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作者：吳曉燕 張光一 單位：河北省產品質量監督檢驗院 河北經貿大學生物科學與工程學院
各種質粒為本研究室保存，質粒在大腸桿菌中選擇標記為氨芐青霉素抗性（Amp）r。酵母自主表達質粒pUT332攜帶腐草霉素抗性基因[4]。所用酵母在30℃培養，在4℃麥汁斜面保存。培養基LA培養基：大腸桿菌生長培養基LB（0．5％酵母粉、1%蛋白胨、1%氯化鈉），根據需要添加氨芐青霉素（濃度為50μg/mL），用于質粒擴增。酵母生長復合培養基（YEPD）：1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖，瓊脂2%。YNB培養基:YNB6.7g/L，葡萄糖2%。含腐草霉素250μg/mL，用于酵母菌轉化子篩選。酶和試劑限制性內切酶、PfuDNA聚合酶、T4DNA連接酶為寶生物工程（大連）有限公司產品。小牛胸腺DNA及其它分子生物學試劑為Sigma公司產品。引物由上海生工生物技術服務有限公司合成。
儀器RS-1型渦旋振蕩器：北京鼎昊源科技有限公司；GenePulserTM電轉儀：美國Bio-rad公司；Mini-BeadBeater-1小型珠磨式組織研磨器：美國BioSpec公司；BLBIO-5GJ發酵罐：德國B.Braun生物技術公司；惠普-1100型高效液相色譜儀、HP5890氣相色譜儀：美國Agilent公司。細胞破碎液制備[5]3000r/min離心5min收集1×109細胞，首先用pH7的100mmol/L的KH2PO4洗，然后用pH7的10mmol/L的KH2PO4洗。取100mg（濕重）酵母細胞加1g直徑0.5mm玻璃珠、0.5mLpH7的50mmol/L的KH2PO4（含1mmol/LMDDT和2mmol/LMgCl2）的混合液洗。試管在渦旋振蕩器中振蕩1min，冰浴1min，重復5次。然后13000r/min離心1min，收集上清液。
目的基因PCR根據GenBank（accessionnumberZ81318）報導的瑞士乳桿菌（Lactobacillushelveticus）的乳酸脫氫酶基因L-LDH基因序列設計引物。引物1：5'-gcggatccaggagatttattgtt-3'，引物2：5'-ctggtaccgaaaagagatgctc-3'。其5'端有BamHI酶切位點，3'端有KpnI酶切位點。按下面條件PCR，獲得L-乳酸脫氫酶基因，大小1kb。根據GenBank（accessionnumberX04675）報導的釀酒酵母基因組丙酮酸脫羧酶基因為模板設計引物。編碼序列上游序列3：5'-atatatgaattcgcgtttatttacctatctt-3',4：5'-atatatggatcctttgattgatttgactgtg-3',其5'端有EcoRI酶切位點，3'端有BamHI酶切位點。編碼序列的下游序列5：5'-atataggtcgacttgaacgtcccagctaagttg-3',6：5'-atatattctagactcgtcagcaatagtggtcaac-3'，其5'端有SalI酶切位點，3'端有XbaI酶切位點。按下列條件進行PCR，獲得丙酮酸脫羧酶1的部分啟動子序列和編碼序列的下游序列。PCR體系組成（50μL）：模板1μL；E.Master酶混合物25μL；引物2μL×2；重蒸水加至50μL。
酵母轉化酵母細胞經10mLYEPD培養基30℃過夜培養，然后轉接500mLYEPD培養液（2L三角瓶）搖床培養至OD600=1.3~1.5。4℃，4000r/min收集細胞重懸于80mL重蒸無菌水，添加10mLpH7.5的10×TE緩沖液、10mL1mol/LLiAc，30℃低速振蕩45min；再加2.5mL新配制的1mol/L的DTT，溫浴15min。酵母懸液用重蒸水稀釋至500mL，洗3次。細胞重懸于250mL冰冷的重蒸水，再懸于30mL冰冷的1mol/L山梨醇。收集細胞并重懸于0.5mL冰冷的1mol/L山梨醇中，調節細胞懸液OD600=200。向1.5mL離心管添加40μL細胞，5μLDNA（線性DNA：質粒DNA=10∶1，最好是50ngpUT332）。細胞-DNA混合物轉入帶帽的0.2cm冰浴電轉移管進行電脈沖處理（1.5kV，25mFand200ohms），然后立即加入1mL冰冷的YEPD培養基，30℃輕微振動2h~4h。取250μL涂含腐草霉素的轉化平板，30℃培養3d~4d。
適應進化實驗保藏菌株涂基本培養基平板，選單菌落接種5mL液體試管，30℃搖床（40r/min）培養過夜，然后轉接250mL三角瓶，其工作量50mL，30℃40r/min搖床培養3d。轉接培養7d。培養細胞重復上面步驟，碳源或鹽濃度增加。培養介質定期更新（3.5d更新一次），共12次。培養液葡萄糖濃度為20%~30%。碳酸鈉濃度為3%~5%。培養40多天后，取5mL轉接50mL培養液培養，再轉接1.0LYNB介質，（含葡萄糖300g/L或碳酸鈉5g/L，發酵1d。培養物涂平板，挑單菌落依次轉接如上5mL、50mL、1.0LYNB介質（含葡萄糖300g/L或碳酸鈉50g/L），發酵16h。第3次重復上述步驟發酵13h。最后收集細胞涂平板。用乳酸調節發酵液的pH<4.6。篩選生長旺盛的適應菌株。
乳酸脫氫酶測定YEPD培養基培養，將對數生長期的細胞（OD600=0.8）轉至含0.9mol/LNaCl的YEPD培養基，30℃培養2h。離心收集細胞，用等滲鹽溶液洗2次，置于沸騰的乳酸脫氫酶LDH提取緩沖液（0.1mol/LMops，pH7.2，10%甘油,1mmol/L二硫蘇糖醇），然后酵母用小型珠磨式組織研磨器破碎細胞，添加0.5-mmzirconia-silica珠，然后4℃13000r/min離心15min除去細胞碎片，上清液用于乳酸脫氫酶活性測定。在磷酸緩沖液（73mmol/LKH2PO4，3.5mmol/LNa2HPO4，pH5.6）添加1mmol/L丙酮酸和0.2mmol/LNADH，25℃分光光度法測定乳酸脫氫酶活性。酶活性定義為在反應條件下，1min將1mmol/L底物還原為乳酸所需的酶量。蛋白質含量用考馬斯亮藍染色法測定，以牛血清蛋白作為測定參照標準。
發酵實驗儲存菌株培養物2mL接種250mL三角瓶（100mLYEPD培養介質），30℃150r/min搖瓶培養至平衡期作為種子培養物。發酵采用合成培養基，發酵罐裝有3L培養介質，121℃滅菌40min。發酵罐接種量為1.0×107個/mL~1.5×107個/mL，轉速650r/min?？刂仆饬?.5L/min，發酵溫度控制在30℃。如果需要可用10%無菌氨水控制。發酵6d，每天取樣測定發酵液的pH、細胞生物量、糖消耗量、乙醇含量和乳酸含量。
分析方法乳酸、殘糖用高效液相色譜HPX-87H（300mm×7.8mm）Aminex色譜柱（Bio-Rad）或DNS法測定。用NucLeosiL5C-18100A柱。流動相為重蒸水，流速1mL/min。5mmol/LH2SO4作為洗脫液，流速0.5mL/min。乳酸的光學純度用惠普-1100型高效液相色譜儀測定。HypersilODS（C18）色譜柱（150mm×2.1mmi.d，5μm）；流動相：0.65mmol/L2，3，6三甲基β環糊精（TM－β－CD，含5mmol/LH2SO4），pH2．5；流速：0．5mL/min；紫外檢測波長：210nm；進樣量：5μL；柱溫：室溫。乙醇用氣相色譜測定，采用火焰離子化檢測器。取1μL注入HP5890氣相色譜儀，配備DBWAX大孔柱。載氣為氮氣，流速為10mL/min。加樣和檢測溫度分別為240、250℃。爐溫：80℃保持2min，然后升至200℃，升溫速度10℃/min。#p#分頁標題#e#
乳酸脫氫酶基因LDH獲得將乳酸脫氫酶基因LDH基因引入釀酒酵母，使其可以用另一代謝途徑再生NAD+，糖酵解轉向乳酸生成途徑，使胞內丙酮酸直接還原為乳酸，導致乙醇和乳酸同時積累。已經證明[6]：瑞士乳桿菌（L.helveticus）乳酸脫氫酶基因LDH可以與酵母的丙酮酸脫羧酶競爭使乙醇生產方向轉至乳酸生產方向。故本研究以瑞士乳桿菌基因組為模板，進行PCR獲得乳酸脫氫酶基因。乳酸脫氫酶基因嵌合片段構建將PCR獲得的丙酮酸脫羧酶基因的5'插入pBluescriptM13-的EcoRI/BamHI位點,然后再將3'片段插入SalI/XbaI位點。重組載體1經BamHI+SalI酶切，與將L.helveticus的L-LDH/BamHI+KpnI基因和乙醇脫氫酶下游3'基因片段/KpnI+SalI一同連接，獲得攜帶5'PDC1+LDH+ADH1T+3'PDC1基因片段的重組載體2。用AatII+XbaI酶切獲得該嵌合片段如圖1，大小約為2.9kb。
電轉化及整合驗證通過電轉化法將整合片段與酵母自主表達質粒pUT332轉化工業釀酒酵母菌,在含150μg/mL腐草霉素的YEPD培養基上篩選陽性轉化子。提取轉化子基因組進行PCR驗證，如圖2，以乳酸脫氫酶基因LDH上游引物和PDC1終止序列的下游引物為引物，獲得基因片段為2.1kb。表明乳酸脫氫酶基因整合在酵母的基因組上，并破壞丙酮酸脫羧酶1基因。轉化子的篩選標記丟失培養對目標轉化子進行YEPD非選擇性培養數代，選擇腐草霉素抗性丟失的菌株進一步研究。轉化子初步生長研究對轉化子進行細胞生長及初步發酵性能測試，轉化子30℃培養72h，接種量為10%。測定L-乳酸產生量最高為48.9g/L，見圖3。
轉化子適應進化研究發現，在高滲透脅迫條件下，酵母細胞通過激活不同的機理合成一些代謝產物并在胞內積累滯留，達到適應存活[5]。酵母細胞中pH越高，生存能力越強，乳酸產量越高。本研究采用高滲脅迫適應和低pH適應相結合的篩選策略。首先采用高糖/高鹽作為選擇條件誘導菌株發生遺傳改變獲得突變子庫。用30%葡萄糖及5%的碳酸鈉的合成基本培養基進行適應篩選（40r/min搖瓶培養），使獲得的重組菌株產生抗脅迫能力，并經連續傳代培養28d（約200代）的系列轉移-稀釋策略，篩選生長旺盛的適應菌株60個；然后用低pH4.5的合成培養介質（用乳酸調節發酵液的pH<4.5）進一步適應培養，篩選生長旺盛的適應菌株30個。最后，篩選生長旺盛、胞內pH高、乳酸產量高的菌株3個。
發酵介質組成優化對糖蜜、玉米黃漿水、尿素比例進行研究，采用三因素四水平，按正交表L（934）設計正交試驗，30℃250mL三角瓶（裝瓶量100mL）搖床培養48h，確定培養基最佳組成。優化培養基組成（g/L）：糖蜜總糖120；玉米黃漿水1000；K2HPO46。發酵條件研究1）以菌體接種量、培養基初始pH、培養時間，按正交表L（934）設計正交試驗，250mL三角瓶裝有100mL培養介質30℃200r/min搖瓶培養，測定乳酸生成量，確定最適初始發酵介質pH5.0，接種量1.3cells/mL×107cells/mL，培養5d。2）采用5-L發酵罐（BIOSTAT-B,B.Braun,Germany），介質填充量3L，發酵介質初始pH5.0，接種量1.3×107cells/mL?？刂迫苎?0%~50%，攪拌速度300r/min~1000r/min，發酵溫度30℃，發酵6d。每天取樣測定發酵液的pH、細胞生物量、糖消耗量、乙醇含量和乳酸含量。確定最佳發酵條件：發酵介質初始pH5.0，接種量1.3×107個/mL，發酵溫度30℃，溶氧30%，攪拌速度650r/min，發酵時間4d。最終得率：乳酸52.2g/L，乙醇45.8g/L；49.2%的糖轉化為乳酸，乙醇產生量降低到原來的46.8%。
聚L-乳酸作為一種非常有吸引力的熱塑性無毒高分子材料，生物相容性好，易與市政環衛管理處理體系結合，沒有白色污染，滿足社會可持續發展要求。本課題獲得高效表達L-乳酸的酵母適應工程菌，可利用價格低廉的糖蜜、玉米黃漿水發酵生產乳酸。發酵介質組成（g/L）：糖蜜120，玉米黃漿水1000，K2HPO46，pH5.0。最適發酵條件為：發酵溫度30℃，裝液量60%，接種量1.3×107個/mL，溶氧30%，攪拌速度650r/min，發酵時間4d。構建的酵母適應工程菌可以用廉價培養介質發酵生產，生產成本低；引入的乳酸脫氫酶基因整合在酵母染色體上，遺傳穩定；沒有引入細菌來源的抗藥性基因，利于食品應用；可以進行高密度培養；酵母酸耐受性強，減少發酵過程中中和劑使用。該酵母適應工程菌的乳酸產量比一般乳酸菌低，仍有部分乙醇產生，今后應進一步進行遺傳修飾，提高L-乳酸產量。由于廉價發酵介質雜質多，發酵后的低成本純化方法選擇具有挑戰性，應繼續進行純化研究，降低純化成本。
