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細胞生物學常用研究方法范文1
關鍵詞：細胞生物學 實驗 教學改革
中圖分類號：G642 文獻標識碼：A 文章編號：1673-9795（2014）01（a）-0104-02
細胞生物學是生命科學領域至關重要的基礎學科。近年來，隨著新理論、新概念、新技術的不斷涌現，細胞生物學發展非常迅速。細胞生物學實驗是細胞生物學的重要組成部分，但目前細胞生物學實驗教學普遍滯后于理論課[1～2]。為了使細胞生物學實驗教學質量上一個新臺階，我校對細胞生物學實驗教學進行了改革與初步實踐。在此，我們從課程內容安排調整，實驗教學手段多樣化和實驗考核體系多元化三個方面進行闡述，以期為其他院校的細胞生物學實驗教學的改革提供參考。
1 實驗課程安排調整
傳統的細胞生物學實驗主要是以驗證型實驗為主，實驗內容單一，不能激發學生的學習興趣，不利于學生綜合素質和創新能力的培養。傳統的細胞生物學實驗還存在學時過少，上課時間與理論課脫節的問題。鑒于以上原因，細胞生物學實驗的課程內容和上課時間需要進行重新調整。
1.1 課程內容調整
實驗學時由原來的32學時增加為48學時，實驗內容由原來單一的驗證型實驗被調整為包括驗證型、綜合型和創新設計型三種類型的實驗（見表1）。
1.1.1 調整驗證型實驗
基礎性驗證型實驗的開設是為了鞏固理論知識和基本實驗操作技能的鍛煉，因此，我們保留并重新調整了驗證型實驗。細胞形態結構和大小測量的實驗被融入細胞培養實驗中，小鼠巨噬細胞吞噬的觀察實驗被融入細胞吞噬與融合實驗。DNA的Feulgen染色法和PAS反應法顯示糖原及其它多糖都運用了細胞免疫化學方法，僅保留其一。為了學習不同細胞器的具體分離方法，線粒體的提取與觀察實驗被擴展為葉綠體和線粒體的提取與觀察實驗。
1.1.2 開設綜合型實驗
綜合實驗涉及了多種實驗技術，系統化的綜合實驗有利于鍛煉學生的綜合素質[3]。細胞培養及細胞吞噬與融合被定為綜合型實驗。在細胞培養實驗中，培養材料為配對的正常細胞與腫瘤細胞，實驗涉及了細胞培養液的配制，細胞的復蘇、培養和凍存，以及細胞形態的觀察，大小測量和計數等技術。學生通過正常細胞和腫瘤細胞的比較，為學瘤細胞的基本特性提供了感性認識。在細胞吞噬和融合實驗中，選擇雞紅細胞為材料。以吞噬百分數和吞噬指數為指標，增加不同處理對小鼠巨噬細胞吞噬功能的研究；以聚乙二醇為誘導劑，研究不同的細胞密度、融合溫度、乙二醇濃度及反應時間對細胞融合率的影響，篩選雞紅細胞融合的優化條件。
1.1.3 增加創新設計實驗
最后，我們結合細胞生物學教研室中教師的科研工作，開展了創新設計實驗，進一步培養學生的創新和科研能力[4]。首先，各實驗小組學生根據設計實驗的大方向查閱國內外文獻后進行選題并完成實驗設計。然后，按照小組闡述，學生發表意見，指導教師歸納總結的流程，對實驗設計進行論證。最后，學生對實驗設計進行修改和完善后，親自進行實驗前的準備及操作。
1.2 上課時間調整
為了配合細胞生物學理論知識的學習，細胞生物學實驗的上課時間被調到與細胞生物學理論課同一個學期進行，而且從該學期的第四周開始實驗，此時學生剛剛結束了細胞生物學第三章內容《細胞生物學研究方法和技術》的學習，對于常用的方法有了理論上的知識，有利于理解和掌握實驗的內容。
2 實驗教學手段多樣化
目前，飛速發展的信息技術正以驚人的速度進入到教學的各個領域和環節，推動著教育教學的深刻改革。細胞生物學實驗教學手段多樣化的改革也離不開信息技術，需要現代教育技術的支持。
2.1 采用用多媒體技術
傳統的實驗課教學停留在黑板和掛圖上，受時間和空間限制，難以調動學生學習的積極性。我們采用多媒體進行教學，提供了大量圖表和圖片以及動畫，增加了教學信息量。多媒體教學優化了教學過程，充分調動了學生的積極性，提高了教學效率和教學效果。
2.2 介紹科學文獻
細胞生物學實驗操作技術是為科學研究服務的，教師在實驗開始時展示與開設實驗技術相關的3～5篇中外文科學文獻，注重介紹文獻中的實驗方法，總結實驗方法的進展，讓學生了解實驗方法的最新動態[5]。
2.3 利用網絡教學平臺
網絡教學突破了傳統教學中以“課堂、課本、教師”為中心的教學模式，能夠更快捷和有效的進行信息交流，提高了學生的學習效率。通過實踐和調查，學生通過網絡平臺主要解決了以下問題：第一，學生通過瀏覽網站，可以更有效的進行預習和復習；第二，學生在教學網絡中的實驗經驗交流論壇中，通過交流實驗心得加深了對實驗的理解和掌握；第三，教學網站中提供了專業網站鏈接，便于學生充分利用網絡資源，有利于培養學生的創新精神和創造能力。
3 實驗考核體系多元化
傳統的實驗成績基本上是根據學生的實驗報告給定的，實驗報告以學生抄寫實驗目的、原理、過程為主，不能體現出學生的實驗操作能力和掌握能力，不利于學生良好實驗素質和嚴謹科學態度的培養和形成。因此，實驗考核系統的改革勢在必行，我們采用不同的實驗考核內容和不同的考核方式，即多元化考核體系進行考核。
3.1 基于實驗類型的考核體系
根據基礎性驗證型、綜合型和創新設計型實驗各自的特點，我們建立了基于實驗類型的考核體系，具體實驗考核如下分配。
其中，基礎性驗證型實驗注重考核學生的平時操作及實驗結論，綜合型實驗注重學生的實際操作能力（占80%）。實驗報告包括以下兩方面的內容：第一，對實驗結果的記錄和分析。隨堂記錄實驗結果可以促進學生對實驗操作的重視；第二，通過解答實驗后的思考題鞏固實驗內容。創新設計型實驗注重對學生的創新能力進行考核，其中的論文寫作為以后的畢業論文以及科研論文的寫作奠定良好基礎。
3.2 網絡化考核體系
隨著細胞生物學實驗教學網絡平臺的開發，我們在網絡平臺上建立了考核數據庫。對于耗時時間長的實驗，教師讓學生觀看錄像，然后提出問題進行考核。對于切片觀察的實驗，讓學生對在網絡平臺上隨機抽到的圖片進行解釋。此外，學生可利用計算機進行實驗設計，完成對其創新能力的考核。
4 結語
在細胞生物學實驗教學的改革中，我們通過對實驗課程的內容及上課時間進行重新調整安排，借助多媒體技術、科研文獻的介紹和網絡平臺等實現教學手段多樣化，利用基于實驗類型及網絡的考核體系進行考核，充分調動了學生學習的積極性和主動性，提高了學生的科研和創新能力。
參考文獻
[1] 張曉云，周汝濱，李永泉.《醫學細胞生物學》教學改革的實踐與思考[J].廣東醫學院學報，2004，22（1）：30-31.
[2] 張儉，劉勝貴.《細胞生物學》實驗課程的教改探索[J].黔東南民族師范高等?？茖W校學報，2005，23（3）：71-72.
[3] 孫瞄，毛澤善，穆靈敏，等.開設細胞生物學綜合實驗的改革與探索[J].實驗室科學，2006，4（2）：14-15.
細胞生物學常用研究方法范文2
[關鍵詞]外泌體;分離;鑒定;差速離心法
中圖分類號：TU755 文獻標識碼：A 文章編號：1009-914X（2016）24-0193-01
近年來，越來越多的證據表明外泌體對于細胞生物學以及醫學研究方面具有重要的價值，而由于外泌體的體積結構方面的因素，其分離純化還存在很大的困難，目前比較常用的分離方法有差速離心法、密度梯度離心法、超濾離心法、免疫磁珠法、多聚物沉降法等。
1.差速離心法
陳紹倩[1]等人以白血病細胞系K562細胞為材料，采用多步離心的方法成功地提取到了的外泌體。此種實驗方法操作不是很復雜，實驗設備要求相對簡單，擁有超速離心機和細胞培養設備即可，是一種比較簡便的提取外泌體的方法，基本可以滿足實驗研究的要求。但分離純度不是很高，并且經過多次離心對外泌體的理化性質造成一定的影響。
2.密度梯度離心法
像所有的脂質小囊泡一樣， 外泌體懸浮于特定密度梯度的蔗糖中，其密度范圍從 1.13g/ml到1.210g/ml，將細胞混懸液或勻漿置于蔗糖介質的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離，從而將外泌體從混雜的物質如蛋白聚集物或細胞凋亡的核小體碎片等中分離出來[2]。崔焱[3]等人根據其這一特性，從大量培養的腫瘤細胞上清中分離純化外泌體，并對此進行了電鏡鑒定;在得到大量較高純度的外泌體的基礎上，將其加入含有白細胞介素-2（1L-2）的淋巴細胞培養體系中，觀察其對淋巴細胞增殖的影響。
3.超濾離心法
王偉[4]等人以樹突狀細胞為實驗材料，基于對外泌體物理特性，大小以及密度的了解，將超濾離心分離外泌體的方法與傳統的分級離心法進行了比較，通過實驗證明超濾離心法耗時少，產量和純度都得到了很大程度的提高，是一種比較高效的制備外泌體的方法。
4.免疫磁珠法
將具有磁性的磁珠表面包被特殊的抗體，細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性抗體結合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細胞由于不能與磁珠結合而不能在磁場中停留，從而使細胞得以分離。Richard Wubbolts[5]等人在對外泌體進行蛋白質組學和生化分析的過程中，將外泌體的標志性蛋白―抗MHCII抗體包被于磁珠表面，通過抗原抗體特異性識別的特性有效的將外泌體分離出來。
無論采用哪種方法進行分離，如果想對其進行系統的研究都必須首先確定分離得到的產物是不是外泌體，其次要鑒定外泌體是否達到實驗所要求的純度和數量。因此，外泌體的鑒定是必不可少的。目前，常用的鑒定方法主要有電子顯微鏡觀察、動態光散射技術、Western blot、納米顆粒跟蹤分析技術等。
其中電子顯微鏡觀察法是從形態和大小上對外泌體進行鑒定，但由于電鏡拍攝視野有限，因此這種方法只能對個別外泌體進行觀察。而動態光散射技術則是從整體上對外泌體大小的分布情況進行檢測，具有準確、快速、可重復性好等優點，但對于多分散的復雜外泌體樣本的測量還存在一定的問題。Western blot則是通過抗原抗體特異性結合的原理，對外泌體中的標志蛋白進行檢測，從蛋白質組學方面對外泌體進行鑒定。
隨著科學技術的發展，納米顆粒跟蹤分析技術逐漸成為外泌體鑒定的新技術，不但可以實時對外泌體進行觀測，同時還可以對每個顆粒的布朗運動進行追蹤和分析，從而計算出外泌體半徑和濃度。
外泌體作為細胞間物質信息的傳遞者，在細胞生物學以及分子生物學領域中，扮演著越來越重要的角色。因此，提高外泌體的分離純度，改進外泌體的分離方法尤為重要。目前，雖然外泌體的分離與鑒定已經擁有系統的理論基礎，但實際操作起來依然存在很多困難，無論是哪種方法，都有各自的優點和缺點，因此只有將各個方法有效的結合起來，例如差速離心法與免疫磁珠法、電鏡法與Western blot結合使用，才能達到更好的分離鑒定效果。
參考文獻：
[1] 陳紹倩，杜英，王 鑫，顧巧麗，黃玉敏，董子明.多步離心法提取K526細胞外泌體.鄭州大學學報（醫學版） ，2006，41（3）.
[2] Thery C，Zitvogel L，Amigorena S.Exosomes：composition，biogenesis and function.Nat Rev Immunol，2002，2：569-579.
[3] 崔焱，于津浦，李慧，楊莉莉，魏楓，安秀梅，任秀寶.腫瘤細胞來源胞外體的分離鑒定與功能檢測.天津醫藥，2009，37（12）.
細胞生物學常用研究方法范文3
[關鍵詞]體細胞；核移植；克?。槐碛^遺傳重構
[中圖分類號]Q819 [文獻標識碼]A [文章編號]2095-0616（2016）05-40-04
一直以來研究人員普遍認為只有通過卵子和相互結合形成受精卵，隨著受精卵的不斷分化，最終才能發育成為一個新的生命，但在這個過程中，受精卵細胞同時也將逐漸地失去其發育成為完整后代的能力，把受精卵細胞具備發育成為完整個體的能力稱為全能性。體細胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）技術的成功歸因于人們對細胞全能性的逐步認識。核移植（NT）就是將動物的體細胞或者早期胚胎卵裂球的細胞核，移植進經去核的發育成熟的卵母細胞的胞質中或受精卵中，得到重構的卵母細胞，然后通過重新激活，恢復其細胞分裂及分化，從而促使其發育成為與供體細胞的基因型完全相同的子代，這一技術也可稱為體細胞克隆技術。體細胞核移植技術最早是由德國的胚胎學家Spemann 1938年提出的，他起初提出這個理論，主要是為了研究細胞核全能性的機制以及在胚胎發育的過程中細胞質與細胞核的相互作用機理。直到1952年Briggs和King按照他的理論，首次成功地進行核移植試驗，他們首先將非洲爪蟾的卵子去除其細胞核，然后向其中移植進其囊胚細胞核，從而得到了正常的后代。隨著胚胎工程技術的不斷進步，人們先后以不同動物的胚胎細胞等作為供體，不斷成功地培育出了各種克隆動物，如克隆羊、克隆牛、克隆豬、克隆小鼠以及克隆家兔等。其中最具有標志意義的是1997年Roslin、研究所的Wilmut等，首次在世界上報道了他們利用體細胞核移植技術，用成熟綿羊的體細胞（乳腺上皮細胞）作為核供體，成功地克隆出“多莉”羊，一下在全世界掀起了軒然大波。這一實驗充分證明了高度分化的體細胞仍然具有全能性，人們可以利用體細胞，通過體細胞移植技術獲得基因型與供體細胞基因型基本相同的子代個體。成為了生物學以及遺傳學發展史上一個重要的里程碑事件。家兔是生物醫學研究中最常用的實驗動物之一。利用體細胞核移植技術生產克隆兔子是目前研究的熱點，在生物醫學領域具有十分誘人的應用前景。而家兔被認為是利用體細胞核移植技術難以成功克隆的哺乳動物之一，直到2002年法國學者Patrick Chesne等用卵丘細胞作為核供體首次成功克隆了家兔，突破了家兔難以成功克隆的關鍵問題，為擴大家兔在生物醫學方面的應用研究提供了方法。應用這項技術，2006年我國學者李善剛博士應用成纖維細胞作為核供體成功地培育出克隆家兔，在此基礎上他又進一步將轉基因技術與體細胞核移植技術結合起來，成功培育出了表達綠色熒光蛋白的克隆兔，將該項技術推向新的高度。
1體細胞核移植的主要方法
具體來講，體細胞核移植技術主要包括受體細胞的去核、核供體細胞的準備與選擇、細胞周期的調控、細胞融合、重組胚胎細胞的激活以及培養等步驟。
1.1受體細胞的選擇
在哺乳動物體細胞核移植的實驗中，可以作為受體的細胞主要有以下三種：（1）去核的受精卯；（2）去核的MⅡ期成熟卵母細胞；（3）去核的早期胚胎細胞，其中MⅡ期卵母細胞是目前采用較多的核移植受體細胞，因為在這個時期，一方面該細胞體積較大，便于顯微操作；另一方面重組胚胎所需要的各種細胞因子在MⅡ卵母細胞質中均存在，而且細胞營養成分充足。在細胞分裂過程中，結合在DNA上的各種細胞因子如轉錄因子等從DNA螺旋軸上脫離下來，與此同時胞質中的大量重組因子即可與DNA螺旋軸結合，從而促進基因重組的發生。另外一方面，因為選擇合適卵齡的卵母細胞作為胞質受體，對體細胞核移植是否能夠成功產生巨大的影響，故細胞培養的時間也特別重要，實驗中一般多選擇培養40～44h，傳代4～6代的卵母細胞作為受體細胞。因為大量的實驗證明，傳代越多重組胚的囊胚率也越多。
1.2受體細胞去核的方法
先要對受體細胞進行去核，才能進行供體核的移植。受體細胞去核必須完全，如果去核不完全，一方面可能導致重組的胚胎細胞染色體形成非整倍體或多倍體從而使克隆直接失敗，另一方面也可能使卵母細胞產生異常分裂進而發育受阻甚至可以導致胚胎的早期死亡從而使克隆最終失敗。所以是否完全使卵母細胞去核，是保證核移植所形成的新的胚胎細胞能否發育成為正常個體的前提條件。為了減少實驗中的干擾因素，可以通過縮短體外操作的時間并快速而準確的去除受體細胞核以避免孤雌發育。大體上受體細胞去核的方法可以分為兩種方法，即化學去核法和機械去核法。具體有以下幾種操作方法（1）盲吸法：這一方法的優點是不用借助于其他的化學物質，但此法耗費時間較長、易影響細胞質空間結構故對卵母細胞損傷比較嚴重，所以技術要求較高，不同動物去核率相差也較大，應用較少；（2）半卵法：這個方法是應用特制的卵母細胞切割刀，將卵母細胞切割成為兩個半卵，然后丟棄含有極體的那一半半卵細胞，用兩個不含極體的半卵細胞與供體細胞核進行融合，構建核移植胚胎。（3）化學試劑去核法：這種方法的原理是利用蔗糖或者脫羰秋水仙堿等化學試劑的作用，使受體細胞能夠自行排出第二極體，從而實現去核的目的，但目前還不清楚化學試劑是否對受體細胞造成損傷；（4）擠壓法及點壓法：此兩種方法均是利用固定管固定住細胞，使細胞染色于特定位置，然后擠壓透明帶，用去核針取出第一極體，再用熒光染料Hoechest33342染色后觀察其去核率。點壓法是擠壓法的改進方法，優點是對卵母細胞胞質的損傷較小，在去核操作的過程中不用更換去核針，節省了時間，有效的提高了去核效率；（5）紡錘體探測技術：此法去除細胞核的方法是將卵母細胞放置于Spindle-view偏振光系統的倒置顯微鏡下，受體卵母細胞的紡錘體區域較其它部位明亮，從而清楚顯示其染色置，而后再用去核針通過顯微鏡下操作去核，以利于去核的操作準確完全。（6）透明帶膨脹輔助去核法：此法是先用去核針吸入適量操作液后稍施正壓，使吸入的操作液平緩流出，推進去核管，使透明帶逐漸膨脹，然后用去核針將細胞核取出，此法的優點是縮短了去核操作的時間并且顯著地提高了去核操作后卵母細胞的生存率。（7）離心去核法：這個方法的原理是根據細胞質的密度小于細胞核，通過離心的方法將沒有透明帶的細胞核甩向一側進而脫離卵母細胞。該方法的缺點是必須去除透明帶，不利于之后核移植胚胎的發育。
1.3供體細胞選擇與核的移植
實驗中可用于核供體的細胞很多，主要有胚胎干細胞（ES細胞）、卵丘細胞、顆粒細胞、支柱細胞、細胞、乳腺細胞、神經細胞以及成纖維細胞等，其中最主要的是兩種：一是生殖細胞如卵丘細胞，二是胎兒或成年成纖維細胞。影響核移植成敗的一個重要因素是受體與供體細胞的細胞周期同步化發育，早期的研究認為要使體細胞核移植成功必需使供體細胞處于GO期，獲得GO期細胞主要是通過兩種方法：選擇細胞類型或者人工誘導的方法。Inoue等研究人員在小鼠的核移植實驗中發現，移植的效率較大的受到供體細胞的細胞類型以及其基因型的影響。近年來許多科研人員通過實驗發現把沒有經過休眠誘導的處于細胞周期中G1期、G2期以至于M期的細胞作為供體細胞進行核移植也可以獲得成功。將供體細胞核移植進入受體細胞的常用方法主要可分為融合法以及注射法兩類。其中融合法中目前最常用的是電融合的方法，這是因為電融合的方法具有細胞損害較小、可重復性好而且融合的效果較好等明顯的優點，所以逐漸被廣大的研究人員所應用。電融合方法的原理是通過細胞在強電場短時間的作用下，使細胞膜產生一過性的擊穿，當電流使兩個相鄰的細胞膜接觸的區域發生擊穿時，兩側的細胞膜就可以在擊穿的瞬間發生接觸并融合成為一個細胞。注射法一般分為透明帶下注射和胞質內注射。透明帶下注射是把整個供核細胞注射至受體細胞卵周隙，這就需要在注射后還需使供體細胞與受體細胞進行融合。胞質內注射一般是用壓電一陶瓷微注射系統，直接把供體核注入胞質內。
1.4卵母細胞的激活
因為缺少了受精這一步驟，在以成熟的卵母細胞作為受體的核移植實驗中，缺少了自然受精過程中受精卵的激活過程，所以必須進行人工激活核移植后重構的卵母細胞從而促使其進一步分化發育。根據激活時期的不同，可分為移核前激活、移核時激活、移核后激活三種不同的時期。使卵母細胞激活的方法可以分為化學或者物理刺激的方法兩類。激活方法目前應用較多的有鈣離子載體A23187激活和離子霉素激活、乙醇激活、蛋白質合成抑制劑激活、氯化鍶激活、提取物激活、蛋白質磷酸化抑制劑激活以及電脈沖激活、聯合激活等。雖然卵母細胞可以被以上的各種化學物質以及物理刺激的方法激活，但是卻不可避免地在激活的同時也造成受體細胞一定程度的損害，影響胚胎的發育。所以，是否能夠盡快地探索出對卵母細胞損傷較小并且激活效率高的激活方法對體細胞核移植技術最終能否成功尤為重要。
2體細胞核移植技術的應用前景
體細胞核移植技術作為細胞生物學及發育生物學領域取得的最偉大的成就之一，應用前景必然是特別廣闊的甚至是我們一時無法估量的！其潛在的經濟效益是十分巨大的，隨著這項技術的不斷發展、逐步完善，必將帶來生物學以及醫學領域的一場深刻變革。這項技術在生物學方面如在保護瀕危動植物物種、新物種的培育、優良畜種培育以及轉基因動植物生產方面前景十分廣闊。另外，這項技術在醫療衛生領域同樣具有巨大的應用潛力和發展前景。尤其在醫療衛生領域，可能為機體損傷修復、器官移植乃至遺傳性疾病、老年性疾病的治療等打下堅實的基礎，有著不可估量的作用，所以值得科研人員持續關注并為體細胞核移植技術的不斷完善發展付出不懈的努力。
細胞生物學常用研究方法范文4
關鍵詞：藥物篩選;分子印跡技術;高通量篩選技術;生物芯片技術;生物信息學技術
藥物篩選是應用適當的方法和技術根據特定的目的對藥物進行優選的過程。藥物的種類很多，從大量的藥物中找出對特定疾病有針對性治療作用的藥物是個復雜的過程。傳統的藥物篩選一般是采用生物學方法，也就是將藥物與相應的病原作用，能夠有效抑制病原生長或對已有病原有殺滅作用的即為有效藥物。然而對于由病毒或細菌引起的具有強傳染性的疾病此種方法是一項既繁瑣，危險性大又對實驗條件要求極高的工作。因此，應建立非生物學方法來替代傳統生物學方法。所謂的非生物學藥物篩選方法即在不接觸傳染性病原的情況下進行藥物篩選。篩選的方法可以是間接的篩選藥物，如分子印跡法、生物信息學法;也可以是獲得病原的相應結合靶點來選取有效藥物，如高通量篩選技術和生物芯片技術。本文將對非生物學藥物篩選方法進行簡要綜述[1]。
1分子印跡技術
分子印跡技術也叫分子烙印技術或分子模板技術(molecularimprintingtechnique,MIT)，是一種模擬抗原與抗體相互作用的人工生物模板技術。分子印跡聚合物(molecularlyimprintedpolymers，MIPs)也就是由分子印跡技術制備出來的，具有高效、穩定、使用壽命長等優點。在對映體和異構體的分離[2，3]、固相萃取[4，5]、緩控釋給藥系統[6]、臨床藥物分析、膜分離技術[7]、模擬酶催化[8]、化學仿生傳感器[9]等領域中MIPs都展現了良好的應用前景。MIPs的制備過程為：①在溶劑(致孔劑)中將模板分子和功能單體按照一定比例混合后一定條件下進行反應，通過共價鍵或非共價鍵作用形成可逆的模板分子-功能單體復合物;②加入交聯劑、引發劑，使模板-功能單體復合物通過聚合反應在模板分子周圍形成高交聯的剛性聚合物;③將模板分子(印跡分子)從聚合物中洗脫解離出來，這樣在聚合物的骨架上便留下了一個對模板分子有“預定”選擇性的識別空位?？瘴恢泻芯_排列的與模板分子官能團相互補的由功能單體提供的功能基團[10]。分子印跡聚合物中的空位和模板分子形狀、大小完全一樣,從而實現對模板分子的特異性識別。印跡聚合過程如圖1所示[11]。MIT具有分子識別性強、固定相制備簡便快速、操作簡單、性質比較穩定(耐酸堿、耐高溫、高壓等)、溶劑消耗量小、模板和MIPs都可以回收再利用等優點。
應用分子印跡技術，根據已篩選出的對相應病原有抑制作用的化合物作為模板建立生物法替代篩選模型。一方面可以避免與病原的直接接觸，增強安全性;二是可以在普通實驗室進行實驗，實驗條件要求低;三是有針對性的選擇有效藥物成分，縮短了篩選時間和實驗強度;四是精確有效篩選。如中草藥含的化合物結構類型多樣，含量懸殊且許多成分是未知的，因此從中分離純化有效成分是一項費時費力的工作，而且容易丟失微量的有效成分。為了盡快從中草藥中尋找出高效的實體藥物及各配方的有效成分，以及將中藥推向國際市場并從中發現療效顯著的符合歐美市場要求的新藥，就可以應用分子印跡技術來達到這個目的。謝建春等[12]以駱駝蓬種籽中抗腫瘤活性化合物哈爾滿作為模板,用非共價鍵法制備了對哈爾滿結構類似物哈爾明及哈馬靈具有強親和性的分子印跡聚合物。分離鑒定了駱駝蓬種籽甲醇粗提物中所含的哈爾明及哈馬靈兩種抗腫瘤活性成分。此實驗結果說明了通過分子印跡技術能夠有效地對中草藥活性成分進行分離。實驗還說明了通過分子印跡親和色譜與質譜聯用可以分離鑒定復雜成分中有效成分。這對于篩選已知藥物的結構類似物無疑是種簡單快速安全的方法。
2高通量藥物篩選技術
高通量藥物篩選(highthroughputscreening,HTS)是20世紀80年代后期發展起來的一項快速尋找新藥的技術。篩選的對象是藥物作用靶點，根據待選樣品與靶點是否相互作用來判斷待選化合物的生物活性。高通量藥物篩選技術涉及自動化控制技術、細胞生物學技術、藥理學實驗技術、分子生物學技術和管理技術以及計算機計算等。隨著各學科的發展及相應技術的成熟[13]，高通量藥物篩選技術憑借其自動化操作系統和微量靈敏的檢測系統，使其篩選速度快、規模大、用量小實現一藥多篩。
高通量篩選的體外模型通常有分子水平模型和細胞水平的模型，分子水平模型主要分為受體模型、酶篩選模型和離子通道篩選模型。細胞水平藥物篩選模型是以細胞功能為基礎的篩選模型。各種模型篩選的原理有3個方面，一是待選化合物與靶點的作用。多數情況下藥物與靶點相結合從而產生治療作用。其作用原理如同受體-配體相互作用?？梢耘c相應受體結合的化合物就有可能是有活性的成分;二是待選化合物對酶活性的影響。生物體內的許多生理生化反應都必須有酶的參與，加入待測化合物的同時測定酶的一些指標，以指標的變化為依據來評價化合物的作用。此種模型相對易于檢測，被普遍使用;三是待測化合物對細胞的作用。通過化合物的篩選，了解整體細胞對化合物作用的反應。靶向細胞因子、生長因子、離子通道和G-蛋白耦聯受體(GPCR)在細胞水平上的功能性檢測中都取得了成功的進展[13]。(i)復合物化(ii)聚合(iii)去模板分子a.模板分子b.聚合前復合物c.聚合后復合物d.模板分子去除后的聚合物圖1分子印跡聚合過程示意圖據統計高通量藥物篩選技術每天可以對數以萬計的樣品化合物進行篩選，應用得最多的是組合化學庫。我國中藥資源豐富，許多資源尚未開發。有部分中藥及組方治療作用明確，但大部分作用機理尚不清楚。從而限制了中藥的發展及國際化的要求。由于中藥有效成分具有多靶點的作用特點，故天然產物庫的建立將為高通量藥物篩選提供更多更全面的化合物[14，15]，同時中藥有效成分的作用機理也會明確。羅弟祥等[16]用PTP1B(蛋白酪氨酸磷酸酶1B)抑制劑高通量篩選模型對17940個植物提取物和其組分進行了篩選，陽性率為2.85%[17]。另外針對腫瘤、2型糖尿病[18]、神經系統疾病、免疫系統疾病和感染性疾病等相關靶點明確的疾病，已經逐步建立和完善了以高通量分子篩選模型為初篩的篩選體系。隨著生物化學、分子生物學、細胞生物學、蛋白質組學及基因工程等學科的發展，疾病的發病機理越來越明確。特別是對于一些病毒和病菌，它們的致病靶標也越發的清晰。只要針對相應的靶標進行篩選，就能夠很快找到相應的有效藥物，這樣就可以減少操作的危險性，避免與相應病原直接接觸，同時也加快了藥物的篩選速度及篩選的精確性[19]。曹鴻鵬等[20]以神經氨酸酶(NA)為抗流感藥物的作用靶點建立可用于高通量藥物篩選的模型來篩選NA抑制劑，初篩發現12個化合物對流感病毒神經氨酸酶有可重復的抑制活性。高通量藥物篩選過程是從藥物作用靶點水平篩選藥物即只是停留在分子細胞水平，而藥物的作用多數是要全面分析。由于藥物經過體內循環代謝到達靶點時的濃度及代謝物藥效是有變化的，所以必須在篩選之后進行相應的組織器官和整體動物水平的藥物篩選來確定藥效。
3生物芯片技術
生物芯片(biochip)是指采用光導原位合成或微量點樣等方法，將大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細胞等生物樣品以陣列式有序地固化于支持物(玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等載體)的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器對雜交信號的強度進行檢測分析來判斷樣品中靶分子的種類和數量[21]，從而實現對細胞、蛋白質、DNA以及其它生物組分的檢測，把生化分析系統中的樣品制備、生化反應和結果檢測3個部分有機的結合起來，具有快速、高通量、高信息量、平行化、集約化、微型化、自動化、成本低、污染少、用途廣等特點[22]。
生物芯片包括基因芯片、蛋白質芯片、芯片實驗室(微全分析系統)、細胞芯片以及組織芯片等。另外根據原理還有組件型微陣列芯片、通道型微陣列芯片、生物傳感芯片等新型生物芯片。藥物通過不同的靶點作用于組織細胞，直接或間接地影響細胞內基因的表達及蛋白質的生成。通過對用藥前后兩組樣品進行表達譜生物芯片檢測，就可以反映出該藥物作用后相應組織或細胞中基因表達譜及蛋白質等的變化，從而揭示藥物的作用。生物芯片技術可以尋找藥物靶標、進行毒理學研究、研究藥物處理細胞后基因的表達情況、藥物分析、中藥研究、指導臨床個體化用藥、抗藥性研究、建立生物技術平臺等[23]。
托婭等[24]研究基因芯片篩選抗腫瘤血管生成中草藥的相關基因，實驗結果顯示利用基因芯片技術可從基因水平解釋中藥的作用機制，為新藥的開發提供理論依據。LiX等[25]采用微流體芯片技術檢測中藥成分對白血病細胞的早期細胞毒性，結果表明用此法不但能夠縮短藥物篩選的周期、降低實驗成本而且還能解決傳統技術中遇到的顏色和化學干擾問題。生物芯片技術使高通量藥物篩選的單靶點單模型模式轉變為同時對多靶點進行篩選的新模式，逐漸形成了超高通量藥物篩選的概念。由于生物芯片體積小，包含的藥物作用靶點多，從理論上講，生物芯片技術和高通量藥物篩選技術相結合，不僅可同時對大量化合物進行生物活性篩選，而且可同時對大量藥物作用靶點篩選。隨著分子生物學的發展而建立起來的分子水平的藥物篩選模型，可以從更深入的層次評價藥物的作用，從而可以為許多疑難病癥提供新的治療途徑和方法。應用生物芯片大規模的篩選研究可以減少大量的動物試驗，縮短藥物篩選所用時間，增強實驗過程中的安全性，從而帶動藥物的研究和開發。
4生物信息學技術
細胞生物學常用研究方法范文5
【關鍵詞】兔視網膜色素上皮細胞；體外培養；中藥含藥血清；制備
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.11.685文章編號：1004-7484（2013）-11-6861-021體外培養兔視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞
組織培養工作始于1907年，美國動物學家Ross Granville Harrison為解決“神經纖維的起源問題”，而設計出的“一種能在生活狀態下直接觀察正在生長的神經末端的方法”，即哈里斯懸滴培養法，后經美國醫生M.T.Burrows和Alexis Carrel不斷的改進和完善，組織培養技術得以迅速發展，作為一種研究組織和活細胞的良好方法，由于其具有的諸多優越性，現已被廣泛應用于生物學、醫學與藥學的各個領域，成為重要的基礎科學之一。
視網膜色素上皮位于視網膜的最外層[1]，是由單層六角形的色素上皮細胞所構成，它具有多種復雜的生化功能以及支持光感受器活動的色素屏障功能，并具有對視網膜外層傳遞來自脈絡膜的營養，和對光感受器外節脫落的膜盤及代謝產物進行吞噬的功能，其代謝異常和喪失，可引起視網膜感覺層發生繼發性變性改變，甚至導致失明。在組織胚胎學上視網膜色素上皮層由神經外胚葉發育而來，胚胎4周時細胞內出現色素顆粒，至第5周則完全充滿其中。體外培養的色素上皮細胞屬于貼附生長型細胞，其形態為扁平的多角形，細胞質近中央處有圓形的細胞核，細胞之間緊密相靠、互相銜接，具有連接成片的能力。
1.1取材為了避免細胞的生長，在摘取兔眼時不能通過碘酒消毒，因為碘酒中的碘有抑制細胞生長的作用。另外還要注意將眼球摘除之后要將其放入冰箱當中，放置的時間要在15分鐘，并且在放置之前還要進行慶大霉素生理鹽水的浸泡，這樣在色素上皮分離、視網膜神經分離就比較容易。為了減少碘進入兔眼視網膜的概率，此時應該著重關注眼球內層的色素上皮細胞。這一點很關鍵。如果發現摘取的細胞生長緩慢，那么在排除了生物因素、物理因素之后就要考慮到這方面的原因。
1.2分離進行上述操作后，我們就要將其分離，此時將眼球球角鞏膜緣后的3毫米地方做一環形切口，將其去除晶體、角膜、玻璃體去除，力量一定要均勻，將眼科周圍的（彎）的頭部鈍緣通過視網膜向視進行輕刮，此時通過鑷子將視網膜上的神經上皮去掉，這種方法是我們通過多次的實驗總結出來的，通過這個可以干凈、徹底地將視網膜進行分離。
1.3消化將去除視網膜神經上皮層的眼球掛置于自制的眼杯中（由橡膠瓶塞和針灸針制成），滴加0.25%的胰蛋白酶沒至距角鞏膜緣切口1mm處，放入二氧化碳孵箱中消化10-15min，消化時間可根據具體情況而定，如新制胰蛋白酶消化時間可相應縮短。與先消化后分離相比，我們的方法可以較準確地把握消化時間，同時消化洗脫下來的色素上皮細胞也較多，雜細胞較少。
1.4吹打我們總結了一下，吹打30-40次后就可以充分的將細胞制成懸液；另外在進行沖洗時最好選用合成培養液如DMEM代替PBS緩沖液，目的是盡可能地模擬細胞生存的內環境，減少細胞離體后再培養時的貼壁時間。
1.5關于微生物污染組織細胞在培養時一般失敗的最主要的原因就是微生物的污染，在體外培養的細胞沒有免疫能力，缺乏機體屏障，當發生細菌、霉菌時缺少相應的防御能力最終細胞出現死亡，鑒于這個原因，實驗的成功就必須做好防止污染的工作，進行操作時要做到無菌操作，并且確保各個環節都是無菌狀態。
我們的體會就是嚴格按要求操作，決不能馬虎、懶惰，更不能抱有僥幸心理。無菌培養室每天都要用0.2%的新潔而滅擦洗地面一次，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次實驗前要75%酒精擦洗，然后紫外線消毒30min。實驗前認真清洗（經清潔液處理過的器具先用自來水沖洗20遍，之后一次蒸餾水清洗5遍，最后再用3次蒸餾水清洗3遍）、消毒培養用品；實驗時也要保持無菌操作，如打開或封閉瓶口等都應在酒精燈近火焰處燒灼；拿取培養用品都應在超凈工作臺內完成；現在進行細胞培養大多數是通過二氧化碳孵箱，因此需要再次強調一下孵箱中的消毒的問題，孵箱雖然為細胞的生長提供了良好的環境，例如提供了恒定的二氧化碳、在維持PH值穩定時也做的相當的到位，但是開放式的培養，就給細菌、真菌提供了良好的生長環境，因此做好孵箱中細菌防止工作很重要，如果孵箱中的存在著污染那么整個細胞培養工作就會功虧一簣。因此定期地對箱內清潔，定期地將水槽中的無菌的蒸餾水進行更換很重要。
由于在體外培養的細胞缺乏一定的抵抗能力，因此要做好微生物污染的工作，為了提高微生物的免疫力，可以選擇在培養液中加入一定的抗生素。但是通過實驗表明，加入抗生素的作用有限，并且也嘗試通過對細胞進行抗生素的沖擊療法、動物體內接種、加溫處理等，上述方法都是有限的，因此做好預防工作是勢在必行。
附：兔視網膜色素上皮細胞體外分離、培養及鑒定6只家兔空氣栓塞法處死，隨即于無菌操作下摘除眼球，經0.9%氯化鈉溶液充分沖洗后，在角鞏膜緣后3mm處環形剪開，棄眼前節和玻璃體，用顯微鑷輕輕撕去視網膜，加入0.25%胰蛋白酶，于37℃消化10-15min，后經小牛血清終止消化，800r/min離心10min，棄上清，加入DMEM培養液，接種于50mL培養瓶中，在37℃，5%CO2，90%濕度的孵箱中培養，待細胞貼壁后，每3d換液一次，直到細胞融合，行1：2傳代，倒置顯微鏡下觀察細胞形態改變，經細胞免疫化學抗角蛋白與抗S100染色進行視網膜色素上皮細胞鑒定，選擇1-2代對數生長期細胞，0.25%胰蛋白酶消化，制備成單細胞懸液。細胞計數板準確計數，調整細胞濃度到1×105個/ml待用。2中藥含藥血清（medicated serum）的制備
為在體外實驗中能觀察到中藥經體內胃腸吸收、生物轉化后的綜合整體藥理效應，日本昭和藥科大學田代真一教授于20世紀80年末首次提出“血清藥理學（serum pharmacology）”的概念[2]，具體是指將中藥或復方經口給動物灌服，一定時間后采集動物血液，分離血清后用含有藥物成分的血清進行體外實驗的一種半體內實驗方法。此法不僅可排除由于中藥復方粗制劑直接加入體外試驗系統對實驗造成的干擾，而且含藥血清能較真實地反映藥物在體內的狀態，使體外試驗能較好地重復在體試驗的結果，它為科學地闡明中藥復方的作用及其機制提供了新的研究方法。
2.1供體動物的選擇為避免種屬差異導致的實驗偏差，我們選擇與培養細胞同種動物（家兔）作為血清供體，具體方法：在性別、年齡、體重方面與細胞供體家兔保持一致；為保證各實驗組細胞于造模前處于相同的實驗條件，我們給予各組同種正常血清（normal rabbit serum，NRS）孵化36h；鑒于生理、病理狀態下可能會產生較大的藥代動力學差異，給予含藥血清供體家兔造模。
2.2給藥方案的制定首先采用與臨床實際給藥途徑相同的方法（灌胃）給藥；其次為提高體外實驗體系中含藥血清的濃度，在給藥劑量上，我們結合臨床常用量、動物體表面積比值及實驗目的，設定成人臨床日用量的10倍和20倍（量效關系）作為最后的給藥劑量；最后在給藥時間及采血時間上，由于中藥及其復方成分復雜，血藥濃度及半衰期難以準確測定，我們采用供體動物實驗前禁食8-12h，每天灌胃給藥2次，連續給藥3d，末次給藥后1h，心臟取血的方法獲得含藥血清[3]。
2.3血清的滅活和保存由于血清中所含生物活性物質可能會對體外培養的細胞產生毒性及嚴重干擾作用，我們對血清進行微孔濾膜（0.45μm、0.22μm）除菌，56℃水浴30min滅活，以去除非藥理性干擾；考慮到含藥血清長期低溫（-20℃，2個月）保存后藥效會顯著降低，我們將新鮮制備的含藥血清置于4℃冰箱保存，以備隨時取用，剩余血清-70℃以下低溫冰箱長期保存。參考文獻
[1]葛堅.眼科學（第2版）[M].北京：人民衛生出版社，2010：63-65.
細胞生物學常用研究方法范文6
關鍵詞：醫學基礎綜合實驗技能；研究生；課程實施
《醫學基礎綜合實驗技術》是一門包括分子、細胞、蛋白領域的基礎實驗技術課程，其中包含的實驗技術是目前在科研領域應用非常廣泛的技術，是醫學院校研究生完成課題不可或缺的實驗技術，因此《醫學基礎綜合實驗技術》已成為研究生課程的必修內容之一。為了提高實驗課教學效果，應注意如下幾個教學環節。
1合理設置實驗內容
《醫學基礎綜合實驗技術》實驗教學內容應根據醫學科研的具體特點和培養目標而設置。首先要強調基礎性，把分子生物學的質粒提取、轉化、酶切和細胞生物學的細胞培養無菌技術及蛋白質電泳融合在整個實驗課里，使整個實驗具有連貫性。其次，要注重實用性。要完成一項醫學課題，掌握分子生物學的real-time PT-PCR，細胞生物學的細胞培養以及顯微鏡技術，蛋白質學的Western blot等幾項常用且比較前沿的實驗技術是必不可少的，對于完成研究生課題有著至關重要的幫助，因此這些實驗技術設置在了我們的課程里。
2改變實驗課教學方式
2.1調整理論課和實驗課順序 在傳統的實驗教學中，一般將理論課安排在實驗課的前面，造成理論和實踐脫節。教師在課堂上花大量的時間講解實驗原理、方法和注意事項，但是由于學生對該實驗缺乏感官認識，只能理解吸收一小部分內容，使學生置于消極的被動狀態下，難以調動學生的學習積極性，不利于思維的開發和創新能力的提高。針對這個問題，應適當調整理論課和實驗課的授課順序，嘗試將某些理論知識的學習放到實驗課的后面，即學生先做實驗，然后帶著問題進入理論課的學習，教師可以將實驗的結果和討論結合到課堂的理論教學當中，從而引導學生解決問題。例如，教師在講解蛋白質電泳時，學生對蛋白質在凝膠中從負極向正極泳動的原因較難理解，可以嘗試先進行蛋白質電泳實驗的操作，學生有了明確的感性認識，帶著問題進課堂，用實驗現象去輔助理解和掌握相關理論知識。這種實驗課和理論課相結合的教學方式有助于學生更好的掌握實驗的原理和技術，也有利于學生求知欲的激發和學習主動性的提高[1]。
2.2讓學生參與準備流程 《醫學基礎綜合實驗技術》實驗準備工作繁多，如：試劑的配制、高壓、分裝，實驗耗材的滅菌，菌種的培養等，在傳統的實驗教學模式中，這些工作已經由實驗師完成。學生進入實驗室后只是根據老師的指導將這些實驗試劑進行加樣，對于試劑如何配置等卻一無所知。這種教學流程使學生在實驗中處于被動，缺乏主動操作和思考，不能提高學生的實踐能力，并會使學生對實驗課失去興趣。因此，可以嘗試開放實驗室[2]，鼓勵學生利用課余時間參加實驗準備，讓他們了解實驗前需要什么，如何準備，增加學生動手的機會，調動學生的積極性，擴大知識面，為獨立完成畢業論文打下堅實的基礎。
2.3通過小組合作，培養合作能力 一個科研課題通常需要幾個學生通力協作才能順利完成，所以可以通過小組合作的方式培養學生的實踐和合作能力。例如，在Western blot實驗中，將2～3個學生分為一個小組，可以將提蛋白、配凝膠及電泳、轉膜等工作分工，每個學生都要獨立完成實驗的一部分，然后將各個部分連接起來，在實驗過程中，要求每組同學分工協作、互相幫助、取長補短、密切配合，這樣一個Western blot實驗才能成功完成。小組合作的方式有利于知識互補和互相學習[3]，既培養了學生獨立思考和動手的能力，又培養了他們的團隊合作精神和對科研工作的嚴謹態度。
2.4增加自主實驗設計 《醫學基礎綜合實驗技術》這門課程不僅是為了讓學生掌握幾項實驗技術，更重要的是培養學生的實驗設計能力，幫助學生建立整體的科研思路，將所學的實驗技術應用到具體的科研課題中。現在的實驗教學內容往往是幾個固定的實驗項目，學生只是單純的接受和學習，實驗課結束后，僅僅了解了實驗的一些原理和操作，而不能將這些技術應用到未來自己的科研課題中。因此增加學生自主實驗設計的內容是解決這一問題的有效方法。首先讓學生根據自己將來要進行的課題研究，應用實驗課所學的實驗技術設計合理的實驗方案，讓學生在講臺上對自己的方案進行講解，并接受同學的提問，最后由教師進行講評。當實驗課進入這個環節后，新穎的教學方式和豐富的教學資源極大的調動了學生的學習興趣，充分發揮創造性思維，將所學和所用緊密聯系起來。這種實驗課模式充分調動學生的學習積極性，極大的提到了學生的創新思維和實踐動手能力。
3建立科學的考核制度
傳統的實驗課成績往往以實驗報告為依據，不少學生應付了事，抄襲現象時有發生，實驗報告無法真實反映學生的動手能力和操作水平。因此，可以用多個方面綜合評價學生的實驗課成績。例如：①實驗課出席率；②平時實踐表現；③實驗報告；④自主實驗設計。通過綜合的考核方式建立，能夠增加學生的學習積極性和對實驗課的重視，同時又能夠比較全面的評價實驗課的成效。
4教師的必備條件與自我提高
師資隊伍的建設是實驗教學改革可持續發展的根本保障[4]。作為一名實驗技術課程的講授者，既是科研服務工作者，同時又是學生的接觸科研的啟蒙老師，教師在課堂上的一言一行，一招一式均要規范，使學生從教師身上學到嚴謹的科學態度，嚴肅認真的工作作風，嚴格規范的實驗操作。因此，教師應具備以下條件：①熱愛實驗室工作，認真對待科研及教學；②具備良好的專業知識，能夠熟練使用實驗室的各種儀器，深度了解實驗技術的原理；③不斷的獲知和學習科研領域中的新興技術，能夠對實驗課內容進行更新；④具備科研和教學等多種技能，工作積極上進，具備不同學科間的科研協作精神和認識。
《醫學基礎綜合實驗技術》是一門更新換代特別快的實驗課，要求講授的內容與時俱進，教師需要不斷提高理論基礎知識和業務實踐能力，既要經常查閱國內外文獻，又要積極參加學術交流，對所學知識進行更新，這樣才能提高教學質量，培養出高素質的醫學人才。
參考文獻：
[1]吳艷峰，曹雪濤.關于免疫學實驗課教學改革的幾點思考[J].中國免疫學雜志，2011，27（5）：468-470.
[2]楊雅婷，李天俊，王英超，等.高校生物化學開放性實驗室建設的研究與實踐[J].天津農學院學報，2013，20（1）：55-57.
