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細胞分化范文1
1 引言
間充質干細胞(mesenchymal stem cells， MSCs) 于1976年由Fridenshtein首次發現，是一種具有多分化潛能的成體干細胞，存在于人類等生物的骨髓等組織中， 具有向骨、軟骨、脂肪、神經元和肌肉及肌腱等組織分化的潛能［1，2］。研究發現臍血中含有MSC，與骨髓間充質干細胞具有相同的多向分化和造血支持功能[3，4]。臍血間充質干細胞與其他來源的干細胞相比具有免疫原性弱， 來源廣泛， 采集方便，更強的增殖能力和無倫理問題等諸多優點。目前臍血間充質干細胞作為多種疾病治療的細胞來源，在臨床應用方面具有廣闊的前景。我們的實驗分離培養臍血MSCs，并向脂肪細胞轉化的研究，了解MSCs誘導分化前后的生物學特征，為組織工程研究方面奠定實驗基礎，為骨質疏松、代謝綜合癥等疾病的發病機制提供細胞模型。
2 材料和方法
2.1 材料
所有臍血取自解放軍401醫院婦產科，征得病人及其家屬同意。低糖型DMEM培養基購自Gibco公司；胎牛血清(FBS) 購自杭州四季青生物工程公司；1-甲基-3-異丁-2黃嘌呤（IBMX）、地塞米松和胰島素、Percoll 分離液、油紅O染料購自上?；瘜W品采購公司。CD44、CD34單克隆抗體購于Neomarker 公司。
2.2 方法
2.2.1 臍血MSCs的分離培養
參照國外[4]成熟分離方法，在無菌條件下抽取臍血3ml，肝素抗凝后與3mlPBS混勻，然后按1：1的比例緩慢加入3ml的percoll淋巴細胞分層液(1.073g/ml)中，2000轉/min離心10分鐘，取白膜層，PBS沖洗稀釋后1000轉/min離心10分鐘，共2次。離心后的沉淀細胞加入5%FBS的LG-DMEM 制成單細胞懸液后接種于培養瓶中， 37℃，5%CO2培養箱下培養，24h細胞貼壁，呈圓形形狀生長。72小時后細胞呈紡錘形或多角形，每2-3天換液1次，當細胞匯合85%時胰蛋白酶消化按1∶3比例傳代。第3～4代以后， 細胞形態開始比較均一。
2.2.2 臍血MSCs透射電鏡樣本制備
取第3代臍血MSCs制成單細胞懸液，2.5%戊二醛固定，4℃過夜。PBS洗滌，1%鋨酸固定，梯度乙醇脫水，環氧丙烷浸透，Epon812包埋并聚合，常規超薄切片。醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛雙染色。透射電鏡下觀察。
2.2.3 MSCs細胞向脂肪細胞的誘導培養
我們配置了含1-甲基-3-異丁-2黃嘌呤(IBMX)、地塞米松、胰島素、和胎牛血清的培養基誘導液誘導臍血MSCs向脂肪細胞分化。6孔板每孔接種1×106個細胞，標準培養基培養24 h后換成脂肪誘導基質(含10%FBS，1μmol/L地塞米松， 10μg/ml胰島素，0.5mmol/L IBMX)，每3d換液1次。油紅O為特異性的脂質結合劑，在第3周時來檢測脂肪沉積。PBS液洗滌誘導后細胞，10%中性緩沖甲醛固定20～30min，60%異丙醇漂洗去除多余染液，蒸餾水沖洗10min。光鏡下觀察，隨機抽取計數10個非重疊視野(×100)，計算脂肪細胞占細胞總數的比例。結果用均數±標準差(x-±s) 表示。單純的LG-DMEM培養，每3～4d換液。
3 結果
分離臍血得到的白膜層接種到培養瓶中在第2～3天時貼壁，兩端有較長突起，胞核橢圓形，細胞增殖生長， 形成集落，起初生長緩慢，2周左右達到90%匯合。細胞形態呈現多元化，有的呈小圓形、星形，有的體積較大有多個核，多數在傳代后死亡，形態與骨髓間充質干細胞相似，隨培養時間延長，細胞體積逐漸增大伸展。
圖1 第3代的臍血MSCs 圖2 第3代臍血MSCs電鏡結果
3.1 臍血MSCs的鑒定
在透射電鏡觀察胞核類圓形，核仁明顯核膜有核袋及核突，有些細胞呈現1～2個核仁，在核膜周圍有染色質排列。胞質中有多量的粗面內質網、線粒體、微管等。貼于蓋玻片表面的細胞呈長梭形突起較長，細胞表面有微絨毛。
3.2 誘導組與對照組結果
第3d誘導組中可觀察到臍血MSCs的由扁平漸收縮變小，圓形胞體外形成突起，細胞逐漸變成圓形（圖2），胞突起逐漸變圓鈍，胞漿內出現類似脂滴樣物質。第7天后高折光性的脂滴沉著細胞數目逐漸增多，第20d油紅O染色示胞核呈藍色， 脂滴呈橙色（圖3），絕大多數脂肪細胞的脂肪顆粒充滿整個細胞。而對照組的MSCs培養8d時，大部分細胞依然是臍血MSC長梭樣形態特點，油紅O染色陰性結果。
圖3 油紅O染色脂肪細胞
4 討論
本實驗聯合應用密度梯度離心法及貼壁篩選法，并在此基礎上采用單克隆培養法來分離、培養臍血MSCs， 使獲得的hMSCs盡可能為同源細胞，從而提高其純度[5]。經密度梯度離心后獲得的MSCs貼壁生長，形態呈梭形，具有形成成纖維集落的能力[6]。在特定環境脂肪誘導過程中，細胞形態、結構和功能均發生了顯著變化。誘導7d細胞形態開始由成纖維樣梭形細胞變為圓形突起或多角形細胞，至20d時細胞體積增大，胞內出現高折射率的脂滴，呈脂肪細胞樣細胞表現。
臍血間充質干細胞誘導分化為脂肪細胞的研究領域較少，隨著臨床組織工程醫學的興起， 臍血間充質干細胞作為種子細胞具有生物學特性和來源的多樣化，尤其是臍血來源的間充質干細胞具有分離簡單、低免疫原性、無倫理性等很多優點已成為研究熱點。目前越來越多的證據表明，骨髓脂肪細胞和成骨細胞表型間存在相互轉化的關系，抑制骨髓脂肪細胞生長成為預防骨質疏松的有效途徑，骨髓脂肪細胞則被視為骨質疏松癥防治的靶細胞，利用臍血MSCs 作為種子細胞定向誘導分化為脂肪細胞， 有助于深入探討其誘導分化機制，同時也為骨質疏松治療提供自體細胞來源。
參 考 文 獻
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細胞分化范文2
本文就近幾年國內外白細胞介素與骨髓間質干細胞分化為肝細胞的研究進展作一綜述。
1 細胞移植干細胞的選擇
干細胞最大的特性是可塑性大，對組織再生的肝細胞基本要求是：具有多樣性，容易獲得，有增殖能力，體外轉化率高，可選擇細胞移植治療肝衰竭的干細胞有造血干細胞，成人肝臟干細胞和祖細胞、骨髓間充質干細胞及其他類型的細胞。
1.1造血干細胞 造血干細胞是從骨髓、臍帶血、外周血中分離出來的標準的多能干細胞，具有自我更新及分化增殖的能力，但他們在體外很難增殖，并且確定此類細胞的身份和表型主要靠選擇過程，但選擇的標準是有爭議的。
1.2成熟肝臟干細胞和祖細胞 成熟肝臟干細胞大約有四種主要類型：卵圓細胞、小肝細胞、肝上皮細胞和間質樣細胞。在肝臟損傷時卵圓細胞來源于排膽汁的細胞，有兩種分化潛能，即分化成肝細胞和膽管細胞，在體外能增殖，但是否起源骨髓還不清楚，同種類型在健康的肝臟能分離到。小肝細胞最先是Mitaka T在肝細胞離心方式獲得的，這種細胞小，體外有增殖能力，能分化成成熟的肝細胞，肝上皮細胞是Tsao MS最先報道的，在成人的肝臟中含量高[3]，間質樣細胞團也來自成人肝臟，這種細胞團能高水平的增殖，巨大的分化潛能。肝臟內的主要細胞形式為成熟的肝細胞。肝細胞是單能干細胞，對有害刺激的反應迅速[4]。成熟肝臟干細胞雖然能分化成肝細胞，但其轉化具有諸多不足，如獲取肝細胞難度較大、異基因肝細胞可能產生免疫排斥反應、體外培養易失去活性與功能等，因而不能成為滿意的治療細胞。
肝祖細胞在肝臟持續和嚴重的損傷后僅僅是邊緣的擴張，無法補充成熟肝細胞的損傷。因此也難成為首選的治療細胞。
1.3骨髓間充質干細胞 骨髓間充質干細胞是從骨髓中分離出來的[5]，也可以從其他組織中分離，如脂肪組織，胚胎，羊水，和臍帶血液[6，7]。在體內，他們的功能和習性還不十分清楚[8]。在體外，間充質干細胞有高度增殖的特性，容易轉染，且在體外展現巨大的分化潛能[9]。骨髓間充質干細胞來源于中胚層的成體干細胞，可以重復利用，釋放多種祖細胞，然后分化為各種功能性的細胞，如肝細胞，脂肪細胞，骨細胞及內胚層來源的細胞等[10]。由于它以下的優勢，骨髓間充質干細胞被認為是目前細胞治療中的首選，第一、骨髓間充質干細胞可以辨別各種來源于中胚層的組織細胞，當組織細胞受到損傷時骨髓間充質干細胞可以自我復制用以補充細胞修復組織。第二、最新研究表明骨髓間充質干細胞用來治療時，可分泌可溶性的細胞因子來調節機體的免疫環境。第三、骨髓間充質干細胞可調節機體內的微環境用以緩解炎癥因子及腫瘤因子對機體的損傷。盡管其機制還沒有完全的研究透徹，但是骨髓間充質干細胞已被用于多種疾病的治療如肝衰竭，移植物抗宿主疾病，骨髓移植后，心血管疾病，自身免疫性疾病等[11]。近期研究發現骨髓間充質干細胞具有多向分化及自我增殖的能力，具有分化成肝細胞的潛能，在肝臟損傷修復過程中，能參與修復損傷的肝組織，在肝臟疾病的治療中有廣闊的治療前景。而且骨髓間充質干細胞作為免疫系統的有效調節劑，與多種免疫細胞間有相互作用關系并可抑制白細胞或使之激活成特異性的抗炎因子[12]。骨髓間充質干細胞能通過旁分泌途徑分泌細胞因子和生長因子，從而抑制炎癥反應、細胞凋亡、肝星狀細胞的激活及促進細胞外基質的降解，改善肝纖維化及促進肝細胞的再生，骨髓間充質干細胞不僅能增強肝臟再生的能力，而且還能抑制肝細胞的凋亡，修復受損肝細胞功能。其中最有利的是他們的免疫特性，即無明顯免疫源性，易形成免疫耐受，這就有利于細胞移植[13]。在動物實驗中，骨髓間充質干細胞通過門靜脈注入，肝動脈注入，周圍靜脈注射、腹腔內注射或直接注入肝臟或脾臟等發現，其在不同的誘導條件下可分化為肝細胞、膽管細胞、成骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、神經細胞和心肌細胞等[14，15]。骨髓間充質干細胞可在肝細胞生長因子和成纖維細胞生長因子的培養基下分化成成熟肝細胞，分化率在30%～80%。從骨髓間充質干細胞培養獲得的肝細胞樣細胞能表現出肝細胞的功能，如產生白蛋白，儲存糖元，分化尿素，吸收低濃度的脂蛋白等[16]。骨髓間充質干細胞是通過抑制細胞凋亡來促進損傷的肝細胞達到修復作用[17]。它具有免疫抑制及抗炎作用，在慢性肝損傷中是另一種改善機制，可能涉及抗炎細胞因子的分泌（例如IL-10，IL-1Ra，）或者生長因子的分泌（例如肝細胞生長因子，血管內皮生長因子或胰島素樣生長因子結合蛋白）[17]。從骨髓間質干細胞的分離，培養到形成肝細胞樣細胞受到很多因素的影響，特別是受到許多細胞因子的影響，主要影響的是各個階段獲得的細胞數量，而細胞的數量對細胞移植治療肝衰竭尤為重要。一般來說，移植數目越多，治療肝衰竭就越易成功，相反治療效果就越差。
1.4其他類型的細胞 最后是其它類型細胞，如胎兒干細胞是體細胞分化的模板，但他的倫理的局限性和可能發生腫瘤而限定臨床應用。單核細胞、成纖維細胞是否分化成肝細胞仍在研究中[18]。
2 白細胞介素與肝細胞再生
白細胞介素是由多種細胞產生并作用于多種細胞的一類細胞因子，由于最初是由白細胞產生又在白細胞間發揮作用而得名。目前已經發現了29種白細胞介素，分別命名為白細胞介素1到白細胞介素29，功能復雜，形成一個網絡，相互重疊，是非常重要的細胞因子家族，在免疫細胞的成熟、活化、增殖和免疫調節等一系列過程中均發揮了重要作用，此外它們還參與多種生理及病理反應。Conget等報道骨髓間充質干細胞表面有白細胞介素2、白細胞介素3及白細胞介素6及堿性成纖維細胞生長因子等多種細胞因子受體。目前研究與肝細胞有關的白介素有白介素6、白介素10。
恢復肝臟體積主要在于肝細胞的再生，研究表明肝細胞的再生受IL-6/Jak/STAT3通路的影響，在非病理及靜態下肝細胞并不進行細胞的有絲分裂，在各種條件的刺激下，肝細胞能在IL-6或者TNF-α的作用下進行有絲分裂。IL-6/STAT3信號通路是由IL-6受體，Jak激酶，gp130和STAT3共同組成的，IL-6受體形成2個復雜的gp130受體，當其被IL-6識別后，馬上將信號傳遞給肝細胞，Jak激酶主要的責任是激活gp130受體和STAT3。IL-6通過激活STAT3發送有絲分裂信號給肝細胞，并在肝細胞的再生中扮演者重要的角色。STAT3激活是肝細胞再生的促動反應，通過觀察IL-6缺失型小鼠肝部分切除后30min～3h STAT3的激活過程，STAT3活化是受抑制的，因此肝細胞再生與IL-6是通過激活STAT3是密切關聯的。TNF-α主要表達在庫普弗細胞中，主要激活NF-kB，增加IL-6的產生，與IL-6受體結合，激活激活STAT3發送有絲分裂信號給肝細胞，促進肝細胞的再生。
研究表明，巨噬細胞激活和多種細胞因子的分泌在急性肝衰竭的發病機理中起著重要的作用，內毒素，巨噬細胞的激活和促炎細胞因子都可能誘發CD163的表達[19]。而IL-10能上調CD163在單核細胞中的表達，從而減少肝細胞炎癥反應。CD163和白介素IL-10在抗炎反應扮演了一個重要的角色。有研究表明，IL-10和巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）可能誘導單核細胞分化成巨噬細胞，這可能進一步上調CD163 mRNA和蛋白表達[20]。骨髓間充質干細胞可以通過調控抗炎細胞因子白細胞介素10及分泌白細胞介素1受體拮抗劑，從而減少前炎癥細胞因子的產生，減輕肝臟的炎癥反應。白細胞介素10可通過減少Bcl-2的表達及促進FasL和Bax的表達促進肝星狀細胞的凋亡。
3 展望
近年來隨著肝衰竭的發病率的增加，傳統的治療及器官的移植已經不能滿足我們對疾病治療的期望，因此干細胞的移植成為研究的熱點。骨髓間充質干細胞具有低免疫源性，自我復制及能夠分泌細胞因子或生長因子等多種優勢，已經成為我們干細胞移植的首選治療細胞。但是，骨髓間充質干細胞來源少，并且隨著動物年齡的增長逐漸減少，而且骨髓間充質干細胞分化為肝細胞的具體機制尚不明確，因此怎樣能夠大量獲得骨髓間充質干細胞，促進體內骨髓間充質干細胞向肝細胞的分化及白細胞介素對骨髓間質干細胞分化成肝細胞樣細胞的各個階段的影響，至今還沒有弄清楚。通過各種途徑對肝細胞特征性蛋白的mRNA轉錄水平、糖原染色等來分析誘導分化的效果，了解白細胞介素對干細胞生長的可能影響，能夠為干細胞移植治療肝衰竭提供積極的指導意義。
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細胞分化范文3
1.(2013·海淀模擬)2012年諾貝爾生理學獎獲得者發現，誘導人體表皮細胞使之具有胚胎干細胞的活動特征，且這些細胞可以轉變為心肌細胞和神經細胞。下列與此有關的說法，不正確的是()
A.該研究說明細胞分化是可以逆轉的
B.人體表皮細胞的基因發生了突變
C.誘導后的細胞具有分裂和分化能力
D.該研究可為治療心血管絕癥提供幫助
答案 B
解析 表皮細胞是高度分化的細胞，經誘導后具有了胚胎干細胞的活動特征，胚胎干細胞的分化程度較低，這說明細胞分化可以逆轉;在該過程中，細胞中的遺傳物質并未發生改變;誘導形成的胚胎干細胞能夠分裂分化為心肌細胞和神經細胞，因此該研究可為治療心血管疾病提供幫助。
2.脊椎動物胚胎發育中產生了過量的運動神經元，它們競爭肌細胞所分泌的神經生長因子，只有接受了足夠量神經生長因子的神經元才能生存，并與靶細胞建立連接，其他的則發生凋亡。下列敘述正確的是()
A.脊椎動物細胞凋亡僅發生在胚胎發育時期
B.一個存活的神經元只與一個靶細胞建立連接
C.神經元凋亡是不受環境影響的細胞自動死亡
D.神經元凋亡是由基因控制的編程性死亡
答案 D
解析 細胞凋亡不僅發生在胚胎期，也發生在生物體其他的生命過程中;一個神經元通過它的軸突末梢可以與一個或多個神經元建立突觸聯系;從題中信息可知，神經元的凋亡與神經生長因子有關，說明神經元凋亡受環境影響;神經元凋亡是受基因所控制的細胞自動結束生命的過程，是基因控制的編程性死亡。
3.視網膜母細胞瘤為惡性腫瘤，其發病與RB基因有關。RB基因編碼的蛋白質稱為RB蛋白，分布于核內，能抑制細胞增殖。正常人體細胞中含有一對RB基因，當兩個RB基因同時突變產生突變蛋白時，會發生視網膜母細胞瘤。下列敘述正確的是()
A.上述RB基因發生的突變屬于顯性突變
B.RB基因為抑癌基因，能抑制細胞癌變
C.突變蛋白的產生體現了細胞分化的實質
D.突變蛋白可以延長細胞周期
答案 B
解析 根據“當兩個RB基因同時突變產生突變蛋白時，會發生視網膜母細胞瘤”可知，RB基因發生的突變屬于隱性突變;因為RB基因編碼的蛋白質能抑制細胞增殖，所以RB基因為抑癌基因;細胞分化的實質是基因的選擇性表達，而RB基因突變過程中遺傳信息發生了改變;RB蛋白能抑制細胞增殖，可以延長細胞周期，而突變蛋白形成后產生癌細胞，其細胞周期變短。
4.下列關于細胞衰老、凋亡與壞死的敘述，正確的是()
A.衰老細胞的體積和細胞核體積都縮小
B.青蛙發育過程中尾的消失屬于細胞壞死現象
C.細胞凋亡的根本原因是病原體感染
D.細胞衰老與凋亡是細胞正常的生理過程
答案 D
解析 衰老細胞的體積縮小，細胞核體積增大;青蛙發育過程中尾的消失屬于細胞凋亡現象;細胞凋亡是受基因控制的編程性死亡過程。
5.下列有關細胞分化、衰老及凋亡的敘述，不正確的是()
A.細胞分化能使細胞中細胞器的種類和數量發生改變
B.衰老細胞會出現線粒體減少、酶活性降低及細胞核變大等現象
C.細胞分化發生在胚胎期，細胞衰老與凋亡發生在老年期
D.被病原體感染的細胞的清除是通過細胞凋亡完成的
答案 C
解析 細胞分化是生物個體發育中，由一個或一種細胞增殖產生的后代，在形態、結構和生理功能上發生穩定性差異的過程。細胞分化使細胞中細胞器的種類和數量發生改變。細胞的衰老與凋亡發生在生物個體生長發育的各個時期。
6.為探究物質P抑制癌細胞增殖的效應，研究人員使用不同濃度的物質P處理人的離體肝癌細胞，實驗結果如圖所示。下列相關敘述正確的是()
A.隨著物質P濃度的增加，促進腫瘤細胞凋亡的作用越明顯，但與處理時間無關
B.隨著物質P處理時間的延長，抑制癌細胞增殖的作用越明顯，但與濃度無關
C.物質P對腫瘤細胞的作用機制，可能與調控細胞凋亡相關基因的表達有關
D.通過本實驗可以得出結論，物質P抑制癌細胞增殖的最適濃度為1.00 g/L
答案 C
解析 分析圖中曲線可知，物質P的濃度和處理時間影響抑制率，A、B錯誤;從實驗的結果看，該藥物可以有效地抑制癌細胞增殖，其作用機理很可能是調控了癌細胞內凋亡基因的表達，使癌細胞進入編程性死亡的程序，C正確;本實驗只是設置了物質P的部分濃度，雖然在1.00 g/L時抑制效果較另兩組好，但不能確定該濃度為最適濃度，D錯誤。
7. 2012年諾貝爾生理學或醫學獎授予了在細胞核重編程研究領域作出杰出貢獻的英國和日本的兩位生物學家。所謂“細胞核重編程”即將人類成熟的體細胞重新誘導回干細胞狀態，它們就有再分化形成多種類型的細胞的可能，可應用于臨床醫學。下列有關敘述錯誤的是()
A.細胞核重編程與細胞內基因的選擇性表達密切相關
B.該項研究為臨床上解決器官移植的排斥反應帶來希望
C.“動物細胞的分化是一個不可逆的過程”將可能被改寫
D.他們的實驗驗證了動物細胞的全能性
答案 D
解析 根據題意，細胞核重編程是指將人類成熟的體細胞重新誘導回干細胞狀態，該過程與細胞內基因的選擇性表達有密切關系，A正確;臨床醫學上利用該研究可以解決器官移植中的排斥反應問題，B正確;利用細胞核重編程技術可以使已經分化了的動物細胞重新回到干細胞狀態，C正確;干細胞可以分化成多種類型的細胞，體現了干細胞發育的全能性，D錯誤。
8.科學家研究發現，人與其他哺乳動物一樣，體內也存在一種被稱為“ISL1”的心臟祖細胞，它可以分化為心肌、血管等特定類型的細胞。下列有關心臟祖細胞的說法，錯誤的是()
A.心臟祖細胞分化程度比心肌細胞的低
B.心臟祖細胞的分化性能比胚胎干細胞的低
C.心臟祖細胞與心肌細胞的核遺傳信息相同
D.心臟祖細胞與造血干細胞形態結構不同的直接原因是mRNA不同
答案 D
解析 心肌細胞是由心臟祖細胞分化而來的，可見心臟祖細胞的分化程度比心肌細胞的低，A項正確。胚胎干細胞具有發育的全能性，故心臟祖細胞的分化性能比胚胎干細胞的低，B項正確。同一個體的不同體細胞都是由同一個細胞(受精卵)分裂、分化形成的，故含有相同的遺傳信息，C項正確。心臟祖細胞與造血干細胞形態結構不同的直接原因是蛋白質不同，根本原因才是mRNA不同，D項錯誤。
9.下列有關細胞生命歷程的說法，正確的是()
A.進行有絲分裂的細胞中一定存在同源染色體
B.細胞凋亡受基因控制，細胞癌變不受基因控制
C.白化病患者由于細胞衰老，酪氨酸酶活性降低而頭發變白
D.將胡蘿卜韌皮部細胞培養成植株的過程體現了植物細胞的全能性
答案 D
解析 單倍體生物進行有絲分裂的細胞不一定含有同源染色體，如含有一個染色體組的單倍體;細胞凋亡受基因控制，細胞癌變是由于原癌基因和抑癌基因發生突變造成的，也受基因控制;白化病產生的根本原因是基因突變，頭發變白是由于其體內缺少酪氨酸酶，最終轉化成的黑色素少;將胡蘿卜韌皮部細胞培育成完整植株的過程體現了植物細胞的全能性。
10.如圖為人體細胞的分裂、分化、衰老和死亡過程的示意圖，圖中①～⑥為各個時期的細胞，a～c表示細胞所進行的生理過程。據圖分析，下列敘述正確的是()
A.與①相比，②的表面積與體積的比值增大，與外界環境進行物質交換的能力增強
B.⑤與⑥的基因型相同，蛋白質的種類也相同
C.若⑤⑥已失去分裂能力，則其細胞內遺傳信息的流動方向為DNARNA蛋白質
D.細胞衰老與死亡就會引起個體衰老與死亡
答案 C
解析?、诒娶俚捏w積大，細胞體積越大，細胞的表面積與體積之比越小，與外界環境進行物質交換的能力越弱;⑤和⑥細胞是由同一細胞經有絲分裂形成的，它們所含有的遺傳物質相同，因此基因型相同，但由于這兩種細胞是細胞分化形成的，它們基因表達的情況有差異，因此，蛋白質種類有差異;若⑤⑥細胞失去分裂能力，則細胞中沒有DNA復制過程，但有基因的表達過程，遺傳信息流動的方向為DNARNA蛋白質;多細胞生物中細胞的衰老與死亡和個體的衰老與死亡不一定是同步的。
11.下列關于細胞生命活動的敘述，不正確的是()
A.不同細胞中處于關閉狀態的基因一般不同
B.細胞普遍衰老與個體衰老存在因果關系
C.通過細胞凋亡可完成細胞的自然更新
D.霉變的食品易導致基因突變而產生原癌基因
答案 D
解析 細胞分化與基因的選擇性表達有關，因此不同的細胞處于關閉狀態的基因一般不同;細胞的普遍衰老引起個體的衰老;通過細胞凋亡可完成細胞的自然更新;原癌基因是細胞中原本就含有的，不是由基因突變產生的。
12.正常干細胞和腫瘤干細胞都具有增殖、轉移的能力，但二者在細胞增殖、分化潛能和細胞遷移等行為上又存在明顯的差異。下列相關敘述中，合理的是()
A.正常干細胞的增殖過程受基因調控，腫瘤干細胞的增殖過程不受基因調控
B.正常干細胞只能遷移到特定組織，而腫瘤干細胞可遷移到很多部位
C.二者都失去了正常分化的能力
D.二者的遺傳信息都沒有發生改變
答案 B
解析 正常干細胞和腫瘤干細胞的增殖都受基因調控，A項錯誤;正常干細胞只能遷移到特定組織并分化為特定的細胞，而腫瘤干細胞不受限制，易擴散轉移，B項正確;正常干細胞具有分化能力，腫瘤干細胞則不能完成正常的分化，C項錯誤;腫瘤干細胞的遺傳信息發生了改變，D項錯誤。
13.變形蟲和草履蟲均為單細胞真核生物，二者在形態、結構和生理功能上存在較大差異(設為甲組);同一高等植物上的葉肉細胞和根毛細胞在形態、結構和生理功能上也存在較大差異(設為乙組)。下列關于兩組不同細胞間存在較大差異的根本原因的敘述中，正確的是()
A.兩組均是因為遺傳物質不同
B.兩組均是因為處于表達狀態的基因不同
C.甲組是因為遺傳物質不同，乙組是因為處于表達狀態的基因不同
D.甲組是因為處于表達狀態的基因不同，乙組是因為遺傳物質不同
答案 C
解析 變形蟲和草履蟲屬于兩種生物，二者的遺傳物質不同;同一植株上的葉肉細胞和根毛細胞是由一個受精卵經有絲分裂、分化得到的，二者的遺傳物質相同，但處于表達狀態的基因存在差異。
14.細胞的生命歷程與人的生命歷程相似，都可分為生長、發育、衰老和死亡等階段，下列關于細胞生命歷程的敘述，正確的是()
A.細胞衰老的過程與基因無關
B.只要不接觸致癌因子，就不會發生細胞癌變
C.經過分化的細胞一定不具有細胞分裂能力
D.效應T細胞使靶細胞死亡，屬于細胞凋亡
答案 D
解析 細胞分裂、細胞分化、細胞衰老、細胞凋亡和細胞癌變都受基因調控，A項錯誤;細胞癌變的內因是原癌基因和抑癌基因突變，外因是致癌因子誘導，不接觸致癌因子的細胞也可能會發生癌變，B項錯誤;經過分化的細胞不一定就不具有分裂能力，如B細胞是經過分化的細胞，但它還能增殖、分化，C項錯誤;被病原體感染的細胞的清除是通過細胞凋亡完成的，D項正確。
15.脊椎動物的神經系統在發育過程中，約有50%的細胞凋亡。發育中神經細胞數量的調節示意圖如圖所示。下列說法錯誤的是()
A.在發育過程中產生的神經細胞一般是過量的
B.神經細胞能夠存活下來可能與獲得足夠的生長因子有關
C.細胞凋亡能夠調節細胞的數量
D.神經細胞的死亡與生長因子的數量有關，與基因表達無關
答案 D
解析 由題意可知，正常存活下來的神經細胞只有一半，因此發育過程中產生的神經細胞一般是過量的。細胞凋亡是基因決定的細胞自動結束生命的過程，因此與基因的表達有關。
16.某科研小組開展了人白細胞介素18(IL18)對核輻射誘導小鼠脾細胞凋亡的抑制作用的研究。
實驗原理：機體的免疫系統對核輻射損傷很敏感，主要表現在核輻射會誘導免疫細胞凋亡。
實驗步驟：
①選取若干實驗小鼠，隨機均分成甲、乙、丙三組;
②甲組無輻射損傷;乙組輻射損傷(60Co照射，下同);丙組先輻射損傷，1天后注射IL18。
③14天后分別取各組小鼠脾細胞進行體外培養，在培養了0 h、12 h、24 h、48 h后，檢測并計算細胞凋亡相對值。
(1)脾屬于機體免疫系統的____________，IL18是一種淋巴因子，由________細胞分泌;淋巴因子與____________都屬于免疫活性物質。
(2)細胞凋亡是由遺傳機制決定的________________死亡，與細胞凋亡直接相關的細胞器是________。
(3)設置甲、乙兩組的目的是探究有無核輻射對細胞凋亡的影響。設置乙、丙兩組的目的是__________________________________。請設計實驗結果記錄表。
(
4)科研小組還設置了丁組實驗，方法是先注射IL18,3天后進行輻射損傷，14天后的實驗操作同前三組，與丙組相比，設置丁組的目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)免疫器官 T 抗體(或溶菌酶) (2)編程性(程序性) 溶酶體 (3)探究有無注射IL18對細胞凋亡的影響
表格如下：
組別 細胞凋亡相對值0 h 12 h 24 h 48 h 甲 乙 丙 (4)探究核輻射前、后注射IL18對細胞凋亡的影響
解析 (1)免疫系統是由免疫器官、免疫細胞和免疫活性物質組成的，脾屬于免疫器官，而白細胞介素是由T細胞分泌的一種淋巴因子，白細胞介素和抗體都屬于免疫活性物質。(2)細胞凋亡是由基因所決定的細胞自動結束生命的過程，與其直接有關的細胞器是溶酶體。(3)根據實驗所遵循的單一變量原則，可以看出乙丙組對照，自變量是有無注射IL18，從而探究有無注射IL18對細胞凋亡的影響。(4)設計丁組實驗和丙組形成對照，進一步探究核輻射前、后注射IL18對細胞凋亡的影響。
17.如圖表示造血干細胞的發育途徑，請據圖回答下列問題。
(1)造血干細胞A進行自我更新的過程需要進行________和有關蛋白質的合成。
(2)與細胞C凋亡有關的細胞器主要是________，細胞D和細胞E不同的根本原因是______________________。
(3)在免疫的三道防線中，細胞E參與________________防線。在細胞D參與的免疫過程中，細胞D由__________________________分化而來，細胞E在此免疫過程中的作用是________________________。
細胞分化范文4
【關鍵詞】 骨髓間充質干細胞 細胞培養 丹酚酸B 心肌細胞
0引言
當前，細胞移植作為一項極具開創性意義的治療方法及技術用于改善心功能及心肌活力已受到廣泛關注. 骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells， MSCs)存在于骨髓基質中，由于MSCs取材方便、操作簡單、增殖能力強，且具有干細胞的多向分化潛能，可被誘導成為間充質來源的多種成體細胞［1-3］等特點，被稱為是組織工程最具應用前景的一種干細胞，將MSCs誘導分化為心肌細胞來修復死亡的心肌組織，具有一定的臨床意義.
MSCs向心肌細胞定向分化需要一定的誘發因素. 體外研究大多學者都使用5氮胞苷（5 Azacytidine，5aza）作為誘導劑對MSCs進行誘導分化為心肌細胞. 然而作為一種白血病化療藥物，5aza會殘留在細胞DNA中［4］，因此誘導后的移植細胞潛在的生物安全性令人擔憂. 而中藥具有臨床應用安全和長期有效的特點，許多中藥制劑、單味中藥及中藥單體都具有誘導細胞分化成分. 丹酚酸B是丹參水溶性成分中最主要的活性成分，具有和一些誘導劑（如β巰基乙醇、DMSO）相似的抗氧化作用，因此開展丹酚酸B誘導MSCs分化有一定的開創性.
1材料和方法
1.1材料實驗動物：SD大鼠，雄性，體質量90~100 g，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供. 主要試劑：DMEM培養基（GBICO/BRL），胎牛血清（奧地利PAA），丹酚酸B（廣州市藥檢所，標準品），5aza(Sigma)，兔抗大鼠CD44多抗（博士德），兔抗大鼠CD34多抗（博士德），CY3標記的羊抗兔IgG（博士德），Hoechst33342 (Sigma)，AllPrep RNA/Protein Kit（Qiagen），OneStep RTPCR Kit（Qiagen）.
1.2方法
1.2.1MSCs分離、培養無菌條件下取大鼠股骨，以含150 mL/L胎牛血清的DMEM 培養液沖洗髓腔，以5×109個/L接種. 當細胞接近80%鋪滿瓶底后，以2.0×108個/L細胞的密度接種于傳代培養瓶中進行擴增培養. 取第3代的MSCs進行實驗.
1.2.2MSCs鑒定
1.2.2.1形態學鑒定相差顯微鏡下觀察細胞形態，拍照.
1.2.2.2免疫熒光鑒定MSCs種于蓋玻片上，步驟如下：多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗3次，每次3 min. 加入含5 mL/L Triton X100和50 mL/L BSA的 PBS， 30 min后用PBS洗3次，每次3 min. 加一抗兔抗大鼠CD44（1∶100）， 兔抗大鼠CD34（1∶100）多克隆抗體，各100 μL，放入濕盒內4℃過夜. 用PBS 沖洗3次，每次5 min. 加入熒光二抗Cy3IgG（1∶100），室溫下避光孵育30 min后，用PBS沖洗3次，每次5 min. 加10 mg/L的Hoechst 33342溶液，放入濕盒內37℃避光孵育10 min. PBS清洗3次，每次3 min. 在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照. 對照片滴加PBS代替一抗，其余相同.
1.2.3丹酚酸B誘導MSCs向心肌樣細胞分化將對數生長期的P3 MSCs以2.0×108個/L接種于6孔板內，每孔1 mL. 待細胞生長至亞融合狀態（約第3日），將細胞分為3組，每組8個孔. A組細胞用MSCs完全培養基、B組細胞用終濃度為5 μmoL/L的5aza培養基、C組細胞用含丹酚酸B 30 mg/L的培養基共同培育24 h后，吸棄培養基，用PBS清洗3次，加入MSCs完全培養基繼續培養. 分別在誘導1，7，14和21 d后收集細胞，提取細胞總RNA，檢測濃度后進行RTPCR檢測NKX2.5， GATA4， αactin mRNA的表達.
提取總RNA作為模板，經電泳鑒定其完整性后，利用紫外分光光度計測定A260與A280的比值，并計算其濃度. 設βactin為內參照. 取40 mg/L的RNA，反應體系為25 μL，循環參數：95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，共33循環進行RTPCR. 取5 μL RTPCR產物，經20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，利用凝膠成像系統掃描分析NKX2.5， GATA4， αactin基因與內參βactin的光吸收比值. 進行3次獨立實驗. RTPCR引物用primer premier 5.0軟件設計，序列為Nkx2.5的上游引物CAGAACCGCCGCTACAAG，下游引物AGTCCCCGACGCCAAAGT，預期大小325 bp；GATA4的上游引物CTGTCATCTCACTATGGGCA，下游引物CCAAGTCCGAGCAGGAATTT，預期大小257 bp；αactin的上游引物GGAGAACCACAGGCATTG，下游引物CATCGGGAAGTTCGTAGC，預期大小297 bp；βactin的上游引物AGAGGGAAATCGTGCGTGAC，下游引物AGGAGCCAGGCAGTAATC，預期大小353 bp.
統計學處理：實驗數據用SPSS 13.0統計軟件進行處理，均數間比較使用單因素方差分析及LSDt檢驗，方差不齊用秩和檢驗.
2結果
2.1細胞形態觀察原代培養1 d后， 可見MSCs呈長梭形貼壁生長并散在分布(圖1A)， 7 d后， >80%的細胞克隆融合， 可傳代. 傳代后， MSCs在2 h內貼壁生長， 無潛伏期， 克隆狀增殖， 細胞形態較一致， 多為長梭形， 呈“旋渦”樣生長(圖1B)， 5~6 d可再傳代.
2.2免疫熒光鑒定MSCs細胞呈CD44陽性，見胞質呈紅色（CY3），胞核呈藍色（Hoechst33342）（圖1C）；而CD34呈陰性，胞質未見紅色，僅見胞核呈藍色（圖1D），陰性對照片也僅見藍色的胞核.
2.3誘導后細胞形態的變化細胞誘導前呈長梭形（圖2A），30 mg/L的丹酚酸B誘導1 wk后，形態逐漸發生變化，細胞體積增大，呈球形或棒狀（圖2B），誘導14 d左右細胞相互融合，形成肌管樣結構（圖2C），誘導21 d肌管樣結構明顯增多，部分細胞聚集，形成一個球形的聚集物（圖2D）. 5aza組的細胞的變化過程和丹酚酸B組相似.
2.4丹酚酸B誘導MSCs向心肌樣細胞分化過程中相關基因表達的變化RTPCR擴增基因片段后，20 g/L瓊脂糖凝膠檢測到NKX2.5和GATA4 mRNAA: 原代培養1 dMSCs ×200; B: 傳代MSCs ×200; C: CD44陽性×1000; D: CD34陰性×1000.表1NKX2.5 mRNA的RTPCR產物的相對光密度值
3討論
現在還沒有發現MSCs的特異表面分子［5-6］. 目前認為MSCs表達SH2， SH3， SH4， CD9， CD10， CD29， CD44， CD51， CD54， CD58， CD59， CD61， CD62， CD80， CD90， CD102， CD106， CD120， CD121， CD123， CD126， CD127， CD140， CD147， CD166，但它不表達造血譜系特異的表面分子，如CD14， CD34， CD38， CD45等. 實驗通過多次傳代純化MSCs，并通過免疫熒光法檢測了第3代MSCs的CD44和CD34，結果顯示CD44呈陽性，而CD34呈陰性，進而鑒定了MSCs.表2GATA4 mRNA的RTPCR產物的相對光密度值
轉貼于 發生生物學的研究表明NKX2.5， GATA4等心肌細胞特異性的基因在心肌發生中扮演重要角色，是胚胎干細胞向心肌細胞分化的重要啟動基因［7-10］. NKX2.5基因在心肌細胞分化前就開始表達，是心臟發生中最早表達的轉錄因子，心臟前體細胞分化的最早標志物. GATA4基因也是心臟前體細胞的最早期標志之一，調節心肌細胞的發生、分化及心臟前體細胞形成線狀心管. 本實驗發現，NKX2.5， GATA4基因在誘導前有不同程度的弱表達，可能是因為這些基因在體內各組織器官表達的廣泛性. 這些基因在誘導后1 d表達開始增強，7 d時達高峰，誘導后7 d MSCs形態即發生變化，14 d時心肌細胞重要結構蛋白αactin顯著表達，開始具有心肌細胞的表型. 在丹酚酸B誘導MSCs分化為心肌細胞的過程中推測丹酚酸B促進了這兩個基因的表達，從而促進心肌細胞結構蛋白的表達.
丹酚酸B的誘導骨髓MSCs分化心肌細胞機制目前尚未清楚. 推測，丹酚酸B在誘導MSCs轉變為心肌樣細胞中的作用估計與其影響心肌細胞相關調控基因(包括GATA4， NKX2.5)和(或)改變骨髓基質微環境，分泌某些細胞誘導因子有關，但確切機制尚有待于進一步探討. 而MSCs的分化機制研究是當前MSCs研究的重點和難點，如果在該方面取得突破性進展，將對MSCs的臨床應用產生深遠的影響.
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細胞分化范文5
骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有在體內及體外向神經細胞分化的潛能，為多種神經系統疾病的細胞治療提供了新的思路。開展中藥定向誘導間充質干細胞向神經細胞分化研究，可望為今后臨床神經細胞移植提供安全有效的誘導分化劑，也可為中醫藥在間充質干細胞領域的應用開辟新的途徑。
【關鍵詞】 間充質干細胞 神經細胞 中藥
【Abstract】 The mesenchymal stem cells（MSCs），have the potential on the differentiating intoneuron both in vivo and in vitro.It offers new methods of cell treatment on several kinds of neural diseases.Developing the Chinese herbal medicine study on that MSCs are directional induced differentiationinto neuron，hope it can offer secure and effective inducibledifferentiation pharmaceuticaldosage form on clinicalneurontransplant，also hope it can find new approach on herb application in MSCs territory.
【Key words】 mesenchymal stem cells; neuron; Chinese herbal medicine
近年來，隨著干細胞治療的研究進展，骨髓間質干細胞（mesenchymal stemcells，MSCs)在神經系統疾病中的治療作用，越來越被人們所重視。由于成年哺乳動物神經元損傷后無法再生，而骨髓間質干細胞具有多向分化能力，可以分化為神經細胞，故在神經元受損如腦梗死等疾病的治療中具有一定的療效，而傳統中藥作為誘導分化劑具有價廉、安全的優點，可望成為今后臨床神經細胞移植安全有效的誘導分化劑，因此為臨床神經系統損傷疾病的治療以及新藥的開發提供理論基礎。
1 骨髓間質干細胞
1.1 定義 骨髓包括基質系統和造血系統，基質系統含有非造血組織的干細胞，它來源于中胚層的未分化的間充質細胞，具有能夠分化形成至少7種組織細胞，因其有向中胚層和神經外胚層來源的多種組織細胞分化的能力，如骨、軟骨、脂肪、纖維組織和骨髓支持基質等多種間充質組織，因而被稱為骨髓基質干細胞(MSCs)或骨髓間充質干細胞［1］。
1.2 來源 MSCs作為一種組織干細胞存在于多種組織中，不僅存在于骨髓、臍血和外周血中［2］，還存在于軟骨膜、骨膜、肌肉［3］、脂肪以及骨小梁中［4］。目前研究較多的是骨髓來源的MSCs，骨髓基質是MSCs最重要的來源。目前MSCs的試驗研究多取材于大鼠、小鼠，少數還有兔子、猴、狗、羊及成人、胎兒等。
2 MSCs誘導成神經細胞的相關檢測指標
目前鑒定神經細胞多用免疫組化和RT-PCR法檢測神經絲蛋白（NF-M）、神經元特異性烯醇化酶（NSE）、神經元特異性核蛋白(NeuN)［5］、巢蛋白（nestin）［6］、微管聯合蛋白-2（MAP-2）、生長相關蛋白-43（GAP-43）［7］、膠質纖維酸性蛋白（GFAP）［8］等的表達。
3 國內外誘導MSCs向神經細胞分化的研究現狀
近年來神經干細胞的發現和研究，對中樞神經細胞是不能再生的傳統理論提出了挑戰。Kopen、Brazel-ton等發現MSCs注射到新生小鼠腦內可分化為神經元和神經膠質細胞［9，10］。由此為神經系統的多種難治性疾病開辟了一條新的細胞替代療法。雖然Woodbury等在體外用經β-巰基乙醇誘導MSCs分化的神經元樣細胞雖然速度快、誘導分化率高，但神經元樣細胞成活時間很短，臨床實際應用價值不大［5，11］。目前中醫藥在這方面的研究有了新的進展，中醫藥素有滋陰補陽、強身壯體、增智健腦、抗衰老和調節免疫功能之功效，自2001年項鵬、夏文杰［12］等首次報道將成人MSCs用堿性成纖維生長因子(bFGF)預誘導，再用復方丹參注射液誘導，發現MSCs在誘導后，類似神經元形態，結果與硫代甘油對照組相似，但細胞存活時間較久。此后中藥對MSCs的定向誘導分化作用引起了關注。近年來研究發現，中藥丹參、麝香多肽、川芎嗪、三七總皂甙、黃芪、天麻、人參、當歸、地黃多糖以及中藥丹參聯合神經生長因子等均可誘導MSCs定向分化為神經元樣細胞，銀杏內脂B也可促進成年大鼠神經干細胞向神經元分化。并且發現利用麝香多肽在體外將MSCs定向誘導分化為神經前體細胞后，再將此類MSCs源性的神經前體細胞植入橫斷性脊髓損傷大鼠模型和帕金森病大鼠模型中，發現此類細胞不但可在宿主體內成活、遷移，還能與宿主的相應組織發生整合，植入此類細胞還可促進宿主的神經再生，大大改善宿主的癥狀，使宿主的神經功能得以較大程度的恢復［12～18］。但神經干細胞需要在腦組織中獲取，在人體中該項研究受到極大限制。骨髓間充質干細胞(MSCs)體內及體外具有向神經細胞分化的潛能，為多種神經系統疾病的細胞治療提供了新的思路。近年來國內學者嘗試應用中藥體外誘導間充質干細胞定向分化為神經細胞，可望為中醫藥在間充質干細胞領域的研究和應用開辟新的途徑。
4 研究中藥誘導MSCs向神經細胞分化的意義
4.1 研究MSCs的意義 雖然有學者應用神經干細胞、胚胎干細胞移植在治療腦梗死等神經系統損傷性疾病中取得了一定的療效，但若開展MSCs移植卻有著更為明顯的優勢，特別是因MSCs來源廣，取材容易，對機體損傷小，利用患者本人的骨髓獲取的MSCs完全是自身遺傳背景，可避免免疫排斥反應，并且無倫理學方面的困擾，更易于臨床應用。因此，在中樞神經系統的細胞治療中，MSCs是很好的細胞來源。
4.2 研究應用中藥誘導的意義 MSCs體外向神經細胞分化，國外研究較多使用β-巰基乙醇、二甲基亞砜、硫代甘油等作為誘導劑，但這些化學制劑均有一定毒性，不能應用于人體內。利用經臨床驗證的傳統中藥作為誘導分化劑具有價廉、安全的優點，可望成為今后臨床神經細胞移植安全有效的誘導分化劑。
5 MSCs在中樞神經系統疾病治療中的應用
許多學者將MSCs移植進一些神經系統疾病動物模型中，如：遺傳性脫髓鞘性神經病、腦卒中、腦外傷等，觀察其治療效果，以期探索一條治療CNS疾病的新途徑［19］。
如MSCs對Parkinson疾病的治療，侯玲玲等［20］用實驗證明了骨髓MSCs有望成為治療PD 的種子細胞。MSCs對脫髓鞘性神經病的治療，Sasaki M 等［21］也通過實驗表明體內MSCs能分化成髓磷脂形成細胞并修補脫髓鞘的CNS。以及MSCs對腦中風疾病和對CNS外傷的治療都表明MSCs在中樞神經系統疾病的治療中有著廣闊的應用前景。
轉貼于 6 存在的問題
（1）MSCs分化成神經細胞的機制尚不清楚。目前已報道的用于誘導MSCs向神經細胞分化的中藥大部分和β-巰基乙醇有共同之處，即抗氧化作用，推測它們的誘導機制可能與其抗氧化作用有關，但確切機制仍需要進一步探討。（2）迄今尚沒有一位研究者成功地誘導MSCs定向分化為某一種有功能的特定類型神經元，如DA 神經元。進一步解決如何控制MSCs向神經元方向定向分化，延長神經元的存活時間等問題，將有助于中樞神經系統損傷和退行性疾病的治療。（3）中藥誘導MSCs向神經細胞分化研究中，已證實一些中藥具有在體外誘導MSCs向神經樣細胞分化的作用，但在動物模型中，移植MSCs并同時應用這些中藥誘導，能否增加MSCs分化為神經樣細胞的陽性轉化率。促進新生神經元存活；能否更有效的刺激宿主細胞分泌神經營養因子，促進神經損傷功能恢復；體外用這些中藥誘導出的神經元尚未觀察到遞質的表達，如何才能誘導出具有合成和分泌神經遞質功能的神經元；體外用這些中藥從MSCs誘導分化形成的神經樣細胞，用于動物體內是否具有神經樣細胞的功能，仍需要進一步探索［22］。（4）還有姚曉黎等觀察到參芪液在誘導hMSC分化為神經元樣細胞的過程中，去除參芪液，觀察到神經元樣細胞又恢復為hMSC的外形，呈現寬大扁平或長梭形?；驒z測顯示逆轉化的細胞基因表達與未分化hMSC相似。因此得出結論：參芪液可以促進hMSC分化為神經元樣細胞，誘導分化過程可以出現逆轉化現象［23］。此例可提示在用中藥誘導MSCs向神經細胞分化過程中，誘導時間的長短也是個關鍵的因素，還有待進一步摸索。
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細胞分化范文6
【摘要】 目的: 研究人核遷移蛋C（hNUDC）促進人臍血來源的CD34+細胞增殖、 分化為巨核細胞的作用。方法: 使用Dynal CD34體外分離系統收集人臍血CD34+細胞， 無血清甲基纖維素半固體法體外培養CD34+細胞12 d后， 顯微鏡下觀察hNUDC對CD34+細胞分化增殖為小、 中、 大巨核細胞集落的形態、 數目的影響; 無血清液體培養體系培養CD34+細胞10 d后， 流式細胞術檢測hNUDC對CD34+細胞分化增殖為CD41+細胞的表達率及其DNA倍性的影響。結果: hNUDC能夠明顯促進CD34+細胞分化增殖形成中小型CFUMK集落， 可顯著增加巨核細胞表面標志物CD41+的表達， CD41+細胞中DNA倍性顯著地高于血小板生成素。結論: hNUDC對促進造血干細胞增殖和分化為巨核細胞具有重要作用。
【關鍵詞】 人核遷移蛋白; 巨核細胞; DNA倍性
［Abstract］ AIM: To study the effect of human nuclear distribution C （hNUDC） on human megakaryocyte proliferation and differentiation from cord blood CD34+ cells in vitro. METHODS: Human CD34+ cells were isolated using the Dynal CD34 Progenitor Cell Selection System from umbilical cord blood. The CD34+ cells were then cultured in serum free methylcellulose semisolid media， the morphologic aspects and number of small， medium and large CFUMK colonies were observed and scored on the day12 by microscopy analysis. The CD34+ cells were cultured in serum free liquid media， cells were removed on day 10 and formation of CD41+ in human megakaryocyte and its DNA polyploidization of nuclear were analyzed on a FACsort flowcytometer. RESULTS: hNUDC supported the formation of small and medium CFUMK colony in serum free semisolid media. Furthermore， hNUDC induced a remarkable increase in expression of the megakaryocyte cell surface marker CD41+ and stimulated the CD41+ DNA polyploidization more effectively than TPO. CONCLUSION: hNUDC may play an important role in megakaryocyte proliferation and differentiation.
［Keywords］hNUDC; Megacaryocyte; DNA polyploidization
［摘 要］ 目的: 研究人核遷移蛋C（hNUDC）促進人臍血來源的CD34+細胞增殖、 分化為巨核細胞的作用。方法: 使用Dynal CD34體外分離系統收集人臍血CD34+細胞， 無血清甲基纖維素半固體法體外培養CD34+細胞12 d后， 顯微鏡下觀察hNUDC對CD34+細胞分化增殖為小、 中、 大巨核細胞集落的形態、 數目的影響; 無血清液體培養體系培養CD34+細胞10 d后， 流式細胞術檢測hNUDC對CD34+細胞分化增殖為CD41+細胞的表達率及其DNA倍性的影響。結果: hNUDC能夠明顯促進CD34+細胞分化增殖形成中小型CFUMK集落， 可顯著增加巨核細胞表面標志物CD41+的表達， CD41+細胞中DNA倍性顯著地高于血小板生成素。結論: hNUDC對促進造血干細胞增殖和分化為巨核細胞具有重要作用。
［關鍵詞］人核遷移蛋白; 巨核細胞; DNA倍性
血小板生成素（thrombopoietin， TPO）在體外具有調節巨核細胞增殖、 成熟和血小板形成的功能［1］。但研究發現TPO基因敲除小鼠的血小板計數雖然比正常小鼠降低了85%， 但這些小鼠并沒有發生出血現象， 仍具有形態正常的巨核細胞和血小板［2］。因此推測， 很可能存在有其他因子， 與TPO一起參與巨核細胞和血小板生成的調控過程。核遷移蛋白C (nuclear distribution C， NUDC)在核遷移中起著關鍵的作用， NUDC與其家族成員相互作用［3］， 和微管一起參與細胞增殖［4］、 正常的造血、 神經遷移和腦發育。在增生的細胞中可以觀察到NUDC強烈的免疫標記， NUDC的水平在紅系祖細胞中最高， 在正常人骨髓中， 早期骨髓祖細胞和紅系祖細胞中， 人核遷移蛋白C （hNUDC）和mRNA有高水平表達。我們使用重組hNUDC 蛋白， 成功制備了 hNUDC單克隆抗體（mAb）， 前期實驗結果表明， hNUDC 蛋白呈點狀分布于人巨核細胞、 巨核系白血病細胞株Meg01、 Dami的細胞膜與細胞核中， 而且hNUDC可以特異地與血小板生成素受體（Myeloproliferative leukemia， Mpl）特異地結合， 對于小鼠的巨核細胞系和血小板的生成， 具有與TPO類似的生物活性［5］; 表明hNUDC很有可能是巨核細胞增殖分化調控中一個重要的因子。為進一步確證并檢測hNUDC蛋白是否具有參與巨核細胞和血小板生成調控的生物活性， 我們選擇正常人臍帶血的造血干細胞， 在體外實驗觀察hNUDC對造血干細胞增殖、 分化的作用， 為臍血巨核系定向擴增的基礎研究和臨床應用摸索條件， 提供新的研究思路。
1 材料和方法
1.1 材料 Dynal CD34 祖細胞分選系統購自 Dynal Biotech公司; 造血干細胞無血清培養液StemSpan H2000購自Stem Cell Technologies公司; 淋巴細胞分離液購自Amersham Biosciences公司; IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)培養基粉末購自Gibco公司。青霉素和鏈霉素、 rhTPO、 甲基纖維素均購于Sigma公司。FITC標記的抗人CD41抗體、 抗人IgG抗體購于Biolegend公司。
1.2 方法
1.2.1 免疫磁珠分離法體外分離人臍血CD34+ 細胞 每份臍血均取自廣東省造血干細胞庫， 樣品經產婦正式同意后來自足月分娩的胎兒。 臍血平均采集量為50～80 mL， 用分離緩沖液將肝素抗凝的臍血1∶4稀釋， 淋巴細胞分離液 FicollHypaque (JPrep) 水平離心機密度梯度離心， 收集界面層單個核細胞， 用相同體積的分離緩沖液懸浮混勻細胞， 500 g離心20 min; 用分離緩沖液重懸沉淀細胞， 300 g離心20 min; 取沉淀， 將細胞用冰預冷的分離緩沖液重新懸浮至4×1010～4×1011/L， 總體積至少到1 mL。按照Dynal CD34祖細胞分選系統操作說明進行臍血CD34+細胞分選， 得到純化的CD34+細胞， 細胞計數后用流式細胞儀定量分析分離前后樣品中CD34+細胞表達率， 計算純度和回收率。
1.2.2 hNUDC蛋白的表達、 純化以及實驗分組設計 hNUDC蛋白的表達、 純化的具體方法參考文獻［5］。實驗設正常對照組、 TPO 陽性對照組（終濃度為50 μg/L）和 hNUDC 蛋白不同濃度組（終濃度為 50、 100、 500 μg/L）。正常對照組為 pET28大腸桿菌表達系統空載體， 經過與表達 hNUDC 和組氨酸親和柱純化hNUDC相同的處理過程， 最后溶解于含1 g/L BSA 的 PBS 緩沖溶液中。
1.2.3 hNUDC對CFUMK集落形成的影響 使用9 g/L甲基纖維素無血清半固體培養， 每毫升培養體系為含5×103個CD34+細胞、 常規劑量鏈/青霉素以及各種濃度的rhTPO 或hNUDC蛋白， 接種在35 mm 培養皿， 每組重復3個培養皿， 每個培養皿1.5 mL。置37℃、 50 mL/L CO2飽和濕度的孵育箱中培養12 d后計算CFUMK集落數， 根據每個CFUMK集落中包括的巨核細胞數目， 將CFUMK集落分為3類。(1)CFUMK小集落（small CFUMK colony）: 包括3～20個巨核細胞; (2)CFUMK中集落（medium CFUMK colony）: 包括21～49個巨核細胞; (3)CFUMK大集落（large CFUMK colony）: 包括≥50個巨核細胞。倒置顯微鏡下分別計算大、 中、 小集落數。本實驗重復3次。
1.2.4 hNUDC對CD41+細胞陽性表達率的影響 5 mL的無血清培養液體系中含1×104人臍帶血CD34+細胞， 無血清培養基StemSpan H2000， 不同濃度的hNUDC蛋白、 TPO和相同體積的對照液體PBS。 37℃、 50 mL/L CO2條件下培養， 每3～4 d半量換液1 次。培養10 d后收集細胞， 用PBS緩沖液洗3次后， 加入FITC標記的抗人CD41抗體， 同時用FITC標記的抗人IgG抗體作為陰性對照， 4℃孵育30 min， 用PBS緩沖液洗3次后， 用-20℃預冷的乙醇固定細胞， 采用雙色FACSVantage流式細胞儀定量分析CD41+細胞陽性表達率。
1.2.5 hNUDC對CD41+細胞的DNA含量和倍性的影響 細胞收集與標記方法同上， 用-20℃ 預冷的乙醇固定細胞并透膜后， PI (propidium iodide)染色， 采用雙色FACSVantage流式細胞儀定量分析CD41+細胞的DNA含量和倍性。
1.2.6 動態觀察臍血CD34+細胞液體培養體系中 CD41+細胞形態和數目 倒置顯微鏡下， 在培養第7、 10天動態觀察hNUDC與TPO對CD34+造血干細胞形態學的影響。培養第10天收集培養的細胞進行吉姆薩染色觀察。
1.2.7 統計學分析 實驗數據以x±s表示， 所有數據均采用SPSS/PC11.5軟件分析， 統計方法為單因素方差分析LSD法， 其中CD41+細胞的表達率及其DNA含量的比較先行平方根反正弦變換（Y=arcsinx ）變換， 以P
2 結果
2.1 體外分離臍血單個核細胞和CD34+細胞 每次采集的抗凝處理后臍血在40～ 60 mL之間， 經淋巴細胞分離液離心分離單個核細胞。去黏附細胞后得(0.98±0.33)×108的單個核細胞 ［(0. 7～1. 3)×108 ］， CD34 +細胞比例為(1.20±0.33)% ［(0. 8～1. 7)%］。流式細胞術測定分離前后樣品中CD34+百分含量分別為3.2%和95.3%。本次實驗中應用的免疫磁珠分離系統一次吸附過濾的CD34+干細胞的平均純度達到88%。從1×108個界面細胞， 平均可以分離獲得1×106 CD34+干細胞。
2.2 hNUDC對CD34+細胞增殖分化為CFUMK集落的作用 對照組只有小型CFUMK集落生長， hNUDC在50 μg/L時即能促進CFUMK小集落生長， 與對照組比較差異有統計學意義(P
2.3 hNUDC對CD34+細胞分化為CD41+細胞的作用 人臍帶血CD34+細胞與不同劑量組的hNUDC液體培養10 d后， 對照組CD41+細胞百分含量僅為5.43%; 50 μg/L和100 μg/L劑量的hNUDC組的CD41+細胞百分含量分別34.03%和43.56%， 明顯高于對照組 (P
2.4 hNUDC對CD41+細胞DNA倍性的作用 單獨經過50 μg/L和 100 μg/L hNUDC培養后細胞的DNA含量明顯高于對照組 (P
2.5 hNUDC培養不同時間對CD41+細胞形態的作用 使用hNUDC蛋白單獨培養人臍帶血CD34+細胞后的第7天， 可以觀察到許多“巨大細胞”形態的巨核細胞， 在第10天達到最多， 大部分細胞成為成熟巨核細胞， 部分細胞還伴隨有前血小板的形成。100 μg/L hNUDC劑量組的效果最好， 500 μg/L hNUDC劑量組的“巨大細胞”數量低于50 μg/L和100 μg/L hNUDC劑量組。TPO單獨使用后， 在第5天就可以觀察到許多“巨大細胞”形態的巨核細胞， 并隨著培養時間延長增多變大。在第10天， 收集各組細胞進行吉姆薩染色 (圖1)， 可見單獨經過100 μg/L hNUDC培養后， 倍性為四倍體、 八倍體的巨核細胞所占比例較多， 并且部分細胞已經進入前血小板狀態。TPO組中的大部分細胞的細胞核為二倍體和四倍體， 進入前血小板狀態的細胞很少見到。對照組中的細胞幾乎全部為不成熟的原始干細胞， 表現為淋巴母細胞樣的祖細胞形態， 細胞核多為深染的單核細胞， 部分為二倍體細胞， 但體積很小。圖1 hNUDC對人CD34+細胞培養10 d后形態學的影響
3 討論
血小板的形成極其復雜， 是多水平調控的生物學過程。包括多潛能造血干細胞向巨核細胞分化、 增殖。在巨核細胞趨于成熟時細胞核經數次分裂成為多倍體， 但胞體不分裂， 在產生血小板之前細胞呈不規則形狀， 細胞伸出細長的微管， 微管的頂端連著突起的胞質， 胞質膨大后脫落即成血小板。這一過程又稱前血小板(proplatelet)生成過程［6］。然而前血小板生成以及血小板釋放的過程目前僅僅是假設， 幾十年來一直是人們關注的課題。TPO是血小板形成中一個最重要的細胞因子［1］， 但是研究表明TPO并不是必不可少［2］， TPO受體mRNA表達量的增加并不受TPO的影響［7］。另有實驗證明， TPO只作用于巨核細胞的增殖及早期成熟時期， 對巨核細胞后期成熟尤其對前血小板的生成沒有明顯的促進作用［8］。本實驗以TPO作為陽性對照， 其結果與以往研究的報導結果一致。
為研究hNUDC促進人臍血來源的CD34+細胞增殖、 分化為巨核細胞的作用， 本實驗在無血清甲基纖維素培養系統中加入不同濃度的hNUDC蛋白， 結果顯示在hNUDC存在條件下， 生長的CFUMK集落主要為包括3～50個巨核細胞的CFUMK 中小集落。而TPO 在 50 μg/L時對大、 中、 小型CFUMK都有明顯的促進生長作用， 主要產生的集落為包括≥50個巨核細胞的CFUMK大集落。一般認為， CFUMK大集落生長來源于較原始的巨核祖細胞， 而中小型的CFUMK集落生長來源于較成熟的巨核祖細胞。我們發現不同劑量組的hNUDC均能促進CFUMK小集落形成， 因此說明hNUDC能夠在體外直接作用于較成熟的巨核祖細胞， 促進巨核祖細胞細胞分化增殖形成集落， 對巨核細胞具有促進增殖和分化的作用。
在無血清液體培養系統中添加hNUDC蛋白， 純化后的CD34+細胞向著巨核系細胞分化， 并表達巨核系細胞特異的表面標志物CD41。隨著CD34+ CD41+巨核系定向祖細胞向成熟的巨核系細胞分化， CD41 抗原表達明顯增加， 并且細胞的DNA含量高于對照組。值得注意的是CD41+細胞的DNA倍性分布中， 二倍體、 四倍體和八倍體的比例與TPO組相近， 但16倍體和32倍體的分布則明顯高于TPO組。吉姆薩染色進一步確證了hNUDC培養后的人臍帶血分化后細胞形態學變化， 巨核細胞倍性增加， 細胞質更加成熟， 其效果明顯優于TPO。
本實驗結果提示， hNUDC對巨核細胞活性的作用可能主要集中于巨核細胞的后期成熟階段， 尤其是巨核細胞的多倍體化與胞質成熟階段或者血小板生成的階段。 hNUDC很可能是促進造血干細胞向巨核系分化及誘導成熟的晚期作用的重要因子。但是對于其重要作用機制以及與其他調控因子的相互作用還需要進一步深入研究。
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