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摘要:間充質干細胞成骨分化能力異常減弱和成骨細胞數量異常下降都會導致生物體內骨代謝紊亂，誘導骨質疏松癥的發生。線粒體在MSC多能性保持和成骨分化過程中具有十分重要的作用，通過能量代謝、抗氧化途徑、代謝相關信號通路、線粒體生物發生、線粒體動力學和線粒體自噬等參與間充質干細胞成骨分化的調控，形成了復雜的調節網絡。本文綜述了MSC成骨分化中線粒體的重要功能和作用，以及部分通過調節線粒體功能發揮抗骨質疏松治療的藥物，為進一步探討間充質干細胞成骨分化功能失調的機制提供新的思路，為臨床治療骨質疏松癥提供新的靶點。
關鍵詞:線粒體;間充質干細胞;成骨細胞;成骨分化
成骨細胞和破骨細胞功能的動態平衡在維持正常骨代謝和骨骼結構中至關重要［1］。間充質干細胞(mesenchymalstromalcell，MSC)是多能分化干細胞，在健康狀態下能夠分化為成骨細胞、成脂細胞和成軟骨細胞，并維持自我更新和分化的平衡。MSC向成骨細胞分化能力異常減弱和成骨細胞數量異常減少均會導致骨穩態平衡破壞，從而引起骨量丟失、骨微結構破壞，誘導骨質疏松癥的發生［2-3］。線粒體是主要的細胞供能細胞器，是細胞內的半自主調節細胞器。近年來，大量研究揭示了線粒體在干細胞維持和分化中的重要機制和作用［4-5］。研究［6］表明，線粒體與MSC功能及其成骨分化過程密切相關。所以，本文通過綜述線粒體在MSC成骨分化中的重要功能和作用，為進一步研究MSC成骨分化功能失調的機制和骨質疏松治療的藥物靶點提供新的思路。
1線粒體在MSC成骨分化中的作用
1.1線粒體功能
1.1.1線粒體能量代謝參與MSC成骨分化:細胞內能量代謝包括細胞質中的糖酵解和線粒體中的氧化磷酸化反應。MSC主要依賴糖酵解產能，無論是在體內、體外或者低氧環境都更有利于MSC保持增殖和分化潛能。在MSC分化過程中，成軟骨分化同樣依賴于糖酵解供能，而成骨分化和成骨細胞則更多的通過線粒體氧化磷酸化獲取能量［7］。在成骨分化的過程中，細胞耗氧量和內源性ATP生成量都會顯著提高，抑制線粒體功能并阻礙成骨分化［8-9］。Gao等［9］使用劑量為1μmol/L的細胞呼吸復合物抑制劑Ｒotenone抑制MSC線粒體復合物I的活性，體外成骨誘導后發現抑制劑組茜素紅染色和堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性顯著降低，提示MSC的成骨分化受到顯著抑制。Hollenberg等［10］使用乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)抑制劑草氨酸鹽處理C3H10T1/2細胞系和人MSC細胞系，拮抗了細胞糖酵解反應，細胞的成骨礦化能力顯著提高，動物實驗中使用草氨酸鹽顯著提高了小鼠長骨骨量及其生物力學強度。所以，MSC從糖酵解到線粒體氧化磷酸化產能的生物學轉換在成骨分化過程扮演十分重要角色，通過藥物干預線粒體氧化磷酸化途徑成為潛在的治療骨質疏松癥的措施。
1.1.2線粒體抗氧化途徑參與MSC成骨分化:成骨分化過程中，能量代謝向氧化磷酸化轉變后，在細胞內產生大量的活性氧(reactiveoxygenspecies，ＲOS)，同時激活線粒體抗氧化途徑，抑制內源性的ＲOS累積［11］。在MC3T3-E1細胞系中活性氧水平升高會抑制細胞成骨礦化能力，因此激活MSC抗氧化途徑可以提高細胞成骨能力和促進體內骨形成［12］。外源性的H2O2同樣降低了細胞成骨分化過程中ALP活性，延緩或抑制成骨分化，而使用抗氧化藥物則可以恢復線粒體功能，促進MSC的成骨分化［13-14］。線粒體具有酶和非酶抗氧化防御系統，非酶抗氧化系統包括細胞色素C、維生素C、還原性輔酶Q10等成分，酶系統包括Mn-sod、谷胱甘肽還原酶、過氧化物酶等［8］。Chen等［11］研究發現，成骨分化過程中超氧化物歧化酶2和過氧化氫酶表達量顯著提高，降低細胞內ＲOS水平，進而提高MSC的成骨分化能力。Gao等［9］研究證明，在MSC中敲除線粒體Mn-sod，能夠抑制細胞成骨分化，而Sirt3是一種關鍵線粒體相關蛋白，能夠通過FOXO3a去乙?；?、增強超氧化物歧化酶2的活性等機制減少ＲOS產生，在Sirt3敲除小鼠模型中同樣出現了明顯的成骨障礙和骨質疏松表型。同樣，鐵離子過載能夠激活線粒體中滲透性轉換，誘導成骨細胞中的ＲOS大量產生，形成鐵死亡，從而達到抑制細胞成骨能力［15］。當使用外源性的物質減少細胞內ＲOS含量，能夠達到促進MSC成骨分化，達到治療骨質疏松的目的。Jin等［16］使用唑來膦酸與MSC共培養，發現能夠逆轉H2O2造成的ＲOS水平升高，上調ALP、ＲUNX2和BGLAP的水平，并且以劑量依賴性的方式提高BMSC中ALP的活性和細胞成骨礦化能力。因此，在MSC成骨分化過程中，線粒體的抗氧化途徑與氧化磷酸化能量代謝產生的大量ＲOS維持著關鍵平衡，對成骨能力至關重要。
1.1.3線粒體代謝相關信號通路參與MSC成骨分化:線粒體在氧化磷酸化產生ATP的同時，還參與了細胞內信號通路的調節，通過細胞內信號通路參與間充質干細胞的成骨分化。β-catenin信號通路在成骨分化過程中至關重要，Lee等［17］研究發現，成骨分化時細胞內線粒體氧化磷酸化水平上調，導致乙酰輔酶A含量增加，促進β-catenin的乙?；头€定，從而激活β-catenin信號通路及其下游成骨相關信號分子，如ＲUNX2和OSX等［8］。除此以外，Notch信號通路，Hif-1α［18］等同樣參與線粒體代謝信號通路的調節。
1.2線粒體的生物發生參與MSC成骨分化
線粒體的生物發生過程通過原有線粒體的生長和分裂發生，與細胞周期、細胞功能、氧化應激等密切相關。2008年，Chen等［11］研究發現，在人MSC成骨分化過程中，線粒體膜電位、呼吸酶復合物、耗氧量和細胞內ATP含量均升高，mtDNA的拷貝數增加，成骨誘導促進線粒體的生物發生。An等［19］發現，Wnt-3a通過增加線粒體發生來促成骨分化，而當在研究中使用線粒體生物發生抑制劑zidovudine，則顯著抑制了間充質干細胞的成骨分化能力。過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1-α(peroxisomeproliferator-activatedreceptorgammacoactivator1-alpha，PGC-1α)是線粒體生物發生的主要調節因子，在成骨分化過程中起到十分重要作用。Yu等［20］研究證明，PGC-1α完全敲除的骨骼干細胞的堿性磷酸酶活性較低、礦化成骨能力較差，而PGC-1α過表達則顯著增強了Ｒunx2、Ibsp、Col1a1和Bglap等成骨標記基因的表達，增強了細胞的成骨能力。而在體內實驗中，作者發現PGC-1α的表達隨著年齡增加而減少，其缺失促進骨骼老化過程中的骨質流失，并增加了骨髓內的脂肪含量。
1.3線粒體動力學參與MSC成骨分化
根據細胞功能和需求不同，線粒體通過融合、裂變、降解等線粒體動力學行為滿足MSC細胞需求。在未分化的間充質干細胞中，線粒體呈破碎球形，隨著間充質干細胞的成骨分化、成脂分化和成熟，線粒體呈細長型，均勻的分散在整個細胞質內［21-22］，而這些形態和分布變化與細胞代謝的轉變相關［23］。線粒體融合主要由GTPase同源物Mfn1和Mfn2介導，Forni等［24］研究發現，線粒體膜蛋白Mfn2調節了線粒體融合，Mfn2敲低可以導致線粒體融合和耗氧量減少，從而導致間充質干細胞分化受損，Mfn2敲低阻礙成骨鈣化和抑制Ｒunx2等成骨關鍵基因的表達。同時，線粒體的嵴形態在成骨分化中扮演重要角色。mitofilin/mic60是線粒體接觸位點和嵴系統核心成分，mitofilin不足會導致堿性磷酸酶活性降低，減弱成骨礦化能力。成骨分化時，mitofilin表達增加，從而與線粒體轉錄因子A和B2相互作用，促進線粒體DNA轉錄，增強氧化磷酸化代謝活性［25］，而當敲低mitofilin后，線粒體膜穩定性受抑制，同時抑制了mtDNA轉錄和ATP產生，最終成骨分化受到顯著抑制，導致成骨缺陷［26］。所以，線粒體動力學在MSC成骨分化中具有重要作用，通過干預線粒體的融合、裂變、降解等線粒體動力學行為，能夠實現調節MSC成骨分化和成骨細胞的功能。
1.4線粒體自噬參與MSC成骨分化
線粒體自噬能夠清除受損線粒體，以此保證細胞內線粒體功能和質量。線粒體自噬通過選擇性隔離和降解功能失調或衰老的線粒體，在干細胞維持中發揮了重要作用。研究人員發現，將MSC置于21%氧含量條件下培養，氧化應激會激活Pink1/Parkin介導的線粒體自噬途徑，誘導MSC釋放包含完整線粒體或線粒體結構的囊泡，囊泡內含有細胞溶質微管相關蛋白輕鏈3(LC3-I)和自噬相關蛋白12，當使用巴弗洛霉素A1或低濃度(3～5μmol/L)氯喹藥物阻斷線粒體自噬時，MSCs表現出明顯的細胞凋亡。PINK1(PTEN-inducedkinase1)是線粒體中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞線粒體自噬的關鍵調節因子，其缺乏會影響線粒體穩態、導致受損線粒體積累［27］，而在MC3T3-E1細胞系中，PINK1是成骨分化的正調節因子，敲低PINK1會損害成骨分化過程中線粒體穩態［28］，在成骨分化過程中，線粒體自噬缺陷導致MSC成骨分化過程中無法維持健康線粒體而降低骨量［29］，而在Pink1－/－小鼠中，卵巢切除后加劇骨質流失［28］。以上表明線粒體自噬對于MSC成骨分化至關重要，但是深層次的機制仍需要進一步研究［30］。
2靶向線粒體的骨質疏松治療策略
目前對于骨質疏松和骨衰老的細胞療法中，包括移植健康MSCs，使用促進MSCs成骨、抑制破骨細胞功能的藥物等。線粒體功能相關，如能量代謝、活性氧和抗氧化途徑等，在MSCs的成骨分化和功能維持中起到至關重要的作用，調節線粒體功能相關的藥物越來越多的展現出抗骨衰老和治療骨質疏松的功能(表1)。白藜蘆醇是一種天然多酚類化合物，是SIＲT1和AMPK信號通路的激活劑，提高PGC-1α活性，從而增強線粒體功能，促進MSC成骨分化。另一方面，白藜蘆醇［26］能夠上調mitofilin表達調節線粒體穩定性，延緩MSCs衰老，同時能夠增加堿性磷酸酶活性和鈣沉積，增加線粒體mtDNA拷貝數，在成骨分化過程中促進線粒體生物發生，從而提升成骨分化能力。此外，白藜蘆醇還能夠顯著改善MSCs內的氧化應激［31］。二甲雙胍在體外能夠促進MSCs的成骨分化，調節正常和糖尿病缺陷MSC的成骨分化和骨再生。二甲雙胍［32］具有抗氧化作用，能夠上調SIＲT3蛋白的表達減輕成骨細胞的氧化應激反應［33］。雷帕霉素是廣泛應用的mTOＲ抑制劑，可以通過激活線粒體自噬改善線粒體呼吸并且促進線粒體自我更新和質量控制。研究［34］發現，雷帕霉素能夠在多種小鼠骨質疏松動物模型中改善MSC成骨分化能力，挽救骨量丟失。許多中藥也能夠影響線粒體代謝，其中有效成分如肉桂苷A［35］、三七皂苷Ｒ1［36］、芍藥苷-3-O-葡萄糖苷［37］等在修復線粒體損傷方面也具有重要作用。三七皂苷Ｒ1［36，38］作為天然小分子，能夠抑制JNK信號通路激活，拮抗活性氧誘導的線粒體損傷，恢復成骨細胞活力和成骨分化功能。3總結線粒體的穩定是細胞功能維持的核心，線粒體功能障礙或失調，將會影響間充質干細胞多能性維持和增殖分化能力(圖1)，也會影響成骨細胞的成骨礦化能力。線粒體在骨骼及相關組織的發育和穩態維持等方面具有關鍵作用。以線粒體為靶點的藥物在治療骨質疏松等領域已經取得了一定的進展，如何維持線粒體氧化磷酸化功能、降低ＲOS水平、維持線粒體穩態、促進線粒體生物發生，成為骨質疏松和骨衰老治療的新的方向。
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作者:胡淼 孟怡辰 周許輝 單位:海軍軍醫大學長征醫院骨科