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動物行為學分析方法范文1
關鍵詞：有氧運動；慢性腦缺血；PI3K；Akt；信號通路
慢性腦缺血是指各種原因引發的長期腦血流灌注不足，為臨床上常見的腦損傷之一，可導致持久或進展性的認知與神經功能障礙[1]。
細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，是細胞在某些生理或病理條件下發生的有序的主動性非炎癥性死亡。研究認為，腦缺血后與細胞凋亡有關的信號轉導通路主要有有絲分裂原蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K） /絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（Akt）信號通路[2]。Akt又名蛋白激酶B（PKB），為分子量大約為60 kD的蛋白激酶。Akt能使絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）磷酸化，故又稱為絲氨酸/蘇氨酸激酶。Akt能介導多種生物學效應，是重要的抗凋亡調節因子。因子PI32K激活的Akt可以介導胰島素、多種生長因子、凝血酶等誘發的細胞生長，能經多種途徑促進細胞存活[3]。
本研究采用結扎右頸動脈的方法構建了小鼠酒精性肝損傷模型，采用跑臺和游泳兩種不同的有氧運動方式干預，通過神經行為學、顯微結構形態學觀察以上干預對腦缺血損傷小鼠的影響；采用免疫組化實驗技術，檢測PI3K/Akt信號通路上下游相關因子的差表達，探討其神經保護作用的機制。
1.研究方法
（1）動物模型的構建：成年健康雄性KM小鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠（0.3ml/100g體重），參考Yoshizaki的方法結扎小鼠右頸動脈構建慢性腦缺血損傷小鼠動物模型。
（2）實驗動物分組以及運動方案：建模成功后，將小鼠隨機分為四組：假手術組（SO）、模型對照組（M）、游泳組（SW）、跑臺組（TM），每組10只，建模后3―4天對其進行干預。
（3）組織形態學觀察：實驗結束后，取小鼠腦組織進行石蠟包埋，尼氏染色，解剖形態學觀察。
（4）神經行為學評估：Clark神經功能評分方法，根據癥狀表現程度分0、1、2、3、4遞增等級，對小鼠步態、攀爬能力、轉圈、胡須反應、眼睛、耳朵、毛發等的情況進行綜合評分。
（5）免疫組織化學分析：檢測缺血腦組織中的PI3K、Akt、mTOR的表達，采用SABC法的免疫組織化學法進行以上因子的定位和半定量表達檢測。在10×20倍光學顯微鏡下，觀察并計算PI3K、AKT、mTOR的陽性表達面積百分比[4]（陽性反應面積/測量面積）。
2.結果與分析
（1）小鼠神經行為學評估：分別記錄建模后無干預和建模后進行有氧干預的得分（三次評分取平均值）。
（2）解剖形態學觀察：組小鼠尼氏體排列緊密，大且數量較多，神經元受損程度??；M組排列疏、欠規整，且數量較少；與M組相比，SW、TM組中尼氏體數量較多，排列緊密，僅次于SO組，TM排列有規則較集中，效果優于SW組。
（3）免疫組織化學分析。圖2顯示：小鼠腦細胞PI3K、Akt主要表達于細胞漿。PI3K表達強弱依次為SO>TM>SW>M組；Akt表達強到弱依次為SO>TM>SW>M組。
表2可見：小鼠腦組織中PI3K、Akt免疫組化中SO組陽性表達最高，SW組、TM組表達均高于M組（P
3.討論
（1）小鼠腦缺血模型。腦缺血理想的實驗動物模型是實驗研究取得進展的關鍵性因素之一。由于本實驗需要進行長時間的有氧游泳和跑臺的運動訓練，我們對所選小鼠的右頸動脈進行結扎以構模。術后我們跟蹤觀察小鼠的情況，發現小鼠右眼半閉或全閉。這說明小鼠建模成功，且其成功率達90%，應用此模型可以順利完成本研究。
（2）有氧運動對小鼠腦缺血干預的效果。近年來，大量有關有氧運動康復訓練治療急性缺血性腦血管疾病的動物實驗取得了一定的成果。適當的運動訓練能夠促使腦血管新生，增強抗氧化能力，減輕腦細胞凋亡，促進神經元生長等。從本實驗結果可見，對小鼠建模前、后以及有氧運動干預后神經功能的評分，除M組外，各干預組都有明顯的變化。腦組織尼氏染色顯示，相比于M組，有氧運動組尼氏小體相對清楚有規律，TM組尤為顯著，這說明有氧運動對小鼠腦部神經元細胞的再生以及保護有著重要的作用，其能促進神經干細胞增殖以及分化，促進軸突及樹突的生長。
（3）有氧運動干預與PI3K/Akt信號通路表達影響。腦缺血后與細胞凋亡有關的信號轉導通路主要有有絲分裂原蛋白激酶（ MAPK）和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K） /絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（Akt）信號通路。PI3K是一種可使肌醇環第三位羥基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶。PI3K被激活后生成的磷脂產物進一步激活Akt及其下游的信號的級聯反應， 參與生長、發育、分化和細胞的存活。PI3K激活的Akt可以介導胰島素、多種生長因子、凝血酶等誘發的細胞生長，能經多種途徑促進細胞存活。從小鼠腦組織免疫組織化學結果的分析可見，PI3K/Akt的表達情況在游泳組和跑臺組的表達面積遠高于模型對照組、低于假手術組，且跑臺組表達面積更佳。由此可知，有氧運動對該模型中的鼠腦組織發揮著保護作用，能抑制細胞的凋亡過程。其抗損傷作用機理可能通過激活PI32K /Akt信號通路的表達，達到抑制細胞凋亡，發揮腦組織保護的作用。
4.結論
（1）兩種有氧運動均能對本慢性腦缺血小鼠模型的腦細胞發揮抗損傷作用，且其效果跑臺組優于游泳組。
（2）兩種有氧運動可能均通過調節PI32K /Akt信號通路的表達，達到抑制細胞凋亡，發揮抗腦組織傷害作用。
參考文獻：
[1]楊運華.運動對胰島素抵抗狀態下胰島素PI3K/Akt/GSK-3信號傳導通路影響的研究進展[J].長江大學學報（自然科學版），2013（21）：142-145.
[2]黃秀蘭，崔國輝，周克元.PI3K/Akt信號通路與腫瘤細胞凋亡關系的研究進展[J].癌癥，2008，27（3）：331-336.
[3]朱裕華，袁紅花，吳連連，等.IGF-1通過PI3K/Akt信號誘導神經干細胞向神經元分化[J].山東大學學報（醫學版），2014，52（3）： 11-15.
動物行為學分析方法范文2
[關鍵詞] SOD；Ca2+-ATP酶；復方地黃
[中圖分類號] R285.5[文獻標識碼]A [文章編號]1673-7210（2008）10（b）-008-02
Effect of Compound Dihuang on SOD and ATP enzyme in SAM-P/8 mice brain
SUN Li-hui, HOU Jin-cai, HOU Kui-yuan, FEI Hong-xin*
(Qiqihar Medical University, Qiqihar 161042, China)
[Abstract] Objective: To observe the influence of Compound Dihuang on SOD and ATP enzyme in the brain of SAM-P/8 dementia mice. Methods: SAM-P/8 mice were divided randomly into model group, pisacetam group and Compound Dihuang group, and then the changes of SOD, Na+-K+-ATP enzyme, Ca2+-ATP enzyme and coordinated motion function of each group were observed. Results: Compound Dihuang changed the coordinated motion function of SAM-P/8 dementia mice and enhanced the activities of SOD, Na+-K+-ATP enzyme as well as Ca2+-ATP enzyme. Conclusion: Compound Dihuang can change the activities of SOD, Na+-K+-ATP enzyme and Ca2+-ATP enzyme of SAM-P/8 dementia mice, which indicates that Compound Dihuang shows a protective and therapeutical effect on Alzheimer disease(AD).
[Key words] SOD; Ca2+-ATP enzyme; Compound Dihuang
阿爾茨海默病(AD)是成年癡呆中最常見的一種類型，其病因十分復雜，發病機制至今不清?；谥嗅t理論、已有的研究成果及診治AD的經驗，祖國醫學認為AD的發病機制為腎精虧虛、痰濁阻竅、淤血阻滯。復方地黃有益腎健脾、祛痰清瘀、滋陰養血的作用，研究報道應用此藥物防治AD，已取得較好的效果[1-3]。在此基礎上，繼續選用SAM-P/8小鼠，對復方地黃的療效作進一步觀察，為臨床用藥提供理論依據。
1材料與方法
1.1 材料與試劑
超純水儀系Purelab plus公司產品；日本快速老化癡呆小鼠SAM-P/8，天津中醫學院第一附屬醫院實驗動物中心提供；健康昆明種雄性小鼠由齊齊哈爾醫學院實驗動物中心及哈爾濱醫科大學實驗動物中心提供；SOD、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、考馬斯亮藍測定試劑盒均由南京生物工程公司提供。
1.2 小鼠分組
將30只SAM-P/8小鼠隨機分為模型組(M)、腦復康組(N)、復方地黃組(F)，并隨機選取10只7個月健康小鼠作為老年對照組(L)，10只2個月齡小鼠作為青年對照組(Q)。復方地黃灌胃液2 ml/(只?d)(生藥475 mg/ml)；腦復康水溶液2 ml/(只?d)，青年組及老年組以等量水灌胃。3周后處死小鼠。
1.3 行為學測試
處死小鼠前先進行行為學測試，采用爬桿法：使用一根光滑的金屬棒垂直倒立，將小鼠置于棒的頂端，頭向下使其自然向下爬行，觀察小鼠的協調運動情況。協調運動的標準可分為：0級，一步一步向下爬；1級，向下爬行；2級，不能抓住棒；3級，翻正反射消失。在0~3級又設0.5級、1.5級和2.5級。小鼠的正常分值范圍為0~0.5級。
1.4 檢測SOD、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的活性
小鼠測試行為學后，斷頭處死，進行腦組織稱重，加入4倍體積冷生理鹽水勻漿, 3 000 r/min離心10 min，棄沉淀，得去核上清。將此上清10 000 r/min離心10 min，得去膜上清，沉淀為破碎細胞膜和線粒體等。用10 mmol/L Tris緩沖液洗2次,10 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀用Tris緩沖液懸浮，供膜SOD、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶測定用。SOD測定采用黃嘌呤氧化酶法，Na+-K+-ATP酶測定采用定磷法，蛋白測定采用考馬斯亮藍蛋白定量法，測定步驟按考馬斯亮藍試劑盒說明進行。
1.5 統計學方法
數據以均數±標準差(x±s)表示，以SPSS 10.0統計軟件分析，計量資料采用t檢驗分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。
2 結果
2.1 小鼠協調運動水平分析結果(表1)
由表1可知，F組與M組比較，小鼠協調運動能力有顯著差異(P
2.2小鼠腦組織SOD測定分析(表2)
由表2可知，F組與M組比較，SOD活性明顯增強(P
2.3 小鼠腦組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性水平(表3)
由表3可知，F組與M組比較，ATP酶活性均明顯增強(P
3 討論
AD的模型有很多種，如轉基因動物模型、興奮性毒素損害模型、淀粉樣蛋白誘發動物模型、化學損傷模型及老年動物等。在這些模型中，轉基因動物模型最明顯的優點是模擬了AD的神經病理學改變，包括細胞淀粉樣蛋白沉積、老年斑的形成、神經膠質細胞增生以及與AD相似的腦區特異性突觸密度喪失等。當前公認的AD動物模型首推SAM-P/8小鼠。
SAM為快速老化小鼠，是日本京都大學竹田俊男教授開發的一種較理想的快速老化動物模型，具有壽命短、老化快、老化病理改變典型等優點。SAM-P/8為SAM中的一個品系，以癡呆為主要特征，其組織病理學基礎是部分腦區神經元及神經纖維壞死，腦皮質萎縮。
祖國醫學認為，老年性癡呆以本虛為主，兼有標實之證，本虛腎精虧虛，心脾兩虛、標實則為痰濁阻竅，氣滯血淤中，氣血不足是形成痰濁淤血的病因，痰濁淤血又使臟腑功能紊亂，加速氣血虧損。復方地黃組行為學分值分數為(1.250±0.463)分，與模型組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，提示復方地黃可以改善老年癡呆模型小鼠的癡呆狀態。另外，復方地黃組SOD活性較高，為(240.213±8.635)分，與對照組比較有顯著差異(P＜0.05)，提示復方地黃可以增強SOD的活性，SOD 作為體內重要的抗氧化酶，在氧化防御體系中起著重要作用，可以延緩衰老。復方地黃還可以增強Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的活性，對機體的能量供應起到重要作用[4,5]。
綜上所述，復方地黃能夠改變SAM-P/8癡呆小鼠的協調運動功能，增強SOD、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的活性，表明復方地黃對AD有保護和治療作用。
[參考文獻]
[1]Goate A, Chartier-Harlin MC, Mullan M, et al. Segregation of amissense mutation in theamyloid precursor protein gene with familial Alzheimer's disease [J].Nature,1991,349:704-706.
[2]Li YC, Bao YM, Jiang B,et al. Catalpol protects primary cultured astrocytes from in vitro ischemia-induced damage[J]. Int J Dev Neurosci,2008, 26(3-4):309-317.
[3]魏昌秀,李慶明,蒙榮森.中藥復方腦還丹對快速老化鼠SAM-P/8海馬CA1區超微結構的影響[J].貴州醫藥,2005,29(9):790.
[4]Tan W, Song CS, Tan HL,et al. Hematopoietic effect of siwu decoction in the mice with blood deficiency induced by compound method of bleeding, starved feeding and exhausting[J].Zhongguo Zhong Yao Za Zhi,2005,30(12):926-929.
[5]孫麗慧,陸佰榮,孫廣惠.腦健膠囊防治老年性癡呆神經遞質改變實驗研究[J].醫學研究通訊,2002,31(8):38.
動物行為學分析方法范文3
關鍵詞:運動生理學;運動醫學;慢性應激抑郁模型;行為學;體重;動物實驗
中圖分類號:G804.2文獻標識碼:A文章編號:1006-7116(2010)11-0100-06
Effects of exercising on the ethological expressions and body weight of
chronic stress induced depression model rats
WEI Hong-wen1,JIAO Wei1,ZHANG You-zhi2,ZHAO Nan2,XUE Rui2
(1.Sports Rehabilitation Depatrment,Beijing Sport University,Beijing 100084,China;2.Institute of
Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Medical Sciencet,Beijing 100850,China)
Abstract: In order to observe the effects of exercising on the ethological expressions and body weight of chronic stress induced depression model rats, the authors replicated depression model rats by means of chronic unpredictable stress (CUS), used fluoxetine (Flu, a classical antidepressant) as a control, observed the effects of medium intensity treadmill running (MIR) and low intensity treadmill running (LIR) on the ethological expressions and body weight of depression model rats in chocolate milk anhedonia experiment, start experiment and novelty inhibition ingestion experiment, and revealed the following findings: 1) ethological study: CUS could significantly lower the degree of addiction of the rats to chocolate milk, reduce their spontaneous activity, and prolong their ingestion latent period in a novel environment; fluoxetine could significant counteract the said changes; with the continuance of exercising, chronic stress had fluoxetine consistent anti depression like behavior functions; 2) body weight change: CUS significantly inhibited the increase of body weight of the rats, Flu, Flu+MIR and Flu+LIR were all unable to improve the slow increase of body weight of CUS rats; MIR and LIR can improve the condition of slow increase of body weight of CUS rats; their weekly body weight had no significant difference as compared with the rats in the CUS group. The said findings proved the followings: depression model rats showed body symptoms of slow body weight increase and depression like ethological expressions such as anhedonia, spontaneous activity slowdown and ingestion latent period prolongation; exercising has fluoxetine consistent anti depression ethological effects on CUS rats.
Key words: sports psychology;sports medicine;chronic stress induced depression model;ethology;body weight;animal experiment
抑郁癥(depression)屬于情感性精神障礙(mood disorders),是一種以明顯而持久的心境低落為主要特征的綜合征,其高發病率、高復發率和高自殺率對社會造成了極大危害。世界衛生組織(WHO)預計,到2020年,抑郁癥將在全球疾病負擔排名中居第2位[1]。目前治療抑郁癥的藥物普遍起效較慢,有效率也只有60%~70%,且部分難治性抑郁癥更是目前治療的難點[2]。
研究顯示,抑郁癥發生與長期缺乏健身鍛煉有關,不參加運動本身就是導致抑郁癥的重要因素[3]。經常從事體力活動的人患精神疾病的比率明顯低于很少進行體力活動的人[4]。近年來臨床在治療精神類疾病的過程中發現,運動療法用于精神疾病和腦疾病的治療與康復顯現出良好的效果[5],而且運動與抗抑郁病藥物相結合對治療抑郁病比單一藥物療法有效[6-7]。但這些研究仍停留在一般的問卷調查或診療觀察上,缺乏運動抗抑郁作用的機制研究。
慢性不可預知性應激(Chronic Unpredictable Stress,CUS)是近年來國內外應用最為廣泛的抑郁動物模型之一,它可模擬抑郁的核心癥狀――缺乏(anhedonia),目前被廣泛運用于抑郁癥的病理生理機制、抗抑郁藥物研發及作用機制的研究[8]。本研究通過復制CUS大鼠模型,觀察運動對CUS模型大鼠行為學表現和體重的影響,以經典抗抑郁劑氟西汀(Fluoxetine,Flu)作為對照,旨在探討運動的抗抑郁樣的作用。
1材料與方法
1.1實驗動物
65只成年SD雄性大鼠,SPF級,購入時體重150~160 g,購自維通利華實驗動物有限公司,許可證編號:SCXK(京)2007-0001。大鼠每籠4只群養,自由攝食飲水,室溫22~24℃,相對濕度(50±10)%,自然晝夜節律光照。
1.2主要儀器設備
DSPT-202動物跑臺(杭州段氏,中國),VIDEOMEX-V 圖像運動解析系統(Columbus Instruments,美國),大鼠穿梭箱反應儀(Med Associate,美國),噪聲儀(中國)。
1.3實驗設計
1)實驗流程。
大鼠購入后安靜飼養3 d后,進行1周跑臺適應性訓練,接著進行為期4周的慢性不可預知性應激。期間針對不同的組別,分別伴隨給予氟西汀、跑臺訓練干預措施,每周測定體重,并在慢性應激結束后進行開場實驗[9]、巧克力牛奶缺失實驗[10]、新奇抑制攝食實驗[11]。
2)動物篩選及分組。
適應性跑臺訓練負荷安排:坡度=0,跑速=5~10~15 m/min,10~15~20 min/次,1次/d×6 d。訓練期間不使用電擊裝置驅趕大鼠,以避免對大鼠施加不良應激[11]。
將篩選出來的大鼠,根據體重均衡分為7組,每組8只。各組之間體重差異沒有顯著性(P>0.05)。各組具體情況見表1。
3)大鼠慢性應激模型的建立。
參考文獻[9,11,13]方法,并盡量使應激程序符合不可預知性的特點,連續4周每天下午時間給予大鼠采用1~2種如下刺激:禁食24 h、禁水24 h、潮濕飼養(200 mL水加150 g墊料)+孤養24 h、鼠籠45°傾斜24 h、夾尾1 min、電擊(0.8 mA,電擊每分鐘間隔15 s,共30 min)、通宵照明12 h、白噪音(110 dB)1 h、10℃冰水游泳6 min、制動1~2 h。
4)藥物干預。
Flu組、Flu+LIR組、Flu+MIR組每次應激前1 h給予氟西汀(Fluoxetine Hydrochloride,批號000530,白色粉末,純度>99%,由常州第四制藥廠惠贈),灌胃給藥(10 mg/kg),給藥體積2 mL/kg,1次/d。其余組大鼠灌胃給予相應體積的生理鹽水。
5)跑臺訓練。
每天08:30~12:30進行跑臺運動。具體訓練負荷安排見表2。
1.4統計學分析
所有數據以“平均數標準差”( s)表示。統計分析用Windows SAS 6.12軟件完成。SAS引導程序引自文獻[14]。
2結果及分析
2.1跑臺訓練篩選情況
大約至少有10%的大鼠天生不會跑動或者不愿意跑動[12]。所以,在大鼠購入后安靜飼養3 d后進行1周的跑臺適應性訓練,剔除了9只不愿意跑動的大鼠。
2.2巧克力牛奶缺失實驗
由于液體攝入量與體重大小有關,所以各液體攝入量以每kg體重計算。實驗日從2000開始進行測試,測定2 h內大鼠攝入液體的相對質量。結果顯示(表3):各組大鼠液體攝入總量沒有顯著性差異(P>0.05);除CUS組外,其他各組大鼠巧克力牛奶攝入量均顯著多于水攝入量(P
2.3自發活動
將大鼠放入不同于飼養環境的新環境時,首先表現為對新異環境的探究行為,經過l5 s對新異環境的適應和熟悉,然后開始自發活動測試。
采用Videomex-V圖像運動解析系統測定大鼠自發活動,結果顯示(見表4),與Control組相比,CUS組大鼠自發活動減少,表現為測定時間內的活動總路程顯著減少(P
2.4攝食潛伏期
結果顯示(見表4),與Control相比,CUS組大鼠在新奇環境中的攝食潛伏期明顯延長(P
2.5體重
結果顯示(見表5):CUS開始前各組大鼠體重差異無顯著性(P>0.05),符合實驗的基本要求。慢性應激對大鼠體重有明顯影響,CUS組大鼠在2周后體重開始顯著低于Control組(P
3討論
在應激致抑郁的動物模型中,開場實驗、糖水消耗量、體重變化是經典的反映動物抑郁行為學及軀體癥狀的指標[14]。根據文獻,并結合本實驗室的以往研究成果[9,11,13]和實驗條件,本研究選取巧克力牛奶缺乏實驗、開場實驗、新奇抑制攝食實驗這3個行為學測驗,結合大鼠體重的變化,來綜合評價造模的效果。
3.1巧克力牛奶缺乏實驗
CUS抑郁模型腦內獎賞系統一些神經元結構受損,導致快樂體驗能力的缺乏[15]。動物對甜覺獎賞的反應性下降是最簡單、最易于觀察的指標,因此目前國外大多數學者采用液體消耗實驗中糖水消耗量和糖水偏愛百分比來作為測量缺乏的有效客觀指標[8-9,11,13,15],也有研究用巧克力牛奶缺乏實驗(chocolate milk anhedonia test,CMAT)[10]、甜味食物攝取量(sweet food intake)或甜味食物攝取比值(rate of sweet food intake)、美味食物攝取(palatable food intake)、顱內自我刺激(brain stimulation reward)、位置偏愛實驗(place preference conditioning procedure)等實驗來測量[16]。
傳統的糖水消耗實驗由于存在許多繁瑣的步驟[8],如:需要進行糖水基線訓練和測試,大約有10%~15%的動物不能獲得穩定的糖水攝入基線,而且還有同樣比例的應激動物經過3周應激后糖水攝入量并沒有清晰和穩定的減少,這些動物需要淘汰;在實驗時要進行控制飲食等復雜的工作。還有文獻報道,大鼠糖水攝入量(或糖水偏嗜度)在慢性應激后沒有下降,有的抗抑郁藥也不能恢復慢性應激動物下降的糖水攝入量[17]。盡管上述局限性可能與研究者所采用的動物品系、應激程序和糖水實驗方法的不同有關,但從另一方面提示了糖水消耗實驗的方法不夠穩定和敏感,這在很大程度上限制了該實驗在抑郁癥研究領域的應用。
CMAT是另外一種反映動物缺乏的實驗,該方法不需要事先進行液體消耗的訓練,只需要進行一次性測試,具有快速、簡便的特點[10]。
本研究結果表明,在液體攝入總量沒有差異的情況下,CUS大鼠攝入了較多的水,而Control組大鼠攝入了較多的巧克力牛奶,相對于Control組大鼠而言,CUS組大鼠對對巧克力牛奶“沒有興趣”,提示其出現了“缺乏”。大鼠巧克力牛奶飲用量的下降不能單純地解釋為液體飲用的下降(即渴覺的下降),因為動物總液體消耗量并無明顯改變,而巧克力牛奶攝入量、巧克力牛奶偏嗜度顯著下降,提示本研究的CUS模型表現出了動物對幸福事件反應能力的下降。
結果還表明,CUS伴隨給予氟西汀,進行中、小強度運動跑臺訓練,以及氟西汀分別聯合中、小強度運動跑臺訓練,均能夠顯著提升CUS大鼠對巧克力牛奶的“興趣”,“缺乏”顯著減少。表明CUS大鼠出現了抑郁癥的核心癥狀――缺乏,而運動、氟西汀均能夠改善此核心癥狀。
3.2開場實驗
本實驗采用Videomex-V圖像運動解析系統測定動物的自發活動(spontaneous motor activity),該系統能夠自動識別動物的運動軌跡,減少了實驗工作量,更重要的是提高了實驗數據的精度和可靠性。結果顯示,CUS使大鼠自發活動減少,表現為測定時間內的活動總路程顯著減少,與本研究室[8,10,12]以及國外文獻報道一致[17]。CUS伴隨給予氟西汀、進行中等強度跑臺訓練、氟西汀分別聯合中、小強度跑臺訓練均能夠顯著增加CUS大鼠活動距離。表明跑臺運動能夠使CUS大鼠維持一定的自發活動,減少抑郁樣行為。
3.3新奇抑制攝食實驗
新奇抑制攝食實驗(novelty-suppressed feeding,NSF)是動物禁食后在饑餓狀態下新奇的環境中產生攝食和對新環境恐懼的矛盾沖突,長期給予抗抑郁藥物可使動物的沖突反應降低,表現為開始攝食的潛伏期縮短,該模型目前被廣泛應用于抗抑郁劑以及抗焦慮藥物的長期效應評價[11]。
本研究結果表明,與Control相比,CUS組大鼠在新奇環境中的攝食潛伏期明顯延長,慢性應激伴隨給予氟西汀能夠顯著縮短CUS大鼠攝食潛伏期,這與本研究室以往研究結果[9,11]一致。
運動對NSF實驗影響的報道較少。自由轉輪運動顯著縮短了正常小鼠攝食潛伏期,但對LID小鼠(一種以血清IGF-1較低為特點的突變小鼠)攝食潛伏期沒有顯著影響[19]。目前尚未見運動對CUS大鼠NSF影響的文獻。
本研究顯示,CUS伴隨進行中、小強度跑臺訓練,氟西汀分別聯合中、小強度跑臺訓練,均能夠顯著縮短CUS大鼠攝食潛伏期。表明運動,以及抗抑郁藥聯合運動,均能夠縮短抑郁模型大鼠攝食潛伏期,運動在該模型上顯示出較好的抗抑郁樣作用,而且運動進一步加強了氟西汀在新奇抑制攝食模型上的抗抑郁作用。
3.4體重
體重的變化可以看作是抑郁大鼠模型量化的軀體癥狀和體征,抑郁大鼠體重增長緩慢,這與抑郁癥患者的食欲降低、消瘦相類似[8]。
本研究對大鼠每周測定一次體重,結果發現,CUS對大鼠體重有明顯影響,CUS組大鼠在2周后體重開始顯著低于Control組,并且一直延續到慢性應激的第3周和第4周;慢性應激伴隨給予氟西汀,未能改善CUS大鼠體重的增長緩慢,表現為從慢性應激2周后開始到慢性應激結束后,每周體重均顯著低于CUS組;CUS伴隨進行中、小等強度跑臺運動,能夠改善CUS大鼠體重增長緩慢的情況,而且對抗CUS抑制體重增長的情況優于慢性應激伴隨給予氟西汀,表現為LIR組、MIR組與CUS組相比,在整個實驗期體重差異均沒有顯著性,LIR組體重在4周后,MIR組在3周、4周后體重還顯著高于Flu組;CUS伴隨給予氟西汀并分別聯合中、小強度跑臺訓練,也未能明顯改善CUS大鼠體重增長緩慢的情況,表現為從慢性應激2周后開始到慢性應激結束后,每周體重均顯著低于CUS組;Flu+LIR組、Flu+MIR組在慢性應激3周后開始到慢性應激結束,體重均分別顯著低于LIR組、MIR組。
由于本實驗對大鼠進行群養(4只/籠),群養大鼠進食過程中經常有食料遺撒現象,而且慢性應激程序中有禁食、禁水的項目,故無法精確計量每只大鼠的進食量。因此,慢性應激導致大鼠體重增長緩慢,本研究分析可能與HPA軸有關:下丘腦分泌的CHR不但可以刺激垂體釋放ACTH,而且是調節能量平衡和體重的重要因子。慢性應激導致大鼠體重增長緩慢,可能是HPA軸被激活,下丘腦分泌的CHR引起食欲減退,以及在應激條件下能量消耗增加,兩種因素雙重作用的結果[20]。而慢性應激伴隨給予氟西汀進一步降低大鼠體重的原因,與氟西汀的藥理作用有關。氟西汀屬于擇性5-HT再攝取抑制劑,其主要藥理作用在于選擇性地抑制CNS突觸前細胞對5-HT的再攝取,可以通過增加大腦自身的5-HT供給來糾正這種神經遞質的缺乏,從而能夠有效控制抑郁癥的癥狀。動物實驗表明增加突觸間隙5-HT或直接刺激5-HT2C受體可減少進食,反之則增加進食[21]。因此,氟西汀通過升高突觸間隙的5-HT水平,減少了大鼠的進食,進而導致體重下降。
我們也發現與本研究結果類似的報道[11,22],即:抗抑郁藥物能夠有效改善甚至逆轉CUS大鼠抑郁樣行為,但是不能改善其體重的緩慢增長。因此,我們存在這樣的疑惑:盡管抑郁模型大鼠表現出體重增長幅度減少或體重下降已經得到許多研究的驗證,但是當氟西汀能夠有效改善抑郁模型大鼠的行為學異常時,為何不能逆轉其體重下降?是因為本研究的大鼠在總共為期5周(1周適應期,4周慢性應激期)的實驗后(已達10周齡)已錯過了生長發育的最佳時期,慢性應激對其生長發育造成不可逆的抑制,從而使抗抑郁藥物不能恢復其體重增長,還是抗抑郁藥物在發揮抗抑郁作用的同時,也作用于神經內分泌系統的某個靶點,對大鼠體重增長產生抑制作用?這有待于后續工作的深入研究。
本研究結果還說明,慢性應激伴隨進行跑臺訓練,對于大鼠體重增長緩慢有一定的改善作用,對于保持動物的體重有一定的效益。原因可能是適量運動部分平衡了HPA軸的功能,還有可能是運動促進機體新陳代謝,增加了大鼠的食欲,后者引起體重的增長。這有待于今后進一步的驗證。
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動物行為學分析方法范文4
摘要：【目的】觀察復聰香液對血管性癡呆大鼠海馬CA1區神經元形態結構的影響。【方法】SD大鼠40只隨機分為4組，分別為假手術組、模型組、腦復康對照組和復聰香液組，經反復腦缺血再灌流加降血壓法造模后，分別給予生理鹽水、復聰香液及腦復康溶液，連續15?d后腦部取材，蘇木素伊紅（HE）染色觀察海馬CA1區組織形態變化?！窘Y果】與假手術組比較，模型組可見大量神經細胞損傷、變性，甚至壞死；而復聰香液及腦復康均能不同程度地減輕神經細胞損傷?！窘Y論】復聰香液對血管性癡呆模型大鼠大腦海馬CA1神經元損傷具有一定的保護作用。
關鍵詞：復聰香液／治療應用； 癡呆，血管性／中藥療法； 癡呆，血管性／病理學；疾病模型，動物； 大鼠
癡呆的發病機制涉及多個方面，其中最主要的是老年退行性變與血管性癡呆。血管性癡呆（vascular dementia，VD）是由于缺血性或出血性腦血管病以及全腦性缺血、低氧而引起的認知障礙，是以記憶減退、表情淡漠、呆滯，或人格改變為主要臨床表現的一組神志異常綜合征［1］。本實驗觀察了復聰香液對血管性癡呆模型大鼠海馬CA1區神經元組織的影響，現報導如下。
1 材料與方法
11 材料
111 動物 成年雄性SD大鼠40只，清潔級，體質量180～220?g，由第一軍醫大學動物實驗中心提供（合格證號：2002A041號）。動物分組情況：按照水迷宮訓練成績隨機分為4組：
（1）假手術組；（2）模型組；（3）腦復康陽性對照組；（4）復聰香液組。
112 藥品與試劑 復聰香液，由銀杏葉、石菖蒲、麝香、冰片等加工制成，廣東江門市五邑中醫院制劑室提供，批號020919，分為A液及B液（B液為原方水提濃縮液，A液則為原方揮發油部分的提取液）；腦復康由廣東華南制藥廠生產，批號為020803，臨用時蒸餾水溶解；硝普鈉由北京雙鶴藥業股份有限公司加工生產，批號為0206211。
12 方法
121 模型制備
參照王蕊［2］等造模方法，將大鼠麻醉后，分離暴露雙側頸總動脈；硝普鈉按25?mg/kg腹腔注射后即刻用無創動脈夾夾閉雙側頸總動脈10?min，然后復通10?min，再次夾閉10?min，再通后縫合。實驗過程中使大鼠肛溫保持在（375±03）℃，以防止低溫對腦缺血損傷的保護作用，術后保溫飼養。
122 給藥方法
待動物造模清醒后即開始給藥。復聰香液組按425?μL?kg－1?d－1隨氧吸入A液1?h，495?g?kg－1?d－1劑量灌胃B液；陽性對照組給予腦復康，按4?g?kg－1?d－1灌胃，模型組和假手術組給予等容量的生理鹽水灌胃，連續灌胃15?d后，進行行為學測試，然后取腦組織。
123 病理學檢查
大鼠斷頭處死后，迅速取大腦，用體積分數為10%的市售福爾馬林固定，在前囟后17?mm處切取腦組織，石蠟切片，蘇木素伊紅（HE）染色，光鏡下觀察海馬CA1區的病理變化。
2 結果
假手術組可見海馬CA1區錐體細胞排列整齊、密集，形態正常，結構完整，無變性，膠質細胞無增生；模型組見錐體細胞排列紊亂，胞體腫脹，胞膜溶解，有空泡產生，出現核固縮，核裂解，膠質細胞增生形成多處結節；復聰香液組和腦復康組僅見少數細胞變性壞死，錐體細胞排列較模型組整齊，正常細胞數目增多。結果見圖1。
假手術組（pseudooperation group，10×10）
假手術組（pseudooperation group，10×40）
模型組（model group，10×10）
模型組（model group，10×40）
腦復康組（Naofukang group，10×10）
腦復康組（Naofukang group，10×40）
復聰香液組（FL group，10×10）
復聰香液組（FL group，10×40）
圖1 各組海馬CA1區神經元形態學比較（略）
Figure 1 Histological features of hippocampal CA1 neurons in different groups 3 討論
中醫認為血管性癡呆病位在腦，涉及肝腎心脾諸臟，尤與腎中精氣的盛衰密切相關；多因年高正損、情志內傷等因素引起臟腑陰陽氣血失調，以致痰瘀濁毒阻絡窒竅，造成腦絡閉塞、神機失用而發??；本病病性為本虛標實，其本為精氣虧虛，其標為痰瘀濁毒內阻。故治療上應采用化濁豁痰開竅，益氣祛瘀醒神之法。復聰香液是經過長期的臨床實踐針對本病的病因病機所擬的標本兼顧之劑。方中運用石菖蒲、麝香、冰片、薄荷腦等芳香化濁，祛痰開竅；川芎、郁金、丹參、銀杏葉等活血化瘀；黃芪、羊藿等益氣補陽，標本兼治，虛實兼顧，使得實邪得以祛，正氣得以復。從現代藥理學角度來看，近年來中醫藥治療本病研究的重點在于改善神經遞質傳導，改善自由基代謝，改善微循環，抗細胞凋亡等，而本方中運用的藥物如丹參、川芎、銀杏葉、石菖蒲、冰片等，均有報道顯示其所含的成分具有以上作用。
石菖蒲揮發油不僅能降低凋亡細胞的積分光密度，也能降低凋亡細胞數，對腦神經細胞具有保護作用［3］；川芎嗪能在某種程度消除超氧陰離子，阻止自由基反應造成的脂質過氧化，從而減輕缺氧缺血后再灌注損傷，達到治療目的［4］；銀杏葉提取物可以明顯改善反復腦缺血再灌注小鼠的學習和記憶功能，同時可不同程度地抑制腦組織中異常升高的丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）和前列腺E2（PGE2）的含量，明顯增強腦組織中降低的超氧化物歧化酶（SOD）［5］活性；黃芪、丹參、川芎等可明顯改善腦缺血再灌注動物的腦組織血氧代謝，增加腦組織血液容量［6］；冰片能促進某些藥物透過血腦屏障，促進其他藥物透皮吸收，提高其他藥物的血藥濃度和生物利用度［7］。
病理學檢查是評價腦缺血損傷和治療效果的一個比較客觀的指標。海馬是腦組織中對缺血、缺氧最敏感的區域之一，而其中的CA1區又是海馬中最易受損的部位。從本實驗結果可以看出，假手術組大鼠海馬CA1區結構完整，錐體細胞排列整齊，而模型組結構不完整，錐體細胞排列紊亂，細胞脫失嚴重，證實了缺血對海馬的損傷。復聰香液組海馬CA1區的細胞脫失明顯少于模型組，表明本方對血管性癡呆模型大鼠海馬CA1區神經元的缺血性損傷具有保護作用。復聰香液對血管性癡呆模型行為學的研究表明，與對照組比較，模型組大鼠游完全程時間延長，錯誤次數增多，學習記憶能力下降，復聰香液能使上述情況改善，統計學分析差異有顯著性［8］。
本方的制作工藝及臨床用藥方法有獨到之處。在制作上，是將處方中諸藥煎煮后，收集藥物的揮發油部分加工制成A液，并將剩余藥液去除雜質后濃縮加工成B液。在臨床用藥上，口服B液的同時，還將A液混合于低流量氧氣中，使藥液的揮發油部分隨氧氣吸入，透過鼻粘膜下豐富的血管吸收入血液，促使腦細胞功能更快地恢復。經鼻腔給藥是近年來一種較新穎的給藥途徑，而中藥藥氧吸入法治療血管性癡呆目前也較為少見。國內外的一些研究顯示，鼻腔給藥療效優于口服給藥，而與靜脈給藥近似［9］。但本研究中復聰香液的給藥途徑療效是否確實比其他途徑要好，有待進一步證實。
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動物行為學分析方法范文5
關鍵詞：焦慮， 抑郁， 神經環路， 分子機制，光學成像， 電生理，鈣成像，晝夜節律
Neural circuits and molecular mechanisms underlying anxiety and depression
Abstract：Anxiety and depression are common human emotion and mood disorders， and their underlying neural mechanisms remain largely unknown. In this project， we plan to use mouse as the model system to study the neural circuits and molecular mechanisms of anxiety and depression， at the levels ranging from molecules to animal behaviors. The first team carries out the cellular physiological studies of animal anxiety and depression. The malfunctions of the serotonin （5-HT） system are related to anxiety， anhedonia， and depression. We examined the behavioral effects of activating 5-HT neurons in the dorsal raphe nucleus （DRN）， the major source of 5-HT in the forebrain. By combining optogenetics， single-unit recordings， pharmacology， mouse genetic， and behavioral assays， we find that the activation of DRN 5-HT neurons produces strong reward signals that are mediated through the release of 5-HT and glutamate. Our results demonstrate that the DRN directly mediates reward， provides new insights into the intervention of depression and schizophrenia， which often manifest as the disorders of emotion and mood. The second team mainly focus on the interactions between circadian/circannual rhythms and the mood regulation. Here we present some substantial progresses on three aspects. First， we discovered that the C3H mouse strain is particularly suitable for studying seasonal affective disorders （SAD）， highlighting the light-entrainment， or seasonal-mimicking， in mood regulation. Second， we found that the deletion of Bmal1 or Clock gene in the brain VTA area developed a counter-depression effect in mice， suggesting the engagement of the circadian clock in mood regulation. Finally， we have developed a cell-based high-throughput screen assay to identify clock modifier drugs， which are potentially useful to cure or relieve the mood disorders such as depression in humans. The third team is tasked to perform optical imaging studies of the neural circuits. We have established the optical methods and platforms to study the neural circuits underlying anxiety and depression， carried out the preliminary experiments of studying the whole-brain projection patterns as well as calcium imaging of NE/E neurons in the brain. In addition， we have completed the study of the behavioral functions of POMC neurons in thebrain. In summary， we are smoothly on the track of our research schedules， and are well-positioned to make more exciting findings in the future years.
動物行為學分析方法范文6
白城醫學高等?？茖W校，吉林白城 137000
[摘要] 目前，關于學習記憶在腦中如何形成的機制一直受到人們的關注。經過若干年的動物實驗研究，目前已經開展并提高了許多研究學習記憶機理的動物實驗模型。其中最完美、最廣泛應用的是驚恐條件反射模型，該模型是以條件反射為基礎，將條件刺激（如電擊）和非條件刺激（如聲音）有機結合，觀察動物對刺激的反應情況，以此來衡量動物恐懼經驗獲得并保存的能力。
關鍵詞 驚恐條件反射模型
[中圖分類號] R392 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2014）05（c）－0196-02
[作者簡介] 高明春 （1973.3-），女 ，吉林白城人，碩士研究生，副教授，從事高職高專教學及學生管理工作。
在20世紀后期，人們對精神疾病的研究愈加深入，在神經科學家和臨床科學家的研究下，建立了驚恐條件反射模型，為學習記憶機制的研究奠定了基礎。驚恐條件反射，又稱條件性恐懼[1]，是指動物在實驗中先接受兩種不同性質刺激的作用，其中一種稱為條件刺激，另一種稱為非條件刺激，結果動物就會出現各種害怕行為；接下來單獨給予條件刺激，動物即可出現恐懼反應：如應激性心跳加強，僵直動作等。
在過去的幾十年中，科學家們根據實驗動物在行為學方面的改變，主要研究驚恐條件反射模型的方法及類型。在實驗的研究中，常采用動物獨特的驚愕反應特征和活動范圍、規律的改變以及對環境的新穎性、好奇性來評價驚恐條件反射的狀況，目前較成熟的實驗方法有如下幾種[2-5]。
1 “田”字型區域實驗
該裝置由一正方形圍邊組成基本框架，厚度為1~2 cm，距離地面高度50 cm。內部平均分為四部分，呈“十”字型的四個區域即可，其中2個為無障礙的開放區，2個為封閉區。方法如下：首先將大鼠或小鼠放入十字的中央，單位時間內觀察動物的行為，分別記錄進入2種區域的次數和時間。正常情況下，因鼠類喜歡黑暗、密閉的環境，因此主要活動場所為寂靜、安全的封閉區。如果動物非上訴活動情況，而是進入開放區的頻率增加，逗留時間加長，則標志著恐懼反應的發生。
2 Oen-field實驗
該實驗中，在光滑、平整、潔凈的地面上，用50 cm高金屬絲圍成3個同心圓，直徑分別為20 cm，40 cm和60 cm，并鋪上黑色地毯，在圓心上方70 cm處配以白色和紅色兩種燈光照明作為條件刺激，同時在最合適的位置安裝攝像機記錄整個場地情況。實驗分為兩部分，首先采用白色燈光照明，2~3 d即可，目的讓大鼠適應環境，接下來換用紅色燈光照明，形成非條件刺激，觀察2~3 d。在具體操作過程中，首先將大鼠放入中央最小的圓圈中，以單位時間內跨越每個圓圈的次數、僵滯百分比、排糞、后腿站立和梳理行為的數量為指標，觀察并記錄，以此為數據進行統計學分析。
3 日常行為改變實驗
該研究依據實驗動物群居、圈養的習性，通過改變環境，觀察原有習性的變化，衡量動物的非條件刺激特點。首先將兩只或多只大鼠放在一個明亮、寬敞的場所，然后觀察并記錄動物的日常行為，如彼此間親吻、聞吸氣味、梳理毛發、叨咬尾巴、爭斗等，作為條件刺激的數據；接下來將大鼠調換置光線暗淡、狹隘的新環境，與較前的相比較而言，動物在新場地里其正常的行為將受到影響，標志著恐懼反應的發生，以此作為對照，非條件化恐懼的特點得以展現及證實。
4 “回”字格迷宮試驗
小鼠或大鼠的天性喜歡黑暗、寂靜的環境，回避明亮、喧鬧的氛圍。依據這一特點，設計一結構為“回”字形的籠子，內部寬敞、明亮、安靜，外部狹窄、昏暗、嘈雜。通常情況下，老鼠在昏暗一側活動行為正常，包括尋找性活動、彼此間吻舔、整理皮毛、后肢翹起等，隨著時間的延長，對環境的陌生會減少，如果恐懼緩解時，就會在明亮的內“口”字一側頻繁出現，或在該側多次、反復、長時間爬行、尋找、嗅吸等，進而來評估實驗動物驚秫反應的程度。
5 掩埋電擊觸頭實驗
在這一模型中，以電擊作為非條件刺激，觀察并研究動物對刺激的反應。實驗籠子內懸掛帶電的金屬掛鉤，當大鼠碰觸掛鉤時便遭到電擊，其會迅速地將籠子內的墊料或其他物品通過前腿堆置掛鉤處將其屏蔽，以防備再次接觸金屬掛鉤而受到電擊。在一般的日?；顒硬粶p少的情況下，遮蔽金屬掛鉤的次數減少就作為衡量恐懼程度的指標。此后，一些學者又做了進一步改進，將不帶電情況下，大鼠觸及金屬掛鉤頻率的增加，作為研究分析恐懼反應的又一指標。
6 電擊導致吼叫實驗
目前，在電腦相關程序的配合下，此類實驗廣泛開展。首先按電腦程序的安排，將大鼠置于裝置內，接受反復電擊，同時記錄尖叫聲，并經由相關軟件程序處理轉化成數據，作為參數提供依據。
7 恐懼誘導性驚愕試驗
該實驗是多種方法結合之后形成的。在裝置中，既有條件刺激如電擊，又配合非條件刺激如聲音、光照，以此為基礎，通過合理配置，研究動物的恐懼反應。首先在籠子底部配以金屬柵格，并與電擊發生器相連，每個大鼠所受電流強度為2.0 mA，100 ms，接下來通過電腦與高頻揚聲器連接，發出55~95 dB的強音，另外將光源置于籠子上方20 cm處。實驗開始時先將大鼠放入不透光的一側，此時零刺激，目的僅為適應環境。然后將噪音和電擊成對作用，電擊的同時，光源發光，形成條件化信息。經過以上過程處理的動物隨機分為兩組，一組24 h后再將大鼠重新置于裝置內，只有噪音和燈光刺激，以此種情況下動物特殊、異常行為的頻率和次數為數據，記錄并整理；另一組只有噪音刺激，結果發現2種或2種以上條件的配合所致驚恐程度比單純一種條件要明顯增強（約80%~100%）。
8 沖突實驗
沖突試驗途徑過程多種多樣，其基本原則是將獎賞與懲戒兩大內容分別組合。以威氏試驗為例，將正常的大鼠禁水48 h后再給予飲水，但約束5 min左右，然后在水管或籠子底部安裝電擊設備，每當大鼠舔吸水管口達一定次數（如10次）就給予微弱的電流短時間刺激；而格氏實驗是把經過處理的的大鼠隨機分為兩組，一組只有獎勵，另一組獎勵+懲罰，兩種條件反復、交替地進行，記錄舔吸行為的次數，作為評定指標。結果發現兩組動物都會因電擊導致動物舔吸行為減少，從而產生條件化恐懼。
研究驚恐條件反射造成的恐懼的意義在于[6-7]：①為研究學習和記憶的機制，開發大腦的潛能，尋找一條新的途徑。通過動物模型實驗證明：由于恐懼的經歷，使得大腦中的記憶系統能夠對環境的改變及時做出反饋，以確保在危險地情況下保存自己。②掌握恐懼與行為的相互關系，指導人類情緒支配行為的原因。③熟悉恐懼的有關醫學原理及內涵，對于焦慮癥、抑郁癥等神經性疾病的診斷和治療具有深遠的影響。
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