前言：中文期刊網精心挑選了兒媳柔佳范文供你參考和學習，希望我們的參考范文能激發你的文章創作靈感，歡迎閱讀。
兒媳柔佳范文1
目的：研究（nuclear factor，NF）2κB抑制劑吡咯烷二硫氨基甲酸(NF-B Inhibitor pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)對體外培養人翼狀胬肉成纖維細胞（human pterygium fibroblast，HPF）增殖的影響，尋找輔助治療和預防翼狀胬肉復發的新方法。方法：取人翼狀胬肉標本進行體外貼壁細胞常規培養，取第3～6代細胞進行試驗。（1）免疫組化法染色結合細胞生物學特征鑒定成纖維細胞；（2）不同濃度PDTC (2.5，5，10，20，40μmol/L)干預成纖維細胞24，48，72h后， MTT法檢測細胞生長抑制率；（3）免疫細胞化學法分別檢測PDTC干預48h后HPF增殖細胞核抗原 (PCNA)的表達情況。結果：體外培養的翼狀胬肉細胞經免疫組化染色可見波形蛋白表達陽性，結合細胞生物學特性可以確定為成纖維細胞。MTT實驗表明，隨著PDTC干預濃度的增大和時間延長，成纖維細胞生長抑制率增加(P
【關鍵詞】 吡咯烷二硫氨基甲酸 翼狀胬肉 成纖維細胞 增生抑制
Effect of pyrrolidine dithiocarbamate on proliferation of human pterygium fibroblasts
Abstract AIM: To study the effect of pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC)， a potent inhibitor of NF2κB， proliferation and apop- tosis of human pterygium fibroblasts(HPF)，inculture and search for a new method to prevent the recurrence after pterygium surgery. METHODS：The primary culture and subculture of HPFs were established in vitro. The third to sixth passage of HPFs were used in next steps:(1) HPFs were identified by the immunocyte to chemical method of SABC. (2) HPFs treated with PDTC （2.5，5，10，20，40μmol/L) for 24，48，and 72 hours， respectively. MTT assay was used to evaluate the cell proliferation inhibitory rate. (3）Immunocyte chemical method were used to analyze expressions of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) ， respectively after HPFs being treated with PDTC for 48 hours. RESULTS: The expression of vimentin in cultured cell was positive and the HPFs were identified. The proliferation inhibitory rate of PDTC on HPFs increased as incubation time and concentration increasing (P
· KEYWORDS: PDTC; human pterygium fibroblast; prolifera- tion
0引言
翼狀胬肉是較為常見的疾病，其發病機制仍不十分清楚。它以新生的纖維血管組織自球結膜生長侵入角膜為特點。治療翼狀胬肉的手術方法較多，但均不能有效地降低其復發率，因此尋找有效、副作用少的治療方法是許多學者所面臨的研究課題。PDTC已廣泛用于體外培養的人視網膜色素上皮細胞的增生及人肺腺癌細胞A549細胞的生長抑制作用等方面的研究。核因子2κB（NF2κB）是一種重要的核轉錄因子，廣泛存在于真核細胞內，是機體細胞間信號傳導通路的重要因子[1] 。研究發現，NF2κB活化后參與多種腫瘤的形成與發展[1]，在腫瘤組織中呈持續激活狀態[2]。吡咯烷二硫氨基甲酸（PDTC）是NF2κB特異性阻斷劑，可抑制其活性[2]。翼狀胬有類似腫瘤的增生特點，但PDTC是否對翼狀胬肉有作用尚待研究。為此，我們利用體外培養的翼狀胬肉成纖維細胞作為實驗對象，觀察PDTC對其是否具有抑制作用如下。
1材料和方法
1.1材料 體外培養的人翼狀胬肉成纖維細胞，DMEM培養基（Gibco 公司），新生牛血清（Gibco 公司），1∶250胰蛋白酶、PDTC及噻唑藍（MTT）（Sigma公司），二甲基亞砜（DMSO）（Sigma公司），小鼠抗人角蛋白及波形蛋白單克隆抗體、小鼠抗人PCNA單克隆抗體為武漢博士德公司產品。胬肉組織標本為本院眼科手術切除組織，采用組織塊培養法原代接種1d后，觀察組織塊貼壁情況、培養液色澤、細胞生長狀況和形態特征等。48h后觀察有細胞從組織塊周圍爬出（圖1），每3～4d更換1次培養液，待細胞生長匯合至80%后以2.5g/L胰蛋白酶消化細胞，按1∶3分種傳代。取傳代細胞接種于預置蓋玻片的6孔板，待細胞長滿蓋玻片，取出用無水乙醇+冷丙酮1∶1混合固定15min，風干后HE染色（圖2），并以抗波形蛋白和角蛋白抗體行免疫組化鑒定（圖3）。
圖1 HPF原代細胞組織片的邊緣可見“毛刷狀”緣，細胞呈火焰狀或放射狀延展，輪廓清晰，胞體透亮(×100)
圖2 細胞波形蛋白表達陽性，呈現與成纖維細胞長軸方向一致棕黃色網狀或束狀結構（SP×200）
圖3 傳代細胞輪廓清晰，呈扁平多邊狀的上皮形態，胞內為淡紅色，胞核邊界清晰，有的可見“雙核”(HE×200)
1.2方法
1.2.1HPF生長抑制率檢測 HPF細胞用含100g/L新生牛血清的DMEM培養基，于37℃，CO2培養箱內培養，2.5g/L胰蛋白酶消化傳代。取對數生長期HPF細胞按1×104/孔接種于96 孔培養板，每孔加液200μL。設不接種細胞的空白組（調零組）、對照組和PDTC組。24h后換液，對照組不加PDTC，PDTC組PDTC終濃度分別為2.5，5，10， 20，40μmol/L。每個濃度每個時間點設6個復孔。分別于PDTC干預24，48，72h加入5g/L MTT 20μL/孔，繼續培養4h后吸出培養液，加入DMSO150μL/孔，振蕩溶解10min，待結晶完全溶解后，在ELX800酶標儀上選擇波長490nm，空白組調零，測定各孔吸光度（A），計算細胞生長的抑制率：抑制率=(1-PDTC組A 值/對照組A值)×100%。
1.2.2HPF細胞PCNA表達檢測 采用免疫細胞化學法。取對數生長期HPF細胞1×108 /L接種于預置蓋玻片的6孔板，24h后換液，對照組不加PDTC，PDTC組PDTC終濃度分別為2.5，5，10，20，40μmol/L，培養48h后0.01mmol/L PBS沖洗3次，冷丙酮＋無水乙醇1∶1固定。采用SP法，操作按說明書進行，鼠抗PCNA mAb稀釋度為1∶50。胞核呈棕黃色為PCNA陽性，PCNA表達強度用高清晰度彩色圖像分析系統（同濟科技集團千屏影像公司）測定5個視野的吸光度，取平均值。隨機計數（放大倍率20×10）100個細胞數出全部陽性細胞及陰性細胞并列表。
統計學處理：實驗結果數據計量資料用 表示，MTT抑制率同濃度和時間的關系采用方差分析。不同濃度PDTC對細胞作用結果與對照組的差異用SPSS11.0軟件進行t檢驗。細胞PCNA陽性表達數采用卡方檢驗。
轉貼于
2結果
PDTC作用后HPF生長抑制率對照組細胞呈鋪路石樣、排列整齊貼壁生長;用藥組細胞變圓、分布松散，且高劑量組細胞數明顯減少。PDTC濃度≥2.5μmol/L時，能顯著抑制HPF增生（P
HPF細胞PCNA表達 細胞陽性表達顯示為棕黃色、黃色或淺黃色細小均勻顆粒，分布于整個細胞核；細胞核無著色、胞內呈淡黃色者為陰性對照組。HPF細胞胞核呈棕黃色，PCNA表達強陽性；PDTC干預后，胞核染色變淺，且呈劑量依賴關系( P
圖4 PDTC組細胞PCNA的表達（SP×200）
3討論
翼狀胬肉是局部球結膜纖維血管組織呈三角形膜樣增生而侵犯角膜的一種眼表疾病，單眼或雙眼受累。不僅直接影響美觀， 還可由于牽拉而引起眼部不適及角膜散光， 嚴重者影響視力及不同程度地影響眼球運動，是眼科的常見病、多發病。病理學研究表明，它的主要成分是異常增生的成纖維細胞和新生血管[3]，具有類似腫瘤發生前的性質。纖維增生和新生血管化的范圍和程度是預測翼狀胬肉切除術后復發的可靠形態學指標[4]。治療翼狀胬肉的手術方法較多，但均不能明顯地降低其復發率。目前常采用抗增生藥物，如5-氟尿嘧啶、絲裂霉素C、噻替派等單獨或聯合手術治療試圖降低翼狀胬肉術后的復發率，臨床觀察對延緩胬肉發展具有一定療效[5]。但這些藥物對局部及全身有較大的毒副作用。因此尋找安全、有效的抗增殖藥是許多學者所面臨的研究課題?？寡趸瘎㏄DTC可抑制NF2κB的p65亞單位，并具有金屬螯合作用，是NF2κB特異性阻斷劑。在抑制腫瘤的研究中發現其發揮作用的機制可能與下調NF-κB，抑制iNOS，COX-2活性有關[6]，也可能是通過抑制細胞周期蛋白D和E的活性或者刺激caspase-3，caspase-8的活性來降低B c l-x L的水平來誘導細胞凋亡[7]。NF2κB是一種p50、p65異源二聚體，在生理狀態下與抑制蛋白IκB在胞漿中結合，處于無活性狀態；當細胞受到內毒素、過氧化物、生長因子、白介素、細胞毒素等刺激時，IκB可泛素化和降解，NF2κB活化，可參與和免疫、血管生成、抗腫瘤、炎癥反應有關的基因轉錄調控，并與細胞增殖有關。目前認為，NF2κB抑制細胞增殖作用主要與其抗凋亡、抗腫瘤和免疫激活功能有關[ 8]，同時與抑制新生血管也有關，通過抑制多種細胞NFκB的活化和一系列依賴NFκB細胞因子的分泌，這些細胞包括血管內皮細胞，血管平滑肌細胞，巨噬細胞[9-11]，而這些細胞均參與新生血管的形成。因此推測PDTC通過抑制NF2κB活性，抑制細胞增殖的作用。
我們以不同濃度PDTC干預人翼狀胬肉成纖維細胞后MTT法顯示，PDTC可抑制人翼狀胬肉成纖維細胞生長，隨著干預濃度的增大和時間延長，抑制率增加；我們還發現，PDTC干預人翼狀胬肉成纖維細胞后， PCNA蛋白表達均下降，其下降程度與PDTC干預濃度均呈負相關?？傊?，本實驗研究表明PDTC能時間、劑量依賴性的抑制HPF增生，提示PDTC對翼狀胬肉的治療具有潛在的應用前景，為翼狀胬肉的藥物治療提供了一個新的思路。但目前研究僅限于離體實驗，且PDTC發揮作用機制較為復雜，尚未系統、明確地了解，有待進一步研究。
參考文獻
1 Shishodia S， Aggarwal BB. Nuclear factor－kappa B: a friend or a foe in the Cancer? Biochem Phramacol ，2004;68(6):1071-1080
2 Chen F， Castranova V， Shi， X， Demers LM. New insights into the role of nuclear factor-kappa B， a ubiquitous transcription factor in the initiation of diseases. Clin Chem ，1999;45(1):7-17
3 Coroneo MT， Di Girolamo N， Wakefield D. The pathogenes is of pterygia. Curr Opin Ophthalmol ，1999;10:282-288
4 Tan DT， Chee SP， Dear KB， Lim AS. Effect of pterygium morphology on pterygium recurrence in a controlled trial comparing conjunctival autografting with bares clear excision. Arch Ophthalmol ，1997;115(10):1235-1240
5 Liu DJ， Chen XM， Bao J， Pan RG， Li M， Liu YL. Effects of extensive Tenon's membrane excision combined with mitomycin C treatment in the pterfgium surgerl. Int J Ophthalmol(Guoji Yanke Zazhi) ，2006;6(3):700-701
6 Surh YJ， Chun KS， Cha HH， Han SS， Keum YS， Park KK， Lee SS. Molecular mechanisms underlying chemopreventive activities of anti-inflammatory phytochemicals: down-regulation of COX-2 and iNOS through suppression of NF-kappa B activation. Mutat Res ，2001;480-481:243-268
7 Moragoda L， Jaszewski R， Majumdar AP. Curcumin induced modulation of cell cycle and apoptosis in gastric and colon cancer cells. Anticancer Res ，2001;21(2A):873-878
8 Hanahan D， Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell，2000;100(1):57-70
9 Chen XL， Tummala PE， Olliff L， Medford RM. E-selectin gene expression in vascular smooth muscle cells. Evidence for a tissue－specific repressor protein. Circ Res ，1997;80(3):305-311