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摘要：基于網絡藥理學和分子對接篩選辨識白及五味子顆粒中保胃護肝的功效成分及作用機制，并利用HPLC-DAD建立含量測定方法。該研究遵循多個功效成分共同測定取代總成分測定以提升保健食品質量控制總體思路，采用網絡藥理學的方法對功效成分進行篩選?；赥CMSP、GEO和Genecards等數據庫共收集白及五味子顆粒的59個目標成分和74個疾病與成分的共同作用靶點，采用PPI平臺及“成分-靶點-疾病”網絡篩選得到包括AKT1、JUN等11個核心靶點與橙皮苷、芒柄花素、川陳皮素、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素共6個功效成分。通過對共同作用靶點進行GO和KEGG富集分析可知，白及五味子顆粒保胃護肝功能的發揮涉及對化學應激的反應，類固醇代謝過程，對酒精的反應，脂質和動脈粥樣硬化通路，IL-17信號通路等關于脂質代謝、氧化應激和炎癥反應的通路。提示了白及五味子顆粒發揮保胃護肝功能是通過多成分、多靶點、多通路的協同作用實現的。對篩選得到的功效成分與核心靶點的結合能力進行預測分析，結果顯示，所有成分均與核心靶點結合情況良好，結合活性綜合排名前3位分別是橙皮苷、五味子醇甲與五味子甲素。此外，對功效成分建立含量測定方法完成對白及五味子顆粒中功效成分的含量測定。該研究結果為保健食品白及五味子顆粒中保胃護肝功效成分的發現和作用機制的闡明提供了思路，建立的功效成分含量測定方法準確、穩定，為實際生產中質量控制環節提供參考。
關鍵詞：保健食品；功效成分；白及；網絡藥理學；分子對接
中藥類保健食品是我國保健食品的重要組成部分，其原料主要來源于“藥食同源”類中藥，具有食品屬性。原料中藥的成分復雜多樣及多功能活性給中藥類保健食品質量的有效控制帶來了巨大挑戰[1]。中藥類保健食品的質量控制現多借鑒中藥復方質量控制方法體系和思路。但鑒于其食品屬性，在質量控制上的關注點應著重于其功能相關的成分以保證核心功能的有效性。若對產品中大多數或全部功效成分進行監測控制，在實際生產中又存在檢測難度大，成本高等問題。通過對少量特征性強、功能明確的成分進行檢測和評價，可規避現有許多保健食品僅以總黃酮、總皂苷等總成分含量作為代表評價，從而造成產品質量不穩定的現象[2-3]。為了保證保健食品的功效，亟需建立一套穩定、適用于生產且符合產品自身功能等特點的質量控制體系。通過對多個功效成分整體的控制可以在保證質量標準在實際生產中可行性的基礎上，更全面地監控產品質量。網絡藥理學是近年來常應用于中藥及中藥復方研究中的一個探究核心成分與功能的方法，可通過對“成分-靶點-疾病”網絡的多層次網絡聯系完成對中藥藥效物質基礎及機制探尋[4]。分子對接通過聯系成分和作用靶點，建立其相互作用關系，廣泛應用于藥物發現與評價領域，是對“成分-靶點-疾病”網絡預測結果的一種驗證方式[5]。白及五味子顆粒是由白及、黃芪、五味子和陳皮組成的一個具有保胃護肝雙功能的一個中藥類保健食品。本研究以白及五味子顆粒為例，從網絡藥理學的角度切入，篩選得到白及五味子顆粒功效成分和其保胃護肝核心靶點，并利用分子對接的方法進行驗證，建立多成分含量測定方法。研究白及五味子顆粒中具有保胃護肝雙功能的功效成分，探索中藥類保健食品功效成分辨別和功能機制闡述的新途徑，為白及五味子顆粒與中藥類保健食品的質量控制提供思路。
1材料與方法
1.1儀器與資料
AcchormS6000高效液相色譜儀，配備在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器，華譜科儀；BT25S十萬分之一電子天平，北京賽多利斯科學儀器有限公司；KQ-250DE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。
1.2試劑與材料
白及五味子顆粒中所用藥材白及（批號：201001）、黃芪（批號：190801）、五味子（批號：191001）和陳皮（批號：200901），均由禹州市凱旋藥業有限公司提供。橙皮苷對照品（批號110721-202019，質量分數≥98%）、五味子醇甲對照品（批號110857-201815，質量分數≥98%）、五味子甲素對照品（批號110764-201915，質量分數≥98%）、五味子乙素對照品（批號110765-201813，質量分數≥98%），購自中國食品藥品檢定研究院；川陳皮素對照品（批號AF20032911，質量分數≥98%）、芒柄花素對照品（批號AF20052952，質量分數≥98%），購自成都埃法生物科技有限公司。乙腈為色譜級，美國FisherScientific公司；其余試劑均為分析純。水為娃哈哈水（批號：20210820），杭州娃哈哈集團有限公司。
1.3網絡藥理學分析
1.3.1白及五味子顆粒目標成分和疾病作用靶點相關數據集的建立。以“gastricmucosainjury”和“liverdisease”為關鍵詞、實驗以人源作為樣本對胃黏膜損傷和肝損傷的條件在GEO數據庫和Genecards數據庫中對疾病作用靶點進行搜集。使用R進行數據處理獲取正常組與患病組差異表達基因。對GEO和Genecards數據庫的靶點信息取并集，去重后得到疾病基因靶點并建立肝損傷和胃黏膜損傷疾病作用靶點數據集。利用中藥系統藥理學平臺TCMSP數據庫檢索白及五味子顆粒中黃芪、白及、五味子和陳皮的成分，并將藥動學參數中的口服生物利用度（oralbioavailability,OB）≥30%和類藥性（drug-likeness,DL）≥0.18作為篩選條件。數據集的建立還參考并查找國內外文獻中記錄的具有活性且未包含在數據庫內的成分，得到符合條件的目標成分，形成白及五味子顆粒目標成分數據集。通過檢索TCMSP數據庫和Drugbank數據庫對成分對應靶點進行注釋，得到目標成分作用靶點數據集。1.3.2功效成分與共同作用靶點的獲取。對疾病作用靶點及目標成分作用靶點信息進行韋恩圖分析，取交集后，得到白及五味子顆粒發揮保胃護肝功效的共同作用靶點。利用PPI網絡對上述靶點進行篩選，將其信息導入STRING數據庫，設置物種為人（homosapines），獲取靶點蛋白的最高置信度＞0.9的交互作用關系。根據STRING數據庫獲得蛋白互作關系，在Cytoscape3.8.2軟件中構建靶點蛋白的交互作用（PPI）網絡。使用“cytoHubba”和“CytoNCA”插件進行分析，并根據度值（Degree）、中介中心性（betweennesscentrality，BC）、接近中心性（closenesscentrality，CC）等信息篩選核心靶點[6]。Degree值、BC值和CC值進行分析、排序。
