基因突變范例6篇

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基因突變范文1

一、教材分析

1、在教材中的地位

本節是必修二第五章第一節的內容，通過前面各章的學習對于基因是什么，基因在哪里，基因是如何起作用的相關知識已經有了整體的認識。那么基因在代代相傳中會不會變化？怎么變化？發生的變化會對生物的生存產生什么影響？本節從遺傳物質變化的角度出發分析基因突變和基因重組對生物的影響，以及在生物進化過程中所起的作用，同時，也是學習第六章《從雜交育種到基因工程育種》和第七章《現代生物進化理論》的基礎。

2、重、難點分析

重點：基因突變的實例；基因突變及基因重組的概念；基因突變的原因；基因突變特點及意義；基因重組的類型及意義。

難點：基因突變的概念；基因突變的結果形成原基因的等位基因；基因突變的特點；交叉互換。

3、教學目標

（1）知識目標。通過對鐮刀型貧血癥病因的分析認識基因突變的概念并分析基因突變的幾種類型；不同器官發生基因突變的遺傳情況；舉例基因突變的原因和特點；識記基因突變的意義；舉例說明基因重組的概念，類型；說出基因重組的意義。（2）能力目標。通過實例分析入手培養學生分析歸納總結能力；設置問題讓學生分組討論，培養學生合作探究能力。（3）情感態度與價值觀。列舉基因突變引起的遺傳病實例讓學生更加珍愛生命，遠離不健康的生活方式。

4、教W方法

通過實例分析入手，設置問題情境引導學生探究，再歸納總結概念，從現象到概念，這種教學更符合學生的認知規律；通過聯想和類比推理讓學生得出基因突變的類型；基因突變的原因部分通過癌變的具體實例歸納哪些因素引起基因突變，讓學生在興趣中掌握了抽象的概念；通過討論的形式引導學生掌握基因突變和基因重組的意義，最后通過比較法掌握基因突變和基因重組的區別。

5、教具準備

多媒體課件

6、課時安排：1課時

二、教學過程

導課：簡單復習下變異的概念，舉例：一美女單眼皮，國字臉，去了韓國一趟變成雙眼皮瓜子臉，她的這種改變從生物學角度來說就屬于變異，問，如果該美女結婚了，她的雙眼皮瓜子臉能遺傳嗎？學生答：不能。教師追問：什么樣的變異才能遺傳給下一代呢？學生答：遺傳物質改變引起的變異才能遺傳給子代。教師和學生一起歸納變異的類型：可遺傳變異，遺傳物質改變引起的變異，有三種來源，基因突變、基因重組、染色體變異；不可遺傳變異，由環境變化引起的，遺傳物質沒有改變，所以不能遺傳給下一代。本節課學習可遺傳變異的兩大來源，基因突變和基因重組。

基因突變

1、基因突變的實例――鐮刀型細胞貧血癥

學生閱讀課本的有關內容，注意以下幾個問題： （1）鐮刀型細胞貧血癥的癥狀？（細胞呈鐮刀狀，容易破裂，使人患溶血性貧血，嚴重時會導致死亡。）（2）鐮刀型細胞貧血癥的直接病因？（血紅蛋白結構異常）科學家為什么先從蛋白質入手？（蛋白質是生命活動的直接體現者）（3）異常血紅蛋白與正常血紅蛋白相比氨基酸序列有什么不同？（一個氨基酸被替換）（4）氨基酸被替換的根本原因是什么？

學生回答每一個問題后播放括號內的內容，然后再展示第四個問題，引導學生回顧基因表達過程讓學生認識到蛋白質的氨基酸序列取決于DNA中的堿基序列，所以，血紅蛋白氨基酸被替換應該是DNA中的堿基序列改變的結果。多媒體展示圖片和學生一起通過圖片分析鐮刀型細胞貧血癥的原因：

DNA中的一個堿基對被替換信使RNA堿基對改變蛋白質中氨基酸改變蛋白質改變性狀改變

教師闡述：像這種氨基酸DNA中堿基對的改變引起基因結構的改變就是基因突變。堿基對改變的類型，除了替換外，還有增添和缺失。

問：這種改變能否遺傳？能的話怎樣遺傳？（能，通過DNA復制后，經減數分裂形成生殖細胞遺傳給后代，無性繁殖的生物還可以通過體細胞遺傳。）

2、基因突變的誘因

學生閱讀課本后，請一個同學回答引起基因突變的原因，不完整的教師補充，通過多媒體展示：物理因素、化學因素和生物因素

3、基因突變的特點

學生閱讀課本后和學生一起歸納：普遍性、隨機性、不定向性、低頻率性、多害少利性。

4、基因突變的意義

教師問：基因突變能產生新的基因，新的基因所控制產生的新性狀對生物的生存產生什么影響？突變是多害少利的，什么個體更容易在自然選擇中生存下來？

（基因突變產生新的基因，進而出現新的性狀，而這種性狀對生物的生存大多數是有害的少數是有利的，只有那些適應環境的有利變異個體才能在自然選擇中生存下來）

基因突變能產生新的基因，是生物變異的根本來源，為生物進化提供可選擇的原材料。

基因重組

請學生閱讀基因重組部分內容，并思考以下問題：

1、基因重組的概念？（生物體在有性生殖過程中，控制不同性狀的基因發生重新組合的過程。）哪些生物能發生基因重組？（有性生殖的生物）有沒有產生新的基因？（沒有，原有基因發生重新組合形成新的基因型出現新的表現型。）

2、基因重組的類型有幾種？（兩種，四分體時期，四分體中的菲姐妹染色單

體發生交叉互換，引起染色單體上的非等位基因重新組合；減數第一次分裂后期非等位基因隨著非同源染色體的自由組合發生重組。）

3、基因重組發生的時期？（減數分裂形成配子過程。）

比較項目

4、基因重組的意義？

基因突變范文2

【關鍵詞】：毛竹；遺傳結構 ；基因突變

【引言】：

經濟社會的發展，促進了物質文明的需要，毛竹的生態價值，長作為景觀竹，翠綠的顏色讓人心曠神怡，對于改善區域內的環境也有很大的作用。被移栽與多個國家，毛竹的生態性和經濟價值被發掘，毛竹的遺傳結構受到品種之間的沖擊，毛竹的基因發生了變異。保持毛竹品種，受到社會各界廣泛的重視。

1、毛竹的遺傳結構

我國的毛竹栽種面積廣泛，主料的產量、工業利用的規模和水平遙遙領先于其他的國家，毛竹作為我國高生態價值和高經濟價值的禾本科竹亞科植物，得到了國家的相關部門的重視，采用科學的手段對毛竹進行相對應的研究，了解毛竹的遺傳結構，從而保護毛竹品種的多樣性。毛竹的遺傳結構和區域分布有重要的關系，不同地區的毛竹的遺傳結構不同，甚至就是同一區域的毛竹因為其的群落不一樣，內部的基因結構也不相同。毛竹的遺傳結構基本上是固定，但不排除環境因素還有自身導致的病變。

毛竹的經濟價值還和她快速的生長和約60年左右開花等非常獨特的生物特點引起我國生物學家、科學家的重視。毛竹主要是群落生長的特征，整個毛竹的群落的遺傳特征大體相同，但是由于人們過度的追求經濟利益，破壞原有的毛竹群落的遺傳，這個需要相關部門引起重視，避免出現部分毛竹品種滅絕。

2、引起毛竹基因突變的原因

基因組DNA分子發生的突然的、可遺傳的變異現象（gene mutation）。從分子水平上看，基因突變是指基因在結構上發生堿基對組成或排列順序的改變?；螂m然十分穩定，能在細胞分裂時精確地復制自己，但這種穩定性是相對的。在一定的條件下基因也可以從原來的存在形式突然改變成另一種新的存在形式，就是在一個位點上，突然出現了一個新基因，代替了原有基因，這個基因叫做突變基因。

引起毛竹基因變異的原因主要分為兩種，一種是基因突變，另外一種是外部環境的改變導致。這兩種基因的突變，對于毛竹的生長有利也有弊。

毛竹的生長環境對于毛竹的基因構造有著重要的作用，毛竹作為中國的經濟價值和生態價值并重的植物，它的基因的突變引起了生物學家、遺傳學家、科學家等相關研究部門的重視。主要有兩個原因導致毛竹基因的突變：

2.1 毛竹受外界原因影響，發生基因突變

因為毛竹具有較高的經濟價值和生態價值，人們大量的移栽毛竹，毛竹為了適應生長環境，內部的基因結構發生變化。人們大規模的移栽毛竹，破壞了毛竹的竹群的完整性，毛竹因為要適應環境而發生基因突變。外界的原因導致毛竹遺傳結構的改變，質變到量變的積累過程，持續的周期長，但是也是毛竹遺傳結構變化細微的地方，應該引起人們的重視，避免毛竹品種出現一致化，破壞毛竹品種的多樣性。

2.2 毛竹群落之間的病變

毛竹的群落因為病蟲災害，或者是環境的變化，毛竹為了生存發生，基因的突變。對于毛竹群落出現病變的情況，應該引起相關部門的重視，對此應該給出合理的方案，避免這類情況的發生。

防治毛竹群落的病蟲災害，根據劃定的毛竹區域的不同，害蟲的不同，使用不同的農藥進行防治。

3、如何避免毛竹的基因突變

毛竹作為重要的經濟物種，引起的生物價值受到人們的重視，避免毛竹基因的突變，怕影響毛竹的經濟價值。避免毛竹基因突變，就應該從導致它基因突變的方面入手。

3.1 劃定區域繁殖

研究毛竹遺傳的多樣性和分布格局為避免毛竹的基因突變有重要的意義，毛竹因為其生物特性，有性生殖率低，開花的周期長以及開花期不確定等綜合性因素，毛竹的基因的突變需要時間。毛竹作為中國乃至全世界重要的的經濟性作物被廣泛的栽培，毛竹的生命力強，但隨著人工的栽植的強度增大，毛竹的多樣性正在減少，為了防止毛竹的群落過于單一化，應該劃定區域繁殖。

3.2分類對待毛竹的基因突變

區域的劃定，是避免了毛竹基因的突變，了解區域內毛竹的品種，能夠利于對毛竹原有品種的保護，比如湖南懷化、貴州黎平和廣東仁化等地區屬于遺傳變異較豐富的居群，應給予重視和優先保護，防止深度破壞該物種；對于特有基因豐富度高的居群，如四川興文，以及分布在各個群體的特異種質要加大力度進行異地保存和利用。

不同的區域采用不同的保護措施，避免毛竹品種的量變引起質變的情況發生，區域的劃定利于毛竹品種的多樣性。

3.3 對毛竹的品種進行保護

避免出現毛竹雜交的情況，對于毛竹的品種進行了解，避免出現劣等毛竹品種雜交，出現更為劣質的毛竹品種出現。

結語

毛竹的栽種歷史悠久，品種多，對于現有的品種的保護，能夠利于毛竹生產資源的單一性，基因純正的保證。保護毛竹的品種，對于后續的毛竹研究，具有重要的意義。

相關部門應該建立相關的毛竹保護區域，避免人工干涉過多，野生的毛竹資源缺少，毛竹的生物多樣性減少，不利于后期毛竹品種的改良。

【參考文獻】：

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基因突變范文3

【關鍵詞】  乳腺癌;腫瘤易感基因;基因突變

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【摘要】  目的 研究河北省家族性乳腺癌患者一級親屬brca基因突變情況。方法 采用聚合酶鏈反應單鏈構象多態性分析(polymerase chain reactionsingle strand conformation polymorphism, pcrsscp)和基因測序技術對國內外報告中常見的4個brca1/brca2突變熱點區域(brca1：外顯子2、11、20;brca2:外顯子11)進行檢測。結果 在12個家族性乳腺癌家系46例一級親屬中，發現1個brca2基因突變位點(5329inst)和1個核苷酸多態性位點(287 g>c)。結論 家族性乳腺癌家系中健康一級親屬突變基因和核苷酸多態性位點攜帶者存在較大的乳腺癌發病風險。

【關鍵詞】  乳腺癌;腫瘤易感基因;基因突變

近年來研究表明，乳腺癌易感基因brca(breast cancer susceptibility gene，brca)在家族性乳腺癌發生的過程中起到重要作用，突變基因可以常染色體顯性遺傳方式傳給子代[1]，目前研究最多的是brca1和brca2基因。本實驗采用聚合酶鏈反應單鏈構象多態性分析(polymerase chain reactionsingle strand conformation polymorphism, pcrsscp)和基因測序技術，對河北省12個獨立家族性乳腺癌家系中患者的健康一級親屬進行brca1和brca2基因突變檢測，以探討家族性乳腺癌患者健康一級親屬brca基因的突變位點及攜帶情況，為乳腺癌的預防和早期干預提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對象均為女性，平均年齡42.3歲。 入選標準：家族中2個及2個以上一級或二級親屬患乳腺癌，選取同意入組的12個獨立家族性乳腺癌家系中乳腺癌患者健康一級親屬46例樣本作為研究對象。

1.2 標本采集和dna提取 經研究對象知情同意后，采集每位研究個體外周靜脈血5 ml，經枸櫞酸鈉抗凝，置4c冰箱保存，并于采血后1周內用高鹽沉淀法提取基因組dna。

1.3 pcrsscp 分析 brca1基因有24個外顯子，brca2基因有27個外顯子，本實驗對國內外報告中常見的4個brca1/brca2突變熱點區域(brca1：外顯子2、11、20;brca2外顯子11)進行了檢測。

1.4 數據分析 采用dna starmagalign分析軟件進行序列比較，所有核酸序列位置編碼參考美國國家生物技術信息中心網站(ncbi, ncbi.nlm. nih.gov)genbank上野生型cdna序列：brca1(u14680.1)和brca2 (u43746.1)[2];采用ncbi上blast2應用程序進行核苷酸翻譯為蛋白質的比較，確定該核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，snp)是否引起氨基酸編碼改變;對發現的snp在乳腺癌信息中心網站 (breast cancer information core， nhgri.nih.gov /intramuralresearch /labtransfer/bic)進行比較，以確定新發現的突變位點是否為新的突變點。

2 結果

46例研究樣本中，于brca2基因發現了1個突變位點(5329inst)，且分布于第11外顯子上，其核苷酸序列在5 329位插入t，為移碼突變，導致終止密碼子形成，產生截斷蛋白。該基因攜帶者24歲，健康一級親屬，其母親和兩個姨媽分別于49、43和47歲確診為乳腺癌，其中一個姨媽為隱性乳腺癌患者。另外，于brca1基因發現了一個核苷酸多肽位點(287g>c)，分布于第2外顯子，攜帶者為另一家系中的健康一級親屬，其母親、姨媽和表姐分別于49歲、56歲、35歲診斷為乳腺癌。上述兩個家系中乳腺癌患者均為3例。

3 討論

brca1和brca2是與家族性乳腺癌發病密切相關的兩個基因[3，4]。研究認為，兩基因突變可以導致家族性、早發性、雙側性乳腺癌的發生[5]。

目前國內外關于家族性乳腺癌患者brca1和brca2基因突變的研究較多，但其一級健康親屬brca1和brca2突變情況罕有報道。該研究應用pcrsscp技術對12個獨立河北漢族乳腺癌家系中乳腺癌患者46例健康一級親屬，進行了國內外報告中常見的4個brca1和brca2突變熱點區域(brca1：外顯子2、11、20;brca2：外顯子11)進行檢測，發現1例致病性突變：5 329inst分布于brca2基因第11外顯子上，為移碼突變，其核苷酸序列在5 329位插入t，導致終止密碼子形成，產生截斷蛋白，上述突變點在國內首次被發現。研究還發現brca1基因外顯子2 存在1個snp位點(287g>c)，經過比對，上述snp位點亦為首次發現。

在該研究中，brca1基因核苷酸多態性位點和brca2基因突變位點攜帶者分別屬于兩個無任何血緣關系的家系，且兩個家系中均相繼發生3個乳腺癌。因此，作者認為：上述核苷酸多態性位點和突變基因攜帶者存在很大的乳腺癌發病風險，應該引起重視，密切隨訪或盡早進行手術或藥物干預。

【參考文獻】

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基因突變范文4

Correlation of p53 gene mutation and p16 gene deletion with hepatocellular carcinoma

【Abstract】AIM: To detect the probability of p53 gene mutation and p16 gene deletion in the plasma of the patients with hepatocellular carcinoma (HCC) and to explore its correlation with onset and development of HCC and its clinical significance. METHODS: PCR was used to amplify p53 gene exon 58 and the immunohistochemistry (SPp16) was employed to determine the deletion of p16 gene. The difference between the patients with or without liver metastasis was analysed in gene mutation and deletion. RESULTS: Of 33 cases of HLL 17(51.55%)， showed the mutation of p53; the mutation rate in metastasis group(n=18) was higher than that in nonmetastasis group(n=15). CONCLUSION: There is a correlation between HCC and p53 gene mutation and p16 gene deletion .The mutation rate may have the reference value in diagnosis and prognosis prediction of HCC.

【Keywords】 genes p53; genes p16; carcinoma， hepatocelluar

【摘要】 目的： 檢測肝癌患者血漿中p53基因突變和細胞核中p16基因缺失的機率，研究與疾病發生、發展的相關性并探討其意義. 方法： 實驗采用聚合酶聯鏈式反應（PCR）擴增p53基因外顯子5~8和免疫組織化學方法SPp16，對其突變和缺失進行分析. 結合臨床患者有無肝組織以外轉移來對比差異性. 結果： 33例肝癌患者中，有17例結果顯示血漿循環核酸p53基因突變；有轉移病灶組18例的突變率高于無轉移病灶組15例. 結論： 血漿p53基因突變和p16基因缺失與肝癌的發生、與疾病的輕重及病灶轉移有相關性，突變機率在臨床鑒別診斷和治療預后中有參考價值.

【關鍵詞】 基因，p53；基因，p16；癌，肝細胞

0引言

在各類疾病中，肝癌以惡性程度高、治療效果差、病灶易轉移和給患者帶來極大身心損害而排在前列［1］. 檢測血漿中p53和細胞核中p16基因突變機率，對治療效果判定、康復干預都有參考和使用價值［2］，對肝癌的發生和發展的危險因素評估、早期預防提供實驗方法學.

1材料和方法

1.1材料收集病例35例，患者均經腹部B超、CT或MRI影像學診斷，CEA， AFP多項腫瘤標志物蛋白檢測. 有胸腹水患者21例抽取樣本進行組織細胞學，4例肝穿刺活檢病理學診斷. 21例術后證實為肝癌，12例失去手術機會，2例因病情惡化死亡. 本組研究實為33例，肝癌無轉移15例，肝癌合并肺、胃、腸、腦等部位轉移癌18例. 男性27例，女性6例，年齡27~69（中位年齡48.27歲）. 自靜脈采血分離血漿，不受時間、飲食和治療影響. 31例正常對照為獻血員血漿，男性20例，女性11例，年齡25~55歲（中位年齡42.93歲）.

1.2方法PCR擴增儀使用美國PE公司智能型熱循環儀，引物設計參照序列如下［3］：p53基因外顯子5，擴增第5個顯子（P56.1和P5.2）序列上游引物順序5′TTC CTC CTG CAG TAC C3′， 214 bp，上游引物順序3′GCC CCA GCT GCT CAC CAT3′；p53基因外顯子6，擴增第6個顯子（P6.1和P6.2）序列上游引物順序5′CAC TGA TTG CTC TTA GGT CT3′， 144 bp，上游引物順序5′AGT TGC AAA CCA GAC CTC AGG3′；p53基因外顯子7，擴增第7個顯子（P7.1和P7.2）序列上游引物順序5′TCT CCT AGG TTG GCT CTG AC3′， 133 bp，上游引物順序5′CAA GTG GCT CCT GAC CTG GA3′；p53基因外顯子8，擴增第8個顯子（P8.1和P8.2）序列上游引物順序5′CCT ATC CTG AGT ACT GGT AA3′， 166 bp，上游引物順序3′GTC CTC CTT GCT TAC CTC G3′.

DNA提取方法為靜脈血2.5 mL，EDTAK2抗凝，混勻后3500 r/min離心10 min，分離血漿低溫-20℃保存. 操作程序按DNA提取試劑盒（由博華公司提供QLAmp DNA minikit，Germany）說明書進行. PCR擴增循環條件為：95℃ 40 s， 60℃ 30 s， 75℃ 40 s，重復循環32次，70℃ 10 min完成延伸反應. 再經非變性聚丙烯酰胺凝膠SSCP電泳，銀染，應用凝膠自動成像系統分析. 陽性（基因突變）條進行基因測序.

免疫組織化學方法采用SP方法，p16單克隆Ab及SP試劑購自成都醫藥工業總公司. p16蛋白以細胞核染棕蘭色為陽性，每張切片中以東西南北中五個高倍鏡下視野計數，按100%計算. 判定標準為陽性細胞數≥5%. 陽性對照同批實驗對照.

2結果

2.1p53基因突變p53基因突變與轉移癌的相關性（表1）和p53基因突變分布有區別（表2）.

表1小細胞肝癌（HCC）p53基因突變與轉移癌的關系（略）

表217例肝癌患者血漿p53基因熱點區外顯子突變的分布（略）

2.2p53基因突變相關性分析正常對照血漿31份，結果均為陰性（未發現泳動變位），33例肝癌患者血漿，有17例結果為陽性（有泳動變位）. 33例肝癌血漿p53基因有突變的17例（17/33， 51.55%），在第8外顯子居多（6/17， 35.4%）. 5~8外顯子擴增結果表明，HCCp53基因發生突變的機率在臨床有轉移的HCC中明顯高于無轉移的HCC（P

轉貼于

2.3p16基因缺失p16基因缺失情況見表3. 陽性為細胞核內著棕蘭色顆粒，均勻散在分布. 隨采樣位置，顯示無轉移癌組織切片>有轉移癌組織切片，分別為88.9(16/18)% 和11.1(2/18)%，統計學分析存在顯著性差異(χ2=6.095，P

表3p16基因缺失程度與癌組織是否轉移的相關性（略）

3討論

目前已知的抑癌基因有數十種，隨著人類基因組計劃的進行；其數目不斷增加，由于功能效團最終聚到細胞增殖調控機制上來［4］，在人體的各種細胞中都有p53蛋白質，由于含量很低、半衰壽期很短，一般檢測方法無法測到. p53有抑制細胞生長的作用［5］. 從以上實驗可知：在33個病例中有17例患者HCC的p53基因發生突變，占51.52%. 由于p53基因的突變或缺失導致p53基因功能的改變或喪失，從而不能抑制細胞的生長. 在HCC患者中p53發生突變，抑制細胞生長的作用隨之降低，導致癌細胞的快速增長，在同等條件下，發生HCC轉移的機率將比p53未發生突變的大，從實驗數據顯示HCC有轉移的占66.6%，HCC無轉移的占29.5%. 表明在肝癌患者中HCC p53基因突變與癌轉移有一定的相關關系，以上實驗從5~8外顯子擴增結果表明，HCCp53基因發生突變的機率在臨床有轉移的HCC中明顯高于無轉移的HCC（P

p16基因（MTS1，CDR41，CDRN2）是細胞周期調空基因家族中的重要成員［9］，是近年來新發現的抑癌基因，其作用機制為直接抑制. 實驗表明，隨采樣位置顯示：無轉移癌組織切片＞有轉移癌組織切片，分別為88.9(16/18)% 和11.1(2/18)%， 存在顯著性差異(P

結論： 核酸（RNA和DNA）的PCR擴增已成為分子生物學研究的重要技術體系，本研究在國內較早將其用于肝癌血漿p53基因突變的檢測，同時觀察基因p16缺失的情況，不僅從分子水平精確地闡明機制，也為基因診斷和基因治療提供了實驗依據，盡管目前仍存在一定的局限性，尚不能確定特異的對應關系，但無疑是一種前景廣闊的發展方向，處于學科前沿.

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基因突變范文5

【摘要】 目的 探討CD117陽性的胃腸道間質腫瘤（GIST）ckit基因突變分布及類型。方法 采用免疫組化技術，對10例GIST標本行CD117、CD34、SMA和S100檢測，以確診為GIST；采用PCR技術對CD117陽性的GIST進行ckit基因突變檢測；采用直接測序方法對突變ckit基因11、9、13和17號的外顯子突變進行序列分析。結果 4例成功提取了腫瘤DNA，其中3例檢出了ckit基因突變，均分布于第11號外顯子，均為557～558（WK）的缺失性突變；其中2例為純合子性突變，1例為雜合子性突變。結論 CD117陽性的GIST通常有ckit基因突變，其11號外顯子是經典分布熱點，變異純合子和雜合子突變為常見類型。

【關鍵詞】 胃腸道間質腫瘤；DNA突變分析；ckit基因

［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the locus and types of ckit (CD117) mutations in gastrointestinal stromal tumors (GIST).MethodsSpecimens of 10 GIST cases were detected immunohistologically for CD117， CD34， SMA and S100 to confirm the diagnosis of GIST. For CD117positive GIST， the mutation of ckit was detected by PCR， and its exons 11， 9， 13 and 17 analyzed by direct sequencing technique.ResultsDNA was successfully isolated in four cases， in which， mutation of ckit was found in three cases， all the genes detected were at ckit exon 11 with codon 557-558(WK)， homozygous mutation being noted in two cases and heterozygous in one.ConclusionThere is usually ckit gene mutations in CD117positive GIST， the exon 11 being classic “hot spot” of the mutations. The homozygous and heterozygous are their common types.

［KEY WORDS］Gastrointestinal stromal tumor; DNA mutationa analysis; ckit gene

胃腸道間質瘤（GIST）是近年來被認識并命名的新實體瘤，CD117（KIT蛋白）是其特異性敏感標志物[1]。GIST具有ckit基因的11號外顯子突變，從而導致酪氨酸激酶持續激活[2]。GIST對酪氨酸激酶抑制劑Gleevec治療敏感[3]。基因診斷和分型為臨床深入認識該病提供了重要前提[4]。本文探討了GIST ckit基因突變分布及類型，現報告如下。

1 材料和方法

1.1 標本及其來源

收集膠南市人民醫院外科收治的10例臨床病理診斷為GIST的腫瘤石蠟包埋組織標本，其中男6例，女4例，年齡31～72歲。根據臨床病理組織學形態特征將GIST分為：梭形細胞型4例，上皮樣細胞型3例和兩者混合型3例。腫瘤直徑

1.2 免疫組化方法

將40 g/L甲醛溶液固定、石蠟包埋的組織制成4 μm連續切片，以CD117(A4502，1∶200)、CD34(M7165，1∶50)、SMA(M851，1∶100)、S100(Z231，1∶200) 進行免疫組化標記。CD117免疫標記采用Envision兩步法；余者均采用SP三步法[5]。

CD117陽性細胞胞膜呈棕黃色；S100陽性細胞胞核和胞質呈棕黃色；CD34、SMA陽性細胞胞質呈棕黃色。

1.3 ckit基因突變檢測分析

用Qiagen DNA 試劑盒提取石蠟包埋組織的DNA，行PCR擴增。所有病例均首先進行ckit 第11號外顯子的擴增檢測，發現有突變者，不再進行其他突變檢測；對11號外顯子突變無陽性發現者，再進行ckit 9號外顯子的擴增檢測；無ckit 9號外顯子突變者，再進行13 號和17號外顯子的擴增。所用引物序列、退火溫度和PCR產物片段大小見表1。表1 PCR擴增引物序列、退火溫度和產物片段外顯子編號引物序列（略）

PCR反應條件為：95 ℃變性2 min；94 ℃ 40 s，退火40 s，72 ℃ 35 s，循環 30～35 次；最后72 ℃延伸5 min。以雙蒸水代替模板作為陰性對照。

PCR產物由北京華大中生生物科技發展公司純化并測序（ABI 3100測序儀）。有突變的病例再行反向測序證實，并與NCBI基因庫ckit基因序列進行比對。

2 結果

經免疫組化檢測CD117、CD34、SMA和S100，確認10例為CD117陽性GIST病例。

10例石蠟標本中僅4例成功提取了DNA，并進行了PCR擴增和測序。按細胞類型分為上皮樣細胞2例，梭形細胞1例，混合型1例。按侵襲危險性分為高度危險性3例，其核分裂象(8～15)/50 HPF；中度危險性1例，其核分裂象(1～2)/50 HPF。該4例中，有3例檢出了ckit基因第11號外顯子缺失突變，均為累及557～558（WK）的缺失性突變。其中1例CD117（+）、CD34（），第11號外顯子缺失突變，缺失片段為TGGAAGG，為雜合子性缺失突變；1例CD117（）、CD34（），第11號外顯子缺失突變；1例CD117（）、CD34（），第11號外顯子缺失突變。后兩者均為純合子性缺失突變。1例CD117（+）、CD34（），未檢測到11、9、13、17號外顯子的突變，屬野生型序列。其余6例，經反復提取DNA和檢測，均失敗。

3 討論

本組10例GIST的組織病理學研究顯示，GIST腫瘤細胞主要有3種類型：梭形細胞型、上皮樣細胞型和梭形細胞與上皮樣細胞混合型，但主要以梭形細胞型為常見。組織學檢查表明，GIST腫瘤細胞的核分裂象數目差異很大，而且與腫瘤的大小不相關。光鏡高倍視野下GIST腫瘤細胞核分裂象數目與腫瘤大小，均為FLETCHER等[6]對GIST侵襲危險度分級的主要指標，在評估病人預后上有重要意義。

本文研究結果進一步表明，免疫組織化學幾項檢測指標，特別是CD117和CD34對GIST的診斷是必需的。95％以上GIST表達CD117陽性，70％左右表達CD34陽性。因此，CD117和CD34是GIST病理診斷和鑒別診斷的關鍵性免疫形態學指標。GIST從組織學上，被認為來源于胃腸道間質中的Cajal細胞和其前身細胞[7]，這兩種細胞都顯示CD117和CD34陽性表達；SMA和S100則是用于鑒別平滑肌和神經源性腫瘤的免疫學指標。

本研究對10例GIST組織進行ckit基因突變檢測分析，目的是揭示腫瘤賴以發生的突變基因靶點，尋找在基因水平上的序列異常改變，幫助臨床選擇恰當治療方案。但是，其中6例檢測失敗。分析失敗原因，主要是組織標本處理不規范，造成無法有效提取組織DNA。因此，規范GIST的組織處理過程，是必須首先解決的問題。

本組GIST中有3例為ckit基因突變腫瘤，突變位點均位于11號外顯子，并表現為純合子缺失突變和雜合子缺失突變兩種類型。ckit基因是一種原癌基因，它的配體是細胞因子，ckit基因被激活后會引起受體的二聚體，并促進酪氨酸磷酸化，啟動細胞內的信號傳導，產生一系列增殖、分化、凋亡的調節功能。ckit基因11號外顯子是酪氨酸激酶抑制劑的靶向位點，因此是Gleevec藥物作用的敏感位點。按基因分類診斷，是推薦選擇Gleevec靶向治療藥物的適宜對象。而另1例病人的基因突變檢測未發現ckit基因9、11、13、17號外顯子突變，基因類型為野生型。同時，根據其腫瘤大小和核分裂象分級，屬高侵襲危險性GIST者，免疫組織化學檢測其CD117和CD34均為陽性，屬對靶向治療藥物Gleevec不敏感的GIST腫瘤病人。因此，基因診斷分型是GIST的重要臨床指標，為臨床治療提供依據，有重要意義。

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基因突變范文6

1.江蘇省中醫院急診外科，江蘇南京 210029；2.江蘇省中醫院病理科，江蘇南京 210029

[摘要] 目的 探討BRAF基因在甲狀腺狀病變中的突變情況及臨床意義。方法 提取石蠟腫瘤組織中DNA，采用直接測序法分析24例甲狀腺狀癌和30例甲狀腺不典型狀腺瘤石蠟組織中BRAF基因突變的情況。結合臨床資料進一步分析。結果 24例甲狀腺狀癌，16例發現BRAF基因15外顯子第600位密碼子A/T雜合（V600E），突變率為66.7%（16/24）。而30例甲狀腺不典型腺瘤中未發現V600E病理性突變（0/30）。 結論 BRAF V600E位點突變僅見于甲狀腺狀癌，具有一定的特異性，可以用于幫助臨床甲狀腺狀增生良惡性的鑒別。

關鍵詞 BRAF；V600E；甲狀腺狀癌；不典型腺瘤；直接測序法

[中圖分類號] R4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2014）09（a）－0015-03

[作者簡介] 張翼（1979-），男，江蘇如皋人，碩士研究生，主治醫師，研究方向:腫瘤臨床和基礎研究。

[通訊作者] 張士虎 （1975-），男，江蘇濱海人，博士在讀，副主任醫師，研究方向:肝、膽、胰、胃腸腫瘤外科。

甲狀腺癌是最常見的內分泌腫瘤，主要包括狀癌、濾泡狀癌、髓樣癌和未分化癌，其中甲狀腺狀癌最常見，約占85％～90％，以女性多發[1]。由于多種因素，導致甲狀腺腫瘤的發病率呈現逐年上升趨勢。良性甲狀腺病變中常出現狀病變，當出現不典型增生時易誤診為癌，從而擴大手術范圍，給病人造成不必要的傷害，因此對其性質鑒別具有重要臨床意義。而肉眼及顯微鏡下的觀察診斷具有一定的主觀性，這就需要一個客觀的臨床檢測指標幫助辨別良惡性。目前多項研究[2,3]指出甲狀腺狀癌和BRAF V600E突變密切相關，此突變在甲狀腺其他良惡性腫瘤中突變率非常低，具有一定特異性，而BRAF V600E在甲狀腺不典型狀腺瘤中的突變情況尚無人報道。為探討BRAF基因在甲狀腺狀病變中的突變情況及臨床意義，該研究選取2009年11月—2013年3月以來到該院就診的56例甲狀腺狀病變的患者，采用直接測序法分析了甲狀腺狀癌和甲狀腺不典型狀腺瘤的BRAF基因突變情況，探討其在鑒別診斷中的價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2009年11月—2013年3月江蘇省中醫院病理科54例甲狀腺狀病變石蠟標本,男16例,女38例;平均年齡44 19～70歲。其中甲狀腺狀癌24例（包括微癌6例）, 甲狀腺不典型狀腺瘤30例。所有組織標本均經病理證實，診斷參考2004年WHO診斷標準[4]。甲狀腺狀癌患者行單側及峽部全切加頸部淋巴結清掃, 甲狀腺微小狀癌患者行單側及峽部全切加中央區淋巴結清掃，不典型腺瘤行甲狀腺次全切除術，所有患者目前均存活。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA提取 切取5張10 um厚石蠟白片，脫蠟消化后提取DNA。具體方法見試劑盒說明書（Omega FFPE DNA Kit，USA）。以凝膠電泳系統檢測DNA模板的質量。

1.2.2 PCR擴增 使用ABI -2700型測序級擴增儀，擴增目的基因片段。反應體系：10×PCR Buffer 2 μL，HotStar Taq DNA Polymerase 0.25 μL(Q IAGEN，USA)，5×Q-Solution 4 μL, dNTP 2 μL,Primer各1 μL,模板DNA 1 μL,去離子水8. 75 μL。95 ℃ 10 min; 94 ℃ 50 s, 57 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min,共循環35次,最后于72 ℃延伸10 min。PCR產物純化具體方法見試劑盒說明書（AXYPrep PCR Cleanup Kit, USA）。

1.2.3 測序 測序方法[5]：在3100-Avant遺傳分析儀進行測序; Data collection軟件自動進行數據處理和分析。對于測序中發現有突變的病例,都進行反向測序驗證。將測序結果用DNA sequencing analysis5. 1軟件分析原始測序數據,獲取測序電泳圖和序列。將樣品序列用AB I SeqScape軟件與genebank標準序列進行比對,觀察樣本基因序列的改變。

1.3 統計方法

數據處理使用spss 13.0軟件。計數資料采用χ2檢驗、Fisher’s確切概率法進行顯著性檢驗。

2 結果

經直接測序法測定，54例樣本成功檢測了BRAF第15外顯子突變情況，突變位點全部位于V600E位點，未發現其他類型突變。24例甲狀腺狀癌，16例發現BRAF基因15外顯子第600位密碼子A/T雜合（V600E），突變率為66.7%（16/24）。而30例甲狀腺不典型腺瘤樣本中未發現V600E位點病理性突變（0/30）,兩者差異有統計學意義（P<0.01）。見表1。研究結果還顯示，BRAF V600E突變與性別、年齡、腫瘤大小無關，差異無統計學意義（P>0.05），與組織學類型相關。見表2。

3 討論

甲狀腺狀癌組織光鏡下多表現為狀，細胞核毛玻璃樣，可觀察到核溝，核內包涵體，間質中含有砂粒體，此為重要的特征。而當由于冰凍處理或者其他原因造成不典型時與腺瘤難以鑒別。免疫組化可以用于鑒別診斷，但是免疫組化操作過程中易出現假陰性或者假陽性，人工判讀結果也有一定的主觀性，易造成誤診。兩者治療和預后差別很大，需要一個客觀的檢測指標。

BRAF基因為RAF家族成員，位于7號染色體，是編碼B型有絲分裂原激活的蛋白激酶依賴性激酶的激酶。研究顯示，BRAF基因第15位外顯子上的T1799A點突變（V600E）導致BRAF中的纈氨酸(V)被谷氨酸(E)替代，進而持續激活BRAF激酶，造成MAPK通路持續活化，細胞不斷分裂、增殖，進而形成腫瘤[6]。在轉基因小鼠中通過BRAF 突變的表達，可誘導出狀癌，表明了BRAF基因在狀癌起始中的重要作用[7]。Fukushima等[8]檢測了100例甲狀腺癌的BRAF基因突變情況，發現BRAF基因的突變僅存在甲狀腺狀癌中，而且僅發現了V600E突變,陽性率為53％(40/76). 多項研究[9-11]顯示甲狀腺狀癌中BRAF基因突變率為29%~87%，而濾泡型腺癌和所有良性病變如單純性甲狀腺腫則無此突變。Zhang[11]等發現在甲狀腺細針穿刺標本中71.4%發生BRAF V600E突變，所有BRAF(V600E)陽性的標本甲狀腺切除術后都被證實為甲狀腺狀癌。最近的研究還顯示，BRAF（V600E）突變的發生率有地區差異。例如， BRAF V600E突變率在韓國（52％~87％）比其他國家（36％~65％）高[3]。造成這種差異的原因尚不清楚，可能是由于地理因素。一些研究報道了在高碘攝入區BRAF V600E突變率更高，這可能表明碘過量攝入是狀癌BRAFV600E突變的一個危險因素[12]。

甲狀腺狀癌的預后較好，十年生存率超過90%。但是35%的患者在長期隨訪中有復發[13]。甲狀腺狀癌的預后與多種因素相關，包括年齡、多灶性、腫瘤最大徑、甲狀腺外浸潤性的生長方式及缺乏腫瘤相關性纖維包膜等。研究顯示BRAF V600E突變在經典型甲狀腺狀癌中確與侵犯表型相關，BRAF V600E影響腫瘤的生長方式，促進浸潤轉移發生，進而影響甲狀腺狀癌患者臨床預后[14]。這對于甲狀腺狀癌患者的診斷和治療具有重要意義。Yong [15]等研究顯示73.7％的甲狀腺狀癌中發現BRAF V600E突變。淋巴結轉移，TNM分期，多灶性與BRAF V600E突變并無顯著相關。然而，腫瘤大小，甲狀腺外侵犯，組織學類型以及并發橋本氏甲狀腺炎與BRAF V600E突變有關聯。在一項回顧性多中心研究中[16]，BRAF V600E突變的存在增加了甲狀腺狀癌的死亡率。盡管這種聯系并不是獨立存在的，但支持了BRAF V600E突變對甲狀腺狀癌預后和治療影響的進一步研究。

綜上所述，BRAF V600E突變在鑒別甲狀腺狀癌和甲狀腺不典型狀腺瘤中具有重要意義，對患者的治療和預后有指導意義，直接測序法結果準確，價格低廉，適合臨床推廣使用。

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