為增加硫酸銅（50 μmol·L-1）、腺嘌啉、賴氨酸、色氨酸的SC培養基，室溫避光保存［6］。
將1 ml新鮮凍融的酵母菌株接種到9 ml SC培養液中加10 μl CuSO4，置于轉速130 r·min-1，溫度為37℃的空氣浴搖床中培養過夜，用分光光度計測定10倍稀釋的酵母菌株培養液在600 nm波長處的吸光度（以培養基為空白），要求吸光度值在0.15～0.5，用培養液將酵母菌液稀釋到A600=0.75作為工作液［7］。
2.3 南山茶的抗孕激素活性測定分別稱取南山茶子醇提物，石油醚層浸膏，醋酸乙酯層浸膏，正丁醇層浸膏以及水層浸膏各50 mg，用1 ml DMSO溶解，得濃度為50 mg·ml-1的溶液。取990 μl工作菌液至對應的EP管中，分別加入5 μl DMSO（空白），5 μl用DMSO溶解的孕酮（PG，陽性對照，1×10-7mol·L-1）和5 μl用DMSO溶解的樣品渦旋混勻。在加入5 μl樣品的EP管中再加入5 μl PG（濃度為1×10-7mol·L-1）渦旋混勻，將以上溶液各200 μl依次轉移至96孔板中，然后于恒溫平板搖床800 r·min-1，37℃振蕩培養2 h。酶標儀測定A595后，吸取150 μl溶液棄去，加入120 μl測試緩沖液和20 μl氯仿，在30℃的恒溫搖床上預培養10 min。加入40 μl ONPG（4 mg·L-1）反應液將酶反應啟動至出現明顯的黃色后加入100 μl 1 mol·L-1Na2CO3溶液終止反應，吸取200 μl上清液轉移到酶標板中測定A420的值［7］。
2.4 β-半乳糖苷酶活性以及孕激素抑制活性的計算
U=［(A420-A′420)/T×V×A595］×D
式中U代表酶活力，A420代表樣品在420 nm處的吸光度，A′420為空白溶液（即DMSO）在420 nm處的吸光度，A595為樣品在595 nm處的吸光度，T代表反應時間，V為反應菌液的稀釋倍率，D為稀釋因子。
抑制率(%)=1-U樣U陽×100%
U樣為加入樣品后標準品所表現出的酶活性，U陽為對照品PG的酶活性。
3 結果
實驗最后的總體積為200 μl，樣品的反應時間都為60 min，樣品稀釋倍率為0.2，將我們所測得A420和A595值帶入上面的公式，就可以計算出相應的β-乳糖苷酶的活力值和抑制率。結果見表1和圖1。表1 加入南山茶各樣品后孕酮的酶活值/U和抑制率（略）
由表1和圖1可以看出，樣品南山茶子的醋酸乙酯部位抗孕激素活性最強，抑制率達到50%，其他各個組分基本相當，因此通過以上的數據分析我們可以判斷南山茶子醇提物的醋酸乙酯部位為其拮抗孕激素的活性部位。
4 討論
重組孕激素受體基因酵母是一種快速、有效的檢測化合物是否有孕激素活性或抗孕激素活性的方法。它是將人孕激素受體基因（hPR）和孕激素受體響應元件（PRE）相連的β-半乳糖苷酶（LacZ）報告基因這兩個基因片段引入到酵母中，當被測物質加入培養基中誘導或抑制PR時，都會啟動基因的轉錄，產生和分泌β-半乳糖苷酶。通過測定A420的吸光度值來反應β-半乳糖苷酶的活性，從而可以得出被測物質對孕激素受體的作用。
植物雌激素與雌激素受體結合，在體內具有雙向調節作用。當體內雌激素水平較低時，它就表現出雌激素樣活性，當體內雌激素超過正常水平時，它就發揮出抗雌激素的作用［8］。重組雌激素受體基因酵母篩選南山茶子抗骨質疏松有效部位的實驗的結果顯示醋酸乙酯部位對雌激素受體表現出雙向調節的作用，具有較明顯的雌激素活性同時又有較強的抗雌激素活性，因此推斷雌激素樣作用可能是南山茶子發揮抗骨質疏松作用的主要機理之一，但是， 醋酸乙酯部位具有抑制孕激素受體的作用，同樣能夠導致生物體產生類雌激素樣的結果。因此，同時應用重組雌激素和孕激素受體基因酵母，可以更加準確篩選出南山茶子抗骨質疏松的活性部位。
致謝：本實驗是在中科院生態研究中心水生態毒理研究組完成，在此特別向王子健研究員給予本實驗的幫助和支持表示最誠摯的謝意，感謝本實驗室所有的老師和同學。
參考文獻
［1］Wen D X， Xu Y F， Mais D E， et al. The A and B isoforms of the human progesterone receptor operate through distinct signaling pathways within target cells［J］.Mol Cell Biol ， 1994， 14: 8356.
［2］Kraus W L， Weis K E， Katzenellenbogen B S. Inhibitory cross-talk between steroid hormone receptors: differential targeting of estrogen receptor in the repression of its transcriptional activity by agonist- and antagonist-occupied progestin receptors［J］.Mol. Cell. Biol.， 1995， 15: 1847.
［3］高繼銀. 山茶屬植物主要原種彩色圖集［M］.杭州：浙江科學技術出版社，2005:15.
［4］王永奇，吳小娟，李紅冰，等.藥用山茶屬植物的研究［J］.大連大學學報，2006，27(4):47.
［5］吳小娟，林紅景，唐 玲，等.山茶種子抗骨質疏松有效部位群化學成分的含量測定［J］.中南藥學，2007，5(2):107.
［6］李 劍，崔 梅，馬 梅，等.應用重組孕激素基因酵母測定飲用水中內分泌干擾物的方法［J］.環境科學，2006，27(12)：2463.
［7］李 劍，崔 青，馬 梅，等.基于H4ⅡE細胞株測試間接雌激素效應物質的代謝方法［J］.環境科學學報，2006，26(8)：1.
