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正向遺傳學克隆基因的方法范文1
70年代以來，世界上提出“綠色革命”的口號，其實質是指種子革命。應該說綠色革命首先是從農業開始的。世界人口的爆炸帶來糧食的緊缺，建設的需要使耕地越來越少，迫使人們必須加快研究選育和推廣應用優良的農作物新品種，及其配套改革栽培管理技術。使作物單位面積的產量越來越高，以解決人類的吃飯問題。隨著現代社會的發展，資源短缺以及環境惡化的矛盾日益突出，世界的生態平衡受到破壞，人類的生存受到威脅。此時，人們不僅要考慮吃飯問題，還要考慮生存及可持續發展等問題。因此“綠色革命”從農業延伸到林業等學科。
森林是地球上生態系統中最重要的因素。人們對森林的認識已從單純索取木材轉變到可持續經營的角度上來，提出分類經營思想，即把森林區分為生態林與商品林來經營。用80％～90％的林地建設生態林，采用復層林作業，其主要作用是保護生態環境；把條件較好的10％～20％的林地用于商品林建設，進行高度集約經營，主要用于向人們提供木材等林產品。例如。新西蘭的商品林僅占其森林總面積的8％．但提供木材占其總產量的90％以上。其關鍵的技術是林木種子的革命。我們用“革命”這個字眼。是因為良種對林業生產力起著決定性作用，它的變革是根本性的，可帶來翻翻的產量。是現代林業的一個核心技術。
國內外通過林木種子改良取得明顯效益的事例，不勝枚舉。桉樹原產澳大利亞等地，引進巴西后，經過改良，采用無性系營造商品林，5年生時，樹高可達25m，7～8年即可砍伐更新，每公頃蓄積量超過600m3。剛果進行的桉樹育種計劃取得的遺傳增益為：種源選擇50％-80％；雜交、個體選擇、無性系增益100％～150％。
以上事例可以說明，林木良種化帶來的效益是十分明顯的。林木與農作物有所不同，樹木多為異花授粉，多數處于野生或半野生狀態，大部分林木是未經過改良的原始材料。它們的變異普遍，變異的性狀多、幅度大，蘊藏著大量尚未利用的優良變異類型。這些優良類型一旦被選育出來，就可以顯著地提高林業的生產力，加上多數林木具有容易進行基因型“克隆”的特性，一經選擇，馬上采用無性繁殖，大量復制，就可很快投入到林業生產實踐中。
林業上選育良種與農業比較，具有更加經濟長效的優點，在生產周期中只需采用一次，即能獲得長久的效果。農業上一個品種不行，第二年甚至第二季就可換一個。而林木生長周期長，一粒種子播下后，十幾年或幾十年才能砍伐，如果選用良種，年年可獲取增益。從這個意義上看，林木良種選育具有更為迫切的意義。
2林木品種改良的途徑
2．1林木遺傳改良的一般過程
林木遺傳改良的形式多種多樣，可以用如下圖式表達其一般過程：
(1)基本群體表型選擇優良類型
(2)優良類型遺傳測定原種
(3)原種良種繁育品種
(4)品種區域化測定良種
可見一個新品種的培育過程經歷了選擇——測定——繁育——推廣等過程，極為精細復雜，需要耗費大量的時間和經費。
2．2種質資源開發利用
樹木基因資源是地球人的寶貴財富，也是選育樹木優良品種的物質基礎。不論是常規育種，還是誘變育種乃至遺傳工程研究，都離不開基因資源。實踐證明，搜集的基因資源越豐富、越全面，對它們研究得越深入、越有針對性，就越能滿足各種育種目標的要求，選育出人們所期望的新品種。同時，基因資源不僅用于當前的育種，而且要為將來培育更高質量的新品種服務。
據分類學家估計，全世界現有植物5O多萬種，高等植物23萬多種。經人類長期馴化栽培，提供人類吃、穿、用等方面的植物種類，只不過1％～2％。約有2000多種。常見栽培作物只有175種，其中16種提供了人類食物的2／3。正是這些為數不多的栽培種類，成為人類社會物質文明的重要基礎。
譬如樹木中的三倍體山楊、直干藍桉等都是從野生林分中發現的快速生長的優良單株。因此，從某種意義上講，基因資源的收集和保存比創造新品種更為重要，是一項具有戰略意義的工作。
2．3選擇育種
選擇育種是獲得優良品種和生產群體的重要手段，在林木改良中具有極其重要的意義。選擇育種可以在較短時間內，得到人們需要的基因型，經過繁育馬上就可投入到生產之中。例如筆者在天然馬尾松林中發現紅心率達8O％以上的馬尾松單株，這類馬尾松1996年的價格是3000元／m3，為普通馬尾松的5倍。
選擇的物質基礎是所研究材料的變異，材料的變異越大，變異越豐富，選擇的效果越好。以往林業上多用天然變異，從野生樹木中，篩選符合人們愿望的類型，通過培育為新品種。這種利用天然變異材料仍不失為林木選育新品種的有效途徑。但天然變異畢竟有它的局限性，難于滿足社會發展的需求。于是人們又創造了人工的變異方法，以擴大變異范圍和增加選擇機會，成為直接改良品種的有力手段。如19世紀已開始的樹木雜交育種，通過不同種質問的有性雜交，使父本母本的基因進行交換重組，產生變異。這種方法不僅可以使雜交親本雙方的性狀互補，取長補短。而且可能出現超過親本的性狀，產生原來親本所沒有表現出來的新性狀?，F已從種內雜交發展到種間雜交。進入2O世紀以來，人工促進遺傳變異的技術得到很大的發展。7O年代以前主要用物理和化學因素來誘發植物體的遺傳物質發生變異．使基因突變的頻率比自然界自發突變高出100～1000倍。但這種誘變的方向和性質不易控制，選種的效率較低，因此進展不快。6O年代以來．植物的生物技術發展得很快，從器官培養到細胞培養、原生質體培養、體細胞雜交等，直到現在的細胞工程、染色體工程、基因工程，新技術、新成果不斷涌現，給林業帶來革命性的變化。
2．4遺傳測定
在目前樹木育種工作中，處理的育種材料多數屬于未經遺傳鑒定的表現型。表現型是樹木遺傳性與環境條件相互作用的結果．所以優良的表現型并不等于它的遺傳性優良。只有經過遺傳測定，認定優良的經濟性狀受遺傳控制，從屬于優良的遺傳性，才能作為原種，進入到更高一級的育種階段。
2．5林木良種繁育
良種繁育是林木良種化中重要的環節之一。當通過表型測定選育出來的品種．經過區域化試驗，確定推廣地區后，便要做好良種的繁育工作，直至該品種被更換了為止。良種繁育是育種工作的繼續，是前承育種后接推廣并不斷提高種性的一個重要環節。如果繁育措施不當．使良種變為劣種，就會失去它的增產效益。良種繁育不僅是前一輪育種成果進入生產的唯一手段，而且也是下一輪育種所需要的遺傳信息和基礎材料獲得的來源。
目前林木良種主要采用有性和無性兩種形式進行繁育。營建無性系種子園是有性繁育的主要方式，它的營建技術較簡單，繁殖系數較大，被廣泛采用。其實質是通過選擇．改良原有群體的基因的頻率，提高其正向選擇的遺傳增益，達到改良的目的。目前種子園主要的問題是產量低，實生種子的遺傳基礎不一致，對高度集約的商品林來說，木材以及林產品的不一致性，給利用帶來困難。
在無性繁殖的情況下，無性系分株的遺傳成分與其原株的完全相同，它們不僅繼承了原株的加性效應，而且繼承了原株的顯性和上位作用效應。所以在選擇差相同的情況下，能取得較大的遺傳增益，因此近代國內外都趨向于無性系育種和無性系林業。
總之，林木種子從原來的見種就采、見苗就種的局面，到現在選擇優良種源、優良林分、優良家系、優良無性系，建立種子園與采穗圃生產良種，已經大大地向前邁進了一步。它已發揮出明顯的作用，產生了巨大的效益。從某種意義上說，已經開始了林木種子的革命。但這還不夠，現代科技的發展，還要求我們加快生物技術應用的步伐，開展更深層次的林木種子新技術革命。
3生物技術與林木種子革命
近年來生物技術發展迅速．它包括細胞工程、染色體工程和基因工程。
3．1細胞工程
細胞工程主要包括原生質體培養、大規模的工廠化的細胞培養、組織培養和快速繁殖等技術，以生產大量的優良無性系，并可獲得人類所需要的多種代謝物質，如黃連素、人參皂甙等。細胞融合，它可打破種屬間的界限，在樹木新品種的培育上有著巨大的潛力。目前，胚胎分化人工種子等技術的利用也日益普及。
3．1．1林木的組織培養
樹木組織和細胞培養的研究也取得了重要的進展。目前由體細胞再生出完整植株的有：歐洲樺、檸檬桉、巨桉、楊樹、花旗松、長葉松、杉木、柳杉等幾十種樹種。林木原生質體培養及細胞雜交也進行了探索，歐洲云杉、花旗松、火炬松、短葉松、楊樹、泡桐等樹種已分離出原生質體，并進行了培養。日本對楊樹種和泡桐的原生質體做了融合試驗。
用組織培養繁殖樹木，不僅和無性繁殖一樣，能保持樹木的優良性狀，同時還具有如下特點：(1)繁殖系數大；(2)縮短良種的推廣周期；(3)培養無菌苗；(4)繁殖難于用常規方法營養繁殖的樹種；(5)發育階段返青；(6)可作用保有基因資源的一種手段；(7)變異培養無性系利用啕。
3．1．2胚胎發生及人工種子
器官與胚胎發生是培養植物細胞分化的兩種主要途徑。用胚狀體形成植株主要特點是增殖迅速、遺傳單一。在組培中獲得胚狀體以后用適當方法加以包裹即可制成人工種子。根據Flick和Ammirato(1983)統計，經胚胎發生途徑得到完整植株的植物有91種。其中有火炬松、糖松和挪威云杉獲得體細胞胚胎及小苗。我國培育成功的樹木體細胞胚胎發生及小苗形成是中國科學院于1988年以華北云杉(Piceawilsomii)為試材研究成功的。人工種子研制的關鍵是選擇適當的方式進行包被．最常見的是凝膠法包裹。隨著人工種子研究的深入．將有愈來愈多的人工種皮材料被開發出來。
3．1．3原生質體培養
自從Cocking在1960年用纖維素分解植物細胞壁首獲原生質體以來，在原生質體培養和融合方面已取得突破性進展。國內外約有2O種林木獲得原生質體，其中一部分已誘導成植株。
3．1．4體細胞融合
體細胞融合試驗應在誘導原生質體再生植株的基礎上進行。體細胞融合方法對于樹木改良特別適合．該法與常規有性雜交比較，具備以下特點：(1)能形成兩個親緣關系較遠的種間雜種，克服了有性雜交的配子不親合性；(2)能獲得一些含有另一親本非整倍體的雜種或胞質雜種；(3)能設計出一次兩個以上親本的融合；(4)能獲得在遺傳上呈雙親個體基因型總和的雜種；(5)能獲得一些有性生殖障礙的植物種類的體細胞雜種；(6)能獲得具有不同遺傳變化親本的雜種。
3．2染色體技術
染色體技術在樹木的核型、組型、帶型分析的基礎性研究較為深入。速生豐產樹種杉木、楊樹、馬尾松等既有常規的細胞學研究，也有地理種源的染色體性狀比較。經濟林樹種山茶、油茶、漆樹、桑樹、獼猴挑等染色體研究資料也較為深入，藥用植物杜仲、銀杏等有一定的研究。染色體研究在科以上的有杉科、松科、芍藥科、銀杏、山茶科等；地域性染色體資源研究有云南、廣西、寧夏、貴州等地。這些基礎性研究為保護植物種質資源，研究樹種的分類、分化、系統發育提供了詳實的細胞學材料。
3．3基因工程
樹木基因工程取得的進展及其作用主要有：
3．3．1DNA分離與轉導
基因工程的一個最關鍵技術是把目的基因轉導到目標植物中去，并使其能準確地表達出來。8O年代初．人類首次從細菌中分離出來一些分解抗生素的基因，成功地轉移到植物細胞中，并獲得能在含抗生素的培養基上生長的植株。此后即出現了一系列轉基因植株。同時轉基因技術也日益成熟。目前林木轉基因技術有不少成功的事例：
(1)抗蟲轉基因植株。1988年美國依阿華大學林學系利用從馬鈴薯中提取的蛋白酶抑制劑Ⅱ號(InhibitorⅡ)為目的基因，與以新霉素磷酸轉移酶Ⅱ(NoemycinphosphotransteraseⅡ，即NⅡ)為標記基因制成嵌合基因，以根癌農桿菌grobacteriumtumefeciens)的Ti質粒為載體，以葉盤轉化再生法(Leafdisktransf~lrmationregenerationme山ed)為組培手段，用楊樹雜種無性系(PopuiusalbaxPopulusgrandidentata)為試材，經測定這種抗蟲的轉基因植株具有高毒性，幼蟲取食后死亡率很高。
(2)抗除草劑轉基因植株。1987年美國加州和威斯康星州的科學家利用楊樹雜種無性系(alba．xP．grandidentata)為試材，從土壤中沙門氏細菌(Salmenellabacteria)提取抗除草劑的DNA．這種基因能控制一種特殊的酶，它能解除除草劑的作用，而對沙門氏菌安全。經培養獲得除草劑轉基因植株。
(3)通過基因操作控制木素的生物合成。在生產紙槳的過程中，為除去不需要的木素需要大量的能源，處理木素廢液還要龐大的設備，于是就產生了培育木素含量少或易提取木素林木的想法。有人用“反意法”研究培育木素含量少的林木。另一項試驗是把合成闊葉樹型木素的基因導入針葉樹，培育含有大量易提取木素結構的林木。
(4)抗大氣污染氣體的林木的培育。其重點在活性氧解毒上起重要作用的谷胱甘肽還原酶的基因上。有報告指出，把出自大腸桿菌的基因導入雜種楊，培育提高此種酶活性的轉化體。在一般情況下，林木對大氣污染物質也有很強的吸收和解毒能力。而此種酶活性進一步提高的轉化體，作環境綠化木是大有可能的，它具有很強的耐SO：和臭氧的性質。
(5)控制林木形態的形成。對控制柳杉花形態形成的基因和變應原基因進行了分離．利用這些基因培育出能控制產生雄花和合成變應原的柳杉。有報告說：把白葶藶的控制芽分化的基因導入雜種楊，得到了花芽形成時間由通常的8年縮短到僅7個月的轉化體。
(6)通過基因操作擴大林木的生育范圍。一般來說，植物生長發育的場所是不能變動的，個體或種的維持是靠與光照條件、大氣成分、土壤水分、土壤養分、有害物質的吸收、病原菌的感染等環境條件相應的復雜的適應機制。例如，若能對平時出現過剩的基因進行操作。這種基因是控制耐干燥、耐鹽基因群的基因，那么，影響出現前轉化體就有防御機制，其結果就擴大了生長范圍。如果耐凍性、耐寒性、耐高溫性、抗紫外線性等受到重視，那么控制林木生長范圍(南限和北限、海拔高度界限等)的基因操作就會成功。
3．3．2林木遺傳圖譜的構建
遺傳圖譜是選用合適的自然群體或通過人工技術手段構建的人工作圖群體，利用各類遺傳標記和定位的基因構建的遺傳標記與基因的線性排列圖。林木遺傳圖譜是對林木基因組進行系統研究的基礎。由于林木生育周期長，利用形態標記來構建遺傳圖譜幾乎不可能，所以過去幾乎找不到林木遺傳圖譜。由于同工酶技術的發展，7O-8O年代構建了一部分樹種的同工酶標記的遺傳圖譜。但同工酶利用的標記有限。難以構建高密度的遺傳圖譜。由于分子標記的開發，近年林木遺傳圖譜構建已成為林木遺傳學研究的熱點，有利于在短期內構建高密度的圖譜。共顯性以分子標記如RFLP、SSR、STS等適合于任何作物群體的遺傳作圖；而顯性標記如RAPD只適合于單株針葉樹構成的群體(因其來自親本的單倍體胚乳)和DH群體。利用大量分子標記構筑高密度連鎖圖后，有利于今后未知基因的定位、克隆及分子標記輔助選擇等。
3．3．3目標基因定位和克隆
利用已有的遺傳圖譜及適當的分離群體可以將目標基因或數量性狀座位(QuantitativeTraitLoci。簡稱QTL)定位于某條染色體的某一區段或每兩個遺傳標記之間。這些被定位的主基因或QTL可利用位置克隆的辦法被分離克隆，一些作物的有用基因如水稻白葉枯病抗性基因Xa2，就是這樣被克隆到的。
數量遺傳學作為遺傳學的一個分支一直是獨立發展的。但到8O年代卻處于低谷。由于分子生物學的崛起，分子標記的開發，數量遺傳和分子生物學的結合產生了新的邊緣學科——分子數量遺傳學，使得數量遺傳學重新獲得新生。因為利用分子標記對QTL的定位，可象一般主基因那樣將QTL克隆出來加以利用。這對林木遺傳育種將產生重大影響。因為許多經濟性狀都是由QTL控制的。
3．3．4分子標記輔助選擇育種
分子標記輔助選擇(MakerAssistedSelec—tion。簡稱MAS)。是通過分析與目標基因緊密連鎖的分子標記的基因型來判斷目標基因是否存在的一種植物育種選擇方法。這種方法不受其它基因效應和環境因素的影響，因此結果較可靠，而且可以進行早期選擇和對隱性基因的選擇，從而大大加快育種進程。提高選擇效果。特別對于生育周期長的林木來說更具有重要意義。
3．3．5物種、品種及優良無性系鑒別
不同物種、品種及單株在基因組上均存在差異，不同植株(不同無性系)之間的差異在多數情況下是難以鑒別出來的。但由于分子標記的無限性，總可以將其區分開來。因此分子標記可非常有效地用于林木育種特別是優良無性系的鑒別，還可用于物種、品種分類。利用分子標記可以檢測出林木種子園外來其它花粉的污染情況，也可鑒定其生產的種子是否真由種子園親本之間雜交產生，以檢測種子的混雜性。
3．3．6在林木基因研究上的應用
林木的生理現象還有很多是未知的，用基因結構和機能加以說明是驗證科學世界的要求。例如把控制形態形成的基因導入鉆天楊并出現過剩。那么就會改變葉的形態，或者節間變短或者短化。因此我們認為，這種基因有調節葉的形態、節間長短和樹高的可能性?？傊?，基因操作可稱作是解析未知的基因機能的重要技術。林木研究方面也在尋求開發組織特異的或生長階段特異的促進劑。我們在世界上率先對與裸子植物光合作用有關的基因的促進劑結構與機能進行了解析。分析基因促進劑時。要求在促進劑范圍內讓信使基因連結。向基因分離了的該生物種類基因轉移，通過信使基因的出現，分析促進劑的機能。
3.3.7在林木染色體組研究上的應用
對人及實驗動植物的染色體組研究正在蓬勃開展。為了推進林木的染色體組研究，用DNA限制酶斷片多型分析，成功地編制了柳杉連鎖圖。對部分連鎖群來說。利用三體生物能使其處于與特定染色體相對應的狀態。該連鎖圖將向未來高密度連鎖圖發展。與11條染色體的對應及染色體上的基因配置也能得到理解，作為有關柳杉染色體組的結構與機能的基礎信息將會起重要作用。
正向遺傳學克隆基因的方法范文2
反向遺傳技術為在DNA水平上對RNA病毒進行研究和操作提供了極為方便有用的工具。本研究構建了EV71全長cDNA克隆,并將體外轉錄得到的RNA轉染RD細胞,成功獲得拯救病毒,為進一步研究EV71病毒基因功能、基因變異與病毒毒力關系、基因疫苗等研究以及防控該病奠定良好的基礎。
1材料和方法
1.1 材料
1.1.1毒株與細胞
EV71病毒株FJ08149是2008年從一手足口病病例皰疹液分離獲得,經鑒定為EV71 C4基因亞型。RD細胞由中國疾病預防控制中心脊灰實驗室惠贈。
1.1.2主要試劑
長片段擴增Primescript RT-PCR Kit購自Takara公司;PCR-XL- TOPO TA載體 購自Invitrogen公司;RiboMAXTM LargeScale RNA Production Systems-T7 購自Promega 公司;QIAamp Viral RNA Mini Kit、Transfection reagent和RNeasy Mini kit 購自Qiagen公司;EV71單克隆抗體購自Chemicon公司;FITC標記的二抗購自Dako公司。
1.2 引物設計與合成
根據FJ08149株的序列和酶切位點,設計了一對引物,上游引物 EV71-5T7在其5'引入T7啟動子序列及NotI酶切位點,下游引物EV71-3RM在其5'端引入52個Poly(T)及MluI酶切位點。由Takara公司合成。
1.3 RT-PCR擴增基因片段
按照QIAamp Viral RNA Mini Kit 試劑說明提取病毒RNA,最后用適量無RNA酶的雙蒸水溶解。根據長片段Primescript RT-PCR Kit說明書,先以EV71-3RM為反轉錄引物,在42℃反應1小時反轉錄全長cDNA,然后利用Takara Ex Taq HS進行基因組全長擴增,PCR反應條件為:95℃預變性3 min;98℃ 10sec , 68℃ 9min,40個循環;72℃ 10min。反應產物在0.7%瓊脂糖中電泳進行檢驗。
1.4 全長cDNA 的構建與鑒定
RT-PCR擴增產物經電泳后純化,以TA克隆方法將帶有T7啟動子識別序列的基因組全長連入TOPO-XL-PCR載體中,用MluI和NotI酶切鑒定是否插入目的片段。
1.5 體外轉錄與轉染RD細胞
用MluⅠ和NotI將有目的片段插入的質粒進行雙酶切線性化,純化后按照T7體外轉錄試劑盒說明在體外轉錄出RNA,用RNeasy mini kit(Qiagen)試劑盒進行RNA純化后,加30ul無RNA酶的雙蒸水洗脫, 定量。按照Transfection reagent說明書要求把RNA轉染到培養于6孔細胞板RD細胞中, RNA含量為2μg/孔。轉染后每天觀察細胞,待細胞病變(CPE)達到75%及以上或觀察7天后,收獲細胞進行鑒定與傳代。
1.6 拯救病毒的鑒定
1.6.1 RT-PCR鑒定及VP1序列測定
用EV71-S(5’-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3’)和EV71-A(5’-ATTTCAGCAGCTTGGAGTGC-3’)診斷引物對拯救病毒進行鑒定。應用EV71-F(5’-GCAGCCCAAAAGAACT
TCAC-3’)和EV71-R (5’-AAGTCGCGAGAGCTGTCTTC -3’)擴增包括VP1全長在內的1082bp產物,并進行序列測定分析。
1.6.2間接免疫熒光試驗鑒定
CPE達到75%及以上或觀察7天后,收集細胞及上清,2500rpm離心10min,取細胞沉淀用無菌PBS洗2次后,重懸細胞沉淀,滴加到熒光片,用丙酮將其固定,蒸鎦水清洗1次后加入EV71單克隆抗體,37℃濕盒中孵育1 h,PBS 洗滌3次。加入用1∶6000伊文斯蘭以1∶40 稀釋的FITC標記的兔抗鼠二抗,37℃濕盒中孵育1h,PBS洗滌3 次后甘油封孔,鏡檢。
1.6.3拯救病毒效價測定
獲得拯救病毒經RD細胞傳一代擴增后,與母本病毒同時進行TCID50測定。詳細方法及步驟參見《WHO脊髓灰質炎病毒實驗室手冊》[3]。
1.6.4電鏡觀察
獲得拯救病毒經RD細胞傳一代擴增后,反復凍融3 次,4500r/min 離心30 min,取上清濃縮5倍后,以1%加入EV71特異性抗體37 ℃孵育2h后,4℃過夜,10000r/min離心30 min,以PBS重懸沉淀,點樣、負染,電鏡觀察。
2結果
2.1 全長cDNA克隆的構建
利用引物EV71-5T7和EV71-3RM,從FJ08149病毒上清擴增出EV71基因組全長約7.5kb,見圖1A(marker不夠清晰)。應用TA克隆技術,將EV71基因組全長連接入PCR-XL-TOPO TA載體中,構建重組質粒,經MluI和NotI雙酶切鑒定,FJ08149T5和FJ08149T25兩個克隆質粒均有目的基因插入,見圖1B,目的基因約7.5kb,載體大小為3.5kb。
A: FJ08149株基因組PCR擴增產物
1.RT-PCR擴增后的全基因組產物(7.5kb);2.DNA Marker DL15,000;3. 陰性對照。B: TA 克隆NotI和MluI雙酶切鑒定結果;1.DNA Marker DL15,000;2.pFJ149T5;3.pFJ149T25
圖1基因組PCR產物及TA克隆酶切鑒定
2.2 體外轉錄制備感染性RNA
應用MluI和NotI雙酶切,從pFJ08149T5和pFJ08149T25克隆質粒中切下含有T7啟動子的基因組DNA。并將此片段作為體外轉錄模板,通過T7 RNA聚合酶系統,體外轉錄成RNA,經電泳鑒定,轉錄的RNA達到預期的7.5Kb大小,見圖2。
1.RNA Marker RL10,000 2. pFJ08149T5 3.pFJ08149T25
圖2體外轉錄RNA電泳圖
2.3 病毒的拯救
轉錄RNA轉染RD細胞后72小時,即可見到典型的腸道病毒CPE,見圖3A,CPE呈逐日增多,7天后將轉染細胞培養上清以20%比例傳代,第3天CPE達到75%以上。對照細胞培養7天均仍保持正常形態,見圖3B。
A.轉染pFJ08149T5后的RD細胞B. 正常的RD細胞
圖 3RNA轉染RD后CPE形態
2.4 拯救病毒的鑒定
2.4.1間接免疫熒光鑒定
拯救病毒、拯救病毒傳1代后和母本病毒株用EV71單克隆抗體進行免疫熒光檢測,均可見到特異性的熒光,見圖4A,而細胞對照無熒光產生,見圖4B。
圖4拯救病毒的間接免疫熒光鑒定
2.4.2RT-PCR鑒定及序列分析
拯救病毒培養上清用EV71-A和EV71-S、EV71-F和EV71-R進行擴增,均得到預期大小的目的片段,約226bp和1082bp,見圖5。將VP1全長序列測定分析,拯救病毒與母本病毒891個堿基完全一致。
圖5 拯救病毒的RT-PCR鑒定
2.4.3拯救病毒毒力效價測定
將拯救病毒與母本病毒同時進行病毒效價測定,結果pFJ08149T5的效價為105.25TCID50/0.1ml,pFJ08149T25效價為107.25TCID50/0.1mL,母本病毒FJ08149的效價為107.505TCID50/0.1mL。其中pFJ08149T25與母本病毒對細胞的感染力相近,而pFJ08149T5約低100倍。
2.4.4病毒粒子的形態
濃縮后的FJ08149T5拯救病毒與EV71抗體作用后,形成免疫復合物,經負染色,電鏡下觀察到球形病毒粒子,直徑約22nm,見圖6。
圖6拯救病毒的免疫電鏡
3討論
自1981年Racaniello VR和Baltimore D 首次應用反向遺傳學技術成功拯救出脊髓灰質炎病毒(PV)后[4],翻開了RNA病毒研究的新篇章,實現了在DNA水平上研究RNA病毒。通過構建cDNA感染性克隆,應用DNA基因操作方法,如定點突變、重組、缺失和嵌合等手段,研究拯救病毒基因水平的改變對表型的影響,進而達到對病毒基因功能與結構、致病機制、表達調控、分子免疫機理等的全面認識,開發出新型疫苗。日本學者Arita等,于2005年首先構建了EV71標準株BrCr的感染性克隆,然后利用基因置換,引入PV疫苗株(Sabin I)影響溫度敏感與病毒毒力的突變位點,在猴子模型上證實了溫度敏感的病毒株對猴子毒性減弱[5];2008年,他們又在NOD/SCID鼠模型中證實了幾個決定溫度敏感的突變位點在神經毒力減弱中起協同作用[6]。2008年以來EV71在中國大陸流行,迫切需要利用本土流行株構建感染性克隆,為研究其致病機理、病毒變異與毒力關系以及疫苗的研究提供技術支持。
由于PV等小RNA病毒的基因組是單股正鏈RNA分子,裸RNA分子就具有感染性,且基因組較小,如EV71等腸道病毒屬僅有7.5Kb大小,無帽子結構。理論上構建其感染性克隆可能較為容易,但在實際操作中仍然面臨著不少的困難。首先需獲得完整基因組的cDNA序列,先前基本上采取分段擴增后逐步克隆拼接出完整的cDNA序列,操作過程煩瑣,且多次克隆、連接也給基因序列突變增加了機率。本研究中通過長片段RT-PCR一次性擴增出全長基因組,一次克隆操作以盡量減少可能引入序列變異。第二,基因組3’端需有足夠長的Poly(A)尾,一定長度的Poly(A)對維持基因組穩定性及保證其感染性均有作用[7]。據報道,PV的Poly(A)如果少于20個,RNA的感染性比野生株會低20倍[8]。Sarnow等對3’端Poly(A)組成不同對PV體外轉錄本感染性影響的研究得到,Poly(A)尾越長其感染性越接近野生株,但非同源聚合序列反而使其感染性降低[7]。本研究設計時利用3’端引物直接帶入52個Poly(A)尾和一個MluI酶切位點,達到保證感染性同時可進行線性化的目的。第三,保證基因組忠實性,減少其它非基因組序列引入。本研究直接將T7啟動子特異性識別序列通過引物精確加到基因組5’端,并帶入NotI酶切位點,轉錄前通過雙酶切,避免將載體序列引入。第四,克隆擴增時如何避免因細菌增殖可能引起的序列變異,導致序列缺失或插入從而導致基因組序列不完整性。在本研究過程中也曾發現過類似的情況,因此采用了28℃、150rpm/min的低溫低轉速的優化培養條件,這是乙型腦炎病毒等其它感染性克隆構建過程也曾采取的措施[9]。本研究還發現如果基因組正向插入到載體T7啟動子下游,不僅細菌增殖緩慢且量少,質粒拷貝數低,且轉染也無感染性;而如果基因組以反向插入,則細菌不僅增殖快量大,質?？截悢蹈?且所獲得的幾株感染性克隆均為此反向插入的。這是否因不同方向插入時,潛在表達的蛋白質不同導致的,有待于進一步深入研究分析。
本研究應用本地分離株成功地構建了中國大陸流行C4基因亞型EV71感染性克隆,轉染RD細胞成功獲得了拯救病毒,經鑒定與野生株具有相似的遺傳特性與生物學性狀。此感染性克隆構建成功,可為下游研究提供了技術支持。
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正向遺傳學克隆基因的方法范文3
【關鍵詞】 人Era基因
關鍵詞: 人Era基因;基因表達;蛋白純化
摘 要:目的 在大腸桿菌中對人的era基因（簡稱hera）進行表達、純化. 方法 PCR擴增hera基因，測序正確后克隆入大腸桿菌融合表達載體pRSET-C，重組質粒pRSETC-hera以大腸桿菌BL21（DE3）為宿主菌，用IPTG進行誘導表達.然后利用親和層析的方法對表達蛋白進行純化. 結果 克隆了hera基因，測序正確;利用pRSET-C載體在大腸桿菌中融合表達了全長hera-cDNA基因，表達量占細菌總蛋白的59.6%.融合蛋白在菌體內主要以包涵體形式存在，在變性條件下用Ni-NTA親和色譜柱純化此融合蛋白，其純度達到了98.0%. 結論 利用基因重組技術在大腸桿菌中高表達了hera基因.并對融合蛋白進行了初步純化.
Keywords:human Era gene;gene expression;protein purifi-cation
Abstract:AIM To express human Era protein in E.coli and purify it preliminarily.METHODS After being amplified by PCR and identified by sequencing the human era gene was in-serted into expression vector pRSET-C.The recombinant plasmid pRSETC-hera was transformed into BL21（DE3）and induced with IPTG.The expressed protein was purified by affinity chromotography.RESULTS The human era gene was amplified and the sequence proved to be correct.The hera-cDNA gene had been cloned into the vector and ex-pressed in E.coli，and the expressed protein took59.6%of the total bacterial protein.The fused protein existed in the pattern of inclusion body，and it was purified on denatured condition by using Ni-NTA affinity chromotography column.CONCLUSION The hera gene could be expressed with high efficiency in E.coli by using gene recombination technique.The fused protein is purified preliminarily.
0 引言
era基因是1986年在測定大腸桿菌基因組序列時，在編碼RNaseIII的rnc基因下游發現的一個開放讀框，因其編碼的氨基酸序列與人及酵母的Ras蛋白有部分相似之處，命名為E.coli Ras-like（era）基因［1］ .era基因在原核生物中普遍存在，在真核生物如蠕蟲、小鼠、人、植物中也存在與細菌era高度同源的基因.Era蛋白是小G蛋白家族的新成員.它由兩個結構域組成:N端是一個典型的GTPase結構域;C端結構域為Era所特有，其中含有一個KH結構域［2］ .在大腸桿菌中era基因和rnc基因同屬于rnc操縱元，rnc基因和era基因的表達共同受RNaseIII的負調控［3］ .era是大腸桿菌中可以正常表達的基因，但表達水平極低.遺傳學實驗證實era基因與細胞周期和細胞分裂有關，是細菌生存繁殖所必需的重要基因 ［4］ .高表達的細菌Era蛋白有GTP結合及GTPase活性［5］ .最近發現細菌Era蛋白可以特異地與16S-rRNA結合［6］ .
本室陳蘇民教授通過計算機尋索，發現從線蟲、小鼠到人都有與細菌era同源的EST序列，并且相繼克隆了人及小鼠全長的era-cDNA基因.人era-cDNA基因全長約2.2kb，含長度為1038bp的開放讀框，編碼346氨基酸的蛋白質［7］ .人Era（hEra）與大腸桿菌Era（eEra）蛋白全序列比較，有31.0%相同、53.0%相似.同樣，hEra也是由N端的GTPase結構域和C端KH結構域所構成［8］ .新近克隆的人及小鼠era基因為整個era基因家族的功能研究提供了重要的資料.本研究目的是將hera基因在大腸桿菌中進行高表達、純化.這為進一步研究hEra蛋白的功能打下了良好的基礎.
1 材料和方法
1.1 材料
大腸桿菌BL21（DE3）菌種購自Promega公司.pUC19質粒均為本教研室保存;表達質粒pRSET-C為Invitrogen公司產品.pBS-hera為陳蘇民教授提供.各種限制性內切酶、連接酶、核酸修飾酶及Taq酶均為Gibco公司產品.DNA marker和蛋白marker為Takara公司產品.柱式質粒純化試劑盒為華舜公司產品.NucleoTrap Gel Extraction試劑盒購于CLONTECH公司.Ni-NTA spin kit為QIAGEN公司產品.
1.2 方法
1.2.1 PCR反應及產物的鑒定
PCR引物:正向:5'-AAGGATCCAACAGAGATGAGCAGG，反向:5'-AA-CTGCAGTTATCACTTGAGGAGCTTC.PCR反應以pBS-hera為模板在PE公司9600反應儀上進行.PCR反應條件為:96℃30s，55℃45s，72℃60s，30個循環.純化的PCR產物用BamHI和PstI雙酶切定向克隆入pUC19質粒，轉化E.coli JM109，進行藍白篩選，并經酶切鑒定篩選出含插入片段的陽性克隆.重組的pUC19質粒經提取純化后，以此作為測序模板，在PE公司310型測序儀上進行核苷酸序列分析.
1.2.2 重組表達載體構建
從重組的pUC19質粒上用BamHI和PstI切下目的片段，再用BamHI和PstI雙酶切pRSET-C載體.目的片段與載體片段均用NucleoTrap Gel Extraction試劑盒從瓊脂糖凝膠內回收.然后進行DNA的連接，將DNA連接液轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，用氨芐抗性進行篩選，經酶切鑒定出含插入片段的陽性克隆.
1.2.3 蛋白誘導表達
挑取pRSETC-hera重組表達菌株，接種于5mL含Amp的2xYT培養基（胰蛋白胨16g L-1 ，酵母提取物10g L-1 ，NaCl5g L-1 ），37℃培養過夜，次日按4.0%轉接于含Amp的2xYT培養基，37℃振蕩培養3h，加入IPTG至終濃度1mmol L-1 誘導表達，37℃振蕩培養2～7h.取菌體，做120g L-1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）.
1.2.4 SDS-PAGE 4℃9000g離心5min收集菌體，用含3mL L -1 巰基乙醇加樣緩沖液處理（100℃， 10min），12000g離心10min，采用Laemmli不連續PAGE，150g L-1 分離膠，考馬斯亮藍R-250染色.
1.2.5 蛋白質的純化
離心收集100mL誘導菌液的菌體，按每克濕菌體10mL加入超聲緩沖液（0.05mol L-1 NaH2 PO4 ，0.3mol L-1 NaCl）懸浮，-20℃凍融2次，再加入溶菌酶至1g L-1 ，室溫放置30min，然后超聲裂解（150W，每次1min，共5次），4℃下12000g離心20min.再加入超聲緩沖液10mL懸浮包涵體，4℃下12000g離心20min，收集包涵體沉淀.用5mL緩沖液B（8mol L-1 尿素，100mmol L-1 NaH2 PO4 ，10mmol L-1 Tris Cl，pH8.0）懸浮包涵體，Vortex，室溫放置2h，4℃下12000g離心15min，取上清，4℃下12000g再離心15min，留上清上Ni-NTA親和色譜柱.先用緩沖液B預平衡Ni-NTA柱，上樣，用緩沖液C（8mol L-1 尿素，100mmol L-1 NaH2 PO4 ，10mmol L-1 Tris HCl，pH6.3）洗滌，接著用緩沖液D（8mol L-1 尿素，100mmol L-1 NaH2 PO4 ，10mmol L-1 Tris HCl，pH5.9）洗滌，再用緩沖液D1（緩沖液C，250mmol L-1 咪唑）洗脫，用緩沖液E（8mol L-1 尿素，100mmol L－1 NaH 2 PO
4 ，10mmol L-1 Tris HCl，pH4.5）灌洗.在280nm監測下，收集每個吸收峰并行120g L-1 SDS-PAGE.
2 結果
2.1 hera基因的擴增
以pBS-hera質粒為模板，經PCR擴增獲得hera基因片段，擴增產物經1.0%AGE，與編碼hEra全長的cDNA（1038bp）大小相符（Fig1）.將全長hera基因片段克隆入pUC19質粒，重組質粒轉化DH5α感受態細胞，從培養板上隨機挑選白色克隆，從中提取質粒，用BamHI和PstI雙酶切鑒定，含有插入片段的重組質粒命名為pUC19-hera.酶切鑒定結果見Fig2.提取重組質粒pUC19-hera，以pUC19通用測序引物進行核苷酸序列測定.測序結果表明，所擴增的hera基因與已知序列完全相符.
2.2 pRSETChera表達質粒的構建和誘導表達
將hera-cDNA基因全長從pUC19-hera亞克隆到表達載體pRSET-C中，經酶切鑒定，將重組表達質粒命名為pRSETC-hera.酶切鑒定結果見Fig3.將pRSETC-hera質粒轉化BL21（DE3）感受態細胞，在2xYT培養基中生長，轉接后用IPTG誘導4h，由120g L-1 SDS-PAGE結果可見:與未誘導的對照菌相比誘導菌在Mr 42×103 處有明顯的新蛋白表達帶出現，大小和預期的6His-hEra融合蛋白相符（Fig4），激光薄層掃描結果表明此表達條帶占菌體總蛋白的59.6%.表達產物主要以包涵體的形式存在.
2.3 6HishEra融合蛋白的純化
收集100mL誘導菌液的菌體，經裂菌、離心、洗滌、再離心后獲得包 涵體沉淀.包涵體被變性溶解后上Ni-NTA柱，用緩沖液C，D洗滌，用含咪唑的緩沖液D1洗脫，再用緩沖液E灌洗.在280nm監測下，觀察蛋白的流出情況.收集每個吸收峰并行120g L-1 SDS-PAGE（Fig5）.激光薄層掃描結果表明，用Ni-NTA親和色譜柱純化此融合蛋白的純度達到了98.0%.
3 討論
我們利用基因工程的手段在pRSET-C載體內高表達了hEra蛋白.pRSET-C是一個受PT7 強啟動子驅動下的融合表達載體，因而易于在原核進行的目的基因高表達.另外，在目的基因的5'端融合了6個組氨酸的純化標簽，可以用金屬螯合親和層析來分離純化表達的融合蛋白.組氨酸與金屬離子的結合與蛋白質的空間結構無關，因此表達的融合蛋白就可以在變性條件下得到純化，然后復性，這就避免了復性后的蛋白質由于純化條件的改變而丟失.
不同的培養條件對外源基因的表達效率也有一定的影響.含pRSETC-hera質粒的BL21（DE3）菌在LB培養基中IPTG誘導6His-hEra融合蛋白表達時，表達產物占菌體總蛋白的30.0%;當改用2xYT培養基時，外源基因的表達效率明顯提高，表達產物達菌體總蛋白的59.6%.在不同培養基培養條件下，表達產物均以包涵體形式存在.我們先對包涵體進行了分離、洗滌和純化.然后用金屬親和層析的方法對其進行了進一步的純化、復性.當pH≥6.3時，融合了6個組氨酸的蛋白質能和螯合了Ni2+ 的金屬親和層析柱相結合;而當pH=5.9或在咪唑存在的情況下，融合蛋白不再與Ni2+ 結合而被洗脫下來.我們在實驗中發現，用含咪唑的洗脫液進行洗脫的方法要好于通過降低pH值進行洗脫的方法.首先降低pH值不能將融合蛋白洗脫干凈，我們用pH=5.9的洗脫液進行洗脫時（Fig5），就不能將融合蛋白洗脫下來.另外，結合緩沖液的pH值與洗脫緩沖液的pH值相差僅0.4，溶液的pH值又易受環境的影響，因此在每次實驗前需精心調試，給實際操作帶來諸多不便.
隨著基因組計劃的進展，許多生物的基因組序列測定工作已經或即將完成.但是序列測定后，基因的功能及其表達調控的研究將成為后基因組時代最重要的任務.era基因是一個從細菌到人高度保守的小G蛋白基因.以前era基因的功能研究都局限于原核生物，難以揭示整個era基因的功能.本研究為era基因在真核生物的功能研究打下了基礎.
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正向遺傳學克隆基因的方法范文4
關鍵詞：植物根系；禾本科植物；QTL；育種
中圖分類號：S184文獻標識碼：A文章編號：0439－8114（2011）12－2380-03
Research Advances on the Molecular Mechanisms of Root Development
in Gramineous Plants
REN Yong－zhe，XU Yan－hua，ZHANG Qing－chen，LIANG Feng
（Department of Life Sciences，Shangqiu Normal University， Shangqiu 476000，Henan，China）
Abstract： Plant roots are required for the acquisition of water and nutrients， and fixition of plant． The proper establishment of root system architecture is of vital importance to fulfill its functional requirements， particularly in agronomically important crops such as cereals， which account for 70％ of food production worldwide． In recent years， studies on the molecular mechanisms regulating root development have also been initiated in monocot cereals which have been well studied in Arabidopsis in the past ten years． The achievements of root development in cereals were reviewed in this paper． The application of quantitative trait locus mapping in studying root development and the application of root trait information in breeding were also discussed．
Key words： plant roots； gramineous plants； QTL； breeding
根系的主要功能是從土壤中獲取礦物元素和水分，并起到固定植株的作用；根系還可以與多種微生物形成共生結構，以提高植物的養分效率和抗逆性；此外根系還有一些其他功能比如光合產物的儲存、植物激素的合成、無性繁殖等。在進化過程中，植物根系從非常簡單的結構（比如根狀莖）逐漸進化成了具有較為復雜結構的專門器官［1］，這正說明了根系的重要作用。被子植物的根系通常被分為兩種根系構型：直根型和須根型。重要的糧食作物水稻、小麥和玉米所屬的禾本科植物的根系則屬于須根型根系。兩種根系形態表現出明顯的差異，這預示著內在的遺傳基礎決定了它們的根系形態。目前根系發育的分子機制方面所取得的研究進展多數是以直根型的擬南芥作為模式植物而得到的，對禾本科植物根系發育的分子機制研究遠遠落后于擬南芥，不過最近幾年通過對重要作物水稻、玉米和小麥的根系進行研究，須根型根系的分子機制研究也取得了一定的進展［2，3］。結果表明，禾本科植物根系發育的分子機制與擬南芥相比既有一定的保守性，又存在一些差異。目前國內外還較少對禾本科植物根系發育的分子機制進行綜述報道，該文比較了禾本科植物根系發育的分子機制與擬南芥的異同，并對根系表型鑒定的方法以及QTL分析在根系發育分子機制研究中的應用進行了介紹。
1禾本科植物根系發育的分子機制與擬南芥的異同
以前人們對擬南芥和禾本科植物根系方面的差異研究主要集中在形態學上，最近幾年才開始探討禾本科植物根系發育的分子機制。通過與在擬南芥中得到的研究結果進行對比，發現二者的分子機制既存在一定的保守性，又有一定的差異。
在擬南芥中，輻射狀的根系形態是由GRAS基因家族的兩個成員SHORTROOT（SHR）和SCARECROW（SCR）調控的［4－6］。SHR蛋白能通過向附近細胞的擴散誘導內皮層的形成和SCR的表達，SCR具有正向反饋調節機制，它能增加SCR基因的表達。SCR能與SHR相互作用激活下游基因表達，高豐度的SCR還能阻止SHR蛋白向附近細胞的擴散，從而避免形成更多的內皮層，這種機制似乎在包括禾本科植物在內的所有植物中都是保守的，因為這種機制已經在水稻和玉米中得到了一些驗證：首先，SHR和SCR在水稻中的同源蛋白均表現出與擬南芥相似的表達模式，并且能夠相互作用［7］； 其次，ZmSCR在從玉米根尖重新長出輻射狀根系構型的過程中也是最重要的決定因子［8］。并且用擬南芥SCR基因的啟動子接玉米的SCR基因在擬南芥中表達可以互補scr突變體表型［9］。這些證據表明，在禾本科植物中可能也存在著與擬南芥類似的機制來調控輻射狀的根系形態。
小麥的基因組龐大，目前對調控小麥根系發育的分子機制了解的十分有限。已知在擬南芥中超量表達一個小麥的GTPase基因（TaRAN1）可抑制擬南芥主根的伸長和側根的發育，并表現為對生長素超敏，因此推測該基因可能參與了生長素的信號轉導［10］。這說明小麥根系的發育可能與擬南芥一樣受到生長素的密切調控。有人用巴西固氮螺菌研究了生長素對小麥根系的作用，野生型的巴西固氮螺菌Sp6可以分泌IAA，有一個突變的菌株SpM7918只能產生分泌非常少量的IAA，他們用Sp6和SpM7918同時接種小麥的幼苗，發現與野生型的Sp6菌株接種結果相比，SpM7918減少了促進小麥側根形成、伸長以及根毛分布的能力。這說明生長素的確對于小麥側根的形成、側根的伸長及根毛的發育都有促進作用［11］，這也與擬南芥中得到的結論基本一致。
水稻的等位基因crl1［12］和arl1［13］、玉米的rtcs［14］與擬南芥LBD16和LBD29［15］基因位于系統進化樹上相近的位置。但有趣的是，這4個基因被證實參與到根系發育的不同方面。crl1／arl1和 rtcs位于水稻和玉米的染色體共線性區段，并且功能上都與莖生根的形成有關［13，14］。而在擬南芥中， LBD16和
LBD29則是參與到了側根的形成，過量表達能促進側根的發生。研究表明，生長素反應因子ARF7和ARF19能直接激活LBD16和LBD29基因表達，說明LOB domain是生長素的早期響應基因［16］。同樣，水稻的CRL1／ARL1和玉米的RTCS基因的啟動子區也存在生長素的反應元件，說明無論是單子葉植物還是雙子葉植物，這些含有LOB domain的蛋白可能都是扮演了生長素早期響應信號的角色，只不過在水稻、玉米和擬南芥中分別參與調控了不同種類根系的形成。
在禾本科植物中第一個被克隆的調控根毛發育的基因是一個SEC3同源基因［17］，但在擬南芥中這個基因目前還沒有證據表明與根毛的發育有關系。GLUTAMATE RECEPTOR－LIKE 3．1（GLR3．1）是一個維持水稻RAM活性調控因子［18］，與水稻的glr3．1突變體不同的是，擬南芥glr突變體沒有明顯的根系表型，但是GLR3．1在水稻中是單拷貝的，而在擬南芥中卻有20個GLR基因，也許是由于在擬南芥中存在功能冗余才造成一個基因的突變沒有明顯表型，但也可能該基因只在水稻根系發育中起著重要的作用。此外，玉米的胚根鞘是禾本科植物特有的結構，它在胚胎形成以及以后的萌發過程中起著保護根系分生組織的作用［19］，原位表達分析顯示，玉米胚根的形態建成依賴于ZmSCR基因的活性［20］，因此，這可能也是ZmSCR基因在禾本科植物根系發育中所具備的特定功能。
2利用QTL分析研究禾本科植物根系發育的分子機制
QTL定位是研究調控根系發育的分子機制和遺傳機制的一種常用方法。對于模式植物（比如水稻）來說，通過QTL定位的方法，可以找到那些對于根系發育只有微小貢獻的基因（微效QTL），因為這些基因往往很難通過突變體的方法被鑒定出來。并且由于基因組序列已知，可以很容易地對這些QTL位點進行鑒定。也可將這些QTL位點構建成目標性狀只有單個孟德爾因子的近等基因系進行基因分離。其次，QTL分析能夠檢測到復雜的遺傳互作過程。隨著人們對調控根系性狀的基因了解的信息越來越多，QTL分析的這種作用會日益明顯。此外，QTL分析還可以對已知調控根系構型的基因進行功能再驗證以及其調控網絡分析。QTL分析的另一個突出優點是可以對復雜基因組（例如小麥）的復雜性狀（例如根系構型）進行遺傳研究，而且這種QTL分析并不依賴于基因組是否測序。
2．1根系表型鑒定的方法
在根系發育的QTL定位研究中，準確地收集大量的表型數據是非常重要的。但在土壤條件下，很難對較大的遺傳群體進行表型鑒定。利用瓊脂凝膠室培養的方法可以在一定程度上模擬土壤環境［21］，但也難以進行大規模的群體試驗。有人使用電子設備間接地對根系構型和土壤狀況進行研究，比較適合在大田條件下應用，不過這種方法難以得到關于根系構型直接的數據［22］。在過去的10多年中，人們嘗試著去開發一些非破壞性的成像技術來直接研究根系，建立了一系列基于計算機X射線斷層攝像技術的方法，這些方法能夠高通量實時檢測根系的3D結構、土壤的養分和水分狀況［23，24］。但是這種方法對于遺傳學研究來說，最大的限制是獲取數據的時間只有一到幾個小時，利用基于X射線吸收和光透射的2D成像技術可以對其不足進行彌補［25］， 不過上述方法需要一定的技術和較為昂貴的設備。水培方法是目前進行根系形態研究的一種常用方法，它的優點在于能獲得較為準確的表型數據，還很容易對植物生長的環境進行控制，減少其他因素對根系發育內在機制研究的干擾，并可以將影響根系發育的因素進行分解，用于研究根系對不同因素的響應機制。不過，水培方法也有其局限性，由于根系發育具有高度的可塑性，在這種條件下得到的數據需要進一步的驗證。
2．2QTL分析在禾本科植物根系性狀研究中的應用
到目前為止，對根系性狀的QTL定位已經在包括擬南芥在內的十幾種植物中相繼開展，在禾本科植物中也有了較多的報道。一些調控根系性狀的主效QTL位點和調控根系構型對環境響應的QTL位點甚至可以解釋30％以上的表型變異，有些QTL位點甚至有在生產上直接應用的潛力。例如水稻中控制根系深度的QTL位點有利于提高植物的抗旱性和對移動性強的營養元素的吸收［26］。能夠在不同遺傳群體重復檢測到的QTL位點似乎在根系育種中是最有應用價值的。比如在水稻和玉米中，已經有成功利用分子標記輔助選擇技術（MAS）對調控根系的QTL位點進行選擇的報道［26-28］。在水稻9號染色體上定位到一個調控根系深度的QTL位點，這個位點在干旱條件下存在著與環境的互作效應，這就暗示著該位點在干旱脅迫中可能發揮更大的作用［26］。
對于那些尚未完成基因組測序，且基因組結構比較復雜的作物（例如小麥），QTL定位是目前研究根系發育的主要方法之一。例如在小麥上已經有了不少相關的報道。An等［29］利用一套“旱選10號×魯麥14”小麥DH群體進行苗期水培試驗，定位了5個調控根系干物重的QTL位點，單個QTL位點可解釋根干重表型變異的8．6％～19．6％，其中3個位點與大田成熟期吸氮量的QTL位點共定位。李振興等［30］檢測到與小麥根系性狀（最長根長、根數和根干重）及其磷脅迫響應（磷饑餓和低磷處理與正常供磷根系性狀的相對值）有關的QTL位點30個，分布在14條染色體上。周曉果等［31］在水分脅迫及非脅迫兩種條件下檢測到調控根系性狀的11個加性效應QTL 和15對上位性互作QTL，分布在除5A、4B、2D、6D和7D以外的所有染色體上。李卓坤等［32］利用一套永久F2群體分析了小麥幼苗8個根系性狀的QTL，共定位到7個加性QTL位點和12對上位性QTL位點，這些QTL位點主要分布在1A、1D、2A、2B、2D、3A、3B、5D、6D 和7D 染色體上。Laperche等［33］用根盒方法定位6個調控缺氮條件下小麥根系形態的QTL位點，分布于4B、5A、5D和7B上。隨著人們對根系性狀研究的深入以及對基因組信息知道的越來越多，這些定位到的QTL位點將會為人們理解調控根系發育的復雜網絡以及利用分子標記輔助選擇的方法進行根系育種提供重要幫助。
3根系育種的重要性及其困難
3．1根系在作物生產中的重要性
由于在大田條件下對根系性狀進行調查存在著很大困難，再加上根系形態能夠對很多環境因素產生響應，即根系具有很強的可塑性，所以人們對根系形態的研究非常有限。早期的研究認為根系形態可能對土壤移動性差的營養元素吸收非常重要［34］，對于那些移動性強的營養元素（例如NO3－和 NH4＋），其作用就會小的多［35］，深根型的品種可能有利于這些元素的吸收。但是，因為植物在整個生活周期中會受到很多可變的環境因素影響，所以最終能否反映到產量上則存在很大的變數。不過已有研究表明，調控根系性狀的一些QTL位點與調控吸氮量的位點共定位，說明在育種過程中對根系性狀進行選擇有可能是提高氮利用效率的一種有效途徑［29－36］。Coque等［37］也發現不管是在高氮還是低氮條件下根系的構型對玉米的產量都有重要的影響。這些證據都表明了對根系性狀進行選擇的重要性。
事實上，在作物的馴化和育種過程當中，育種家在對地上部分性狀進行選擇時無意之中已經對根系性狀進行了間接的選擇，使作物的根系構型發生了很大的變化［22，38］，這充分說明了根系構型在作物生產中的重要作用。還有一些調控根系性狀的QTL位點與調控生產力（產量、水分或營養吸收）的位點共定位，這進一步說明了根系性狀的重要性［29，39］。這些研究表明，對調控根系的分子和遺傳機制進行研究對于提高作物水分和養分的利用效率，進而對提高在環境脅迫條件下或中低產田的作物產量具有重要的意義。
3．2根系育種面臨的困難與機遇
然而，將調控根系發育的遺傳信息應用到育種當中還存在很多困難。首先，由于根系生長在地下，表型鑒定存在很大難度，目前對于植物根系的研究與其重要性是極不相稱的，在作物中還沒有一個調控根系構型的QTL位點被成功克隆。其次，根系構型的可塑性非常大，將其應用到常規育種時必須要考慮田間的土壤狀況和農田氣候等環境因素的影響［23］。再次，根系構型會對植物養分、水分利用效率產生非常大的影響，但其可塑程度依環境的不同而有所不同。人們對作物根系構型的調控還所知甚少，這極大地限制了其在育種上的應用。
不過機遇與挑戰并存。育種家正在逐步將根系構型納入到育種實踐當中并取得了一些可喜的成績［40］。隨著一些主要的禾本科植物已經完成或正在測序，相信這些將會為在禾本科植物中鑒定和克隆調控根系性狀的QTL位點／基因提供重要幫助，并進而為育種家開展根系育種提供更多的信息。
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正向遺傳學克隆基因的方法范文5
effects of selective cox?2 inhibitor on dna repairing after irradiation
xu hui?ting, yu shi?ying, xia shu,xiong hua，zhuang liang
cancer center, tongji hospital, tongji medical college, huazhong university of science and technology, wuhan 430030, china
corresponding author: yu shi?ying,e?mail：abstract：objective to investigate the effects of a selective cox?2 inhibitor?celecoxib on dna repairing after x?rays irradiation，in order to elucidate the possible mechanism of the radiosensitization of selective cox?2 inhibitor.methods human cervical carcinoma cells (hela) were cultured in vitro and exposed to different doses of celecoxib for 48h then with and without radiation（6gy）, flow cytometry sub?g1fluorescence parameter line was performed to analyze the change of the apoptosis and cell cycle distribution.the dna damage and repair were detected by single cell gel electrophoresis assay.semi?quantitative rt?pcr and western blot were used to measure the mrna and protein level of ku70 and ku80 in hela cell lines treated with celecoxib.results celecoxib had no effect on the cell cycle distribution of hela cell lines,but it induced apoptosis increasing dependent on celecocib doses.radiation?induced apoptosis was enhanced after hela cells treated with celecoxib (enhancement factor=6.96 at100μmol/l), and the radiation?induced g2/m arrest was markedly decreased by celecoxib〔radiation group(rt): g2/m 32.35%, 100μmol/l celecoxib+rt: g2/m 5.95%〕. the dna damage induced by radiation was not increased,but the dna repair was reduced in hela cells treated with celecoxib (60μmol/l) for 48h, the mrna and protein level of ku70 and ku80 were also significantly decreased( p<0.05). conclusion the results suggest that the possible mechanism of radiosensitization of a selective cox?2 inhibitor was related to inhibition of dna repair including reduced g2/m arrest cells and decreased dna?pk expression.
key words：cyclooxygenase?2; celecoxib; g2?m phase; dna repair; radiation damage
環氧化酶（cyclooxygenase，cox）是花生四烯酸生物合成前列腺素(prostaglandin,pg)的限速酶, cox分為cox?1型和cox?2型。多數惡性腫瘤呈cox?2過度表達，且其表達水平與腫瘤的發生、發展、預后與轉移有密切的關系。選擇性cox?2抑制劑不僅具有抗腫瘤活性，在體內外試驗[1]和臨床試驗[2]中還證實其對腫瘤具有放射增敏效應。但其放射增敏機制還不是很清楚，可能與降低pge2水平、促進凋亡、改變細胞周期、抑制dna損傷的修復、抑制血管生成等有關。本文采用人宮頸腺癌hela細胞株，觀察選擇性cox?2抑制劑celecoxib對放射引起的dna損傷修復的影響，旨在進一步闡明選擇性cox?2抑制劑的放射增敏機制。1 材料與方法
1.1 材料與儀器
宮頸癌hela細胞系由華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院腫瘤中心實驗室冷藏；celecoxib藥粉購自安徽森瑞有限公司；碘化丙啶(pi)、 rna酶a(rnase a)購自sigma公司；正常熔點、低熔點瓊脂糖（nma，lma）購自gibco公司；rt?pcr主要試劑trizol購自上海華舜生物工程有限公司，逆轉錄試劑盒、taqdna polymerase、dntp mix均系美國fermentas公司產品，dna修復基因ku70、ku80引物由上海賽百勝公司合成；鼠源性單克隆抗體ku70、ku80購自neomarkers公司；fac sort 流式細胞儀(美國becton dickson 公司)。
1.2 細胞培養及處理
對數生長期hela細胞，0.25%胰酶消化分離，常規傳代培養于rpmi?1640完全培養液中37℃、5%co2培養箱中培養。細胞分為空白組、給藥組（celecoxib作用48h）、放射組(6mv x線 6gy) 、藥放組（celecoxib作用48h后給予6mv x線 6gy），其中celecoxib再按濃度梯度分為20、40、60、80、100μmol/l組。
1.3 流式細胞儀sub?g1法檢測細胞周期分布及凋亡率
按每孔105個細胞接種于6孔板，待24h后給予不同濃度的celecoxib, 使其終濃度分別為20、40、60、80、100μmol/l，空白組加同等體積的dmso，培養48h后收獲細胞并以80%冰乙醇固定，?20℃固定過夜。同上另設6個濃度組celecoxib作用48h后予6mv x線6gy照射處理，繼續培養24h后收獲固定細胞。固定后細胞用pbs洗滌2次,100μl pc緩沖液冰上孵育30min。pbs 洗滌細胞,加10mg/ lpi10μl、50mg/mlrnasea10μl 、pbs500μl室溫、暗處進行dna 染色20min。應用流式細胞儀經488nm 激光激發進行檢測，應用cellquest 軟件(美國becton dickson公司)分析結果。
1.4 單細胞凝膠電泳（single cell gel electrophoresis assay,scge）檢測dna損傷
4組細胞（celecoxib只取60μmol/l組）每組均設平行對照組。將各組細胞消化制備成pbs單細胞懸液（5×105個/ml），并在處理后分別于0、15min、30min、1h、2h時間點收取細胞懸液置冰上。堿性單細胞凝膠電泳法檢測dna單鏈斷裂(ssb)：參照singh np [3]的方法，略修改。將上述各時間點收取的細胞在30min內鋪入附著于載玻片上的瓊脂糖膠內，4℃15min使膠完全凝固。后將膠板浸在堿性細胞裂解液中（2.5m nacl、0.1m edta、1%tritox?100、10%dmso）4℃避光作用2h或過夜；將裂解處理后的載玻片用蒸餾水清洗2次，置于解旋液（0.3mol/l naoh）中，4℃避光靜置20min。隨后將玻片移至盛有新鮮冰冷電泳緩沖液的水平電泳槽中25v，300ma電泳25min。停止電泳后將載玻片轉移至中和緩沖液中10min，蒸餾水柔和沖洗2～3遍，略干后滴加濃度為20μg/ml的溴化乙啶50μl/片，蓋上蓋玻片放在濕盒中，2天內拍照保存。中性單細胞凝膠電泳法檢測dna雙鏈斷裂（dsb）：制膠同堿性單細胞凝膠電泳法。將制好的膠板置入新配的中性裂解液(2mol pl nacl、30mmol/l edta、1%十二烷基肌氨酸鈉、10mmol/l tris、1%triton x?100、10%dmso、ph8.2～8.5)中于4℃裂解2h或過夜；0.5%tbe(2mmol/ledta、90mmol/l tris、90mmol/l 硼酸、ph8.2～8.5)浸沒漂洗3次,每次1h；在盛有0.5%tbe電泳緩沖液的水平電泳槽中0.6v/cm ，電泳25min；后同堿性單細胞凝膠電泳法。在熒光顯微鏡下每樣本觀察100個細胞，用casp comet assay software project對彗星圖像進行分析，計算各組彗星的oliver尾矩（oliver tail moment，otm，即尾部dna百分含量×遷移dna中心密度）。
1.5 半定量rt?pcr
分析給藥組（60μmol/l celecoxib作用48h）與空白組hela（只給相當dmso）細胞ku80、ku70 mrna的表達。按試劑說明書完成rna抽提純化和cdna的合成，以逆轉錄產物為模板進行pcr擴增。
ku70引物為：5′ctctatcgggaaacaaatgaaccag?3′25bp（正向），5′gtatctgcacaatgctgcaacctcc?3′25bp（反向），退火溫度54℃，擴增產物339bp；ku80引物為：5′tatgctcccaccgaggcacagttga?3′25bp（正向），5′actgccttcagccagactggagacg?3′25bp（反向），退火溫度56℃，擴增產物478bp；β?actin引物為：5′cctagaagcatttgcggtgg?3′，20bp (正向),5′gagctacgagctgcctgacg?3′，20bp （反向），退火溫度56℃，擴增產物416bp。pcr產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈下觀察并拍照。
1.6 western blot檢測
按給藥組（60μmol/l celecoxib作用48h）與空白組hela（只給相當dmso）提取細胞總蛋白。具體方法如下：冷的pbs溶液洗3遍，適量細胞裂解液（150mmol/l tris?cl、0.02%疊氮鈉、0.1%sds、100μg/ml pmsf、1μg/ml aprotinin、1%np40、0.5%去氧膽酸鈉、150mmol/l nacl）裂解提取總蛋白，用10%的分離膠做sds?page，然后轉移至nc膜上，5%脫脂奶tbst室溫封閉1h，分別加入一抗4℃孵育過夜，tbst洗滌10min×3次，辣根過氧化物酶二抗室溫孵育1.5h， tbst洗滌10min，洗3次，ecl曝光試劑盒曝光底片顯影。
1.7 統計學方法
以上實驗均重復3次，組間和組內采用t檢驗和方差分析，數據分析由spss11.0軟件完成。
2 結果
2.1 celecoxib與射線單獨和聯合作用后hela細胞周期及凋亡率的變化 單獨 celecoxib作用48h后對hela細胞的周期分布無明顯改變，但celecoxib可引起hela 細胞發生劑量依賴性的凋亡，見表1。表1 celecoxib對細胞周期和凋亡率的影響
celecoxib+放射組與單純放射組相比,可明顯提高放射引起的凋亡率，在celecoxib濃度為60、80、100μmol/l時，可分別增強放射誘導的凋亡率達3.18、4.16、6.96倍。同時celecoxib對6gy x線引起的g2/m期阻滯有明顯的減弱作用，見圖1。
2.2 celecoxib與射線聯合作用對hela細胞dna損傷的影響
2.2.1 堿性單細胞凝膠電泳法檢測hela細胞ssb如表2所示，空白組與加藥組的ssb損傷之間差異無統計學意義（p>0.05），表明適當劑量的celecoxib（60μmol/l）并不引起明顯的ssb。藥放組與放射組相比，其初始ssb（照射后0min時的ssb）無差異（p>0.05），而藥放組照射后各時間點的ssb均高于放射組（p<0.05）；并且放射組的ssb于照射后2h基本修復完全（與空白組相比差異無統計學意義，p>0.05），藥放組的ssb修復較慢，至照射后2h仍有明顯殘留的ssb未修復。
2.2.2 中性單細胞凝膠電泳法檢測hela細胞dsb 如表3所示，與ssb的檢測結果相似，藥放組與放射組相比，其初始dsb也無差異（p>0.05）；而藥放組與放射組相比，藥放組的dsb修復速度明顯低于放射組（p<0.05）, 至照射后2h藥放組仍有約37％的殘留dsb未修復。
2.3 半定量rt?pcr方法檢測celecoxib對hela細胞ku70，ku80 mrna表達水平的影響
空白組ku70(1.030±0.066)，ku80(1.335±0.082)mrna表達水平明顯高于給藥組ku70(0.744±0.066)，ku80(0.596±0.024)mrna表達水平（p<0.05），見圖2。
2.4 western blot檢測celecoxib對hela細胞ku70和ku80蛋白表達的影響表2 堿性單細胞凝膠電泳法檢測hela細胞ssb尾距（otm）rt* ：radiation; n=9；rt+celecoxib組與rt*組的0min相比，p>0.05；rt+celecoxib組與rt*組其余時間點相比，p<0.05；celecoxib組與control組相比，p>0.05表3 中性單細胞凝膠電泳法檢測hela細胞dsb尾距（otm） 結果顯示宮頸癌hela細胞經60μmol/l celecoxib作用48h后，ku70（0.390±0.058），ku80（0.647±0.120）蛋白表達水平均較空白組ku70(0.785±0.113)，ku80(1.232±0.167)（p<0.05）有明顯下調，見圖3。
3 討論
目前已有臨床研究表明，放射敏感的腫瘤表達的cox?2蛋白水平普遍低于放射抗拒的腫瘤，且cox?2蛋白的表達水平與腫瘤的放射敏感性呈正相關[4,5]。體內試驗和體外試驗早已證明，非甾體消炎藥（nsaids）如吲哚美辛（indomethacin）或布洛芬（ibuprofen）可提高腫瘤放射效應。近期研究表明選擇性cox?2抑制劑的放射增敏效應顯著高于非選擇性cox抑制劑，如在相同的鼠移植瘤模型中，以腫瘤生長延緩(tumor growth delay，gd) 為評價標準，sc?236和吲哚美辛的放射增強因子(enhancement factor, ef)分別為3.64和1.39[1,6]。其放射增敏機制可能與抑制cox?2的活性，降低細胞內pge2水平；促放射誘導的凋亡；細胞周期改變和抑制dna損傷修復有關。該實驗室曾在體內外實驗中證實，celecoxib對宮頸癌hela細胞具有放射增敏作用，并在其小鼠移植瘤模型中證實hela細胞具有高cox?2表達[7]。該實驗研究了選擇性cox?2抑制劑celecoxib與放療結合時對宮頸癌hela細胞dna損傷修復的影響。
3.1 細胞周期與放射敏感
處于不同周期的細胞，對低let射線放射敏感性不同，多數實驗提示處于m期和g2期的細胞放射敏感性最高。raju等[8]發現用sc?236處理nfsa(一種鼠源肉瘤細胞)也可引起g2/m期細胞的累積（67％），同時 cyclin a、b以及cdk?1的表達下調。另外，阻滯pg的合成也可能導致g2/m期細胞的堆積。這說明選擇性cox?2抑制劑的放射增敏機制可能與細胞周期的再分布有關。但petersen等[9]的研究發現，經sc?236處理2天，u251的細胞周期沒有明顯改變。也就是cox?2抑制劑誘導細胞周期阻滯與腫瘤細胞類型或其他未知因素有關。該實驗也發現單獨celecoxib作用于hela細胞不顯著影響細胞周期分布，但可使放射引起的g2/m期阻滯作用明顯減弱。見圖4。與此類似，park等 [10,11]的研究也發現celecoxib可以顯著削弱放射引起的cox?2陽性表達細胞的g2/m期阻滯，并認為這種作用與celecoxib阻止cdk1、cdk2的磷酸化有關。
真核細胞受照射后，可以廣泛誘導g2期阻滯出現，這在保證細胞的完整性、損傷后細胞的存活和保持細胞的遺傳穩定性方面具有重要生物學和遺傳學意義。哺乳動物細胞預先用咖啡因[12]（可以解除照射誘導的細胞g2期阻滯）處理后照射，可以使細胞存活率明顯下降，這說明輻射誘導的細胞g2期阻滯是機體的一種保護性調節。cyclinb1?cdc2復合物的活性狀態在g2/m期進程調控中起關鍵作用， 目前普遍認為，atm/atr激酶?chk1/chk2?cdc25c?cdc2是放射誘導g2/m期阻滯的主要途徑。但celecoxib如何影響上述途徑，使g2/m期阻滯缺失和凋亡促進的分子機制還有待進一步研究。
3.2 dna修復與放射敏感性
dna是電離射線殺傷細胞的主要靶分子，輻射誘導的dna斷裂及修復,與細胞內在放射敏感性有很好的相關性,可為細胞內在放射敏感性的預測指標。細胞受到分割的低劑量放射后，少部分細胞呈亞致死性損傷（sld），在細胞存活曲線上出現亞致死性損傷的累積，表現為存活曲線出現肩部及肩區的dp值（即閾值劑量）。raju等[8]發現用sc?236（50um,3天）可消除放射存活曲線上的肩區，并通過分割照射（3gy/次，2次間隔4h）證明單純放射組（1.4）較sc?236＋放射組（1.1）有較高的修復能力。
雙鏈斷裂(dsb)是輻射所致細胞死亡的最重要的dna損傷形式，它的修復是通過兩種形式的重組修復進行的：同源重組（homologous recombination repair，hr）和非同源末端結合重組（non?homologous end joining, nhej），前者是低等生物修復形式,而高等生物主要是后者。dna依賴的蛋白激酶(dna?pk)是參與nhej的重要分子，在dna損傷修復時，首先由其ku亞基結合損傷dna激活dna?pkcs后啟動dna損傷修復機制。已經證實,一些哺乳動物輻射敏感細胞系不能進行dsb修復的原因是由于dna依賴的蛋白激酶(dna?pk)成分ku的缺失。lim等[13]研究發現cox?2抑制劑可以下調ku70,ku80這兩種dna修復相關基因的表達。md anderson的raju等[14]的實驗也不僅在蛋白水平證明celecoxib抑制ku70的表達，同時證明celecoxib還可降低dna?ku的結合活性。
綜上所述，cox?2 選擇性抑制劑celecoxib對腫瘤細胞的放射增敏機制可能與抑制dna損傷修復有關，其作用可能通過減弱細胞周期g2/m檢測點（checkpoint）作用和減弱dsb重組修復酶dna?pk成分ku的表達得以實現。但celecoxib如何影響細胞周期和dna損傷修復的分子機制還有待進一步研究。
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