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細胞生物學的任務范文1
[關鍵詞]干細胞；人牙周膜干細胞；免疫磁珠；流式細胞計量術；免疫細胞化學
[中圖分類號]R783.5 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2008）05-04
Isolation, identification and bionomics of human periodontal ligament stem cells
PAN Feng1,DING Yin1,WANG Guang1,ZHAO Yu2,NI Hua2
(1.Department of Orthodontics,Stomatology Hospital,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,Shaanxi,China; 2.Center of Tissue Engineering, Stomatology Hospital,The Fourth Military Medical University)
Abstract:ObjectiveTo isolate and identify the periodontal ligament stem cells and demonstrate its bionomics. MethodsPDLSCs were isolated by immunomagnetic method. The flow cytometry and immunocytochemistry procedure were used to disclose the cell cycle and surface marker of the PDLSCs.Osteoinduction and adipoinduction were done to conform the multidirectional differentiation of PDLSCs. ResultsThe acquired cells had clonality and low proliferation. Most of the cells were in phase G0 /G1 and there were high expression of CD146 and CD44 on these cells, meanwhile, CD34 and CD45 were of low expression. The cells were Vimentin and STRO-1 positive while their multidirectional differentiation ability was confirmed in vitro. Conclusionimmunomagnetic method was an effective way to isolate and purify the PDLSCs. The acquired cells showed the characteristics of stem cells.
Key words:stem cell;human periodontal ligament stem cell;immunomagnetic beads;flow cytometry;immunocytochemistry
研究證實牙周膜內存在具有橫向分化能力的干細胞(牙周膜干細胞)，在體外微環境作用下還可分化為成牙骨質細胞或成骨細胞[1-2]。因此，牙周膜干細胞（PDLSCs）作為一種新發現的干細胞，在牙周組織工程研究中有較大的應用前景。但是牙周膜組織量小、分離困難，一直成為制約牙周膜干細胞研究的重要原因。已有的克隆篩選法操作程序繁瑣，周期較長[1]，因此需要尋找簡便、快捷的篩選方法來分離牙周膜干細胞。本研究應用免疫磁珠技術對人牙周膜干細胞進行篩選，并擴增培養，通過對牙周膜干細胞生長曲線、克隆形成率、細胞周期、細胞表面抗原標記物測定及多向分化能力的研究對其生物學特性進行研究，以期建立一種便捷有效的分離方法并明確牙周膜干細胞的生物學特性，為進一步研究牙周損傷的發病機理及臨床治療提供基礎。
1材料和方法
1.1實驗材料和設備：α-MEM培養基（Gibco，美國），羊抗小鼠磁珠試劑盒（Dynalbiotech，美國)，基質蛋白-l單克隆抗體(STRO-1，R&D，美國)， ABC型免疫組化檢測試劑盒(Dkao，美國)；小鼠抗人波形絲蛋白單抗(Vimentin，Dkao，美國)；CD44-FITC、CD146-FITC、 CD34-FITC、CD45-FITC小鼠抗人單克隆抗體（Beckmen Coulter，美國）；CO2孵箱(Heraeus，德國)；YJ-875型超靜工作臺(蘇州凈化設備廠，中國)；流式細胞分析儀(Beckmen Coulter，美國)；倒置相差顯微鏡及照相系統(Olympus，日本)。
1.2實驗方法
1.2.1 取材及細胞培養：收集臨床拔除的正常人牙周健康、無齲的新鮮第3磨牙，刮取根中1/3牙周膜組織，移入10cm無菌培養皿內，滴加少許α-MEM培養液保持組織濕潤，銳性分離牙周膜組織約1mm3組織塊，將分離的組織塊以1mm間距平鋪于6孔板內，以無菌蓋玻片覆蓋組織塊，加入培養液(含100ml/L 胎牛血清，100μmol/L2抗壞血酸，2mmol/L2谷胺酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的α-MEM 培養液)，置入37℃、50ml/L CO2的孵箱中培養，待多數組織塊周圍有細胞游出后去除蓋玻片，常規培養，每3天換液1次，細胞生長達80%匯合時傳代。
1.2.2磁珠分離篩選牙周膜干細胞：將5μl磁珠劇烈振蕩后移入離心管內，加入5ml含1％胎牛血清的PBS沖洗，放置于磁力架上靜置2min后去上清，重復一次后重懸，置4℃備用。收集第4代人牙周膜細胞1×108個，以含1％胎牛血清的PBS重懸，加入小鼠抗人STRO-1抗體，4℃孵育60min，每隔10min輕振以防沉淀。以含1％胎牛血清的PBS清洗3次，去除殘留抗體后重懸并加入磁珠，4℃孵育30min，每5min輕振一次。離心，去除含空白磁珠的上清液，以含1％胎牛血清的PBS重懸，將離心管置于磁力架上2min，緩慢棄除上清及未與磁珠結合的細胞。以含1％胎牛血清的PBS再次重懸并清洗與磁珠結合的細胞2次，棄上清，加入磁珠分離液，輕晃均勻2min后置于磁力架上2min，取上清液，重復2次以去除殘存磁珠，離心，加入5ml含10％胎牛血清的α-MEM培養液，重懸，調整細胞濃度為1×104/ml接種于6孔板內，37℃、50ml/L CO2的孵箱中培養。
1.3 牙周膜干細胞生物學特性的研究
1.3.1細胞生長曲線測定：分別取篩選培養的牙周膜干細胞及牙周膜細胞，以1×103cells/孔接種于96孔塑料板，每組3孔，隔日換液。每天取一組，MTT法測各孔OD值，連續測10天，以時間為橫軸、細胞數為縱軸繪制生長曲線。
1.3.2 克隆形成率測定：將收集的對數生長期牙周膜細胞的培養上清1 500rpm離心10min，經0.22μm直徑的小濾器過濾后，與培養基以l:l比例混合作為適應性培養基。取篩選培養的牙周膜干細胞，調整細胞密度至10～15個/ml，100μ1/孔接種于96孔培養板中，培養12h后標記單個細胞孔，并補液至200μ1/孔，5天換液，光鏡下觀察克隆形成情況。
1.3.3 流式細胞儀分析
1.3.3.1細胞周期分析：取篩選培養的牙周膜干細胞，胰酶消化，調整細胞密度為1×107/ml， PBS清洗2次，加入0.01mol/LPBS重懸，再加入預冷的無水乙醇2ml吹打混勻，4℃過夜，離心棄乙醇，0.01mol/LPBS清洗2次，加入5ml/L碘化丙錠1ml，4℃30min，過300目的尼龍篩網，流式細胞儀上機，進行細胞周期檢測。
1.3.3.2表面抗原測定：取篩選培養的牙周膜干細胞, 棄去培養液，PBS清洗兩次，以含0.25% 胰蛋白酶的PBS液消化5 min，制成單細胞懸液，再以含2%牛血清白蛋白和0.1%偶氮鈉的磷酸鹽緩沖液(流式緩沖液)沖洗細胞, 調整細胞密度為3.0×109/L，每個Eppendof管加100μL細胞懸液，室溫下分別與CD44-FITC、CD146-FITC、 CD34-FITC、CD45-FITC小鼠抗人單克隆抗體5μL避光孵育15min，再以流式緩沖液清洗細胞，1 000rpm離心5min，將細胞重懸于含1%多聚甲醛的流式緩沖液0.5ml固定。使用同型對照單克隆抗體確定背景標記。用流式細胞儀分析熒光細胞，專用配套軟件計算細胞表面抗原陽性率，單位用%表示。
1.3.3.3 免疫細胞化學染色：取篩選培養的PDLSCs制備細胞爬片， 免疫細胞化學ABC法進行STRO-1及Vimentin染色，陰性對照以PBS替代一抗，進行細胞來源及表達檢測，光鏡下觀察。
1.3.3.4體外多向誘導分化：①礦化誘導：取篩選培養的牙周膜干細胞制成細胞懸液，調整細胞密度為2×104/ml接種于6孔板中，以含10%胎牛血清的α-MEM培養24h后換礦化誘導液(100μg/ml鏈霉素、100U/ml青霉素、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50μg/ml維生素C、1×10-8mol/L地塞米松、10ml/L胎牛血清、α-MEM培養液)培養，隔日換液。培養3周后吸棄培養液, PBS清洗, 95%酒精固定10min ,PBS清洗2次,加入0.1%茜素紅(Alizarin Red-S)室溫染色30min，去離子水清洗3次，光鏡下觀察。②成脂誘導：取篩選培養的牙周膜干細胞制成細胞懸液，調整細胞密度為1×105/ml接種于6孔板中，以含10%胎牛血清的α-MEM培養24h后換成脂誘導液（地塞米松10-6mol/L、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤0.5mmol/L、胰島素10mg/L、消炎痛100mmol/L、α-MEM培養液）培養，隔日換液。培養3周后吸棄培養液，PBS清洗，10％中性甲醛固定10min，PBS清洗2次，油紅O染色10min，去離子水清洗3次，鏡下觀察。
2結果
2.1形態學觀察：所篩選細胞大部分呈類梭形，核為卵圓形、位于胞質中央，似成纖維樣細胞（如圖1）。
2.2 細胞生長曲線測定：牙周膜細胞及牙周膜干細胞生長曲線均呈倒“S”形，在接種后1天兩者細胞量均減少，自第2天起，細胞生長均加速，第8天達到生長高峰，進入“平臺期”，此后，細胞生長速度減慢。總體而言，干細胞生長速度明顯低于牙周膜細胞（如圖2）。
2.3 牙周膜干細胞生物學特性研究
2.3.1 克隆形成率：10～12天有細胞克隆形成，鏡下觀細胞呈集落狀生長，細胞形態成梭形，體積較小，排列緊密，中心細胞界限不清，呈圓形或不規則形狀，周邊細胞呈梭形或多角形。共獲得克隆株43株，克隆形成率為14.93％。
2.3.2細胞周期分析：細胞周期動力學結果顯示：大多數細胞處于G0/G1期(78.2％)，即靜止期和DNA合成前期。G2期為2.3％，S期為19.5％。表明細胞增殖緩慢，大多數處于靜止期或緩慢增殖期(如圖3)。
2.3.3 細胞表型特征鑒定：表面抗原CD146和CD44檢測陽性率為92.8％及91.7％，CD34和CD45陽性率為1.6％及2.3％ （如圖4）。
2.3.4 免疫細胞化學染色：篩選培養的牙周膜干細胞中STRO-1及Vimentin均為陽性染色，具有間充質干細胞的特征（如圖5～6）。
2.3.5 成骨誘導：成骨誘導液繼續培養8天后，細胞呈復層生長，局部增厚，12天左右中央出現許多顆粒樣改變，并逐漸連接成片，密度增高。21天左右孔板底部出現肉眼可見針尖大小灰白色小結節，并逐漸增大。茜素紅染色可見紅色礦化結節（如圖7）。
2.3.6 成脂誘導：經成脂誘導液培養至第10天左右，可見細胞形態發生改變，較培養初期更為飽滿，至21天時油紅O染色陽性，細胞胞漿內有大量脂滴形成（如圖8）。
3討論
以往成體干細胞的分離純化常用方法有密度梯度離心法、貼壁培養法、克隆化培養篩選，但這些方法操作繁瑣，且所需時間較長，不利于臨床應用。根據干細胞表面特異性受體能選擇性結合或粘附其它信號分子的原理，采用免疫磁珠篩選、流式細胞分選法分離和鑒定干細胞己廣泛開展[3,9]。Seo[1]的研究結果顯示人牙周膜干細胞表達間充質干細胞的特異性標志STRO-1，并利用免疫磁珠篩選首次成功獲得人牙周膜干細胞。Gay等[4]使用STRO-1抗體對牙周膜細胞進行標記后，通過流式細胞儀對其進行篩選，獲得27％STRO-1陽性細胞。在本實驗中，我們通過使用包被二抗的免疫磁珠對復合STRO-1的牙周膜細胞進行分離純化，獲得牙周膜干細胞，篩選程序簡單、迅速，細胞活性保持較好。經細胞生長曲線測定，牙周膜干細胞較同一來源的牙周膜細胞生長慢，符合干細胞慢增殖周期的特點。
克隆形成能力是干細胞的特點，高秦等[10]對人牙周膜細胞進行了克隆化培養，結果顯示細胞培養10～15天有克隆形成，克隆形成率為0.62％。Gay等[4]對牙周膜干細胞及骨髓基質干細胞的克隆形成情況進行了比較，發現牙周膜干細胞有50個克隆形成，骨髓基質干細胞有35個克隆形成，證實牙周膜干細胞有較強的克隆形成能力。成體干細胞處于由周圍間質細胞及其所分泌的相關生長因子或配體形成的微環境中，這些生長因子或配體與干細胞相互作用，控制干細胞的更新和分化。故為提高克隆形成率并盡可能的保持純化后的細胞的未分化狀態，本研究借鑒了高秦等[10]人牙周膜干細胞克隆化培養的方法，收集了牙周膜細胞的培養上清與普通培養基以一定比例混合，制備成適應性培養基，對所篩選的牙周膜干細胞進行了克隆化培養，共得到43個克隆，克隆形成率為14.93％，證實所獲得細胞具有干細胞自我更新的特性。
細胞周期是反映細胞增殖動力學的重要指標。干細胞是處于相對靜止狀態的一群細胞，這種慢周期的特點是大多數成體干細胞的共同特征[11-12]。但在外界因素作用下，干細胞周期也會相應變化[13-14]。本研究對所篩選牙周膜干細胞的細胞周期分析顯示，與高秦等[10]的結果有一定差異，可能原因有：①細胞來源不同，因不同個體的干細胞狀態不會完全一致；②細胞獲取方法不同，高秦等通過克隆化培養獲取牙周膜干細胞，而本研究采用的是免疫磁珠直接篩選，不同的方法導致細胞所受外界條件刺激的不同，進而可能影響到細胞周期的變化。
目前，學者們還未找到牙周膜干細胞的特異性表面抗原標記物。Seo等[1]的研究結果顯示牙周膜干細胞表達間充質干細胞表面抗原STRO-1及血管周圍細胞表面標記物CD146及CD44。Nagatomo等[15]發現牙周膜干細胞表達細胞表面抗原CD105、CD166及STRO-1。Ivanovski等[16]發現牙周膜干細胞或骨髓基質干細胞均無CD14、CD45和CD34表達。高秦等[10,21]研究結果顯示人牙周膜干細胞波形蛋白（Vimentin）及STRO-1呈陽性表達。在實驗中我們對分離培養的細胞進行了表面抗原測定及免疫細胞化學染色，結果顯示：Vimentin及STRO-l染色陽性，顯示其間充質干細胞來源，此外，流式細胞分析結果顯示間充質干細胞標記物CD44及CD146在牙周膜干細胞中高表達，而內皮細胞標記物CD34，造血系細胞標記物CD45的表達極低，從正反兩方面證實了以往學者的結論。而多向分化研究結果也證實牙周膜干細胞可以經誘導分化為成骨細胞及脂肪細胞，符合干細胞特征。
綜上所述，本實驗所篩選培養的人牙周膜干細胞為多角形、成纖維型細胞外觀，具備克隆形成能力及慢細胞周期特點，免疫細胞化學染色及流式細胞術檢測證實所培養細胞表達CD44、CD146、Vimentin、STRO-1，不表達CD34、CD45，均與文獻報道一致。此外，經誘導培養，所培養細胞可分化為成骨細胞及脂肪細胞，進一步證實牙周膜干細胞具有多向分化能力。
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細胞生物學的任務范文2
【關鍵詞】 種子細胞
【Abstract】 AIM: To purify and culture human bone marrowderived endothelial progenitor cells (EPCs) in vitro and to observe their biological characteristics. METHODS: Mononuclear cells were isolated from bone marrow suspension by density gradient centrifugation and EPCs were harvested in the endothelial growth medium (EGM2). EPCs were observed under microscope， the cell growth was calculated by cell counting and the cells were identified by electronic microscope examination and immunofluorescence staining for the expression of Ⅷ/vWF， vascular endothelial growth factor receptor2 （VEGFR2）. RESULTS: The culturedishadherent EPCs uniformly had a round or spindle shape and reformed clones with cobblestone morphology. The cells could be identified by the positive staining for VEGFR2 and Ⅷ/vWF. WeibelPaladle bodies could be seen under transmission electron microscope. CONCLUSION: EPCs are one group of stem cells in the bone marrow with the capacity of differentiating into endothelial cells. They can be purified and cultured by density gradient centrifugation and subjected to culture in vitro with endothelial growth medium (EGM2 MV). These findings suggest that EPCs may be a new seed cell of tissue engineering.
【Keywords】 bone marrow; endothelium/cytology; stem cells; tissue engineering; seed cells
【摘要】 目的： 體外分離純化人骨髓內皮前體干細胞，研究其基本生物學特性. 方法： 利用密度梯度離心法分離成人骨髓得到單個核細胞，再用內皮細胞條件培養基培養得到內皮前體干細胞，觀察細胞生長特性，通過檢測細胞血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）、Ⅷ因子相關抗原抗體表達和透射電鏡對培養細胞進行鑒定. 結果： 原代培養后細胞貼壁生長，7~10 d形成集落或融合呈卵石形，免疫組化熒光染色后結果顯示VEGFR2， Ⅷ/vWF 陽性，透射電鏡顯示細胞內具有特征性的WP小體. 結論： 用密度梯度離心法和條件培養可以從骨髓得到高純度內皮前體干細胞，該細胞具有與血管內皮細胞共同的特征，可以進一步分化為血管內皮細胞，是理想的組織工程種子細胞.
【關鍵詞】 骨髓；內皮/細胞學；干細胞；組織工程；種子細胞
0引言
隨著干細胞研究的深入，研究者發現，內皮前體細胞（endothelial progenitor cells， EPCs）是具有活躍分化潛能的干細胞，具有游走特征并能進一步增殖分化為內皮細胞.它不僅參與胚胎期的血管發育，也存在于成年機體的骨髓和外周血中，在成體血管內皮細胞發育中起重要作用，可以作為種子細胞用于人工血管、組織工程瓣膜內皮化的研究與應用［1］. EPCs的研究愈來愈受到關注，但分離相對困難，關于其培養及生物學特性研究少見報道. 為進一步探討EPCs作為組織工程種子細胞的可能性與優越性，我們進行人骨髓內皮前體細胞的分離培養和生物學特性的研究.
1材料和方法
1.1材料
骨髓取自健康志愿者. 內皮細胞生長培養基（EGM2， Clonetics， USA），內皮細胞生長培養基補充物（EGM2 MV SingleQuots， Clonetics， USA），其中包含有胎牛血清（FBS）、血管內皮生長因子(VEGF）、成纖維細胞生長因子2(FGF2）、胰島素樣生長因子1(IGF1）以及抗生素等，黏連蛋白（FibronectinFn，Sigma），淋巴細胞分離液與PBS液（TBD公司），胰蛋白酶（Gibco），Hanks平衡鹽液（Gibco），VEGFR2兔抗（NeoMarkers，USA），第Ⅷ因子鼠抗(北京中山公司），二抗（FITC羊抗鼠與Cy3羊抗兔，Sigma），FITCconjugated CD34鼠抗（R & D公司）.
1.2方法
1.2.1骨髓中單個核細胞的分離［2］無菌條件下，取人骨髓液5 mL，加入肝素，用PBS液充分混勻，轉入離心管，輕輕地層加到1077 g/L的淋巴細胞分離液上，2000 r/min離心20 min，收集中間的單個核細胞層，用PBS液1000 r/min離心洗滌2次×10 min以洗除殘余淋巴細胞分離液，然后收集細胞備用.
1.2.2EPCs的培養收集骨髓中單個核細胞，用含胎牛血清和多種生長因子的內皮細胞生長培養基混勻，制成細胞懸液，接種于以黏連蛋白（Fn）包被的培養瓶中，置37℃含50 mL/L CO2孵箱中培養，第4日換液，去除非貼壁細胞，此后每3~4 d換液1次. 相差顯微鏡下觀察細胞形態，待細胞長滿瓶底的80%，用0.125 g/L胰酶消化，并以2×107/ L細胞數傳入24孔培養板中，每日取4孔細胞進行計數并求均數，繪制細胞生長曲線，計算細胞群體倍增時間.
1.2.3流式細胞儀檢測取對數生長期骨髓EPCs， 以0.125 g/L胰酶消化后制備單細胞懸液，測定細胞生長周期；同時，檢測細胞表面抗原CD34表達，鑒定所得細胞純度.
1.2.4EPCs細胞表面抗原免疫熒光染色檢測培養10 d的細胞進行免疫熒光化學染色，檢測細胞表面抗原VEGFR2與Ⅷ/vWF等表達情況，選取培養10 d的成纖維細胞進行免疫熒光化學染色作為對照組. 過程如下： 細胞片用PBS液洗，然后用40 g/L多聚甲醛常溫處理30 min，再用含50 mg/L馬血清和50 mg/L小牛血清的PBS液浸泡30 min，去除非特異性標記，再加入VEGFR2， Ⅷ因子mAb （1∶100），37℃孵育過夜，用PBS液洗3次，加入熒光標記二抗，37℃搖床孵育1 h，熒光顯微鏡下拍照.
1.2.5電鏡檢查體外培養10 d，離心收集EPCs，用3 g/L戊二醛固定過夜，細胞團用PBS 洗3 次×10 min，1 g/L四氧化鋨4℃固定30 min， PBS洗3次×10 min，丙酮系列脫水，包埋并制作超薄切片，透射電鏡觀察拍照.
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2結果
2.1骨髓EPCs體外培養及擴增用梯度密度離心法從骨髓中分離出單個核細胞層后，用內皮細胞生長條件培養基培養，并通過換液去除非貼壁細胞，所得貼壁細胞即為骨髓內皮前體細胞. 原代培養4 d內，細胞呈圓形（Fig 1A）；培養7 d后，細胞鋪展呈橢圓形或短梭形，并迅速增殖，10 d后出現細胞融合呈“鋪路卵石樣”（Fig 1B），約14 d可傳代. 傳代后細胞于24 h內完全貼壁，接種后第1~3日為潛伏適應期，從第4日起細胞增殖迅速并進入對數生長期，第7日達高峰，此后進入平臺期，細胞生長曲線如Fig 2所示. 同時，依據生長曲線計算細胞群體倍增時間約為36 h.
2.2流式細胞儀檢測貼壁細胞消化后用流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD34表達，結果顯示細胞均一性較好（陽性表達率72%），說明采用本實驗中分離細胞的方法可得到較高純度的骨髓EPCs. 同時，流式細胞儀測定細胞生長周期，結果顯示： G0/G1期細胞為71.1%，G2/M期細胞為14.7%，S期細胞為14.2%，說明EPCs細胞增殖比較活躍.
2.3骨髓EPCs表面標記的檢測EPCs細胞均表達Ⅷ/vWF，免疫熒光染色呈陽性，細胞胞質呈綠色，胞核不染色（Fig 3A）；EPCs細胞均表達VEGFR2，免疫熒光染色呈陽性，細胞胞質呈磚紅色，胞核不染色（Fig 3B）. 對照組成纖維不表達Ⅷ/vWF與VEGFR2，免疫熒光染色呈陰性，細胞胞質和胞核均不染色.
2.4骨髓EPCs超微結構觀察細胞邊緣可見較多絨毛狀突起，胞質內還見一種短棒狀小體，即Weibel Palade氏小體，是內皮細胞特征性的細胞器（Fig 4）.
3討論
近年來研究發現，EPCs具有游走特征并能進一步增殖分化為內皮細胞，它不僅參與胚胎期的血管發育，也存在于成年機體的骨髓和外周血中，在成體血管內皮細胞發育中起重要作用. 1997年Asahara等［3］成功地在體外將CD34+細胞誘導生成血管內皮細胞，并于體內證明其生血管能力，說明EPCs是CD34+細胞重要亞群. 因此，EPCs有望成為血管組織工程內皮種子細胞的新來源.
EPCs是CD34+細胞重要亞群，多采用吸附單克隆抗體－磁珠分離系統(MACS)進行分離得到，此法所得細胞均一性好，純度高，但價格昂貴，實用價值欠佳，同時，EPCs吞噬的磁性微粒也必然影響細胞的代謝及功能［4］. 本實驗中，根據細胞密度的差異，針對EPCs屬于單核類細胞的特點，抽取骨髓后，用密度梯度離心法分離出單個核細胞層，再利用內皮細胞生長條件培養基外加黏連蛋白黏附特性，最終所得貼壁細胞即為EPCs. 同時，我們對所得到的骨髓EPCs用流式細胞儀檢測表面抗原表達，結果顯示細胞均一性較好，CD34陽性表達率72%，也進一步鑒定了所得到的細胞為較高純度的骨髓內皮前體細胞. 此方法簡單、經濟、高效，具用較高的應用價值.
VEGFR2是內皮細胞生長的早期表面受體，主要出現在內皮細胞誘導轉化的早期［5］. Ⅷ因子是內皮細胞特異性抗原，可以通過vWF的測定對內皮細胞進行鑒定［6］. 本實驗中人骨髓EPCs呈貼壁生長，隨體外培養時間延長，其形態由早期圓形鋪展呈橢圓形或短梭形，并迅速增殖，出現細胞融合呈“鋪路卵石樣”. 培養一定時間后，細胞增殖速度由快變慢，胞體變大、胞質疏松，提示EPCs增殖活力下降. 原代培養生長曲線顯示，EPCs的體外培養經歷了生長滯緩期、對數增殖期和生長平臺期，其增生分裂能力活躍，體外培養可以實現快速擴增. 此外，分離得到的骨髓EPCs具有與血管內皮細胞共同的特征，細胞呈鵝卵石狀貼壁生長，均表達VEGFR2， Ⅷ/vWF，胞質內還可見內皮細胞特異性標記短棒狀小體，即Weibel Palade氏小體.
EPCs存在于成年機體的骨髓和外周血中，可以自體取材，避免新的機體創傷和免疫排斥反應. 同時，EPCs增生分裂能力活躍，體外培養可以實現快速擴增，能進一步分化為內皮細胞，參與成體血管內皮細胞發育、創傷愈合、腫瘤生長等病理生理過程［7］. 因此，EPCs可以作為理想的內皮種子細胞來源，用于人工血管、組織工程瓣膜內皮化研究，具有潛在的臨床應用價值.
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細胞生物學的任務范文3
1當前護理專業醫學細胞生物學教學中面臨的問題
盡管從教學內容、教學手段和實踐環節等方面進行了一定的嘗試，獲得了良好的教學效果。但是，在教學過程中也碰到一些問題:①教學時數的限制。我院細胞生物學的教學理論時數為30學時，實驗為20學時。如何在有限的時間內既要完成教學大綱規定的教學內容，又要適時補充前沿動態、保證教學質量是一個挑戰。②醫學細胞生物學不僅教學內容多，而且知識枯燥抽象，因此，如何把這些微觀事物，生動形象地展現在學生面前是教師面臨的關鍵任務。③鑒于部分護理專業學生在高中階段沒有接觸或學習過生物學及其相關知識，而一進校就學習需要較高基礎背景的細胞生物學，由于課時數的限制，在教學過程中顯得很吃力。如何兼顧基礎扎實和基礎相對薄弱的同學，采取何種教學方法，值得進一步摸索。
2護理醫學本科細胞生物學教學改革的探索與實踐
2．1調整課程實施計劃
由于細胞生物學的快速發展已廣泛輻射醫學及生物的各個學科，為夯實醫學生的生物醫學基礎以適應現代醫學更高要求，經學校批準，已將原有醫學細胞生物學課程由40學時增加為50學時，其中理論課由原有的24學時增加為30學時，實驗課由原有16學時增加為20學時。作為醫學教育的基礎學科，既往我校醫學細胞生物學課程安排在第一學年的第二學期，即學生接觸、學習的第一門生物或醫學學科。細胞生物學課程的前導課程僅為高中生物學，并且護理本科專業一部分學生沒有接觸或學習過生物學及其相關知識。受其限定，既往細胞生物學課程的教學深度、廣度顯然已不能適應現代細胞生物學的發展，同時由于主要相關生物學科如生物化學、分子遺傳學的課程均設置在第二學年，為逐步實現生物學科的系統教學，經相關學科一起反復論證，并經廣泛調研國內、國際細胞生物學課程，經學校批準，已將醫學生細胞生物學課程調整至第三學期(第二學年的第一學期)。
2．2針對專業特點，優化教學內容，改進教學方法，培養創新型人才
筆者在醫學細胞生物學教學過程中，以突出護理醫學專業特點為宗旨，一方面遴選合適的教材。目前我校使用的是衛生部規劃教材《醫學細胞生物學》(陳譽華主編)，該教材的優點是在保證細胞生物學基本知識、基本理論的前提下，與基礎醫學和臨床醫學的聯系比較密切，刪除了一些經典細胞生物學的內容，如有關低等生物細胞、植物細胞的結構及其功能(包括葉綠體等細胞結構)的描述等。另一方面，對教學大綱進行修訂，以堅持“基礎實、內容新、知識活”的原則，大膽對教材內容進行了合理的取舍、調整、深入或更改。鑒于細胞生物學教學內容多，知識枯燥抽象，筆者重新對教學方法進行了審視，作出了以下改進。除了講述式外，還可以采用問題式、啟發式或討論式等多種教學方法。在教學過程中，注意啟發學生，讓學生多動腦筋，帶著問題去學習。比如筆者介紹細胞信號轉導一章，在導入的時候，先放幾張臨床病人的照片。如肢端肥大癥病人和重癥肌無力病人的照片，然后告訴學生這些人的患病是因為細胞信號轉導機制出現了問題。通過學習這一章的內容，學生就可以利用所學知識來解決問題。為了改革傳統的醫學模式和教學方法，國內有一些院校也在嘗試使用PBL，但在醫學細胞生物學教學中還少有運用。我們正在嘗試將PBL教學法引入醫學細胞生物學的教學中，并且取得了一定成效。
2．3倡導多媒體教學
多媒體教學是建立在擁有大量動態圖像(視頻、動畫)、靜態圖像(圖片、圖形)、文字、聲音、電子模型等教學資料基礎上，以電子技術媒體的研究和應用為核心，利用各種電教器材綜合處理文字、聲音、圖像、圖形、動畫、電子模型等信息的技術［2］。多媒體教學具有形象、生動，感染力強，節省時間，容量大等優點，深受廣大師生歡迎的教學方法。例如醫學細胞生物學理論課中關于物質跨膜運輸過程是學生較難理解的內容，在應用多媒體課件后，能展示不同物質在跨膜運輸過程中的動態過程。學生容易理解，反應良好。在講授有絲分裂和減數分裂這兩部分時，利用多媒體靜態圖像、連續動畫、片段動畫、多側面、多層次形象地模擬出染色體在整個細胞分裂過程中的變化，以及分裂過程的差錯將產生何種遺傳病及其病例照片，這種圖文并茂的授課方式增強了教學的直觀性、生動性，使學生印象深刻，從而提高了教學效率，起到事半功倍的效果。
2．4優化實驗內容，培養學生動手能力
醫學細胞生物學實驗課教材使用的是本科室2007年編寫的實驗指導，并且在此基礎上筆者不斷充實、完善和更新實驗內容。該實驗指導詳細介紹了常用的細胞生物學實驗技術，增加了新實驗以提高學生動手能力。針對醫學護理專業的學生，實驗也有所側重，如除了讓學生熟練使用普通光學顯微鏡，還讓學生親自動手制作各種涂片、滴片和壓片等，并且能熟練運用光學顯微鏡對自己制作的標本進行觀察，從而能認識常見細胞在光學顯微鏡下的一些基本形態，為其后續的學習、工作打下基礎。另外還增加了骨髓細胞染色體制備、觀察實驗，鍛煉了學生的動手能力。這些實驗操作性強，動手較多，學生興趣濃厚，教學效果好。
2．5充分利用網絡資源，建立輔導網站
在課堂教學之后引入網絡教學輔導，是對細胞生物學教學的有效補充［3］。教研室在2007年成功申報校級精品課程的基礎上，制作了細胞生物學教學網站，該網站覆蓋了講授的細胞生物學理論課程，還包括學生練習自測、模擬實驗。同時在授課過程中引導學生學會利用網絡資源，給學生介紹一些生物方面的網站以及優秀雜志的網站，讓學生及時了解在醫學細胞生物學領域或生命科學領域最新進展或解決在學習過程中遇到的問題。學生通過瀏覽網站，查詢、下載相關文獻，完成作業，成為知識體系的主動建構者，提高了分析問題、解決問題的能力，同時還培養了獲取信息、處理信息和應用信息的能力。
2．6采取多種形式，提高教師的教學、科研水平
細胞生物學的任務范文4
關鍵詞：TBL；教學模式；細胞生物學；實驗
中圖分類號：G642.4 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2014）11-0257-03
細胞生物學不僅是生命科學的重要基礎學科之一，也是現代醫藥學、生物技術領域、畜牧業、水產養殖等行業的重要基石。同時，它還是一門實驗性較強的學科，通過實驗可以讓學生將理論知識融會貫通。一直以來，細胞生物學實驗“以教師為中心，以驗證為中心”的舊教學方式大大地阻止了學生實驗的積極性和創新性。要怎樣改變細胞生物學的實驗教學來培養學生主動學習知識、獨立思考問題，以及運用實驗手段來探索生命的本質和現象，目前是細胞生物學實驗教學改革需要思考的問題。以團隊為基礎的學習（team-based learning，TBL）是上世紀70年代的美國Oklahoma大學Larry K Michaelssen教授創立的。與傳統的以授課為基礎的學習（lecture-based learning，LBL）教學模式有著很大的不同。TBL不再是以教師講授為中心，而是以學生自主學習為中心，以學生團隊式合作學習為主，注重培養學生人際交往能力，培養主動發現問題并解決問題的能力，是一種有效促進學習的新型教學模式。目前，TBL教學模式已在我國中山大學、三峽大學等高校廣泛應用，特別是在臨床、解剖等醫學基礎課程和信息素質教育課程的教學中已得到普遍認可。雖然在我國已有很多院校在不同程度上開展了TBL教學法的探索和研究并得到不同程度的好評，但沒有得到推廣和應用。針對細胞生物學實驗課程的性質，將TBL教學法應用到細胞生物學實驗課程中，擬為TBL教學模式在《細胞生物學實驗》課程中的推廣進行一些探討，提供一些思路。
一、TBL教學模式設計與實踐
細胞生物學實驗課程教學以理論課程為基礎。理論與實踐相結合，加深對所學知識的理解，對實驗儀器要求較高，因此開設此課程的宗旨是使學生掌握細胞生物學實驗設備的操作方法。使學生更加牢固地掌握基礎知識，更重要的是培養學生動手和科研能力。
1.團隊組建。將我院2011級生物科學本科班60名學生分為15組，其中每組為4人。分組時對組內成員進行調配，以達到組與組之間的均衡，再由成員分推選出一名組長，小組必須合理組織，合理管理，組員需要有責任意識。分組時要遵循的原則是既要使小組內的各種資源均衡，還要保持小組內成員穩定不變，減少影響小組內部凝聚力的因素。
2.教學準備。根據《細胞生物學實驗》教學大綱要求，教師將需要了解與掌握的內容提綱預先告知學生，在TBL教學之前讓學生對將要開展的實驗進行預習。運用TBL教學法，學生根據老師擬定的教學提綱，實驗室具備的實驗器材，結合課程內容，進行實驗前的自我研讀和儀器、材料準備。充分體現以學生為主體，提高學生主動性的要求。
3.教學實施。（1）個人測試。在課堂開始的前十分鐘，給每位學生發放一份復選題，題目覆蓋此次實驗課的實驗目的、實驗原理、操作步驟及其注意事項，要求學生運用之前所學到的知識來完成。之后參照分組，各組共同回答同樣的復選題測驗，并交出共識建立之后的答案，最后老師來分析、總結。個人測試有助于教師了解學生學習知識的情況，有利于教師調整和安排教學進程。（2）組間交流。接著進行組間交流發言，其中某一小組選舉一名代表，上講臺把本組覺得重要內容、必須重視的注意事項向其他組的同學匯報，其他組的同學與該組交換意見，共同尋求保證實驗成功的可行性方法。教師在一旁聽證，記錄各小組在討論中存在的問題、小組的發言次數及發言的質量。在此過程中，教師應鼓勵不愛發言的學生發言，參與到討論中，必要時對不發言的學生進行有針對性的提問。（3）實驗進行。實驗進行過程中教師要注意培養學生的創新精神和能力。及時指導學生對實驗進行階段性總結。教師總體掌控任務的執行，注意隨時為學生調整實驗任務，讓學生就實驗內容進行深入的思考，發現實驗探索生命本質成功的關鍵。實驗結束后，要求學生及時記錄實驗結果，最后各組選派一名代表展示實驗結果，對實驗結果進行分析，優秀學生帶動差生，綜合提高班級水平。評估提高實驗結束后收集實驗結果，要求學生對實驗結果進行分析、討論，最后撰寫實驗報告。
二、TBL教學調查研究
研究采用問卷調查。課程結束后對全班學生進行調查。教師參考相關研究后設計調查問卷。調查問卷包括：實驗前是否進行課前預習；是否有利于提高文獻檢索能力；是否有利于提高人際交往能力；是否有利于提高學習主動性；是否有利于提高實驗動手能力；是否有利于增強團隊協作意識；今后是否繼續使用TBL教學模式等問題。
三、結果
60份調查問卷全部收回，收回率100%，其結果見表1。調查結果98.4%的學生認同TBL教學法能調動學生學習積極性，98.4%的學生認為能提高文獻檢索能力，95.1%的學生認為能提高人際交往能力，96.8%的學生認為能促進課前預習，96.7%的學生認為能提高動手能力，96.7%的學生認為能增強團隊協作意識，96.7%的學生認為能使他們建立自主學習的觀念，96.8%的學生認為TBL教學法能使課堂教學氣氛活躍，95.1%的學生認為能更好地使他們理解課堂內容，91.7%的學生認為TBL教學法能及時解決學習問題，95.0%的學生認為能提高學生運用所學知識的能力，98.4%的學生認為今后應繼續使用TBL教學模式。
四、討論
細胞生物學實驗傳統的教學主要以教師講解理論知識，學生驗證為主。學生被動地學習知識技能，不能激發學生的積極主動性。而采用TBL教學模式在教學中的優點與不足具體討論如下：
1.使實驗課教學能在更高層次提高學生的動手能力。調查結果表明有96.7%的同學對提高學生的動手能力表示認同。與傳統教學模式相比較，TBL教學模式更注重學生的主體性，教師精心設計一系列必要的知識內容，促使學生課前預習實驗內容、操作步驟、注意事項，查閱相關文獻資料解答疑惑，使其理論知識得到不斷鞏固與加強。學生用更多的時間去驗證實驗，可以發現自己在實驗中的不足，激發學生去改正并且提高實驗操作能力。
2.向后進生提供幫助與支持。TBL教學模式以團隊為單位，小組成員無論是理論還是實驗操作技能存在不足的，都會在個人測試，團隊交流、討論中顯現出來，發現有知識點或是實驗操作有不足之處的，老師或者其他懂的同學可以及時指導。所以，TBL教學模式能給后進生提供支持和幫助，能獲得較大容量的學習知識。
3.培養學生的團隊協作和人際交往能力。調查結果表明有96.7%同學對能提高團隊協作認同，有95.1%的同學對能提高人際交往能力認同。在TBL教學中，教學任務的完成主要是通過團隊協作來完成，這有利于提高學生團隊合作的精神。在整個過程中，小組的每個成員都需要參與到問題的分析和解決中去，并通過相互的溝通來達成共識[5]。TBL教學模式中，小組內成員合作學習，取長補短，共同完成組內任務，這一過程培養了學生團隊協作意識[7]。
4.樹立并保持教師的工作熱情。采用TBL教學法對細胞生物學實驗課進行教學，教師不僅要把需要講解的知識點全部熟悉，還要理解相關的其他學科知識，花更多的時間去準備測試題和相關資料。對教師來講，教師是引導者和組織者，通過與學生共同參與討論，教師也從中獲益，實現教學相長式的終身學習，從而提高了教學效率[6]，樹立并保持了教師的工作熱情。
5.真正讓學生主動學習。調查結果表明有98.4%的同學對TBL能調動學生學習的主動性認同。在TBL教學過程中，學生以討論式學習和互教式的拓展性學習，真正做到以學生為中心。例如學生從實驗課開始之前就需要自己根據教師給出的學習任務，自我研讀掌握知識。實驗過程中親自動手實驗，不明白的地方由學生向老師提問。老師在回答之前，先請其他學生來回答，這樣可以增加互動。
6.節省課時，提高課堂效率。TBL教學采用課前給學生下達學習任務，學生以團隊合作方式進行自我研讀，這一環節大大縮短了教師課堂上的講授時間，留有更多時間讓學生測驗、團隊合作學習、團隊討論，提高了課堂效率。
7.TBL教學法在細胞生物學實驗教學具體實施過程中的不足及展望。TBL教學對教學設備、教學場所、教師個人素質等提出了更高要求，首先，要求教師對本專業知識融會貫通，教師個人素養高，教學技能出色，并要具備良好的組織管理能力以及控制實驗進行的能力。其次，教師對學生的學習興趣、學習態度、能力和責任感等很難在短期內較為全面和準確的把握。當發現一些小組成員搭配得不恰當時。已經來不及重新分組，這就會造成組間成績有一定差異[5]。另外，TBL教學法的特點是以小組討論形式開展教學，1位教師組織TBL教學，心有余而力不足，不能有效地參與到每一個小組的討論和實驗指導中去，這樣也會影響到TBL教學的效果。雖然TBL教學在《細胞生物學實驗》中推廣還存在一些問題，還有待今后不斷地探索和完善。但TBL教學模式教學有利于提高學生的學習積極性、主動性以及動手能力和科學研究能力，能有效促進學生培養團隊協作精神，同時更新了教師的教學理念，促進了師生之間交流，提高了細胞生物學實驗的教學質量[5]。調查表明有98.4%的學生贊同在今后教學中繼續使用TBL教學法。
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細胞生物學的任務范文5
細胞生物學是研究細胞基本生命活動規律的科學，是當前生命科學領域中最活躍、最富有發展前景的學科，同時也是一門實驗性很強的學科。細胞生物學實驗不僅可以加深學生對細胞生物學基本理論和基本知識的理解，更能通過實驗教學訓練學生的操作技能，鍛煉學生的實際動手能力，培養學生的科技創新意識，提高學生分析和解決問題的能力，全面發展學生的綜合素質。目前，國內許多高校將細胞生物學實驗作為一門獨立的專業必修課程，細胞生物學實驗教學也越來越受到人們的重視。本文結合近幾年的教學實踐，對細胞生物學實驗教學改革有如下幾點體會。
1 優化實驗教學內容，更新完善課程體系
傳統的細胞生物學實驗教學常采取“封閉性、驗證性”的教學模式，導致了學生難以提高對實驗的學習興趣，也降低了教師的積極性，對教學效果的提高收效甚微。由于細胞生物學實驗課時有限，實驗項目較少，難以增加一些設計性實驗。如何利用有限的實驗課時達到鞏固基本知識、掌握基本技術和培養創新意識的目標就顯得至關重要了。為此，可以將一些在步驟上有連續性或內容上有可比性的實驗項目歸并，提高實驗效率。比如，細胞膜通透性的觀察、細胞的凝集反應原本為兩個實驗，我們將它們并在一個實驗中，既觀察到了溶血現象的發生，還了解了凝集反應發生的原理，節省了實驗材料，提高了實驗效率。同時，合理開設綜合性實驗，將單一驗證性的實驗項目整合為系統化的綜合性實驗。比如動物細胞的原代培養及保存與復蘇這個實驗，包含了原代培養、細胞計數及觀察、細胞的保存與復蘇等小的實驗項目。這樣的實驗不僅強化了學生的基本操作能力，而且培養了其綜合運用實驗技術的科研能力。更重要的是嘗試開設了開放性實驗，如細胞融合、PAS法顯示多糖等實驗項目，由學生自己選擇感興趣的實驗，全部實驗過程由學生獨立完成。將基礎性、綜合性和開放性實驗內容合理安排后進行實驗教學，學生既扎實了基本知識，又體會到科學實驗操作的系統性和嚴謹性。
2 改革實驗教學模式，挖掘學生的科研潛力
長期以來，細胞生物學實驗采取“封閉性、驗證性”的教學模式，由教師準備實驗、講解原理、步驟和方法，然后學生按照教師講的按部就班地完成實驗。這種教學模式導致了學生無心做實驗，變成了一種應付，更談不上提高科研能力了。為此，必需改革實驗教學模式，發揮學生的主觀能動性，盡可能地挖掘學生的科研潛力。
首先，調動學生的實驗積極性，提高實驗效率，需要將學生從被動變為主動，做科研的主人。而要做到這一點，必須完全改變以往的“填鴨式”教學，運用問題教學法、討論教學法、啟發教學法等多種教學方法，引導學生主動學習、獨立思考，注重培養學生的批判性和創新性思維[1]。教師可以利用課前、課后及實驗進行中的空隙時間，提出與實驗相關的問題，組織學生討論，自由發言，最后由教師總結討論結果。此外，教師需要精心設計實驗，并提前告知學生，要求學生預習實驗，對實驗的原理、方法及預期結果進行分組討論，制定合適合理的實驗方案。在此過程中，學生處于主動地位，發揮主觀能動性，盡可能挖掘自身的科研潛能，而教師僅起引導作用，使學生積極主動的完成實驗。
其次，為了避免傳統實驗教學模式帶來的弊端，我們對細胞生物學實驗教學模式進行了嘗試并改革，重點引入了開放性實驗教學的方法。所謂的開放性實驗教學是指學生不受時間、空間、實驗項目、試劑和儀器的限制，自主進行實驗設計，探究科學問題的教學模式[2]。我們從實驗準備工作、實驗內容及實驗室的開放三個方面進行了探索：在開放性實驗教學中，所有的實驗準備工作全部由學生來做，而不是像以往一樣由實驗教師完成；對于實驗內容的開放，教師提供盡可能多的實驗項目，由學生自己選擇感興趣的項目，并完成查閱文獻、設計實驗方案、整理所需試劑和儀器、確定實驗步驟，最后完成實驗。在此過程中，教師只作技術性指導，由學生獨立完成實驗，并撰寫實驗報告；當然，實驗室的開放是必不可少的，也是非常重要的實驗場所。近幾年的細胞生物學實驗教學改革發現，實施開放性實驗教學以后，學生的動手操作能力、分析解決問題的能力以及科研創新意識都比以往傳統教學的學生提高很多。由此可見，開放性實驗教學這種模式值得進一步推廣。
再次，加強教師的繼續教育，提高業務素質和思想素質也是教育改革的關鍵?！皸?重其德業，以為人之師表?！弊鳛橐幻處煟獣r刻加強自己的業務學習，擴寬知識面，跟緊時代的發展；同時，更要提高自己的思想素質和道德修養，這樣才具備資格去教育學生，成為學生學習的榜樣。
3 建立合適的考核體系，全面展現學生的綜合素質
細胞生物學的任務范文6
【摘要】
目的：研究D葡萄糖衍生物2（3羧基1丙酰氨基）2脫氧D葡萄糖誘導人結腸癌細胞SW1116凋亡時，其形態學的變化. 方法： 選用不同濃度的2（3羧基1丙酰氨基）2脫氧D葡萄糖與人結腸癌細胞SW1116共同孵育不同時間后，采用倒置相差顯微鏡，熒光顯微鏡、透射電子顯微鏡觀察人結腸癌細胞SW1116的形態結構變化. 結果： 經2（3羧基1丙酰氨基）2脫氧D葡萄糖的不同濃度作用24~96 h后，觀察發現：人結腸癌細胞SW1116出現體積縮小，熒光染色增強，胞核或胞質中可見致密濃染的顆粒狀黃綠色熒光染色. 細胞染色質固縮，積聚在核膜邊緣呈新月狀，內質網疏松并與胞膜融合形成空泡，并呈一定的濃度、時間依賴性. 結論： 2（3羧基1丙酰氨基）2脫氧D葡萄糖在體外具有誘導人結腸癌細胞SW1116凋亡的作用.
【關鍵詞】 2（3羧基1丙酰氨基）2脫氧D葡萄糖；細胞凋亡；結腸腫瘤；SW1116細胞
【Abstract】 AIM: To investigate the morphological changes of apoptosis in human colon cancer cell line SW1116 induced by 2［(3carboxy1oxoprogy1) amino］2deoxyDglucose. METHODS: Inverted phase contrast microscopy， fluorescence microscopy， transmission electron microscopy were used to observe the morphological changes of apoptosis in human colon cancer cell line SW1116 induced by different concentrations of 2［(3carboxy1oxoprogy1) amino］2deoxyDglucose at different times (2496 h). RESULTS: The morphological changes of apoptotic cells were exhibited， including shrinkage of cell， condensation of chromatin， breakage of nuclear and formation of apoptotic bodies， and the number of apoptotic cells ascended with the increasing concentration of 2［(3carboxy1oxoprogy1) amino］2deoxyDglucose and with the time going by. CONCLUSION: 2［(3carboxy1oxoprogy1) amino］2deoxyDglucose can induce the apoptosis of human colon cancer cell line SW1116.
【Keywords】 2［(3carboxy1oxoprogy1) amino］2deoxyDglucose; apoptosis; colonic neoplasms SW1116 cells
0 引言
甲殼素是1811年法國學者Braconno發現，1823年由Odier從甲殼類動物外殼中提取，并命名為CHTTIN. 化學名稱：聚N乙酰葡萄糖胺，D氨基葡萄糖是甲殼素（chitosan）脫除乙?；蠼到舛纬傻膯翁牵讱に匾驗楹辛u基，可通過?；?、羧基化、氰化等反應形成不同結構和不同性能的衍生物．常見的有磺化甲殼素、N羥乙殼聚糖、O羧甲基殼聚糖等. 本實驗我們利用D氨基葡萄糖的最新衍生物2（3羧基1丙酰氨基）2脫氧D葡萄糖［1］對人結腸癌細胞SW1116的凋亡形態學進行了研究，以探討該D氨基葡萄糖的衍生物誘導人結腸癌細胞SW1116凋亡的作用，以期為結腸癌的治療提供新的理論途經.
1 材料和方法
1.1 材料
人結腸癌SW1116細胞購自中科院上海生化細胞所. 2（3羧基1丙酰氨基）2脫氧D葡萄糖由中科院蘭州化學物理研究所提供. 四甲基唑氮藍（MTT）、RPMI1640為Sigma公司產品，倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡為Olympus產品，透射電鏡為JEM100CX型產品. 2.5 g/L胰蛋白酶、0.1 g/L丫啶橙、100 mL/L小牛血清為上海生物工程有限公司產品.
1.2 方法
1.2.1 細胞培養將傳代的人結腸癌SW1116細胞置于37℃含50 mL/L CO2 溫箱內，在含100 mL/L小牛血清、10 g/L雙抗的RPMI1640全培養液中培養，48 h換液一次，取對數生長期細胞進行實驗.
1.2.2 MTT法將貼壁細胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化后計數，調整濃度為5×108/L，接種于96孔板，試驗時分成0.02，0.04，0.06 mmol/L 3個不同藥物濃度組及空白對照組，每組5個孔，分別于加藥后24， 48， 72和96 h測定各孔的A值. 測定前每孔加5 g/L的MTT 10 μL，溫育4 h后棄上清，加100 mmol/L DMSO 150 uL/孔，溶解，用酶標儀在490 nm波長下測定，計算細胞生長抑制率（%）=（1-實驗組A值/對照組A值）×100%.
1.2.2.1 倒置相差顯微鏡觀察將不同濃度的D葡萄糖衍生物作用不同時間的SW1116細胞置于倒置相差顯微鏡觀察其生長狀況及形態學變化，同時注意觀察其凋亡過程.
1.2.2.2 熒光染色細胞片的制備及觀察取對數生長期SW1116細胞，制成細胞爬片，經0.04 mol/L 的D葡萄糖衍生物處理72 h后，甲醇冰醋酸固定20 min，加入0.1 g /L丫啶橙10 μL染色30 min，清水沖洗后置于熒光顯微鏡下觀察.
1.2.3 透射電鏡觀察細胞片的制備及觀察取對數生長期細胞貼壁生長至培養瓶1/2，棄舊培養液，加入0.04 mol/L的D葡萄糖衍生物作用72 h后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，置離心管中，24 170 g離心20 min后棄上清，收集細胞及空白對照組細胞，PBS洗滌兩次，離心后棄上清，先加入30 mL/L戊二醛固定，后鋨酸固定50 min，脫水、包埋、聚合、超薄切片，透射電鏡下觀察凋亡細胞超微結構形態特征.
2 結果
2.1 倒置相差顯微鏡觀察對照組SW1116細胞貼壁生長良好，細胞輪廓清晰，形態規整，呈梭形或條索狀，生長旺盛，幾乎無脫落；試驗組SW1116細胞生長受到抑制，表現為細胞貼壁能力減弱，由貼壁生長而逐漸脫落，懸浮于培養液中，細胞體積縮小，變圓；出現核固縮，核顏色加深，且有時間和劑量的依賴性，藥物劑量越大，一定時間范圍內作用時間越長，其生長受抑制就越明顯（圖1A，B）.
2.2 熒光顯微鏡觀察對照組SW1116細胞呈黃色或黃綠色，胞核飽滿，胞質表現為橘黃色熒光. 試驗組細胞則出現細胞體積明顯縮小，熒光染色增強，胞核或胞質中可見致密濃染的塊狀或顆粒狀黃綠色熒光染色，有的可呈現新月形（圖1C，D）.
2.3 透射電鏡觀察透射電鏡下見對照組SW1116細胞的細胞膜完整，細胞核和細胞器等微結構清晰. 試驗組細胞胞質出現明顯濃縮，其內微絨毛減少，基質逐漸消失，內質網結構疏松并與細胞膜融合，出現空泡；胞核內的染色質固縮并凝集成塊，聚集在核膜周邊，出現環狀或新月狀（圖2）
3 討論
甲殼素不僅參與人體肝腎解毒，發揮抗炎、刺激蛋白多糖的合成，強化免疫和調節生理機能外，且可抑制腫瘤細胞的增長，其部分衍生物對腫瘤細胞具有更強的誘導分化作用［2］. Wu等［3］利用該衍生物通過體外實驗已證實，該衍生物能夠明顯抑制人肝癌細胞株（HepG2）的生長，同時能誘導其發生凋亡，并且呈一定的濃度、時間相關性.
本研究用不同濃度的2（3羧基1丙酰氨基）2脫氧D葡萄糖處理體外培養的SW1116細胞，MTT法研究顯示該衍生物對體外培養的人結腸癌SW1116細胞有明顯增殖抑制作用，并隨著時間和濃度的增加其抑制作用也隨著增加，并且在一定的時間范圍內有時間、濃度相關性，其中以0.04 mol/L的濃度作用72 h后的抑制作用最明顯，出現的凋亡細胞最多；形態學研究時應用倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡和透射電鏡可觀察到凋亡細胞的形態學特征改變：細胞固縮，染色質凝集，細胞核碎裂，呈新月狀或顆粒狀以及凋亡小體形成；以上研究表明了2（3羧基1丙酰氨基）2脫氧D葡萄糖能誘導人結腸癌細胞SW1116發生凋亡.
最新研究表明細胞凋亡是一個多基因調控的復雜過程，主要由誘導基因、抑制基因和雙向控制基因相互作用的結果［4］. 因此要誘導人結腸癌細胞的凋亡就離不開促細胞凋亡基因如Caspase3和抑制細胞凋亡基因如bcl2，bclx等之間的相互影響和相互作用，已有不少研究表明［5］以上基因均參與了結腸癌細胞的促凋亡及抑制凋亡的過程，而本研究只是從形態學的角度證實了2（3羧基1丙酰氨基）2脫氧D葡萄糖具有誘導人結腸癌SW1116細胞凋亡的作用，但其具體作用的相關機制、促凋亡基因和抑制凋亡基因如何發揮作用仍需進一步研究和探討.
【參考文獻】
［1］喬巖，王愛勤，王哲，等. 2（3羧基1丙酰氨基）2脫氧D葡萄糖的合成［J］. 化學試劑， 2004，26(2):107-108.
［2］王哲，喬巖，黃高升，等. 氨基葡萄糖及其衍生物誘導白血病細胞K562向巨噬細胞樣分化［J］.中國藥理學通報，2003，19(3):290-293.
［3］Wu J， Kou W， Gao MT ，et al. Effects of {2［(3carboxy1oxoprogy1) amino］2deoxyDGlucose} on human hepatocellular carcinoma cell line. ［J］ Acta Pharmacol Sin， 2005，26(5):635-640.
