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核酸檢測方法范文1
1計算機硬件故障的分類
按出現的時間分類，計算機的硬件故障主要分為以下三種，分別是：先期故障；中期故障；后期故障。先期故障指的是用戶完成購買、安裝、使用直到計算機保修期前后的時間內出現的故障，出現這類故障的原因多是產品設計不合理，配送過程中出現碰撞，使得計算機設備的元器件受到損壞，除此之外也有不少是由人為操作不當造成的。中期故障指的是用戶在使用計算機三年左右出現的故障，這些故障大多均勻分布，并沒有什么明顯的特征，一般是由某一個或是幾個零部件質量不佳導致的，更換存在故障的零部件即可排除故障。后期故障指的是設備在使用多年以后出現的故障，例如計算機內部的半導體和集成線路因為長久使用而發生物理或化學反應，從而導致設備元件老化失效。電阻和電容元件的使用壽命往往低于常用的半導體元件，而分立元件的使用壽命又低于集成電路，集成電路雖然價格較為昂貴，但是使用壽命卻是最長的。對于那些即將超出使用壽命期限的故障元件，更換新的元件之后就可以正常工作。而在后期故障中，除了計算機使用過程中突發的故障外，老化故障最為常見。它的特點是電阻元件變質，電容器的容量減少，會出現漏電的現象。這些故障的表現往往不會很明顯，但是一旦出現卻難以迅速解決，屬于疑難故障的范疇，需要專業的工作人員進行排除。
2計算機硬件設備出現故障的原因
對于計算機硬件設備存在故障的原因主要分為三個部分，分別是內部原因、外部原因以及人為原因。內部原因主要指設備內部的元器件性能不良，開關、觸點等部分被氧化以及印刷板漏電等由于生產方的原因造成的故障，像如元器件以及機械內部零部件出現不可逆的損壞，無法正常使用也是屬于這類故障。外部原因指的是用戶使用計算機的外部條件造成的，像如電路元件的損壞，計算機長時間工作造成內部零件的損壞以及外界環境的塵埃造成計算機操作性能下降等問題。人為原因多是為運輸過程計算機設備受到了猛烈的撞擊或震動，或是使用者隨意組裝、錯誤操作而造成的故障。
3計算機硬件常用維修方法概述
3.1常規觀察法。常規觀察法是最為簡單易行的，打開計算機設備的后蓋，直接用肉眼觀察設備的元件是否存在損壞、變形等情況。再連接電源觀察設備內部是否有異味或者異常聲音，以此來判斷是否存在以下故障。3.1.1斷線。在計算機設備故障中最常見的就是電源線路斷裂，保險絲斷裂以及晶體管引線斷裂等。3.1.2短路。短路這種故障常發生在分布較為密集的印制線路和芯片連接的引線之間，常見的是焊錫、裸的引線以及電路板上的汕垢短路。此外元器件相互碰撞以及元器件與屏蔽罩以及金屬地板之間的短路也時有發生。3.1.3漏電。某些漏電故障也能夠憑借感官觀察而直接發現，例如由電解電容外殼炸裂而引起的漏電、電解液流出而引起的漏電亦或者高壓元器件的漏電都能夠憑借感官觀察而直接發現。一旦發生高壓元器件發生漏電，會導致其出現放電打火現象。3.1.4過熱。個別元器件一旦過熱，通常會伴隨著各種異味，維修時可以通過用手背觸摸的方式來判斷其是否過熱，從而決定是否需要更換。3.2電路檢測法。計算機硬件設備維修中電路檢測法主要由以下幾個部分組成。首先電流法，電流法是用來檢查計算機硬件設備的電源電路負載電流，以及電路中各個部分的直流工作電路。簡而言之，若電流值正常，晶體管以及芯片就會處在正常的工作狀態，電源的負載電流若是保持正常狀態，負載中就不會出現故障問題。其次拆除法，有些計算機設備中的元器件只是起輔助作用，像如減少干擾、調節電路正常工作的元器件。但是當這些元器件出現故障時，不僅不能發揮其輔助作用，甚至會影響到設備的正常工作。若將此類元器件進行應急拆除并暫留空位，設備便可馬上恢復正常的工作。一般在缺少替換元器件的情況時，可采用拆除法加以處理。
4完善計算機維修工作的措施
4.1掌握硬件故障的簡單處理技巧。對硬件部分故障進行處理的難點就是快速對故障位置進行準確的判斷，這時就需要用到電阻檢測法以及替換法等檢測方式，發現故障之后再進行針對性的處理。比如說CMOS電源發生故障之后，就需要對電池進行更換。當按下開機鍵顯示器沒有正確顯示，而且伴隨著蜂鳴聲時，我們就需要取下計算機的內存條對其進行清理。清理之后將計算機進行還原，然后再嘗試開機。如果計算機還是不能正常開機，那么就應該更換內存條。若沒有遭受病毒攻擊的狀態下計算機的運行速度無緣無故的變慢，就應該從計算機的溫度以及主機是否故障這兩個方面來考慮問題，在理清楚故障原因之后要根據實際的狀況來及時進行處理。4.2掌握專業的維修技巧。掌握專業的故障判斷技巧是快速準確的維修計算機設備的關鍵所在，工作人員需要根據故障想想在腦海中明確檢驗故障的方法和次序，只有這樣才能最大限度的減少維修時間。在維修的過程中要掌握專業的維修技巧，像如先清潔后檢測、先機外后機內、先簡單后復雜等，只有牢牢的掌握這些專業技巧才能盡可能的排除其他故障，以避免硬件故障給計算機帶來的損害。
5總結
維護人員不僅要掌握專業的知識，還應該掌握一些具體操作方法和維修技巧，還要在工作中總結經驗，能夠對計算機存在的故障進行深入的分析，并采取相應的措施加以解決。
參考文獻
[1]楊琳.計算機硬件常用維修方法和技巧分析[J].中國新通信,2016,18(05):132.
核酸檢測方法范文2
一、建筑施工企業會計核算的內容
建筑施工企業會計核算涉及建筑施工過程中的一切資金費用，具體包括施工費用、人工費用、機械費用、材料費用、直接費用、間接費用、往來款項等。在實際會計核算過程中，企業應依據工程在完成年限、稅款、建筑面積（施工工作任務）等方面的不同，采取不同的核算方法，以總體成本核算為例，需要企業將開始建設到竣工結束所投入的全部資金費用進行核算，以準確反映項目資金的總體使用情況。
二、建筑施工企業會計核算的主要問題
1.會計核算不符合標準
目前，有相當一部分建筑施工企業的會計核算存在核算項目混亂、原始單據遺漏、批注使用不規范等問題，還有部分建筑施工企業未能在既定時間內進行資金結算，導致資金數據缺乏準確性，甚至出現壞賬、假賬、財務造假等嚴重問題。
2.成本控制不受到重視
建筑施工企業的會計核算人員通常只關注項目資金的管理和使用，其工作重心放在提高資金的流動性及使用效率等方面，對建筑成本控制缺乏考慮。另外，當前建筑企業普遍采用分層核算方式，而由于成本管理體系的不健全，加之企業內部權責機制的缺失，導致企業會計核算人員無法真實掌握施工細節及相關資金的使用情況，進而導致財務報表與真實情況的偏差，使企業蒙受巨大經濟損失。
3.會計核算監督力度小
一方面，企業內部監管制度缺失，相關監督工作未能發揮應用作用，導致企業會計核算的準確性和真實性缺乏保障；另一方面，企業外部監管制度執行不力，盡管國家有建筑相關法律法規來對企業的會計核算工作進行約束，但相關制度的執行力度不夠，未能發揮其會計核算監督作用。
4.會計核算人員素質低
目前，建筑施工行業的專業會計人才比較緊缺，企業會計部門的從業人員素質普遍較低，（再加上施工任務分散，會計人員流動性大）不能很好地滿足企業會計核算工作的需要，這不僅影響了企業會計核算的效率，也引發人們對建筑施工企業財務報表真實性的懷疑。
三、建筑施工企業會計核算方法的完善策略
1.革新會計核算理念
理念是行動的先導，要想提高建筑施工企業的會計核算水平，最重要的一點就是擺脫固有理念約束，引進現代會計核算管理理念，使企業從根本上認識到成本核算的重要性，進而有的放矢地推動企業會計核算的規范化，自覺規避會計核算中的各種問題。
2.加強核算人員培訓
企業要制定完善的會計人員培訓計劃，提高會計人員培訓力度，使之能夠滿足企業會計核算工作的需要。首先，企業可利用工作之余的時間，對會計人員進行專業會計知識的講解和培訓，提高會計人員實操水平。其次，應讓會計人員學習并了解會計制度、會計法規等方面的知識，提高會計人員的職業守法意識。再次，會計人員自身也要加強學習，不斷豐富自己的知識儲備，提高自己的工作能力。
3.健全會計核算體系
企業應嚴格遵循《會計法》有關要求，建立健全會計核算體系，為會計部門開展會計核算工作提供可靠依據。首先，企業應盡快設立會計核算中心財務核算系統，并明確規定會計核算人員的工作權限，對其財務行為進行有效約束。其次，企業要購置相應的信息設備，利用計算機技術服務財務核算工作，提高核算數據的真實性和時效性。另外，企業應建立完善的會計核算管理制度，明確會計核算的工作步驟和流程，并針對核算過程中易出現問題的環節制定相應的預防控制措施，及時完成核算信息的統一、整合工作，確保核算成果得到有效利用。
4.強化會計核算監督
首先，企業要建立健全內部監督體系，對會計核算人員的工作行為進行全面監管，使之嚴格按照工作章程來進行會計核算工作，提高核算數據的真實性與可靠性。其次，國家也要加大對建筑施工企業的監督管理力度，并針對建筑企業會計核算出臺專項法律法規，以實現對企業會計核算的宏觀監管和調控。對于在會計核算方面弄虛作假、違規操作的建筑施工企業，要根據相關法律追究其責任，以樹立法律的權威性，督促建筑企業自覺遵守會計核算相關法規。
核酸檢測方法范文3
關鍵詞：蔬菜；有機磷類；氨基甲酸酯；檢測
中圖分類號：S481 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20161033032
眾所周知，蔬菜生長存在農藥殘留，遭受著重金屬等不同類型的污染。為實現保產增產，在蔬菜生長時期必然會施加農藥。長期總結發現，農藥污染通常表現在下述層面：違規使用國家嚴令禁止高度農藥，私自使用非法的高殘留農藥；過度應用低毒農藥；不思量安全間隔期，普遍存在今天用藥，明天采摘的現象。現階段，有機磷、氨基甲酸酯類是產生農藥中毒的基本物質，且這2類農藥也是最為常用、生產規模大和出現中毒幾率較高農藥，它們是國家監控的主要目標。
1 有機磷類、氨基甲酸酯類的主要檢測方法
現階段，國家標準針對有機磷類與氨基甲酸酯類主要提出了氣相色譜和液相色譜檢測，如NY/761液相色譜、酶抑制有效檢測與氣相色譜/質譜等方法。
1.1 NY/761液相色譜
1.1.1 實驗儀器和材料
液相色譜儀-熒光檢測器、電子天平、氮吹儀等、水浴鍋等；大白菜等新鮮蔬菜，乙腈、二氯甲烷等；標準溶液與OPA溶液。
1.1.2 檢測步驟
確定色譜條件，對樣品進行處理，通過粉碎機粉碎，再勻漿處理，規范稱取適宜的量放至錐形瓶，進行勻漿操作，借助濾紙完成過濾，收集至具塞量筒內部，多次震蕩，再靜置，隨后加熱，凈化、比較定量與計算。
1.2 酶抑制有效檢測法
1.2.1 實驗試劑與主要儀器
甲拌磷、樂果與對硫磷等；農藥提取液和殘留速測卡。
1.2.2 檢測步驟
樣品檢測隨機抽樣，樣品質量為20g，借助剪刀剪出方形碎片，其大小為1cm，完全混勻；提取5g蔬菜碎片將其放置到帶蓋瓶，添加10ml浸提液，把提取瓶放置到超聲波提取器進行震蕩，大約震蕩30s，然后將其靜置2min；啟動INSTEK儀器電源，進行預熱；當儀器綠色指燈變亮后，將速測卡擺放至INSTEK儀器中；規范提取提取液，并在速測儀中滴入2滴左右的提取液；提取空白浸提液并滴入速測儀，大約2滴左右，進行對比；關合速測卡，對速測儀進行加熱，持續3min左右；打開速測卡，根據白色藥片進行判定。
標準溶液檢測分別規范稱取合理的農藥對照品，將其放置于10mL容量瓶內，經由農藥提取液進行溶解，同時，將其稀釋到特定刻度，以此來充當備用液，提取一定的儲備液，將其轉移到10mL容量瓶內，使其成為農藥標準液。依據上述步驟進行檢測，得到各種農藥對應的極限檢出限。
1.3 氣相色譜/質譜法
實驗試劑是無水硫酸鈉，二氯甲烷和丙酮，六氯苯，乙酸乙酯；所用儀器及設備是粉碎機、離心機與旋轉蒸發儀等不同設備；測定步驟：提取。規范稱取進行磨碎處理的蔬菜，將其放置100mL三角瓶，添加較多的無水硫酸鈉，進行攪拌，真正均勻后，將其靜置，添加適量的二氯甲烷和丙酮，輔以代用品，進行漩渦混合，超聲波提取，再進行離心操作，提取上層清液，多次重復，將獲得的清液進行混合，然后旋轉蒸發，最后氮吹濃縮；凈化和測定。制作活性炭小柱和乙酸乙酯柱，以供濃縮過柱，將流速控制在1mL/min，經由乙酸乙酯洗脫與其和正己烷混合液洗脫后，完全收集，將其儲存在刻度管，利用氮吹儀進行濃縮處理，添置內標六氯苯，再利用質譜儀進行測定；標準曲線與計算。將標準儲備液獨立稀釋到不同濃度，添置內標六氯苯，依據標準開展進樣分析，繪制標準曲線。明確色譜峰面積，清楚內標色譜峰的實際面積，參照峰面積比值，通過標準曲線獲得檢測結果。
2 不同檢測方式的比較討論
NY/761液相色譜是一種定量方法，檢測結果較為精準，但會消耗較長的時間，一般不會應用在快速檢測中。
酶抑制高效檢測中速測卡法具有一定的針對性和可行性，能夠圍繞有機磷、氨基甲酸酯類展開粗布篩選。速測卡法具有優良的靈敏性，且檢測高效，剖析研究一個樣品常常消耗10min左右。氣相色譜/質譜法具有定量可靠、靈敏性優良，重現性強等特點。不同的方法具有不同的優點，且適用條件也存在差別，應結合具體情境選擇適宜的方法。
3 結語
蔬菜作為膳食結構的基本組成，至關重要，不可或缺，經由合理檢測可掌握蔬菜當下的安全情況，全面控制，以免不達標蔬菜流入餐桌，提升飲食安全水平，促進監督執法工作的開展，保障食品安全。
核酸檢測方法范文4
艾滋病即獲得性免疫缺陷綜合癥，由感染“HIV”病毒引起。HIV是一種能攻擊人體免疫系統的病毒，它可以侵襲人的免疫體系，并終極損壞人體的免疫功效。隨著人體免疫力的下降，人會越來越頻繁地感染上各種致病微生物，而且感染的水平也會變得越來越來重，終極會因各種復合感染而導致逝死亡。艾滋病嚴重威脅人類的身心健康，當我們出現一些異樣的癥狀后，應該選擇什么樣的檢測方法，怎樣確診自己是否患有艾滋病就顯得格外重要。按規定的檢測程序對艾滋病的檢測方法研討如下。
1 材料和方法
1.1 材料：選取我院臨床初篩檢測病例72例，其中男性40例，女性32例。年齡28-63歲，平均39歲。
1.2 臨床癥狀：初期的開始癥狀像傷風、流感、全身疲勞無力、食欲減退、發熱、體重減少、隨著病情的加重，癥狀日見增多，如皮膚、粘膚出現白色念球菌感染，單純皰疹、帶狀皰疹、紫斑、血腫、血皰、滯血斑、皮膚容易損傷，傷后出血不止等。
1.3 方法：目前作為診斷手段使用的檢測主要包括抗HIV病毒抗體檢測、核酸檢測和抗原檢測。其中對病毒抗體的檢測是艾滋病初篩實驗室常規使用的方法
1.3.1 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）：目前應用的ELISA法有8種之多。它們的特異性和敏感性超過99%。在一些特殊情況下，當抗體檢測無法滿足HIV感染診斷的需要時，病毒分離及測定、核酸檢測、抗原檢測可作為輔助手段使用，這包括對非典型血清學反應樣品的診斷、HIV感染的窗口期診斷、新生兒早期診斷和對特殊樣品的診斷。
1.3.2 明膠顆粒凝集法（PA）：它是快速、簡便的一種篩選方法。PA的基本過程是先將樣品稀釋，然后分別加入經抗原致敏的和未致敏的明膠顆粒，混勻后保溫(一般為室溫)。當血清中有HIV抗體存在時，經抗原致敏的明膠顆粒與抗體發生抗原抗體反應，根據明膠顆粒在孔中的凝集情況判讀結果。PA操作簡便,無需特殊儀器設備,適合對少量標本的檢測。是對大量人群初篩實驗使用的方法，例公民義務獻血的初篩檢測。
1.3.3 免疫熒光試驗(IFA)：基本原理為應用H9或HUT78培養細胞作為載體，用HIV感染細胞,該細胞內就會含有HIV抗原,將HIV感染的淋巴細胞涂于玻片上固定，制備為抗原片，加入待檢血清，待檢血清中的抗 HIV抗體與抗原結合后，再與熒光素標記的抗人Ig結合，在熒光顯微鏡下可見到細胞內有黃綠色熒光。
1.3.4 免疫印跡試驗：主要用于確認試驗，基本原理是HIV全病毒抗原經過SDSPAGE電泳，將分子量大小不等的蛋白帶分離開來，然后再把這些已經分離的不同蛋白帶電轉移到硝酸纖維素膜上。將此膜切割成條狀，每一條硝酸纖維素膜上均含有經電泳分離過的HIV病毒抗原。將待檢血清樣品用稀釋液稀釋成1/100，再把它直接加到硝酸纖維素膜上，恒溫震蕩，使其充分接觸反應,血清中若含有抗HIV抗體，就會與膜條上的抗原帶相結合并呈現紫褐色。此確認實驗室是初篩陽性的標本送檢省疾控的HIV確認實驗室或市疾控的HIV中心實驗室進行的。
1.3.5 病毒核酸檢測：是通過檢測HIV RNA水平來反映病毒載量，具有很高的靈敏度，使用適時熒光聚合酶鏈反應(PCR)技術，能夠在HIV感染的前2周檢測到病毒核酸。病毒核酸檢測方法可用于HIV的早期診斷，如窗口期輔助診斷、病程監控、指導治療方案及療效測定、預測疾病進程等。目前常用的測定方法有逆轉錄PCR實驗(RT PCR)、核酸序列擴增實驗(NASBA)、分支DNA雜交實驗(bDNA)等。使用高靈敏度的適時熒光PCR技術，能夠在HIV感染的前2周檢測到病毒核酸。此種檢測是在HIV感染確診之后，判定使用抗病毒藥物的檢測指標，現在可有省疾控中心的艾滋病檢測實驗室完成。
2 結果
經過我院的檢測和分析后，14例送檢經確認實驗，未確診艾滋病感染。
3 討論
近年來，HIV檢測技術取得了很大進展，但是仍有不足的地方。例如ELISA法第四代試劑增加了P24抗原的檢測， p24抗原檢測能夠在病毒開始復制后檢測到血液中的可溶性p24抗原，但易出現假陽性。因此，陽性結果必須經中和試驗確認，該結果才可作為HIV感染的輔助診斷依據。還有病毒核酸檢測方法具有很高的靈敏度，對疾病進展的監測、抗病毒療效觀察和耐藥性監測非常重要。但是，由于HIV基因的多樣性，沒有一套引物可以覆蓋所有的HIV序列，使檢測的敏感性又受到限制。
HIV感染的診斷是艾滋病預防控制工作的重要組成部分，建立敏感實用的檢測方法對于監測、診斷或血液篩查，控制艾滋病的流行顯得尤為重要?？偨Y以上討論的檢測方法，我們得出的結論是，既要提高檢測的敏感性、特異性，縮短窗口期，又要簡便、快速和降低成本已成為HIV檢測技術發展的要求和方向，很多的研究正致力于尋找病毒檢測的替代技術。
參考文獻
[1] 曹韻貞我國艾滋病的現狀中國抗感染化療雜志 2002,2(2):65 66
核酸檢測方法范文5
本文綜合介紹迄今為止檢測DNA脫堿基位點的化學探針檢測方法，歸納總結DNA脫堿基位點在構建小分子檢測元件和生物傳感器等方面的應用，并作以展望。2DNA脫堿基位點的化學探針檢測法
大量脫堿基位點的檢測方法包括32P后標記法、LCMS、ELISA等方法被用于基因中脫堿基位點的檢測。32P后標記法具有靈敏度高、特異性好的優點，但也存在操作復雜且具有放射性的缺欠；LCMS結果準確、可靠，但對待測樣品的前處理要求高，且需要專業人員進行大型儀器操作等。相比之下，ELISA檢測法操作簡單，儀器價格低，但由于所用抗體對結構相似的物質一般有交叉反應，降低了檢測的特異性。20世紀90年代初發展起來的化學探針法某種原因，因為操作步驟簡單、特異性強，且靈敏度合適，成為目前脫堿基位點檢測的主要研究方法之一。
化學探針根據不同作用機理可分屬為共價反應型探針及非共價作用探針兩大類。共價反應探針，是利用化學反應將標記分子與脫堿基位點共價聯接的一類探針。例如脫堿基位點及其氧化衍生物結構中的醛基基團，能夠與氨基基團發生縮合反應，形成穩定的共價結構?；谶@個氨醛縮合反應，可合成一端具有氨基基團、另一端為標記基團的共價反應型探針分子，實現脫堿基位點的標記。非共價作用探針，是依靠探針與核酸分子之間的氫鍵、靜電引力、堿基堆積力等弱相互作用力，使探針分子能夠進入脫堿基位點，由此改變探針分子的物理信號（吸光度、熒光、電化學等），從而實現對脫堿基位點識別的探針類型。
基于以上檢測機理，一系列探針可歸結為共價反應型探針。如，對（4硝基芐基）羥胺上的羥胺基團能夠與脫堿基位點核糖殘基的醛基發生縮合反應，將硝基芐基基團共價標記在脫堿基位點上。標記上的對（硝基芐基）羥胺用5′磷酸脫氧核糖4硝基芐基羥胺的單克隆抗體來識別，實現對脫堿基位點的檢測，此方法可以檢測104個堿基對中出現的1個脫堿基位點，或10 fmol/L的脫堿基位點[15]。氨基玫瑰樹堿（9Aminoellipticine， 圖3a）[16]的氨基與脫氧核糖殘基的醛基縮合生成希夫堿，根據希夫堿的熒光信號，實現脫堿基位點的檢測。用14C甲氧胺滴定含有醛基型脫堿基位點的DNA，生成DNA14C甲氧胺復合物，檢測其放射性，實現對脫堿基位點的識別[17]?；贒NA甲氧胺復合物阻斷內切酶及聚合酶的作用，不用具有放射性的甲氧胺，也成功的檢測了脫堿基位點[18]。
目前廣泛用來檢測脫堿基位點的醛基反應探針ARP（Aldehyde reactive probe， 圖3d）[19，20]， 由生物素酰肼與對羧甲基羥胺在碳化二亞胺存在下反應生成對烷基羥胺衍生物，然后將生物素酰肼的聯氨轉換為羥胺而得到。ARP的羥胺與普通脫堿基位點的醛基進行縮合反應，將生物素共價標記在脫堿基位點。標記上的生物素利用生物素/親和素辣根過氧化物酶檢測，可檢測小牛胸腺DNA或噬菌體f1 DNA經過酸加熱處理產生的脫堿基位點，70～100 ng DNA樣品中可檢測出每104個堿基中的1個脫堿基位點。
2.2非共價作用探針
DNA互補堿基對之間形成的氫鍵作用力以及堿基與相鄰堿基間形成的堿基堆積力，是DNA雙螺旋結構穩定的重要因素。堿基脫落后形成的脫堿基位點使局部氫鍵作用力、堿基堆積力失衡，導致DNA局部結構甚至整體結構趨于不穩定，單個堿基缺失能夠降低DNA穩定性3～11 kcal/mol[29]。而小分子進入脫堿基位點形成的空腔后，能夠彌補這些弱相互作用力，從而利于DNA結構趨于穩定。非共價探針進入脫堿基位點空腔，參與分子間氫鍵、范德華力、靜電引力、堿基堆積力等非共價弱相互作用力，導致探針信號發生變化，實現脫堿基位點的檢測[30～32]。
C5呋喃環的嘧啶衍生物（圖4a）是檢測脫堿基位點的一種典型非共價熒光探針。使用C5呋喃環衍生物取代DNA序列中的正常堿基形成C5呋喃環衍生物修飾的DNA序列。此修飾序列與互補DNA序列互不配對形成雙螺旋結構時，C5呋喃環衍生物對面位置為腺嘌呤A時，其熒光信號被淬滅。而當互補堿基脫落成脫堿基位點，其熒光信號相比于對面為腺嘌呤時增強7倍，根據此熒光信號變化可檢測脫堿基位點[33，34]。
Buzzeo等[35]設計合成了具有電化學活性的非共價探針雷德蒙紅（圖4c）。當固定在金電極表面的DNA序列含有脫堿基位點時，雷德蒙紅進入空腔結構，參與堿基堆積作用，產生穩定、可逆的電流信號，明顯高于正常堿基的情況，從而實現了堿基脫落位點的檢測。在另一個工作中，他們合成的金屬銠配合物Rh（bpy）2（chrysi）3+（圖4b） 能夠進入脫堿基位點，并在光催化作用下切斷DNA骨架?；谶@一發現，并利用核酸的常規生物學檢測方法，實現了Rh（bpy）2（chrysi）3+金屬嵌入劑對脫堿基位點及單堿基凸起微摩爾級的檢測[36，37]。
核黃素等是一類本身具有熒光的生物小分子，與含有脫堿基位點的雙鏈DNA結合后，熒光信號發生變化。當脫堿基位點對面為胸腺嘧啶且鄰位為鳥嘌呤時，構建的23 nt 雙鏈DNA實現了對核黃素的特異性檢測，核黃素與核酸的結合常數達到5.3×105 L/mol，而對黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）及僅相差1個磷酸根的黃素單核苷酸（FMN）的結合能力分別為0.25×105 L/mol及0.21×105 L/mol，與SELEX技術篩選得到的RNA適配體具有相當的識別能力[40，41]。
對于本身不具備熒光特征的靶分子，可以在雙鏈DNA脫堿基位點的附近引入熒光基團。靶分子進入脫堿基位點空腔后，與相鄰的堿基和熒光基團發生相互作用，改變熒光基團的光學性質。如在脫堿基位點的鄰位引入熒光性堿基類似物2氨基嘌呤（圖5），構建茶堿的識別元件。茶堿進入脫堿基位點后，既與對面的堿基形成氫鍵，又與鄰位2氨基嘌呤發生堿基堆積作用，使其熒光信號下降。這種熒光標記的含脫堿基位點雙鏈DNA識別元件，與茶堿結合的解離常數為10 μmol/L，且在同樣反應條件下對咖啡因（與茶堿僅在N7位相差1個甲基）無響應，與SELEX技術篩選得到的RNA適配體具有相當的識別能力[43]。
利用含有脫堿基位點的DNA構建核酸適配體傳感器的基本思路為：將待測靶分子的核酸適配體經過剪切后延長（圖6 A）、直接延長或設計一段部分互補序列（圖6 B），延長部分或部分互補的DNA序列中含有脫堿基位點[45]。如利用以上方法構建的腺苷適配體傳感器，對腺苷的檢出限為μmol/L級[46]：將腺苷的完整核酸適配體剪切為兩段序列，各自含有腺苷結合位點的部分堿基，在其中一段序列的延長位置引入脫堿基位點。在沒有腺苷分子存在的情況下，兩段序列幾乎不能形成穩定的二級結構，因此脫堿基位點對熒光信號分子幾乎沒有結合能力，熒光信號分子沒有完整的結合位點而游離在溶液中，表現出游離分子的熒光特性。當腺苷分子存在時，腺苷分子與兩段序列中的位點結合，同時使部分互補堿基形成穩定的雙螺旋結構，脫堿基位點在雙螺旋結構內形成疏水空腔，熒光分子進入脫堿基位點而產生熒光信號變化，從而將適配體與腺苷的作用直接轉換成熒光信號改變，能夠檢測1 μmol/L的腺苷。
對腺苷適配體進行直接延長或設計一小段部分互補序列（圖6 B），序列中含有脫堿基位點，使直接延長的部分或者部分互補序列在沒有腺苷存在情況下，與核酸適配體上的某一段序列形成互補配對，互補配對的螺旋結構中脫堿基位點形成空腔結合熒光信號分子，產生初始熒光信號。當溶液中存在腺苷分子時，由于核酸適配體與腺苷分子的結合能力高于核酸適配體與互補單鏈核酸之間的結合能力，互補配對的螺旋結構解旋，含有脫堿基位點的互補序列脫落或游離于結合位之外，脫堿基位點不形成穩定空腔結構，信號分子被釋放到溶液中，產生熒光信號變化，從而將適配體與靶分子的相互作用轉換為熒光信號的變化[47，48]，此傳感器對腺苷檢出限為2 μmol/L。
3.3對SNP的檢測
4發展與展望
堿基脫落是一種常見的DNA損傷，無法修復的脫堿基位點可能會導致DNA轉錄復制的終止或堿基突變、變異，最終會造成機體的癌變、畸變、甚至死亡。脫堿基位點的檢測方法的發展趨勢以操作簡單、快速、實時、安全為目標，同時保證高靈敏度和高特異性。根據不同的脫堿基位點結構，研究人員已經設計合成了相應的共價反應性化學探針，這些探針顯示了非常好的特異性和較高的檢測靈敏度，一般可以檢測出104～105個正常堿基中1個脫堿基位點的存在，是極具潛力的檢測方法。
核酸檢測方法范文6
關鍵詞：PCR；食品安全；食品微生物；檢測
0引言
現代食品行業,有很多有害的微生物嚴重危害食品的品質與人們的健康,甚至會引起一些嚴重的疾病。而隨著經濟的迅速發展,對各類食品的需求也日益增大,因有害微生物引起的各類食物中毒事件也逐漸增多。然而,使用傳統的檢測方法即非選擇性與選擇性增菌、生長法及血清學鑒定雖然比較準確,但費力、耗時,一般需4～7 d才能完成。
此外,低水平的病原菌污染,食品加工后導致菌體的“致傷”及食品其它成分的干擾等因素,使得傳統的檢測方法受到了一定的限制。因此,急需一些快速、特異、敏感的檢測方法,以及時發現致病菌,控制污染及其可能對人體健康產生的危害。
分子生物學技術的發展使得許多食品工作者得以尋求更為快速有效的方法來檢測病原菌,以期增加敏感性與顯著地減少檢測時間。其中, PCR技術是比較有效,也是應用得最為廣泛的一種檢測方法之一。
1 多聚酶鏈式反應(polymerasechainreaction)PCR技術
PCR技術是由Kleppe等人在1971年首先提出的,即多聚酶鏈式反應(polymerasechainreaction,PCR),在食品中微生物的檢測中發揮著重要作用。自從1985年成為基因工程中重要技術的同時,也為微生物的鑒定分析提供了新的快捷方法。目前美國、加拿大、日本與我國的科研工作者都將致力于PCR技術應用于啤酒等食品中微生物的檢測。
1.1 PCR技術檢測微生物的原理
PCR技術檢測微生物的基本原理是在被檢測微生物核酸序列,在PCR體系下經高溫變性、低溫退火、適溫延伸三步循環將單個核酸分子序列以二的指數進行大量復制擴增的過程。即在檢測時,被檢測微生物雙鏈DNA序列在94℃變性解鏈成雙鏈,55℃特異性引物與單鏈DNA結合,72℃在引物的引導延伸復制檢測微生物DNA序列。
以上三步進行循環擴增得到大量的被檢測微生物DNA序列,最后一般在凝膠電泳下檢測目的DNA。理論上只要樣品中有一個分子的微生物就可以在短時間內用PCR技術檢測到。
1.2 PCR技術檢測食品微生物的優點
1.2.1方便性
操作煩瑣,自動化程度不高是傳統檢測方法的一大缺點。傳統的檢測方法往往需要花費大量的人工來實現。適合不同微生物生長的培養基以及不同微生物適宜生長的pH、溫度等都需要花費一定的人力與時間,觀察菌落特征、細胞特征、革蘭氏染色以及生理生化鑒定等步驟煩瑣。
因此,落后的檢測方法與高自動化的現代企業形成鮮明的對比,極大地限制了現代化食品企業的發展。而PCR技術檢測食品微生物操作簡單、方便,僅用一人就能完成檢測,具有極大的方便性。
1.2.2快捷性
傳統的檢測方法最大的缺點就是檢測需要時間長,一般的腐敗菌檢測至少需要2到5天,甚至7天以上。檢驗結果出來時往往產品已經流向市場,對實際生產具有嚴重的滯后性。而PCR技術檢測食品微生物能在一天之內檢測出結果,甚至在幾個小時就檢測出結果,對食品工業生產具有很好的指導作用。
1.2.3準確性
食品中污染微生物種類很多,即使是同一種食品中微生物種類也有很多,用傳統的方法檢測食品中微生物要分離出所有的微生物很困難。特別是在檢測食品中的弱勢菌時,可能很難用傳統的方法檢測出來,特別是有些微生物很難培養,而用PCR技術檢測這些微生物可以避免這些問題,因此,利用PCR技術能夠比較準確地檢測食品中微生物。
2 PCR技術的發展
2.1普通PCR
隨著科學技術發展,PCR技術也在逐步優化與簡化其程序,如先進PCR儀,食品樣品中微生物檢測的PCR模板制取的簡化(如超聲波破碎法、反復凍融法等),使得PCR技術更加方便、準確。普通PCR技術發展而衍生出許多特殊的PCR檢測技術,如PAPD-PCR、Nested-PCR等等。
加拿大LABATT公司的研究人員已經將PAPD-PCR技術運用到鑒別啤酒腐敗細菌的種與亞種,Nest-PCR技術檢測啤酒腐敗菌能提高檢測效率。
2.2定量PCR
隨著科技的發展,檢測也從定性檢測發展到定量檢測。即檢測從有沒有到有多少。特別是一些高致病性微生物的檢測,有很少的細胞足以使人致病;在科學研究上致力于食品微生物細胞的數量對致病性的嚴重程度影響的研究。
2.2.1實時定量PCR
實時熒光定量PCR是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。此定量方法的應用基礎是TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性及雙標記熒光探針的發現,它融合了PCR及DNA探針雜交的優點,能直接檢測PCR擴增過程中信號的變化,可對核酸進行相對及絕對定量。實時定量PCR較傳統的PCR定量方法具有以下優點:
①敏感度高,僅需要極微量的模板。②閉管檢測,不需要擴增后分析,減少了產物后分析的污染。③操作簡單,反應快速且重復性好?；趯崟r定量PCR的廣泛應用,介紹一下分子信標原理。
分子信標(molecularbeacon)技術是一種呈發夾結構的莖環雙標記寡核苷酸探針,兩端的核酸序列互補配對,因此標記在一端的熒光基團與標記在另一端的猝滅基團緊緊靠近(圖1),熒光基團被激發后產生的光子被猝滅基團猝滅。分子信標的莖環結構中,環一般為15～30bp,且與目標序列互補。
莖一般5～7bp,相互配對形成莖的結構。熒光基團標記在探針的5′端,而猝滅基團則標記在3′端。在復性溫度下,模板不存在時形成莖環結構,如果有模板存在,加熱變性時莖環雙鏈解開的環序列將與模板配對,分子信標將成鏈狀而非發夾狀,使得熒光基團與猝滅劑分開。
當熒光基團被激發時,因猝滅作用被解除而發出熒光。由于酶切作用的存在,分子信標檢測的也是熒光積累。熒光強度與溶液中模板的量成正比,因此可用于PCR定量分析。常用的熒光基團有FAM、Texas、Red。
根據分子信標的原理,Invitrogen公司設計了LUX(lightuponextention)引物。引物對中的一個引物3′端用熒光報告基團標記,在沒有單鏈模板的情況下,該引物自身配對,形成發夾結構,使熒光猝滅。在模板存在的情況下,引物與模板配對,發夾結構打開,產生熒光信號。
使用LUX引物進行實時PCR擴增,不需要專門設計探針,既節省了成本又給實驗設計提供了寬松的條件。由于沒有探針控制特異性,因此它的特異性要弱于探針技術,但非特異性擴增或引物二聚體沒有影響,所以其特異性要強于SYBRGreenI。
2.2.2競爭定量PCR
競爭PCR是目前用于分子水平檢測的最有效的核酸定量方法,原理是在樣品中同時擴增兩種相似模板,它們競爭同一對引物、酶及三磷酸脫氧核糖(deoxy2ribonucleosidetriphosphate,dNTP),且以相同效率擴增,產物的比率準確地反映兩種模板初始濃度之比。
根據競爭模板的來源分為外源性與內源性競爭模板。外源性競爭模板可分為RNA與DNA競爭模板。RNA競爭模板是提取組織的總RNA,反轉錄后再引入外源性核苷酸片段或將待測模板缺失掉一段核酸片段,使之與待測模板有相同的引物識別序列、相同的酶切位點及長度相近的重組體。
DNA競爭模板最大的優點是準確性強,操作簡便,節約時間,應用范圍廣,可省去酶切、連接與誘變等步驟。內源性競爭模板一般地用持家基因如β-微球蛋白等作為基因表達定量的內標準,但受到以下因素的限制:
①內源性mRNA必須與目的mRNA的含量相近,否則擴增動力學與指數擴增期不一致;
②因二者mRNA的序列大小與二級結構存在的差異造成了逆轉錄效率可能不一致;
③兩者在不同的引物下擴增,若擴增效率有細微的差別,將會極大地影響PCR產物量,使定量差異較大;
④內源性mRNA在組織細胞中的表達量不總是恒定的,因此內源性基因模板很難對目的mRNA進行精確定量。
3 PCR技術檢測食品微生物中應注意的問題
PCR技術在食品檢測的實際應用中表現出靈敏度高、速度快、特異性強、簡便、高效等特點,為食品檢測技術的發展提供了有力的技術支持。
但是,PCR技術在實際應用中也表現出一些缺陷,例如容易出現假陽性、假陰性、產物容易突變、不能檢測致毒微生物產生的毒素等。由于食品樣品的特殊性與PCR技術的特點,在檢測過程中應注意以下幾點。
3.1 PCR模板的制備
不論是在提取微生物的核酸,還是直接處理食品樣品,模板的制備都很重要,特別是直接處理樣品時,食品中有很多PCR抑制因子,要盡可能地除去(包括DNA提取時蛋白與有機溶劑等的去除),這一步的好壞直接影響最終檢測結果。
3.2 污染問題
PCR極易被污染,為避免PCR的污染問題,操作要規范,勤換槍頭。
4 展望PCR技術在檢測食品微生物中的應用
食品在生產、運輸、銷售過程中很容易受到微生物的污染,所以微生物檢測是食品檢驗中的一項重要內容。
隨著生物技術的飛速發展與各項新技術與PCR技術的有機結合,以及今后專門針對如何控制外源DNA的污染、如何控制突變與如何利用PCR技術鑒別致毒微生物產生的毒素等方面的深入研究,必將為PCR技術在食品檢測領域更加廣泛的應用提供新的思路。
總之,隨著國內外快速檢測技術的發展,用PCR技術檢測食品微生物已把食品微生物檢測技術帶入一個新階段。
無論是檢測中心還是企業,科研單位,在選用微生物的快速檢測方法時,應該考慮到方法的預期目標的精確性、檢測時間、經濟性、可接受性、操作簡便性、技術服務等因素。這需要具備完善的科研管理體系,由各種層次專業人員組成的技術隊伍,相當先進的儀器設備配置與相應科研資金投入,以及對國外先進技術與信息的掌握。
5結語
由于其快速、特異、敏感的特點, PCR技術作為一種檢測手段仍有巨大的應用價值。食品安全檢測中一個十分重要的內容是及時準確地檢測出食品中的病原微生物。傳統的微生物檢測方法雖然有效且特異性高,但存在檢測成本高、速度慢、效率低等問題,難以滿足現代社會快速檢測的要求,并且由于傳統的微生物檢測方法基本上都需要對病原菌進行人工培養,對一些生長緩慢或是新的病原菌就難以用傳統方法進行檢測。
而PCR技術等現代生物學技術應用于食品微生物檢測,可以克服傳統食品安全檢測方法的缺點與不足,而且還具有靈敏度高、操作簡便、檢測周期短、檢測成本低等優點。相信隨著PCR技術的進一步完善,將是今后食品微生物檢測技術的一個重要研究方向,若能克服所存在的問題,相信大規模推廣應用指日可待。
參考文獻:
