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條件性基因敲除的基本原理范文1
光鑷( optical tweezers)又稱為單光束梯度力光阱( single-beam optical gradient forcetrap)，是一種利用高度匯聚的激光束形成的三維梯度勢阱來俘獲、操縱微小粒子的技術[1]。其中，勢阱是指一個包圍著局部最小勢能的區域，因形如陷阱而被稱為勢阱。光鑷自 1986 年由美國科學家 Arthur Ashkin[2]發明以來，已被廣泛應用于生物醫學、物理、化學等領域，成為一項重要的研究工具。最初，基于光學顯微鏡的光鑷系統滿足了對生物系統同時進行操縱和觀測的需要。隨著研究的深入，生命科學要求能夠進行單分子層次的研究，光鑷配套的成像觀測系統因此發展出了在秒級時間尺度上的位移測量精度為10－10m級的光鑷以提高空間分辨率；為了避免光鑷高強度聚焦激光束可能產生的熱效應和光化學效應，近場光鑷和飛秒脈沖光鑷應運而生，克服了傳統光鑷的熱效應問題，有利于保持生物分子的穩定性。為適應生物系統的復雜性，雙光鑷、三光鑷、四光鑷和全息光鑷等系統的出現實現了多粒子操控。隨著光鑷的進一步發展，光鑷將有可能走出實驗室，進入制造業、臨床診斷等主流產業中去。本文將綜述光鑷及拉曼光鑷的基本原理和特點，及其在生物醫學領域中的研究進展、現狀和展望。
光鑷的原理和特點
光鑷原理簡述
光鑷是基于光的力學效應的一種新的物理工具。這里以透明電介質小球為模型來闡明光鑷的基本原理。如圖 1，當一束光穿過電介質小球時，將發生反射和折射，在這個過程中，光子與小球碰撞產生的動量變化將使小球受到散射力和梯度力。散射力 (Fs)正比于入射光強，方向沿光傳播的方向；梯度力(Fg)正比于入射光強的梯度，方向沿光強的梯度方向。光鑷是依靠光的梯度力形成的，當達到焦點附近的梯度力大于散射力時才能形成一個穩定的三維光學勢阱來穩定地捕獲生物粒子。這一穩定的三維光學勢阱是由一束激光通過一個短焦距透鏡匯聚來實現的。如圖 2 所示，無論入射光從法線之上或者法線之下入射小球，小球所受到的合力均指向焦點(f)，從而使小球被穩定“鉗夾”在焦點的位置。
光鑷的特點
光鑷的基本功能賦予了其在生物醫學研究領域中的獨特優勢。1) 光鑷可捕獲和操控數十納米到數十微米的微粒，而大多數生物微粒，諸如細胞、細胞器甚至生物大分子，都恰好在這一尺度范圍內。因此，光鑷可用于操控和研究生物微粒。2) 光鑷以一種溫和的、非機械接觸的方式完成夾持和操縱物體，捕獲力是施加在整個微粒上，而不是像機械捕獲那樣集中在很小的面積上，不會對捕獲的生物微粒造成機械損傷和污染。3) 由于光的無形性和穿透性，光鑷可以在保持細胞自然生活環境的情況下對其進行捕獲與操縱，而且，光鑷的所有機械部件離捕獲對象的距離都遠大于捕獲對象的尺度(1000倍)，是遙控操作，幾乎不干擾生物粒子周圍環境和它的正常生命活動。4)光鑷能產生皮牛頓量級的力，且在捕獲焦點附近表現出虎克彈簧的性質，能滿足單分子力學和單細胞研究的需求，是重要的傳感探測工具。另外，光鑷與拉曼光譜結合被稱為拉曼光鑷技術。拉曼光鑷被廣泛應用于生物醫學研究中，因其具有微量檢測、快速和高精度等優點，特別適合生物樣品的化學成分分析[3]。單獨使用拉曼光譜進行測量時需要將激光束聚焦到樣品上，再探測光束焦點處樣品激發的光譜信號。用拉曼光譜技術研究活細胞時，待測細胞需要固定在載玻片上，這樣就改變了細胞周圍的微環境，可能對細胞機能產生影響。光鑷的引入避免了這種情況，因為它可以非接觸地操縱活細胞。因此，拉曼光鑷可以獲得單個活細胞的拉曼光譜，提取單個活細胞的結構信息[4]。
光鑷和拉曼光鑷技術在生物醫學領域中的研究進展
基于多種成像技術的發展，光鑷已經從物理學領域中脫穎而出，演變為一項適用于生物醫學研究的多功能工具，這是由于光鑷可以從單細胞的研究中獲得詳細的信息。其中，多光鑷應用于單細胞的分析擁有巨大潛力，利用其平行測量功能，可以為研究人員提供良好的分析數據，例如，多光鑷用于細胞異質性的研究、生物力的測量用于單細胞機械性能的研究等。利用光鑷對分子馬達和單分子力的研究可以得到其他方法難以獲得的研究結果。光鑷應用于細胞信號傳導和組織工程也有廣闊的前景。另外，光鑷與微流控系統結合時，可以精確地控制細胞的化學環境，因而可以實現對酸堿性、滲透壓、藥物和溫度等環境因素的實時、動態研究。隨著自動化及其它便于操作的光鑷設備的發展和跨學科學術合作的日益頻繁，光鑷技術將成為生物醫學領域中一種經常使用的研究工具。
應用于血細胞和血液系統疾病的研究
血細胞
由于生物細胞的多樣性和復雜性，在許多情況下，為了從研究中得到相關信息，需要對大量細胞進行研究。如果對細胞一個接一個地研究，研究過程會過分耗時。為了解決這一問題，多光鑷被開發出來以實現對單細胞的平行研究。Ramser 等[5]開發了雙光束光鑷系統來研究紅細胞，并使用不同波長的激光獲得了紅細胞的拉曼光譜，發現波長 514.5 nm 的激光激發出的光譜質量最好，且500～1650 cm－1范圍內的光譜峰隨時間發生了變化，這是由于這一區域的光譜對氧從血紅素中解離的光解作用較為敏感所致。Cojoc 等[6]應用多光鑷技術在多個位置成功捕獲了紅細胞，他們使用衍射分光鏡將激光分裂為多光束，使用氬離子激光探測被捕獲的紅細胞。多光鑷技術與單光鑷相比有三個獨特的優勢：1) 允許細胞在三維空間內排布；2)允許細胞的側向移動，激光可從不同位置激發拉曼光譜；3)入射在細胞上的激光強度分散，降低了光損傷的可能性。國內外有許多應用拉曼光鑷對血細胞進行研究的報道。拉曼光鑷基于光子的非彈性散射，通過獲得入射光子與散射光子的能量差異，觀察分子鍵的振動狀態，從而獲得豐富的分子結構信息。因此，拉曼光鑷可以快速靈敏地分析紅細胞，特別是分析血紅蛋白的狀態。Deng 等[7]使用拉曼光鑷技術研究了酒精對紅細胞的作用，他們記錄了細胞與 20%酒精接觸過程中的拉曼光譜隨時間的變化情況，發現表示血紅蛋白的光譜帶強度隨著紅細胞與酒精接觸時間的延長而下降。王桂文等[8]應用拉曼光鑷技術俘獲形態正常和發生形變的紅細胞并獲得其拉曼光譜，以平均光譜、主成分分析 (principal component analysis，PCA) 等方法分析不同形態紅細胞的光譜差異與胞內血紅蛋白的變化，以及這些差異和變化對光譜診斷分析的影響。結果發現，在正常的生理環境下，紅細胞發生皺縮甚至形成棘形細胞，都不會影響光譜判別分析。最近，該實驗組應用拉曼光鑷結合氣體循環供給裝置，收集并分析了不同氧合狀態的單個紅細胞的拉曼光譜[9]，發現較強功率的激光照射會導致血紅蛋白凝集特征峰(1248 cm－1和 1371 cm－1)升高。I1638/I1547比值是區分氧合態與去氧合態的良好標志，經較長時間保存的紅細胞氧合能力增強，但去氧能力沒有顯著變化；α地中海貧血 HbH-CS患者的紅細胞氧合能力比正常對照強，但其去氧能力較差。由此可見，拉曼光譜特別適合分析血紅蛋白。這主要因為血紅蛋白的活性中心由卟啉環組成，卟啉環可以吸收幾個可見光區的波長，使用接近這些波長的激光照射紅細胞，就會出現共振效應，測量集中在血紅蛋白分子上，而不會受到其他細胞成分和環境的干擾。由于在全血中可以檢查到許多血細胞缺陷，血液細胞的分選受到關注。Grover 等[10]使用兩束相反方向的激光，在光捕獲的基礎上，通過圖像處理系統區分紅細胞、白細胞和血小板，并最終將分選好的各類細胞轉運到微流系統的指定容器中。該分選方法快速、精準。這說明當分選對象在大小、形狀上存在較大差異時，可以利用其在光場中所受作用力的不同對其進行分選。Paterson 等[11]利用 Bessel 光產生的環形對稱光場將紅細胞與淋巴細胞分開，正是由于兩種細胞的受力不同，在光場中的行為也不同。在該研究中，研究者發現雙凹形的紅細胞在Bessel 光的外環上聚集后才到達 Bessel 光中心，而球形的淋巴細胞則直接到達 Bessel 光中心。最近，Yang 等[12]使用光鑷技術來測量凝血細胞之間的力，通過觀察血紅細胞的活動，發現凝血共經歷三個階段；通過測量血紅細胞間的相互作用力，發現肝素使血細胞之間的力變小并延長了凝血時間，而氨甲環酸使凝血過程跳過前兩個階段而直接進入最后階段。由于光鑷的力范圍在飛牛至納牛，正好涵蓋了許多細胞內和細胞間的生命過程，所以，可以很好地應用于測量細胞間或細胞內分子之間的相互作用力。
血液系統疾病
血液系統疾病主要表現在血細胞的異質性，由于拉曼光鑷可以獲得詳細的生物細胞分子的結構信息，因此，可用于對細胞異質性的研究。Chan等[13]利用拉曼光鑷技術獲得了正常和癌變白細胞的拉曼光譜，發現癌變的白細胞 DNA 光譜帶強度比正常白細胞低。Chan等[14]還通過捕獲白血病病人的活體白血病細胞獲得了可復制性的拉曼光譜，并應用 PCA 方法將正常和癌變白細胞的拉曼光譜進行了區分。由主元線性鑒別分析法 (principlecomponent linear discriminant analysis，PC-LDA) 進行監督分類，敏感度可達到 95%。因為使用了真實的臨床病例，提高了這項研究的應用價值。Jess 等[15]應用雙光鑷并結合拉曼光譜和微流控芯片，獲得了單個 HI60 人類早幼粒白血病細胞的拉曼光譜。微流控芯片的應用顯著加快了細胞的拉曼光譜檢測進程。De Luca等[16]采用拉曼光鑷技術，在單細胞水平上研究了β-地中海貧血紅細胞的攜氧能力和細胞膜脆性，發現地中海貧血紅細胞的攜氧能力下降，且其對于氧分壓更為敏感；測量到的膜剪切系數顯示地中海貧血紅細胞膜脆性增加了40%，證實主要影響血紅蛋白合成的基因缺陷對于紅細胞的機械性能也存在強烈的影響。王桂文等[17]應用拉曼光鑷技術收集了一例重型α地中海貧血患者單個紅細胞的拉曼光譜。結果發現，重型 α 地中海貧血患者紅細胞的拉曼光譜信號顯著低于正常對照，并檢測到一定比例的有核紅細胞；正常對照的紅細胞拉曼光譜均一，而重型α地中海貧血患者的細胞形態和拉曼光譜均顯示出多樣性；中等大小、形態接近正常的一類紅細胞，其細胞間光譜差異最大；可觀察到部分外表形態正常的紅細胞，但其血紅蛋白可能發生了血紅素凝集和蛋白質變性。該實驗組[18]還將 PCA和反向傳播 BP 網絡預測模型相結合，進行了地中海貧血紅細胞類型的判別。PCA 結果顯示，正常對照與中間型α地中海貧血細胞(HbH-CS)基本可以區分，但正常對照與重型β地中海貧血細胞及 HbH-CS 與重型 β 地中海貧血細胞間的差異不明顯。將歸一化處理的前5個主成分進行 BP 網絡訓練及預測，結果發現，正常對照與 HbH-CS 間的預測正確率高達97.90%，正常對照與重型β地中海貧血細胞及 HbH-CS 與重型 β 地中海貧血細胞間的預測正確率分別為 90.72%和 86.28%。綜上所述，通過將光鑷與拉曼光譜和微流控芯片相結合，可用于檢測血細胞中血紅蛋白的生理狀態，并對血細胞進行分選，具有很大的臨床應用潛力。應用該方法，可以獲得異質紅細胞與正常紅細胞的拉曼光譜，通過PCA 等數據分析手段實現對異質紅細胞的鑒別和分選。另外，多光鑷的應用明顯擴大了對血細胞的研究范圍，提高了研究效率。
光鑷和拉曼光鑷技術應用于微生物和感染性疾病的研究
微生物
大腸埃希菌
由于通過拉曼光譜可獲得被分析物的分子指紋，因此，拉曼光鑷也可被應用于對單個微生物細胞組分的研究。Xie和 Li[19]使用波長為 785 nm 的激光獲得了大腸埃希菌的拉曼光譜，用此方法獲得的光譜具有較好的信噪比(signal noise ratio，SNR)和較小的背景干擾。他們發現，大腸埃希菌在 60℃以上培養時，代表核酸的光譜帶強度顯著下降。該實驗組進一步的研究[20]還發現，使用拉曼光鑷能夠區分不同培養條件下平臺期的細菌。生物對激光的反應取決于激光的波長和強度。與可見光相比，近紅外激光能夠降低光損傷。Neuman 等[21]研究了波長為 790～1064 nm 的激光對大腸桿菌的近紅外光效應，發現光損傷最小的激光波長為830 nm 和 970 nm，而光損傷最大的激光波長為 870 nm 和930 nm。Rasmussen 等[22]研究光鑷捕獲對大腸桿菌的生理損傷，通過測量胞膜內外pH 梯度來確定細菌的生理狀態，發現，波長 1064 nm、功率 6 mV 的激光捕獲大腸桿菌 60 min，其細胞膜內外的pH 梯度無顯著下降，而用同樣波長、功率 18 mV 的激光捕獲僅幾分鐘，大腸桿菌細胞膜內外的pH 梯度就明顯下降；他們還發現，振蕩條件下培養的大腸埃希菌比非振蕩條件下培養的受到的生理損傷小。Mirsaidov 等[23]對大腸桿菌的生存力進行了研究，與之前的研究結果不同，研究人員發現光損傷與近紅外激光波長(840～930 nm)的關系微弱，但與激光強度呈線性相關，大腸桿菌的致死光能量為 5 J。Moritz等[24]通過拉曼光鑷技術結合 PCA 方法，在單細胞水平上研究了大腸埃希菌對抗生素的反應，發現，培養 4 h，無抗生素組在 729 和 1245 cm－1出現譜峰，而在 1660 cm－1沒有譜峰；1 vol%青鏈霉素組和 5 vol%青鏈霉素組在 1660 cm－1出現譜峰，但是在729 和1245 cm－1沒有譜峰。頭孢菌素組的光譜在 729 和 1245 cm－1與青鏈霉素組相似，反應了抗生素存在下細菌胞內腺嘌呤的生理變化。但是，頭孢菌素組的光譜在 1660 cm－1沒有譜峰，這可能與青鏈霉素引起70S 核糖體單體在細胞內的聚集有關?？梢?，通過對獲得的拉曼光譜進行數據處理分析，可得知細胞內外生物大分子的變化情況，因此，拉曼光鑷可用于研究環境因素對微生物的作用及其機制。
酵母菌
Xie等[25]通過拉曼光鑷技術獲取酵母菌的拉曼光譜，再通過與已知正常和死亡酵母菌的拉曼光譜進行比較來篩選正常酵母菌。由于伊紅只能使死亡的酵母細胞著色，因此通過拉曼光鑷技術分選出的酵母細胞可以通過伊紅染色的方法復查。應用此方法對 6 個酵母細胞進行篩選的精確度為 100%。說明可以利用拉曼光鑷對酵母菌進行篩選。然而該研究只用了6個細胞，該方法的可靠性需要更大的樣本量來加以驗證。Creely等[26]通過波長 785 nm 的激光獲取酵母菌的光譜，研究該波長的激光對酵母菌的損傷，發現酵母菌被 785 nm 的激光捕獲 2 h 未出現細胞損傷，未在拉曼光譜中觀察到蛋白質構型的改變，說明 785 nm 的激光對酵母菌的光損傷很小。Eriksson等[27]將光鑷與微流控芯片相結合，研究酵母細胞氧化應激的信號路徑。其中，綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)與信號路徑中的蛋白相結合，可通過熒光顯微鏡觀察細胞的反應。他們發現，轉錄因子 Yap1p 是在抵抗氧化應激中起主要作用的調節因子。當細胞受到氧化應激時，Yap1p-GFP 進入細胞核，而在正常情況下，Yap1p-GFP 應回到細胞胞質中。該實驗組還以同樣的方式研究了不同葡萄糖濃度下的 Snf1 路徑。Tao 等[28]應用拉曼光鑷技術探測粘紅酵母細胞內的胡蘿卜素、核酸及其他重要生物分子。他們發現，胡蘿卜素和脂質的合成在對數期末才出現顯著增加，在平臺期之后總量達到最大；核酸在早期的合成增加，隨著酵母菌生長逐漸平穩，核酸合成反而逐漸下降。這些實驗說明拉曼光鑷系統作為一種快速、便捷、可靠的方法，可以用于胡蘿卜素合成過程的菌體內研究。一般來說，生物對激光的反應取決于激光的波長和強度。通過改變捕獲激光的光學性質，可以實現不同的研究目的。就非損害的光學捕獲而言，應該使用近紅外激光。但是，由于不同的生物分子和細胞對激光的反應不同，光鑷用于捕獲微生物時，應該探索特定波長和強度的激光對該生物的影響。將拉曼光譜與光鑷相結合，能夠獲得細胞內各組分和細胞外分子的詳細信息，可用于鑒別不同微生物，檢測其生活狀態及生命過程。另外，熒光顯微鏡和特定熒光團的使用能夠幫助檢測到細胞內某些特定物質的生命活動。
感染性疾病
Mohanty 等[29]基于紅細胞在光鑷夾持下的旋轉運動提出了瘧疾的高效診斷方法。當健康紅細胞與高滲緩沖液接觸時，紅細胞變為半月形并在光鑷捕獲下旋轉，而瘧疾感染的紅細胞不旋轉，受感染個體中健康的紅細胞低速旋轉。該特征可被用于篩查血樣。通過該方法在 30 s 內可分析完成 20 個紅細胞。最近，Saraogi 等[30]通過用光鑷測量受到瘧原蟲感染的單個紅細胞的布朗運動來研究紅細胞物理性質的改變。光鑷捕獲力是該實驗的一個重要參數，因為光鑷捕獲力與激光強度、被捕獲對象的物理性質有關。測量布朗運動的功率譜是確定光鑷捕獲力的方法，該實驗就采用測量功率譜的辦法來確定光鑷的捕獲力，進而了解被捕獲紅細胞的物理性質。研究發現，正常紅細胞與被感染紅細胞的功率譜出現具有統計學意義的角頻率不同。由于感染引起紅細胞物理性質的改變，從而使角頻率發生變化，但是角頻率的變化與感染各個階段的關系不大。實驗中發現僅有不到 10%的紅細胞受到寄生蟲感染，但是，從感染病人血液中提取的未受瘧原蟲侵染的細胞，角頻率也存在明顯的增加，這說明了旁觀效應的存在。由于瘧原蟲可以引起血紅細胞性質的變化，因此，通過光鑷對受感染紅細胞的運動、物理性質等數據進行測量，可為診斷瘧疾提供幫助，有望成為瘧疾的輔助診斷工具。目前，在口腔醫學領域中應用光鑷或者拉曼光鑷技術進行的研究不多。梁裕芳等[31]應用拉曼光鑷技術比較分析了口腔毛滴蟲和陰道毛滴蟲的拉曼吸收峰，并尋找具有分類學鑒別價值的特征拉曼峰。通過光鑷隨機俘獲單個大小一致、有活力的蟲體并記錄其拉曼光譜，收集數據并做PCA分析。通過實驗發現，不同來源的蟲體在 937 cm－1、1002 cm－1和1446 cm－1譜峰的強度和譜型有差異，因此，根據 1002 cm－1譜峰的信號強度，并結合937 cm－1和1002 cm－1峰強度比值(I937/I1002)及1002 cm－1和1446 cm－1峰強度比值(I1002/I1446)，可以作為區分陰道毛滴蟲和口腔毛滴蟲的量化指標?？梢?，拉曼光鑷技術可以用于鑒別兩種毛滴蟲。
光鑷和拉曼光鑷技術應用于腫瘤疾病和抗癌藥物的研究
腫瘤疾病
乳腺癌
由于癌細胞在生物分子構成上發生了顯著變化，癌細胞的大小、物理性質等也會發生相應的改變。Guck 等[32]使用以光鑷為基礎設計的“光擔架”研究乳腺癌細胞，發現乳腺癌細胞比正常乳腺細胞更容易發生形變。更強的形變能力被認為與惡性腫瘤細胞需要形變后進入循環系統而發生遠處轉移有關。這一方法可以用于微流細胞篩選，并根據細胞膜變形能力進行診斷。
前列腺癌
由于前列腺特異性抗原檢測的高假陽性率，臨床上迫切要求提高診斷前列腺癌的準確性。由于拉曼光譜中包含了大量的化學物質結構信息，拉曼光鑷被廣泛應用于腫瘤細胞與正常細胞的鑒別。Harvey 等[33]應用拉曼光鑷技術結合 PCA，區分前列腺癌細胞 (PC-3) 和膀胱細胞系(MGH-U1)，發現 MGH-U1 比 PC-3 含有更多的核酸和蛋白質。這項研究顯示拉曼光譜包含大量化學物質的結構信息，例如，氨基化合物Ⅰ和氨基化合物Ⅱ的光譜帶分別位于 1650 cm－1和 1570 cm－1，脂質的光譜帶在 1200 cm－1至 1400 cm－1的區域內占優勢，含苯丙氨酸的蛋白質在1002 cm－1能被清楚地觀察到，也有蛋白質在 860 cm－1的位置出現光譜帶，在 800 cm－1以下區域的弱帶一般代表核酸。Harvey 等[34]還采用化學方法固定前列腺癌細胞、早期前列腺良性肥大細胞和尿道細胞，并應用拉曼光鑷技術對這三種細胞進行鑒別。實驗結果顯示，敏感性大于72%，特異性大于 90%?？梢姡撗芯糠椒ㄓ锌赡軕糜谂R床，通過簡單的尿液檢查對前列腺癌進行診斷。與活體組織檢查相比，該方法對患者造成的痛苦少，但就其敏感性和特異性而言，仍無法取代活檢。
結直腸癌
Zheng等[35]應用拉曼光鑷技術獲得了 200 個正常和 200 個癌變結直腸細胞的拉曼光譜，并使用ANN和 PCA 對光譜進行分類。結果顯示：80 個光譜的單盲試驗，敏感性和特異性均達到 86.3%；雙盲試驗，敏感性達到 85%，特異性達到 92.5%。Chen 等[36]制備了取自直結腸癌變組織的細胞懸液，用光鑷捕獲正常和癌變結直腸上皮細胞并獲得其拉曼光譜，分析顯示癌細胞包含更多的核酸和蛋白質。通過單盲試驗，敏感性達到 82.5%，特異性達到92.5%。Deng等[8]使用拉曼光鑷技術對正常和癌變的直結腸細胞進行研究，發現正常直結腸細胞的光譜帶強度比( 1002/1300)為 1.08，而癌變直結腸細胞的光譜帶強度比為 0.85。1002 cm－1的光譜帶代表蛋白質，1300 cm－1的光譜帶代表脂質，可見，正常的直結腸細胞比癌變的直結腸細胞含有更多的蛋白質和更少的脂質，因此通過選擇合適的參數(如光譜帶強度比)，可實現對細胞良、惡性的快速鑒別。
其他腫瘤
Banerjee和 Zhang[37]應用拉曼光鑷來區分星形膠質細胞和它的癌變細胞，與其他腫瘤的研究結果相似：癌變細胞的蛋白質和脂質的光譜帶強度比星形膠質細胞的光譜帶強度高，這項研究說明拉曼光鑷有在較為復雜的領域中進行研究的潛力。姚輝璐等[38]利用拉曼光鑷獲得了鼻咽癌細胞株和正常人鼻咽部氣道上皮細胞株的單細胞拉曼光譜，結果顯示：正常細胞和癌細胞的平均拉曼光譜有顯著差異，正常細胞的光譜強度比癌細胞明顯要高，正常細胞的光譜帶強度比(1304/1336)為 1.05，癌細胞為 1.22。證明拉曼光鑷可以成為區別正常鼻咽細胞和鼻咽癌細胞的有效手段。該實驗組[39]還應用相似的實驗模型獲得了正常肝細胞株和肝癌細胞株的單細胞拉曼光譜，得到了類似的結果：正常細胞和癌細胞的平均拉曼光譜存在顯著差異；癌細胞譜線強度整體變弱；正常細胞1658 cm－1處峰和 1450 cm－1處峰的強度比值為 0.63，癌細胞為 0.99；癌細胞的核酸、蛋白質、脂類等重要生物分子在結構或含量上都發生了不同的改變。用 PCA 方法對單個細胞的平均拉曼光譜進行分析，結果發現PCA 可以正確區分出正常細胞和癌細胞。
抗癌藥物
國外學者使用光鑷研究 DNA 插入藥物與 DNA 的結合方式和親和性。過去的研究發現喹唑酮類藥(PD153035)為新型酪氨酸激酶抑制劑，還發現 PD153035 可以直接插入 DNA，說明這種多靶向定位藥物具有很大的治療人類惡性腫瘤的潛能。Cheng等[40]使用雙光鑷來確定 PD153035 的親和性常數 (KA)和插入位點之間最小的堿基對數(n)。光鑷系統與一個倒置的光學顯微鏡結合，包含兩束激光，一束采用減反射鏡來控制，作為固定勢阱，另一束采用掃描鏡來控制，作為掃描勢阱。另外，用一個四象限光電二極管探測被捕獲微珠的位置。為了構建 DNA- 微珠復合體，將噬菌體 DNA 片段的生物素?；┒伺c T4DNA 連接酶捆綁，末端附著于抗生蛋白鏈霉素包裹的平均直徑為 1.87 μm 的微珠上。實驗結果表明，DNA在 1 mmol/L 的甲次砷酸鈉液中明顯增長，在 (23±0.5)℃的環境溫度下，KA= (1.18±0.09)×104mol－1L，nPD153035=11 bp。在測量 DNA 分子力的實驗中，直接進行 DNA 的操作并不方便，通常需要將DNA 鏈的一端與微珠相連，以便于對 DNA 的操控。
光鑷和拉曼光鑷技術應用于亞細胞結構的研究
除了細胞水平的研究，拉曼光鑷也可應用于對亞細胞結構(如染色體、線粒體、DNA、RNA等)進行研究。Ojeda 等[41]采用拉曼光鑷技術，捕獲操控染色體并獲得即時光譜，成功鑒別了三個不同的染色體。他們使用光鑷分離三個不同的染色體，獲得拉曼光譜并進行GDA分析，再用光鑷將染色體放置于載玻片上，通過 G 帶染色來驗證光譜的檢測結果。實驗結果表明能夠根據拉曼光譜區分這三個染色體，從而證實了使用拉曼光鑷技術無需染色就能夠鑒定人類染色體。Reiner等[42]使用光鑷技術從溶解的人 HL-60 細胞中成功提取出單個線粒體并完成線粒體 DNA 異序性的檢測。用線粒體綠色熒光染料 (Mitotraker Green FM) 對線粒體染色標記，利用紫外光使細胞溶解，用熒光辨認單個線粒體，再用紅外激光捕獲線粒體并將其移動到微小的吸液管尖端，線粒體被吸入緩沖液，為分析線粒體 DNA (mtDNA) 做準備。使用PCR 技術 3 次 DNA 擴增后，通過基因測序的方法發現單個線粒體中 mtDNA 的異序性比率約為 50%。該研究說明，熒光顯微鏡及熒光染料的發展為光鑷對細胞中某些特定物質的研究打下了基礎。Tang 等[43]應用拉曼光鑷技術研究從大鼠的肝臟、心肌和腎臟組織中提取出來的線粒體。首先記錄脂質、蛋白質、核酸的拉曼譜峰，再通過拉曼光鑷獲得各組織中提取出來的線粒體的拉曼光譜，發現從不同組織中提取的線粒體的差異是由于各組織中線粒體組分的不同造成的，例如，肝臟線粒體和心肌線粒體的光譜差異源于脂質的結構和蛋白質的分子量不同。Tang 等還發現，當線粒體與含 100 μmol/L Ca2+的 KCl 緩沖液接觸時，1602 cm－1的拉曼譜峰強度下降。這項研究說明拉曼光鑷技術可以研究單個線粒體的生命活動及其與藥物、毒素接觸時的組分變化情況。
光鑷和拉曼光鑷技術應用于生物學基礎研究
在一些研究中，需要以可控的方式去除某些細胞成分而又不損傷其他細胞組分。此時，可以采用脈沖紫外激光或者近紅外激光作為光刀攻擊細胞器，使其不可逆地失去功能。Paterson等[11]使用紫外光二極管為光源，以相對較低強度的光切細胞膜，向倉鼠卵細胞中引入外源 DNA。Stevenson 等[44]使用鈦寶石激光，以同樣的實驗模型研究細胞的轉染率和生存力，研究顯示光手術非線性地依賴于光強度，作用于細胞膜上的激光強度為 1.2 μJ/cm2時，細胞轉染率為 50%。光刀也可應用于研究細胞不同部分的功能。Grigaravicius 等[45]將光刀應用于老化研究。DNA 的自我修復作用在維持胞內生化反應中起著至關重要的作用，為了更多地研究 DNA 修復分子與 DNA 損傷位點之間的動力學，在時間和空間上有控制地敲除特定DNA很重要，光刀提供了卓越的空間和時間控制，因而成為該實驗的理想工具。將光刀與熒光顯微鏡結合，他們發現，對 DNA 輕度損傷的修復發生在實際發生 DNA 損傷位點的旁邊而并不直接位于該位點上，其原因需要進一步的研究。另外，紫外激光也可在細胞膜上鉆孔，以觀察熒光染料在細胞內的擴散，該技術被應用于研究細胞內區室之間的連接情況[46,47]。將紫外光導向相鄰兩個細胞的鄰接點可引起兩個細胞的融合，He 等[48]應用這種方法，使用1550 nm 的飛秒脈沖激光將人肝癌細胞與人子宮頸癌細胞融合，細胞融合率為37%。多光鑷的出現實現了多個粒子的同時操作，而使激光穿過空間光調制器(SLM-spatiallight modulator)可得到需要的光結構。隨著成像技術和計算機的發展，實現了全息計算直接與 SLM 連接，最終建立起全息光鑷系統。Monnoret 等[49]將設計的儲液池與全息光鑷結合，引導多個橡膠微珠與 cos-7 細胞的特定區域結合，這項研究作為使包裹配合基的橡膠微珠與細胞膜密切結合的基礎，可應用于細胞膜受體的動力學研究。此外，光鑷在組織工程學研究中有巨大的應用潛力，Mirsaidov 等[50]通過將微流控系統與分時光鑷結合，成功構建了人工合成組織。其中，微流控系統將細胞導入組織裝配區；分時光鑷用于將細胞組裝成為復雜的培養組織，之后，這些細胞被包裹在模擬細胞外基質的可光聚合水凝膠中。通過上述過程的反復操作，該人工合成組織的體積逐漸增大。
