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動物行為學研究范文1
關鍵詞人參皂苷Rb2； 藥代動力學； 代謝產物； 液相色譜四極桿飛行時間質譜
1引 言
人參皂苷Rb2為人參（Panax ginseng C. A. Mey.）的主要活性成分之一， 含量約為6.7 mg/g[1]。研究表明， 人參皂苷Rb2能抑制地塞米松引起的細胞凋亡作用[2]， 對于小鼠在輻照誘導的造血系統損傷具有保護作用[3]。人參皂苷Rb2能夠降低在高膽固醇或脂肪酸培養下的3T3L1脂肪細胞的膽固醇和三酰甘油的含量[4]。另外， 人參皂苷Rb2對物質代謝亦有一定的影響， 能夠通過AMPK介導抑制糖原異生作用[5]； 能明顯增加大鼠骨髓細胞DNA、蛋白質的合成， 促進血清蛋白質合成等活性[6～10]。人參皂苷在胃腸道中和酸性條件下會產生多種代謝和轉化產物， 包括人參皂苷Rg3和CK等具有活性的化合物[11～13]。因此人參皂苷的藥代動力學、生物和化學轉化產物研究也一直備受關注， 對于揭示人參皂苷的藥理作用和物質基礎有重要意義， 并且直接影響人參的開發應用。Karikura等[14，15]對于人參皂苷Rb2在大鼠大腸和胃中的代謝情況進行了研究， 鑒定了氧化和去糖基化代謝產物。有文獻針對口服后復方中人參皂苷Rb1、柚皮苷和人參皂苷Rb2進行了藥代動力學研究[16]。但對于人參皂苷Rb2單體的大鼠體內代謝動力學和代謝產物未見報道。為了獲得人參皂苷Rb2在生物體內藥代動力學參數， 更好地理解其在生物體內的生物轉化和排泄途徑， 本研究將利用RRLCQTOF MS聯用技術對大鼠靜脈注射和口服人參皂苷Rb2后的血漿、尿液、糞便進行檢測， 計算靜脈注射后相關的藥代動力學參數并分析鑒定其代謝產物。為深入研究開發人參皂苷Rb2提供理論基礎， 對進一步闡明人參皂苷Rb2的生物活性提供依據。
2實驗部分
2.1儀器與試劑
6520RRLCQTOF質譜儀（美國安捷倫公司）； 5804R臺式高速大容量冷凍離心機（德國Eppendorf公司）； ULT13863V41超低溫冰箱（美國Thermo公司）； 超純水機（美國Millipore公司）。人參皂苷Rb2， Rf， F2， CK固體對照品（吉林大學， 純度95%）； 甲醇、乙腈和甲酸（色譜純， 美國TEDIA公司）； Wistar大鼠（體重（200 ± 10）g， 雄性， 購自吉林大學）。
2.2實驗條件
2.2.1色譜條件Agilent SBC18色譜柱（100 mm× 3.0 mm， 1.8 μm， 600 bar）， 柱溫25℃； 采用二元線性梯度洗脫： 流動相A為0.1%甲酸溶液， B為乙腈。梯度洗脫： 0～13 min， 25%～46% B； 13～19 min， 46%～50% B； 19～22 min， 50%～90% B； 22～25 min， 90% B。進樣量為5 μL。
2.2.2質譜條件采用電噴霧負離子模式； 質量掃描范圍m/z 100～2200； 干燥氣流速（N2）為8.0 L/min； 干燥氣溫度為350℃； 霧化氣壓力為255 kPa； 碰撞電壓為3500 V， 裂解電壓為175 V， 錐孔電壓65 V。實驗數據采用安捷倫Masshunter軟件（B.03.01版本）進行分析。
2.3樣品的配制及樣品處理
以甲醇為溶劑將Rb2和Rf（內標）標準品分別配制為100和10 μg/mL的對照品母液。4℃冷藏備用， 實驗時用甲醇稀釋。將不同濃度的Rb2對照品母液和Rf工作液各100 μL， 加入100 μL 空白大鼠血漿中混勻， 再加入200 μL甲醇， 渦旋1 min沉淀血漿中蛋白， 離心5 min， 取上清放入另一試管中， 最終配制成相當于Rb2濃度為0.08， 0.1， 0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0和1.3 μg/mL的血漿標準液。
2.4驗方法
選取6只大鼠分別用于Rb2靜脈注射給藥， 給藥方式為尾靜脈注射， 給藥劑量為2mg/kg。分別于給藥前（0時）和給藥后2， 5， 10， 15， 20， 30， 40， 60和90 min和2， 4， 6， 8， 12及24 h目內眥取血， 每個時間點取血0.5 mL， 血液冷卻后3000 r/min離心10 min， 取上清血漿100 μL， 測定前加入100 μL Rf內標液和300 μL甲醇， 渦旋30 s， 靜置5 min， 離心10 min。取上清液， 裝瓶， 待測。
選取6只大鼠， 隨機分為Rb2靜脈注射組和口服組， 每組3只， 靜脈注射劑量為2 mg/kg， 口服劑量為50 mg/kg， 制備方法同上。以上動物給藥后均放入代謝籠中收集尿液（0～24 h）和糞便（0～24 h）， 尿液樣本收集后， 經氮氣吹干濃縮， 水飽和正丁醇萃取， 萃取液再用氮氣吹干， 經過80%甲醇提取后， 用0.45 μm微孔濾膜過濾， 最后用80%甲醇定容至1 mL， 待測； 糞便樣本收集后進行研磨粉碎， 加入50 mL水溶解， 再用100 mL水飽和正丁醇分3次萃取， 萃取液放置蒸發皿中， 置水浴鍋上蒸干， 然后用80%甲醇溶解并定容至1 mL， 待測。
3Y果與討論
3.1RRLCQTOFMS和MS/MS方法的優化
利用人參皂苷Rb2進行RRLCQTOFMS和MS/MS的檢測方法優化。Rb2是二醇型人參皂苷（圖1）， 在苷元的C3位和C20位分別為葡萄糖葡萄糖和葡萄糖阿拉伯糖取代。分別在RRLCQTOFMS正離子和負離子模式下進行測定。測定的準分子離子和碎片離子的誤差小于10 ppm（圖2A）， 在下文中討論的離子的m/z數值均用整數表示。在0.1%甲酸水溶液作為流動相的條件下， Rb2在負離子模式下分別給出[M-H]
3.2方法學考察
3.2.1專屬性通過比較空白與加入Rb2和內標的血漿樣本的LCMS色譜考察本實驗的專屬性。人參皂苷Rb2和內標Rf的選擇性良好， 生物基質的干擾較小， Rb2和內標Rf的保留時間分別為10.08 min和10.57 min。
3.2.2線性關系用Rb2/內標Rf的峰面積比值（Y）與Rb2含量（X）進行最小二乘線性回歸， 得到標準曲線回歸方程為Y=3.5174X+0.117， R2=0.9937。結果顯示在0.10～1.26 μg/mL的濃度范圍內線性關系良好， 檢出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分別為0.08和0.10 μg/mL。
3.2.3精密度與準確度采用高、中、低3個濃度的Rb2血漿QC樣本， 每個濃度進行6個樣本分析， 連續測定3天。計算日內和日間精密度和準確度。日內和日間精密度的相對標準偏差別（RSD）均小于5%， 表明本方法的精密度和準確度良好。
3.2.4提取回收率分別取Rb2高、中、低3個濃度的QC樣本， 將空白血漿中先加入Rb2， 處理后計算所測得峰面積， 與空白血漿處理后加入相同量Rb2所測得峰面積比值的百分率進行比較， 考察樣品的提取回收率。結果表明， Rb2提取回收率范圍為92.6%～93.4%， RSD小于15%。
4結 論
本研究建立了人參皂苷Rb2的RRLCQTOFMS 和MS/MS藥代動力學和代謝產物研究方法。藥代動力學研究表明人參皂苷Rb2體內分布代謝符合二室模型， 血藥濃度半衰期的α相（t1/2α）和β相（t1/2β）分別為（23.576±1.103）min和（1306.545±147.226）min， 在體內有較高的血漿蛋白結合率。α相分布較快， 而β相的消除較緩慢。運用優化后的RRLCQTOFMS/MS方法， 對靜脈注射和口服后人參皂苷Rb2的代謝產物進行了系統研究。結果表明， 去糖基化是人參皂苷Rb2在大鼠體內主要的代謝方式。鑒定了代謝產物M6、M2（CY）、F2和CK， 總結了大鼠在靜脈注射和口服給藥后Rb2尿液和糞便的代謝路徑， 分別為Rb2M6M2和Rb2M6M2（CY）/F2CK代謝途徑。人參皂苷Rb2的藥代動力學研究和體內代謝轉化研究結果為更好地理解和開發人參皂苷Rb2的應用價值提供了理論基礎。
動物行為學研究范文2
【關鍵詞】 燈盞花素 再灌注損傷 行為
［ABSTRACT］Objective To investigate the effect of breviscapine on the ethological index after cerebral ischemia/reperfusion in gerbils. Methods A cerebralischemiareperfusion model of gerbils was established， ischemia time being 10 minutes. Gerbils were randomised to shamgroup， control group and breviscapine group. They were further pided into four subgroups， eight in each group. Reperfusion was carried out in the latter two groups， which lasted for 1， 2， 4， and 7 d， respectively. The ethological index of gerbils was counted by the open field method after reperfusion. The brain temperature in all gerbils was kept at(37.2±0.2) ℃ during the experiment. Results After different time of reperfusion， the score of ethological index in control group was higher than that in shamgroup， that in breviscapine group was higher than shamgroup， but was lower than control group. Conclusion Breviscapine could reduce cerebral ischemia/reperfusion injury in gerbils by attenuating the changes of the behavioral marks.
［KEY WORDS］ Breriscapine; Reperfusion injury; Behavior
腦缺血再灌注損傷及其防治的研究一直為國內外學者所關注，至今未獲得重大進展。低溫具有確切的腦保護作用，但其本身存在諸如增加血黏度、干擾微循環、引起心律失常等副作用。燈盞花素注射液是一種中成藥，具有蛋白激酶C（PKC）抑制作用，同時具有降低血黏度、改善微循環之功效。有研究表明，燈盞花素可減輕腦缺血再灌注損傷。本研究就燈盞花素對沙土鼠腦缺血再灌注后相關行為學指標的影響做進一步探討。
1 材料與方法
1.1 動物模型制作
沙土鼠24只，體質量(50～70)g，雌雄不拘。戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉后，將動物俯臥于手術臺上，自頭頂部切開皮膚，于矢狀縫外2 mm、前囟后2 mm處，用細鉆鉆洞（不鉆透腦膜），置入自制電極，用牙托粉固定。電極接多功能腦電監護儀監測腦電圖，以判斷是否造成沙土鼠前腦缺血。然后將動物仰臥于實驗臺上，切開頸部正中皮膚，仔細分離雙側頸總動脈，用無創動脈夾阻斷頸總動脈造成前腦缺血，松開動脈夾恢復腦血流即為再灌注[1，2]。腦缺血時間10 min。假手術組僅游離雙側頸總動脈但不予阻斷。各組動物在腦缺血再灌注期間均將其放入恒溫箱中，以使腦溫控制在（37.2±0.2）℃。
1.2 動物分組
將動物隨機分為假手術組、對照組和燈盞花素組，每組8只動物，后兩組再根據再灌注時間分為再灌注1、2、4、7 d等4個亞組。燈盞花素組于腦缺血前30 min和再灌注后6 h時腹腔注射燈盞花素注射液90 mg/kg（云南省生物制藥廠），假手術組和對照組動物在相同時間點注射等容量的生理鹽水。
1.3 相關行為學指標檢查
沙土鼠腦缺血再灌注后1、2、4和7 d應用開闊法觀察其行為學變化，開闊法檢查所用的迷宮尺寸為76 cm×72 cm×57 cm，劃分為25個方格。檢查時將沙土鼠放于正中格中，記數其10 min內爬過的格子數。每次檢查時保持房間安靜和室內燈光強度一致。
1.4 統計學處理
數據均以±s表示，組間比較采用t檢驗。
2 結 果
沙土鼠腦缺血再灌注后1、2、4和7 d，假手術組行為學評分為244±51，對照組行為學評分明顯高于假手術組（t=5.399～11.372，P
3 討 論
沙土鼠因缺乏Willis動脈環，阻斷雙側頸總動脈可造成前腦缺血，故被廣泛應用于腦缺血的實驗研究。但近來的研究發現，部分沙土鼠存在解剖學變異，阻斷雙側頸總動脈不易造成前腦缺血[3]。
燈盞花素注射液是從云南燈盞花全草中分離所得，其主要成分是黃芩素甙。有研究表明，燈盞花素具有PKC抑制作用[3]，同時其還可降低血黏度、改善微循環。另有研究表明，燈盞花素可減小大腦中動脈阻斷后皮質梗死灶的體積，減輕腦缺血再灌注損傷[4～6]。
開闊法是檢查沙土鼠腦缺血后神經功能障礙的常用方法之一。海馬在維持動物的學習、記憶和空間定位能力等方面發揮著重要作用，當海馬功能受損時，表現為探索活動活躍。海馬對腦缺血特別敏感，短暫的腦缺血即可造成海馬神經元死亡。本實驗結果顯示，沙土鼠腦缺血10 min再灌注1、2、4和7 d后，對照組的行為學評分明顯高于假手術組，提示腦缺血引起海馬神經元功能受損，導致沙土鼠探索活動次數增加。而缺血前應用燈盞花素沙土鼠行為學評分盡管高于假手術組，但明顯低于對照組，證實燈盞花素可減輕腦缺血再灌注損傷。
【參考文獻】
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動物行為學研究范文3
[關鍵詞] 感染性腦損傷；橙皮苷；強迫游泳
[中圖分類號] R-33 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2013）11（c）-0031-02
Influce of hesperidin on forced swimming test of mice with cerebral injury induced by LPS
WU Jian1 LIU Hong-zhi1 WEN Xiang-ru2 FU Yan-yan1 ZHANG Lei3 SUN Ying3 ZHANG Fang1 LIU Yong-min2 DONG Hong-yan1 LIU Yong-hai3 SONG Yuan-jian1
1.Neurobiology Research Center， Basic Courses School of Xuzhou Medical College in Jiangsu Province， Xuzhou 221004， China；2.Teaching and Research Section of Chemistry， Public Education School of Xuzhou Medical College in Jiangsu Province， Xuzhou 221004， China；3.Department of Neurology， Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College in Jiangsu Province， Xuzhou 221004， China
[Abstract] Objective To investigate the influence of hesperidin on forced swimming test of mice with cerebral injury induced by lipopolysaccharide （LPS）. Methods 45 ICR mice at 3 weeks were evenly divided into saline group， LPS group and LPS + hesperidin group （Hesp） in random. Mice from 3 groups in accumulative distance and cumulative time within 5 minutes′ swimming were tested by ZH-QPT forced swimming test video analysis system. Results Compared with saline group， the accumulative distance of swimming in LPS group was obviously shorter， but there was no significant change in cumulative time in the two groups. In comparison with the LPS group， the accumulative distance of swimming in LPS+Hesp group became longer， but without obvious changes in cumulative time. Conclusion Hesperidin can remarkably prolong the distance in forced swimming test in mice with infectious cerebral injury.
[Key words] Infectious cerebral injury； Hesperidin； Forced swimming
腦部細菌或病毒感染是導致新生兒、幼兒腦損傷的重要原因之一。腦損傷后常遺留運動功能障礙、認知行為障礙等神經系統后遺癥[1]。因此，探究感染性腦損傷后行為學指標的改變有重要意義。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分，為脂質和多糖的復合物，屬內毒素，具有神經毒性。幼年小鼠的血-腦脊液屏障（blood brain barrier，BBB）尚不健全，LPS會造成小鼠感染性腦損傷?？蓱肔PS建立小鼠的感染性腦損傷模型，并借助這一模型研究感染性腦損傷后行為學指標的改變。橙皮苷（hesperidin，Hesp）在柑桔類植物的果實中廣泛存在，具有多種功能，如抗炎、鎮痛、抗氧化、抗癌等[2-3]，另有很好的神經保護作用[4]。它是否會影響感染性腦損傷動物的行為，目前未見報道。
強迫游泳行為學實驗可用于初步研究神經或精神類藥物的作用，也可初步篩選相關藥物[5]。通過強迫游泳實驗，考察LPS誘導的感染性腦損傷小鼠的行為學變化，以及橙皮苷對該行為學變化的影響，有助于認識和理解腦損傷導致的行為變化規律，為感染性腦損傷的診斷、治療和康復提供新的思路和方法。
1 材料與方法
1.1 儀器和試劑
LPS購自Sigma公司，Hesp購自鄭州荔諾生物科技有限公司；強迫游泳實驗設備采用淮北正華公司的ZH-QPT型強迫游泳實驗視頻分析系統，硬件系統尺寸為直徑10 cm，高30 cm；記錄分析軟件采用Stoelting公司的Any-maze system，版本為4.72版。
1.2動物及分組
3周齡、雄性健康ICR小鼠45只，體重為8～11 g，由徐州醫學院實驗動物中心提供。將小鼠隨機分為3組，每組15只：生理鹽水（saline）組，腹腔注射生理鹽水；LPS組，腹腔注射LPS；Hesp組，即先用LPS處理，后給予Hesp。
1.3方法
1.3.1 動物模型制備 saline組小鼠腹腔注射生理鹽水；LPS組腹腔注射LPS生理鹽水溶液，劑量為5 mg/kg；LPS+Hesp組先腹腔注射LPS（5 mg/kg），0.5 h后Hesp（劑量為200 mg/kg，混懸于0.5%羥甲基纖維素鈉水溶液中）灌胃。將以上各組小鼠6 h后置于ZH-QPT型強迫游泳實驗視頻分析系統中觀察并記錄其行為學指標。
1.3.2 強迫游泳實驗行為研究 實驗環境的水溫20～25℃，首先將小鼠置于水中適應2 min，再記錄隨后5 min的行為，用Any-maze system軟件記錄分析活動指標，包括活動路程、累積活動時間及累積靜止時間。
1.3.3統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以x±s表示，組間比較采用方差分析，以P
2結果
saline組小鼠在5 min內游動了（14.49±4.08）m，LPS處理后，小鼠游動路程大幅縮短，僅（6.96±1.74）m，差異有統計學意義（P
表1 各組小鼠在強迫游泳實驗視頻分析系統中的活動路程、累積游動時間和累積靜止時間的比較（x±s）
與saline組比較，aP
圖1 小鼠強迫游泳實驗視頻分析系統中的狀態圖
A.靜止狀態；B.活動狀態
3 討論
腦損傷中，除創傷性損傷外，感染性腦損傷、漸進性腦損傷的發生、進展的機制多樣而復雜。感染性腦損傷常見于新生兒和幼兒，腦損傷可能導致幼兒精神神經異常和行為障礙，治療困難[6]，康復往往采用高壓氧等方法[7]，常會導致患兒認知障礙、精神神經行為異常。幼年小鼠的血-腦脊液屏障不健全，本研究用LPS處理雄性ICR小鼠，建立了感染性腦損傷模型。
除強迫游泳實驗外，研究動物的行為變化還可采用曠場實驗、水迷宮實驗、懸尾實驗等，強迫游泳實驗是最早用于研究抑郁類行為的方法[8]，結果可靠性強。不同性別小鼠的強迫游泳行為不同[9]，本研究討論雄性ICR小鼠的強迫游泳行為。溫度等理化因素對實驗動物的強迫游泳行為也有影響，本研究控制實驗水溫為20～25℃。結果表明感染性腦損傷小鼠在強迫游泳實驗中行為異常，雖然累積靜止時間沒有變化，但是活動路程顯著降低。
Hesp是治療心血管病的藥物，是多效藥物，有研究表明其有神經保護作用，但作用機制不明，對動物的行為學有何影響，目前未見報道。本研究通過強迫游泳實驗發現Hesp可以逆轉LPS對小鼠游泳行為的影響，在維持累積靜止時間不變的同時，顯著增加活動路程。
因此，從強迫游泳實驗結果看，Hesp可以有效減輕LPS誘導的小鼠游泳行為障礙，其中所涉及的分子機制，本實驗室正在進一步研究。
[參考文獻]
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動物行為學研究范文4
關鍵詞：酯；高級醇；醒酒小鼠；小鼠行為學
中圖分類號：TS262.5 文獻標識碼：A 文章編號：1674－0432(2011)－05－0085－1
1 材料與方法
1.1材料
1.1.1實驗動物普通昆明種小鼠，雌雄各半，20+2g，標準環境喂養(北京大學醫學部動物實驗中心提供)。
1.1.2實驗試劑乙醇(北京化工廠，分析純)；異戊醇(天津津科精細化工研究所，分析純)；異丁醇(東京化工株式會社，分析醇)；正丙醇、正丁醇(德國FLUKA公司，分析純)；甲酸、乙酯、乙酸乙酯、已酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸異丁酯
1.1.3實驗儀器滾筒運動測試儀(RB－200B型)；1 ml針筒注射器(國營常州注射器廠)
1.2方法
1.2.1灌胃高級醇、酯類配比高級醇成分配比：異戊醇50％，異丁醇30％，正丙醇15％，正丁醇5％。酯類成分配比：甲酸乙酯25％，乙酸乙酯50％，已酸乙酯5％，乙酸異戊酯10％7,酸異丁酯10％。
1.2.2滾筒實驗昆明小白鼠，20±2g，雌雄各半，隨機分為對照組，3個灌胃酯溶液組和3個灌胃高級醇溶液組，劑量分別為0.5ml／20g，1.0ml／20g，2.0ml／20g。每組15只，通電后，小鼠在滾筒中滾動，記錄10分鐘內掉筒及爬筒次數。
1.2.3統計學分析結果用iS表示，并采用excell進行統計分析。
2 結果與討論
2.1酯類對小鼠行為學的影響
啤酒在發酵過程會產生大量酯類并在貯存過程酯類會有所增加。表1可以看出，每組劑量下，小鼠的掉筒次數會隨著酯類濃度的增加而增加，但經統計學分析，不同含量酯類物質在不同給藥劑量下對小鼠掉筒次數影響并不顯著，說明酯類對小鼠行為有一定的興奮作用，但這種刺激作用不強烈。
2.2高級醇對小鼠行為學的影響
經實驗表明對小鼠進行高級醇灌胃后有頭暈感，當高級醇含量超過100ppm，這種影響非常顯著。由表2分析，正常小鼠灌胃空白2ml后，意識清醒。在5分鐘內，平均掉筒次數1.73±0.75，
掉筒后在電擊作用下重新爬上滾筒。灌胃高級醇30ppm，隨劑量增加掉筒次數增加不明顯。
灌胃高級醇70ppm，1ml，掉筒顯著(P
由此表還可以看出，隨著高級醇濃度的增加，灌胃劑量對小鼠的影響越來越大。灌胃劑量由1.0ml增至2.0ml時，在30ppm掉筒次數由1.13±0.11增至1.73±0.75，而在150ppm時掉筒次數由17.66±7.46增至46.36±11.81。
動物行為學研究范文5
關鍵詞：自體血注入法；腦出血；模型；大鼠
中圖分類號：R743.34 文獻識別號：A
出血性腦卒中是原發于腦實質內的非外傷性出血，致殘及致死率高較高，該病嚴重危害著人類的健康。對腦出血的實驗研究一直受到廣泛重視，腦出血造模的穩定性、同患者發病表現的接近性直接關系到實驗研究的科學性和實用性。本實驗研究通過鼠尾動脈血分次回注自體大鼠腦組織內，建立腦出血的大樹模型。
1資料與方法
1.1實驗儀器 腦立體定向儀 （日本）；100 μL微量注射器，渦輪牙鉆機；手術相關器械
1.2一般資料 近交成年雌性SD大鼠90只，體重（300±20）g。由河北醫科大學實驗動物中心提供，標準普通飼料喂養和自由飲水，晝夜自然節律，飼養環境為河北大學醫學部動物實驗中心多層層流架。
1.3方法 大鼠腦出血模型的制備：應用10%水合氯醛對大鼠腹腔注射量為300 mg/Kg進行麻醉，頭部備皮并應用碘伏常規消毒后，俯臥位固定于定向儀上，前囟抬高1 mm，取長度約為2 cm正中縱形切口，小型擴皮器牽開切口，取前囟點中線右側旁開3.0 mm，沿矢狀面向后1.5 mm，牙鉆鉆透顱骨，深及骨膜。在消毒后在鼠尾腹側正中做一縱行切口，抽取尾動脈不加抗凝劑的動脈血液約60～70 μL。將針頭垂直于顱骨骨孔的方向，進針約6 mm，緩慢注入50 μL自體動脈血液，注血時間以兩分鐘為宜，為防止鼠血反流，將針留置10 min。緩慢退針，骨蠟封閉顱骨骨孔，縫合手術創口。
1.4行為學的分級評估 參照Longa 五級評分法[1]，對大鼠進行神經功能缺損評分：0級：無體征，記0分；Ⅰ級：動物不能完全伸直其前肢，記1分；Ⅱ級：動物一側肢體癱瘓，有追尾現象，記2分；Ⅲ級：動物不能站立/ 打滾，記3分；Ⅳ級：無自發性活動，有意識障礙，記4分。
2結果
大鼠實驗腦出血造成后，進行行為學評分，每只大鼠均采用Longa方法，反應其行為學變化。根據對實驗動物的觀察，在大鼠大腦注射自體鼠尾動脈血液后，動物迅速出現行為和神經功能異常，大鼠反應遲鈍、皮毛無光澤、精神萎縮、進食下降，對側肢體出現癱瘓，行走追尾，嚴重者動物不能站立/打滾，個別大鼠呈現意識障礙，昏迷等表現，其功能異常程度與出血的嚴重程度相關。腦組織標本可見明顯的血腫占位，結合對大鼠造模3 d后進行行為學評分，評分2～3分得提示模型建立成功。評分1分的4只，2分的34只，3分46只，4分的6只。造模成功80只，成功率88.9%。
3討論
腦出血動物模型的制備成為了研究腦血管病不可或缺的基礎，而好動物腦出血模型是接近于人類腦出血的血腫、水腫、缺血缺氧等病生理變化，符合疾病的發展規律的，并且動物模型具有較好的穩定性、可重復性。
動物模型的應用，使腦出血過程的神經生物學基礎研究得到較大進展。在過去幾十年里有很多方法造腦出血的動物模型，用于模仿腦出血的發病機制，其原理各不相同，效果也不盡相同，模型的選擇至關重要。常用的方法有以下幾種：①膠原酶誘導腦出血模型，應用膠原酶向腦組織中注入，膠原酶刺激破壞腦內組織，破壞血管而滲血形成血腫[1]。②微球囊充脹腦出血模型，在大鼠大腦尾狀核包埋微小氣囊，充盈氣囊造模，產生占位效應腦部傷害一致，可重復性好，但同顱內血腫產生的其他病生理改變不同。③自發性腦出血模型，用遺傳方式篩選出自發性高血壓大鼠，待出現高血壓嚴重并發癥腦出血后提示造模成功，本模型能夠較準確的模擬高血壓腦出血等病理生理變化，存在的問題是獲得腦出血模型的時間不能把握，出血部位及大小各異，各模型間對比性差；④凝固自體動脈血注入腦出血模型，抽取大鼠股動脈血，靜置5 min待動脈血凝固后后腦內注射。此方式可控制鮮血沿針道返流問題，但同時存在血液凝固后血腫在腦內塑形困難[2]。⑤應用立體定位技術取自體血注血腦出血模型，即本研究采用造模方法，新抽取鮮鼠尾動脈血，應用立體定位儀固定微量注射器，精確定位于尾狀核，穿刺并腦內注血，注血量50 μL血相當與人35 mL的血腫，應用非肝素化自體動脈血，更接近接近人類自發性出血性卒中，適合研究腦出血病理生理特點，能夠觀察各種因子在血液凝固過程中對腦血流及腦組織細胞代謝的影響，本研究取SD大鼠腦內最大的核團--尾狀核，是高血壓腦出血最好發部位，對腦出血的研究提供可靠的依據[3]。
根據對實驗動物的觀察，其功能異常程度與病變嚴重程度一致。腦組織標本在尾狀核部位可見明顯的血腫形成，提示模型建立成功，本組大鼠造模成功率88.9%，本造模方式是能夠較好的模擬腦出血的病理生理的改變，應用此方法保證了在對腦出血的研究過程中確保實驗數據的真實性和可靠性。
參考文獻：
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動物行為學研究范文6
【摘要】 目的：建立新生大鼠腦白質損傷模型，探討腦白質損傷后少突膠質細胞(OL)凋亡和遠期神經行為的變化。方法：5日齡新生大鼠隨機分為實驗組和對照組，制作缺血性腦白質損傷動物模型；術后不同時間點觀察生長發育，HE染色、免疫熒光標記觀察腦組織病理形態改變、細胞變化，懸吊試驗、曠場試驗、拒俘反應測試神經行為學改變。結果：實驗組生長發育明顯慢于對照組，HE染色腦室周圍白質疏松，側腦室增大，髓鞘磷脂蛋白(MBP)免疫熒光標記實驗組陽性細胞數較對照組明顯減少(P
【關鍵詞】 缺血性腦損傷； 腦室周圍白質軟化； 少突膠質細胞; 新生大鼠
產科和新生兒重癥監護診療技術的發展，大大提高了早產兒的存活率，但隨之而來的早產兒腦損傷也較為突出。有研究認為，早產兒腦損傷主要在白質，腦室周圍白質軟化(periventricular leucumalacia，PVL)是早產兒腦損傷的主要形式［1］，高發于胎齡24～32周的早產兒，發生率達26%～60%［2］。PVL可造成腦白質部位少突膠質細胞(oligodendrocyte，OL)前體的受損和丟失，致使腦白質內髓鞘不能形成，導致成活早產兒呈現痙攣性肢體癱瘓、認知障礙以及視聽障礙等后遺癥［3］。PVL發病機制復雜，還不完全清楚，尚須進一步研究。本研究采用雙側頸總動脈結扎法(bilateral carotidartery occlusion，BCAO)制作5日齡未成熟大鼠缺血性腦損傷模型，觀察其腦室周圍白質病理變化和遠期神經行為改變情況。
1 材料與方法
1.1 材料
5日齡新生SD大鼠10窩，共90只，雌雄不拘，體重8.5～11.0 g，由東南大學醫學院實驗動物中心提供，髓鞘磷脂蛋白（MBP）單克隆抗體由上海元象醫療器械有限公司提供，山羊抗兔IgG由北京中杉生物公司提供。
1.2 方法
1.2.1 動物分組
90只大鼠隨機分為實驗組(n=48)和對照組(n=42)兩組。觀察5、7、14、21、28日齡大鼠生長發育情況，對29、30日齡大鼠進行神經行為學檢測。
1.2.2 模型制作
實驗組：大鼠乙醚麻醉后取仰臥位于操作臺上，消毒頸部皮膚，作頸腹側正中切口約0.5 cm長，分離皮下組織，找到血管神經束，分離出雙側頸總動脈，用50絲線完全結扎雙側頸總動脈后縫合皮膚，在37 ℃恒溫水浴箱內恢復至活動正常后返回母鼠身邊飼養。對照組：手術同實驗組，分離雙側頸總動脈，但不結扎，縫合皮膚后回籠。手術中及術后1周內對照組大鼠死亡1只，死亡率為2.4%，實驗組死亡13只，死亡率27.1%，最終進入結果分析76只。
1.2.3 HE染色及免疫熒光檢測
1.2.3.1 HE染色 實驗動物于7、14、21、30日齡(行為學測試后)行心臟灌注后斷頭取腦，4%多聚甲醛固定24 h，取視交叉水平作石蠟切片(片厚4 μm)，行常規HE染色。
1.2.3.2 熒光抗體標記 分別于7、8、14、21日齡灌注取腦，4%多聚甲醛固定，300 g·L-1蔗糖沉底后取不同冠狀面作冰凍切片(10 μm)，加入MBP(1∶200) 4 ℃過夜，暗室中加入山羊抗兔IgG (1∶50) 37 ℃孵育30 min，晾干后于倒置熒光顯微鏡(Olympus，200倍)下觀察腦室周圍白質部位細胞形態變化。每個標本連續作3張切片進行標記，每張切片選取5個視野（陽性細胞數最多者）計數，并取其平均值統計。
1.2.4 神經行為學測定
動物于29日齡行懸吊試驗測試肢體肌力，曠場試驗、拒俘反應檢測隨意運動和情感行為能力，“Y”臂迷宮試驗測定學習能力，30日齡時復測“Y”臂迷宮試驗，檢測記憶能力，如果學習訓練失敗，則成績不列入統計。
1.3 統計學處理
應用SPSS 15.0進行統計學處理，兩樣本均數比較采用t檢驗，結果均以x-±s表示，P
2 結
果
2.1 生長變化
實驗組大鼠術后有皮膚蒼白、皮溫降低、活動減少、喂養困難、睜眼時間延遲、體重增長緩慢等異常表現。術前兩組大鼠體重相差不大，術后實驗組體重平均增長幅度低于對照組，第7天至1個月同日齡大鼠處死前體重明顯低于對照組(P
2.2 HE染色
7日齡各組大鼠大腦外觀未見明顯改變，實驗組大鼠鏡下可見腦白質部位細胞水腫，細胞周圍間隙增寬，腦室周圍白質內大量OL呈凋亡樣變化：胞漿濃縮，核質凝集，形成藍黑色凋亡小體，個別區域有小片的壞死區，部分神經細胞胞核碎裂溶解消失，表現為壞死。但皮質、海馬等部位細胞結構基本完整，未見明顯的病理改變。14、21、30日齡實驗組大鼠腦室周圍白質較對照組明顯染色淺且疏松，腦室周圍白質及內囊組織相對疏松，內囊有空腔形成，腦室進行性擴大。對照組大鼠同時間點未見以上病理變化。見圖1。表1 兩組大鼠不同日齡體重比較
2.3 免疫熒光標記
熒光顯微鏡下可見MBP標記的細胞呈黃綠色熒光(圖2)。7日齡實驗組術后可見陽性細胞數目較對照組減少，8日齡減少最為明顯，與對照組相比，差異有統計學意義(P0.05，表2）。
2.4 神經行為學測定
29日齡實驗組大鼠在懸吊試驗中懸吊在玻璃棒上時間較對照組短，在曠場試驗中活動及后肢站立次數較對照組少，拒俘反應試驗中表現為較易捕獲，試驗評分均較對照組低(P
3 討
論
PVL是指側腦室周圍白質的壞死，常在大腦半球的白質區形成囊腔。未成熟腦白質主要由OL前體細胞構成，導致腦白質損傷的關鍵是OL損傷，OL是中樞神經系統的成髓鞘膠質細胞，其損傷主要影響髓磷脂的產生，最終導致腦白質的缺損，腦白質容積減少，腦室擴張等［4］。缺血在PVL發病機制的學說中占了主導地位，未成熟腦血流調控機制不成熟、腦白質在發育期血供不足和OL的前體細胞對損傷有高度的敏感性是PVL主要發病因素，血流降低會導致腦室周圍白質中的OL損傷、凋亡、壞死，數量減少，從而致使髓鞘合成障礙，引起遠期的神經行為缺陷。
研究表明，7日齡大鼠神經系統發育相當于人類足月或近足月的新生兒，腦組織中OL已逐漸發育成熟并發生髓鞘化，該階段的OL對損傷易感性不強。大鼠生后5 d是神經元遷移的終末階段，Uehara等［5］采用5日齡Wistar大鼠雙極電凝器切斷雙側頸動脈，2 d后檢查，90.9％的大鼠內囊及周圍白質出現病變，包括凝固性壞死和囊性變，54.5％皮質下白質受累而僅有22％皮質受損。張龍等［6］利用5日齡新生SD大鼠腦內注射神經毒素3硝基丙酸成功建立了PVL模型。Cai等［7］利用BCAO后聯合低氧建立4日齡SD大鼠腦損傷模型。研究證實，鼠類生后5 d相當于人類妊娠24～30周［8］，1～5 日齡大鼠腦白質以OL的前體細胞為主，容易受損，從而影響髓鞘的形成，最終導致腦白質的缺損［9］。故本實驗選擇5日齡的SD大鼠通過BCAO模擬PVL病變。
本實驗顯示，缺血增加大鼠的死亡率，相同日齡實驗組幼鼠體重明顯低于對照組，并且睜眼時間延遲，大鼠的生長發育延緩。PVL的病理特征是白質出現明顯損傷，而皮質損傷輕微，本實驗模型主要表現為早期腦白質部位細胞水腫，細胞周圍間隙增寬，腦室周圍白質內OL凋亡壞死增多，皮質下及腦室周圍白質出現疏松及液化灶，后期形成囊腔和腦室擴大，而腦皮質無明顯變化。本實驗MBP免疫熒光標記顯示，缺血性腦損傷后MBP標記的細胞減少。MBP是反映OL及髓鞘結構、功能的重要指標之一，實驗組早期免疫熒光MBP抗體標記陽性細胞數減少較對照組明顯，生后2周對照組MBP陽性細胞數開始減少，系大鼠OL已發育成熟，MBP表達量減少。研究證實，在早產兒PVL的好發期，晚期OL前體更易受到缺氧缺血等因素的影響，導致白質內髓鞘不能形成，臨床上呈現腦癱和智能落后等后遺癥［10］。PVL患兒神經行為學障礙在幼兒期才明顯固定化，通常認為大鼠1月齡約等同于人類的2～5歲，其神經行為學特征性表現已經能夠充分展示［11］，因此對29、30日齡大鼠進行神經行為學檢測結果較為可靠。本實驗表明，BCAO實驗組動物與對照組比較有明顯的遠期神經行為學異常，表現為隨意運動受限，肌力減弱，情感行為及學習能力差，且有明顯的感知障礙，實驗組神經行為表現與病理改變一致。
本研究顯示，5日齡新生大鼠因雙側頸總動脈結扎缺血引起腦室周圍白質嚴重損傷，出現液化、腦室擴大，OL凋亡較對照組增多，術后出現生長遲緩和遠期神經行為功能缺陷，因此，有助于理解早產兒腦白質損傷發病機制和神經病理學變化，為PVL病理學機制及干預提供理論基礎。
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