前言：中文期刊網精心挑選了表白的話語范文供你參考和學習，希望我們的參考范文能激發你的文章創作靈感，歡迎閱讀。
表白的話語范文1
20xx年愚人節表白的話【熱門篇】1) 一滴水在海洋中渺小，在沙漠中偉大;丹頂鶴在鶴群中渺小，在雞群中偉大;你在人群中渺小，在豬圈偉大!
2) 我有件事求你，你那能找個空房讓我住兩天嗎?這件事請你不要告訴任何人，本來我不想麻煩你的，可我真的找不到信任的人了，我是薩達姆!愚人節快樂!
3) 對你的感情是一個簡單的自然指數，你要微分幾次都可以，不變的始終不變…假如你喜歡也可以積分，不過會多出一個常數來，而那個常數等于—我愛你。
4) 寧愿是一杯水，潤你的嘴，暖你的胃，到你心扉，沖走所有煩惱疲憊;寧愿是清風吹，帶著甜味，陪你入睡，給你安慰，你的快樂傷悲，我都想體會。愚人節快樂!
5) 對不起!我不小心把“喜歡你”發到了你的手機里，如果你接受請保留;如果不接受，請把它發還給我。愚人節快樂!
6) 曾有一分真摯的愛，我沒珍惜，失去才后悔莫及，若能再來，我會說：我愛你。若要選表白時間，我希望是：愚人節快樂!
7) 該MM霸主一面，為禍四方;待我練就本事，事業有成，得以報效父母;定然舍命生擒之，押至民政局伏法!愚人節快樂!
8) 走著走著，就散了，回憶都淡了;看著看著，就累了，星光也暗了;聽著聽著，就醒了，開始埋怨了;回頭發現你，不見了，突然我亂了。小住哪里逃，愚人節快樂!
9) 如果我是法官，我將判決你，終身監禁。監禁在———我的心里。愚人節快樂!
10) 啊!你的皮膚如此富有光澤，你散發的香味如此難以抗拒，讓我狠狠咬你一口吧，我親愛的——紅燒肉!愚人節快樂!
11) 拔苗助長是荒誕，掩耳盜鈴是蠻干。草船借箭是妙算，破釜沉舟是決戰。風花雪月是浪漫，舍生取義是奉獻。你若繼續往下看，你就是個笨蛋!愚人節快樂!
12) 白天思你，晚上想你，吃飯念你，睡覺夢你，日不成行，夜難入寐，倍受煎熬，千言萬語化成一句：我什么時候才能得到你……萬大獎啊!愚人節快樂!
13) 如果我不向你求婚，我會后悔一輩子，因為你是我的惟一。
14) 如果我的愛你不信，那就讓它成為彌天大謊，騙你一輩子;如果我的愛你不逃，那就讓它成為深牢大獄，困你一生一世;因為，我想我們一輩子在一起!
15) 我不愛你，是騙你的，是違心的，我真的不想說假話，但是我就是不愛你，就是要騙你，不能讓你猜透我的心。
20xx年愚人節表白的話【精選篇】1) 我是黑板，你是白粉筆，我們的結合讓文字見證我們愛得鮮明;我是浮雕石，你是鑿石刀，讓藝術見證我們愛得深刻!
2) 愛你不是兩三天了，想你不是一兩個星期了，念你不是一兩個月了，你要再不同意嫁給我，那我就搬去跟你一塊住了，你看著辦吧。
3) 房子可以小一些，家具可以舊一些，電器可以少一些，但只要有你，愛和親密就會多一些，幸福和歡樂就會滿一些，有你的家就是五星級賓館。
4) 任何時候，任何情況，只要你需要我，我立即趕來，盡我全力為你做事。
5) 如果愛情是一朵花，就讓它開在我心里，敗在我心里，深埋在我心里。
6) 我要變成一個小精靈，潛入你的靈魂深處，去傾聽你的心跳，你的呼吸，感受你的思想，你的愿望，這樣我就可以和你心有靈犀了，知道如何好好愛你了。
7) 我們之間似有似無的距離，讓我害怕;我們之間若隱若現的朦朧;讓我無措，我怕終有一天，我會累了，會學會放棄.
8) 我答應不會讓任何人傷害你，包括我自己在內，相信我!我會給你幸福。
9) 我從來不會對任何一個女人許下諾言，也從不會對任何一個女人做我會為你所做的事，你在我心目中是多么地不同!
10) 愚人節變成了表白的日子，情人節變成了分手的日子
11) 愚人節···又到了啊···他的歌,他的戲,他的人···“我就是我,是顏色不一樣的煙火,天空海闊,要做最堅強的泡沫”·······
12) 愚人節，最想開的玩笑，我們和好好嗎?
13) 愚人節，只是給說謊的人一個說真話的機會。
14) 愚人節，整死一個是一個，反正清明節也就要到了
15) 愚人節，我可以大膽的和你表白，因為我可以笑著離去。
20xx年愚人節表白的話【經典篇】1) 愚人節，不是給愚人過的節，而是給說謊人一個說真話的機會。
2) 英語考試聽力時，我沉浸在開頭優美的歌聲中，緩過神來。才知道聽力已經結束了!。
3) 一覺醒來我以為我長高了,原來是被子蓋橫了
4) 一稱體重我就很不開心，不開心的時候我就想吃東西。
5) 星期一愚人節，老師竟然讓我們去上課!越想不對勁兒，不行!咱不能上當!
6) 星期一愚人節,公司竟然讓我們去上班,還是八點半上班!越想不對勁兒,不行!咱不能上當!
7) 小時候傍晚在鄰居家看鬼片，當回家的時候。結果摔倒了。在鄰居家已經做好沖鋒的準備，到門口就發腿跑。
8) 現在是愚人節丶整死一個是一個丶反正清明節也要到了
9) 現在的孩子，分手專挑情人節，告白專挑愚人
10) 我最愛的人，愚人節那天一定要來騙我
11) 我一直奇怪,為什么會有一個愚人節,難道鼓勵大家騙人嗎?后來才知道,原來愚人自娛,有諷刺騙人者的意思。越來越發現,越是珍貴的東西,其實越容易被我們 不小心的忽略,譬如新鮮的空氣,干凈
12) 的水源,譬如誠信,譬如健康的身體。而這些東西之所以珍貴,是因為很容易一去不復還,用錢買不到。四月,祝好
13) 我是不該再去找誰的 愚人節又怎么樣,宣泄了我的無聊寂寞想念后又怎樣,我不敢找
14) 我期待的不是情人節，而是愚人節，因為在愚人節里面別人才會對我說真話
15) 我對你，是不是只有愚人節才可以說“我愛你”
16) “在一起吧““啊!愚人節是下星期二”“嘻嘻，跟你開玩笑，傻瓜”
17) “愚人節打算怎么過?”“我打算去表白”“為什么?”“因為被拒絕了我還能笑著回答說愚人節快樂呀!”
18) “我愛你”“我也愛你”“愚人節快樂”“愚人節同樂”看著就覺得心疼。
表白的話語范文2
關鍵詞：凋亡蛋白質；原核表達；可溶性；純化；穩定性
中圖分類號：Q786文獻標識碼：A文章編號：1672-979X(2008)03-0007-05
Expression, Purification and Activity Detection in vitro of Apoptin
FU Wen-bing1, SHI Xuan1, ZHAO Jian1*, FAN Li-qiang1, LI Su-xia, WANG Fu-jun2, SONG Yu-wen1, YUAN Qing-sheng1
(1. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China; 2. Zhejiang Rishengchang Pharmaceutical Co., Ltd, Zhejiang 322100, China)
Abstract ：Objective To construct an soluble expression system in E. coli for apoptin which was encoded by VP3 gene of chicken anemia virus (CAV), and study the purification and stabilization of apoptin. Methods The VP3 gene was amplified by PCR , then the segment was inserted into pET-28a (+) and the expression vector pET-28a-VP3 was constructed in E. coli BL21(DE3). The recombinant soluble protein was expressed in E. coli BL21(DE3)and purified by Ni-NTA column chromatography. The stability of apoptin was analyzed under different conditions. Results The target protein was expressed in E. coli BL21(DE3). The purity of apoptin was beyond 90 %after purification. The target protein was better stabilized by carrageenan in E.coli BL21(DE3). Conclusion Apoptin with high purity and stability can be successfully obtained, which do a base of the further study on clinic application of apoptin.
Key words：apoptin; prokaryotic expression; solubility; purification; stability
凋亡蛋白質是雞貧血病毒（CAV）的VP3基因編碼的小分子蛋白質，由121個氨基酸組成，含有2個脯氨酸富含區和2個堿性區，近N端（33～44a）含有一個11個氨基酸組成的核運輸序列（NES），靠近C端（84～90，112～118）含有2個核定位序列（NLS）。
Noteborn等[1]研究揭示，凋亡蛋白質能夠誘導人的肝癌、淋巴瘤、白血病、乳腺癌、肺癌等多種癌細胞的凋亡，以及轉化細胞的凋亡，但對未轉化的人雙倍體細胞無損傷[2]。凋亡蛋白質的核定位可能是其誘發細胞凋亡的前提之一[3]。凋亡蛋白質選擇性誘導腫瘤細胞的凋亡不同于通常的凋亡機制，它不是通過半胱天冬酶級聯反應進行的，不需要p53參與，也不被bcl-2的過表達抑制，反而能被bcl-2所促進[4]。由于大部分腫瘤細胞具有p53突變或缺失，這種非p53依賴性使凋亡蛋白質作為抗腫瘤藥物有很好的前景。
在許多關于凋亡蛋白質表達和純化的研究中，凋亡蛋白質多以包涵體形式表達。本實驗以pET-28a為載體進行凋亡蛋白質的原核表達，嘗試不同的誘導條件及純化方法，找到了可溶性目的蛋白質表達的條件，用金屬螯合層析法直接純化得到較高得率的活性目的蛋白質，并研究其穩定性。本研究對凋亡蛋白質作為腫瘤治療藥物應用于臨床具有積極意義。
1材料和方法
1.1質粒、菌株和試劑
含有凋亡蛋白質全長基因的質粒pET-11a-VP3（浙江日升昌藥業有限公司提供）；質粒pET-28a和菌株BL21(DE3)等（本實驗室保存）；低相對分子質量蛋白質和DNA Mark（Sigma公司）；IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）（BBI分裝）；SDS（十二烷基磺酸鈉）（Amresco分裝）；限制性內切酶、T4-連接酶、Taq酶（MBI公司）；其它化學試劑均為國產分析純。
1.2原核表達重組質粒的構建
VP3基因來源于pET-11a-VP3質粒。PCR引物分別為P1：5’-AATTTCAAC ATATGAACG CTCTCCAAG-3’；P2：5’- CGTCGGATCCTATT ACAGTCTTATACGC-3’。分別引入NdeI和BamHI位點。PCR產物經NdeI和BamHI雙酶切后，回收的VP3基因片段與經同樣雙酶切的質粒pET-28a連接和轉化。抽提質粒，用BamHI和NdeI對重組質粒進行雙酶切鑒定得到陽性重組質粒。
1.3凋亡蛋白質的原核表達及純化
1.3.1凋亡蛋白質的表達與鑒定將含有重組質粒pET-28a-VP3的BL21(DE3)菌株接種于LB培養基中，37 ℃培養過夜，次日按1∶100的比例稀釋后放大培養，至一定菌體濃度時，加入適量IPTG誘導培養，離心收集菌體。
SDS-PAGE分析 12 % SDS-PAGE電泳，電壓100 V，待樣品即將進入分離膠時，調節至120 V。電泳后凝膠用考馬斯亮藍溶液（45 %甲醇，10 %乙酸，0.25 %考馬斯亮藍R 250）染色。
1.3.2可溶性目的蛋白質的純化將新鮮菌體按1∶5（W∶V）的比例用Tris-HCl緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，10 %甘油，pH 8.5）重懸，保持在冰浴中，超聲破碎至菌液澄清。4 ℃，10 000×g離心20 min，取上清，Ni-NTA Agarose 金屬親和樹脂（Qiagen公司）分離純化。將上清液加入經Tris-HCl緩沖液平衡的Ni-NTA 介質中，4 ℃結合60 min。將混合物小心加入下端封閉的層析柱后，除去下端封蓋，收集流出液（穿出峰）。以15 mL含20 mmol/L咪唑的磷酸緩沖液漂洗后，再分別以15 mL含40，60，100，200 mmol/L咪唑的磷酸緩沖液洗脫目的蛋白質。分別收集洗脫組分，進行SDS-PAGE鑒定，Bradford法測定蛋白質濃度，凝膠掃描軟件分析純度。
1.4凋亡蛋白質溶液穩定性研究
將重組表達的凋亡蛋白質于4 ℃放置3 d后，取樣進行SDS-PAGE電泳鑒定，對照3 d前樣品觀察凋亡蛋白質在溶液狀態中的穩定性。通過改變離子強度（增加NaCl濃度）和添加不同穩定劑來增加凋亡蛋白質的穩定性。
2結果
2.1重組表達質粒的構建
以pET-11a-VP3為模板擴增PCR，得到預期大小的目的片斷。切膠回收后雙酶切（BamHI＋NdeI），酶切產物與同樣雙酶切的pET28a連接。連接產物轉化E.coli DH5α，用BamHI和NdeI雙酶切鑒定重組質粒（見圖1），得到了含有400 bp目的片段的陽性克隆，與預期結果相同。經上海生工生物公司測序驗證構建好的pET-28a-VP3，序列正確，并使凋亡蛋白質的N端帶有His-Tag，為目標蛋白質的純化提供了條件。
2.2重組蛋白質的表達
為了提高重組蛋白質的表達量，本實驗研究了IPTG的濃度。當菌體密度到達約A600 0.6時，加入IPTG至終濃度分別為0.2，0.5，1 mmol/L，30 ℃誘導表達5 h，見圖3。
由圖3可見，經1 mmol/L IPTG誘導后表達量較高，目標蛋白質相對分子質量約16×103，與預期大小一致。
2.3可溶性凋亡蛋白質的純化
誘導表達后菌體破碎離心，上清液用目的蛋白質N端的6×His咪唑基團與鎳離子特異性結合，金屬螯合層析法分離純化，得到較純的目的條帶。經SDS-PAGE電泳掃描分析，純度高于90 % ，見圖4。蛋白質濃度測定表明每克濕菌體可以到0.49 mg凋亡蛋白質。
2.4凋亡蛋白質的穩定性研究
實驗中發現凋亡蛋白質在溶液中不穩定，極易沉淀。實驗中分別取IPTG誘導后樣品立即進行SDS-PAGE分析，第3天再進行1次SDS-PAGE分析，見圖5-A、5-B。
1. 低相對分子質量標準蛋白； 2，3. 放置2 d后目標蛋白質
圖5-A. 誘導的菌體取樣后立即SDS-PAGE，1和2 皆為目標蛋白質；圖5-B. 誘導的菌體2 d后SDS-PAGE
圖5 凋亡蛋白質SDS-PAGE穩定性分析
圖5-A. 誘導的菌體取樣后立即SDS-PAGE，1和2 皆為目標蛋白質；圖5-B. 誘導的菌體2 d后SDS-PAGE
誘導的菌體取樣后立即SDS-PAGE分析，可以看到目的蛋白質的表達條帶清晰；2 d后SDS-PAGE分析，幾乎觀察不到目的蛋白質條帶，推測凋亡蛋白質隨著儲存時間延長發生了聚合。這說明可溶性表達的凋亡蛋白質在溶液狀態中易形成沉淀，一般2～3 d就發生大量聚集。因此有必要進行可溶性蛋白質的穩定性研究。
將表達得到的目的蛋白質分別保存于高、中、低3種不同鹽濃度的緩沖液中，觀察其穩定性。低鹽溶液：20 mmol/L Tris.HCl緩沖液；中鹽溶液：80 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris.HCl；高鹽溶液：300 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris.HCl。pH值均為8.0。
實驗表明，凋亡蛋白質在低鹽溶液中不穩定，在超濾過程中即有大量沉淀析出。分別取高鹽溶液和中鹽溶液中4 ℃保存48 h前、后的樣品，分析上清蛋白質濃度。2次重復實驗結果表明，高鹽蛋白質濃度平均降低16 %，中鹽溶液中平均降低34 %。推測高鹽環境更有利于凋亡蛋白質的穩定。
進一步研究，于緩沖液中加入各種穩定劑（最終濃度0.1 %）：阿拉伯樹膠、卡拉膠、瓜豆爾膠、CMC（羧甲基纖維素鈉）、明膠、高酯果膠、魔芋膠、黃原膠等，觀察是否有利于重組凋亡蛋白質的穩定性。以上樣品4 ℃保存7 d后離心得到的上清經SDS-PAGE分析，結果見圖6。
1. 對照；2. 阿拉伯樹膠；3. 卡拉膠；4. 瓜豆爾膠5.CMC；M. 低相對分子質量標準蛋白質；6. 明膠；7. 高酯果膠；8. 魔芋膠；9. 黃原膠
圖6 添加劑對凋亡蛋白質穩定性的作用分析
圖5-A. 誘導的菌體取樣后立即SDS-PAGE，1和2 皆為目標蛋白質；圖5-B. 誘導的菌體2 d后SDS-PAGE
實驗結果表明，在高鹽緩沖液中加入卡拉膠，目標蛋白質幾乎沒有沉淀，卡拉膠可以有效增強可溶性蛋白質的穩定性。
3討論
本實驗構建了表達質粒pET-28a-VP3，并在E. coli BL21(DE3) 中獲得表達，用Ni-NTA柱純化目標蛋白質。由于稀有密碼子占VP3基因氨基酸序列組成的25 %左右，為了提高表達量，本實驗選用嚴緊型表達宿主菌BL21(DE3)pLysS及促進富含稀有密碼子的基因表達的Rosetta菌株表達目的蛋白質。實驗結果（數據未列出）表明，Rosetta菌株中目的蛋白質的表達量并未增加，說明稀有密碼子不是限制其表達量提高的因素。BL21(DE3)pLysS目的蛋白質的表達量也沒有明顯變化，表明目標產物對細胞無毒性或毒性很小。由于凋亡蛋白質穩定性差，其穩定性對于其臨床應用至關重要。本實驗通過改變溶液的離子強度及添加穩定劑來增加目標蛋白質的穩定性[5]，高鹽緩沖液中加入卡拉膠可以有效增強凋亡蛋白質的穩定性[6]。本實驗為在原核生物中進行目標蛋白質的表達和分離純化，以及穩定性研究提供了簡易可行的途徑，為凋亡蛋白質的進一步藥理研究奠定了基礎。
參考文獻
[1]Noteborn H M, Danen-van Oorschot A A, Vandereb A J. The apoptin gene of chicken anemia virus in the induction of apoptosis in human tumorigenic cells and in gene therapy of cancer[J]. In:Boulikas T. ed. Gene Ther Mol Biol. 1998: 399-406
[2]Danen-van Oorschot A A, Fisher D F, Grimbergen J M, et al. Apoptin induces apoptosis in human transformed and m alignant cells but not in normal cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94 (11): 5834.
[3]Zhang Y H, Abrahams P J, Vandereb A J, et al. The viral protein apoptin induces apoptosis in UV-C- irradiated cells from individuals with various hereditary cancer- prone syndromes[J]. Cancer Res, 1999, 59 (12): 3010-3015.
[4]Noteborn M H, Zhang Y H, Vandereb A J. Apoptin specifically causes apoptosis in tumor cell and after UV-treatment in untransformed cells from cancer-pron individuals: areview[J]. Mutat Res, 1998, 400(1-2): 447.
表白的話語范文3
人物的神情與動態
以樂舞為題材的畫像石被當做是平面造型藝術，在處理人物的神情和動態上其實已經做得非常完備了。樂舞百戲里的人物造型，大部分以正面和側面描繪為主。作品構圖精簡、線條流暢、生動形象。
山東盛產青石，其質地較細密。在面部的處理上，己注意到五官的表情，畫像石常以上下分層或左右分格的手法去刻畫宴飲圖。而南陽畫像石更多的是用石灰石，因為其質地堅硬，但又易脆，不太適合精雕細刻。工匠們想出一法子，通過采用粗獷的雕刻手法，來凸顯南陽畫像石的大氣、粗獷之美。南陽以前地屬楚地，那里的巫風濃郁，同時充滿浪漫主義情調。南陽畫像石對人物形象刻畫很新穎，尤其是面部表情夸張，鮮明。對形象輪廓則是追求大形而不是拘于小節。內部線條簡潔、質樸。在相對空白的畫面上，更加突出了主體人物，畫中人物排列疏密有致，沒有太多裝飾，通過簡練的云紋來聯系彼此，形成一種疏密與動靜的結合。由于該區域畫像石較早達到成熟狀態，對周邊地區的影響也是很明顯的。
四川地區一般多以崖墓及石棺畫像石為主。由于這里的石材質地粗糙且松軟，又是砂巖，所以不太適合對物象進行精細刻畫，只能用大塊面、凹凸起伏、又富有視覺沖擊力的雕刻技藝來完成。在人物造型與動態的表現方面，生動活潑，簡潔明快。在畫面造型方面，不僅要求動感，更多的是夸張的處理。風格依然是漢代文藝所固有的雄偉古樸的感覺。
陜北地區采用的是頁巖，其結構較厚，不利于精雕細化，所以陜北畫像石對人物面部的處理，主要以淺浮雕為主，不追求細枝末節，人物處理的也非常簡潔，人物形象的外輪廓也表現得當，更多采用類似剪紙中“連”的手法，將不同物象巧妙相連，營造出濃郁的剪影風格。陜北的樂舞百戲圖像更多了一種嫻靜優雅，使其極富藝術美感。
畫面的內容與布局
漢畫像石的創作空間十分廣闊，不僅僅表現在內容選取上，同時也表現在構圖形式上。從山東、蘇北、皖北、豫東區樂舞百戲畫像石畫面布局來看，構圖大多呈“密集型”布局，畫面很少留白，一般填充的很飽滿，通常將一塊石面分為好幾格，按照從上至下，從左至右排列，有時還將一格分為數小格。如果畫面未分隔，雕刻者則會將最重要的內容放在畫面最中心的位置，其余的地方會刻上一些花紋加以裝飾，總之其目的就是最終將畫面填滿，整個畫面呈質樸敦厚、充實密集的風格特點。讓人有種密而有秩、亂而有序的感覺，因為整幅畫面想要呈現的重點往往會被放在構圖的中心點上。
南陽漢畫像石在構圖上基本呈現“疏朗型”的布局。即畫面不分層也不分格，不會將不同題材的畫面集聚在一起，只在一塊石頭上呈現一種題材畫面。這樣就使畫面所要呈現的物象有著較為寬松的畫面空間，也使雕刻工匠們在規劃好畫面構圖的基礎上，能夠充分發揮其工藝技巧，對畫面中物象的細節部分進行更加細致的刻畫。
陜北地區則運用了多種手法去描繪畫像石，凸顯出很強的圖案化和裝飾性。在畫面構圖與分割上也是頗具想法，使局部和整體之間更加協調統一。在表現手法和技巧運用方面，使得輪廓特征更加平面化且具備夸張變形的藝術特色。
四川區域的漢代樂舞百戲畫像石有著以下兒個藝術風格特點，畫面的內容與陜北亦有明顯不同，舞者有的著長裙，有的穿短褲，均腰束帶，手牽手翩翩起舞，具有濃郁的西域文化風貌。就以單個作品的構圖來看，依舊采用較簡潔的構成方式，從而簡化了內容繁雜、場面宏大的題材，既有留白，有很寫意。
題材的程式與變化
在山東、蘇北、皖北、豫東區的樂舞百戲畫像石中，樂器大部分情況都是以樂舞伴奏的形式呈現出來的，在舞蹈和百戲同時表演的大型場面中，樂器的伴奏起到了非常關鍵的作用，既可以對節奏進行控制、又能活躍氣氛，使得表演者能更好的表情達意。
南陽對楚文化的保留格外重視，在這個重要地區，楚文化通過天人合一、追求浪漫、夸張等風格特點深刻影響著南陽漢畫像石的題材與畫面。它的構圖十分簡潔，一個畫面對應一個主題，清晰明朗；對跳舞的人描繪的形象生動，極具藝術表現力。
陜北、晉西北地區樂舞百戲畫像石在題材內容方面，由于磚石砌筑的墓室結構的局限，其題材內容突出地表現了當地的歷史環境和農牧兼營的經濟特點。
四川區域的漢代樂舞白戲畫像石一般以現實生活為樣本，在對內容處理上充滿著現實生活的情調。整體組織較為復雜，既有單幅單個主題的，多幅一個主題的，又有多幅多個主題的，還有分格多個主題的。以騎吹為主題材的畫像石較豐富，騎吹也稱鼓吹，它主要是受西域游牧民族的影響，在馬上進行的一種演奏形式。許多從西域傳入的民族樂器也出現在該地區的畫像石中，例如琵琶和胡笛等。四川地區在吸取中原和西域文化的基礎上，形成了特有的巴蜀文化，這些在后來都被作為樂舞和百戲的載體記錄下來。
表白的話語范文4
作者：梁英民 蔣姍姍 孫強 吳絨麗 陳萍 李榮 周鵬 王鍵 韓驊
【關鍵詞】 基因表達
關鍵詞: bcr/abl;基因表達;融合蛋白;抗血清
摘 要:目的 克隆并表達bcr/abl融合基因片段，并制備其抗血清. 方法 PCR擴增包含蛋白融合點的bcr/abl癌基因片段，序列測定后克隆入帶有His標簽的原核表達載體pET-16b，轉化宿主菌BL21，IPTG誘導表達，SDS-PAGE分析表達結果，Ni-NTA樹脂親和純化，皮下多點注射免疫小鼠，ELISA確認抗血清的滴度. 結果 PCR擴增得到大小約523bp的目的片段，序列測定表明與發表序列完全一致;得到了一種新的癌基因bcr/abl片段的原核表達載體pET-16b-bcr/abl，在BL21中表達可見于Mr21×103 處有一蛋白新生帶，表達的BCR/ABL蛋白免疫小鼠后，ELESA確認抗血清的滴度>1∶2000. 結論 成功的克隆、表達了bcr/abl融合基因片段，并制備了相應的抗血清.
Keywords:bcr/abl;gene expression;fusion protein;immune serum
Abstract:AIM To clone and to express bcr/abl fusion gene fragment and to produce immune serum against the expressed fusion protein.METHODS PCR-amplified bcr/abl gene fragment was inserted into plasmid pET-16b with His tag to form a new plasmid pET-16-bcr/abl（pEb）.The BCR/ABL fusion protein was expressed in E.coli BL21trans-formed with pEb and induced with IPTG.The expressed pro-tein was purified by affinity resin-Ni-NTA and analyzed by SDS-PAGE.In order to produce anti-serum，Mice were im-munized by subcutaneously multi-site injection with BCR/ABL protein.The anti-serum was assayed by ELISA.RESULTS Molecular weight of the PCR-aimplified bcr/abl gene fragment which was consistent with the published se-quence was about523bp.Plasmid pEb was constructed.The molecular size of BCR/ABL protein expression was about Mr21×103 .The titer of the BCR/ABL protein anti-serum was more than1∶2000.CONCLUSION Fragment of bcr/abl fu-sion gene is successfully cloned and expressed.The antiserum of BCR/ABL protein fragment has been produced.
0 引言
慢性粒細胞白血病（Chronic myelogenous leukemia，CML）是起源于骨髓造血干細胞的惡性腫瘤.絕大多數CML患者的腫瘤細胞帶有染色體異常，即9∶22號染色體易位，形成特征性的費城染色體（Pheladophia，ph染色體）［1，2］ .在分子水平，這一染色體易位造成bcr基因和abl基因的融合，表達的BCR/ABL融合蛋白具有持續性的激酶活性，引起細胞的轉化［2］ .Bcr/abl融合蛋白被認為是CML特異性腫瘤抗原，可作為CML診斷和治療的指標［3-6］ .我們用PCR擴增了BCR/ABL融合蛋白的基因片段，并在大腸桿菌中進行了表達.表達產物經純化復性后，用于免疫小鼠，得到可識別該抗原的小鼠抗血清.
1 材料和方法
1.1 細菌和質粒 大腸桿菌XL-10gold由本室保存.質粒pET-16b及大腸桿菌BL21均來自Nav-agene公司.帶有人bcr/abl（b3a2）融合基因的質粒pGD210由本校附屬唐都醫院血液科劉立博士提供.
1.2 引物設計與bcr/abl融合基因表達質粒的構建 DNA重組所用試劑來自Promega、寶生物工程公司及華美生物工程公司.以質粒pGD210為模板，用PCR擴增了bcr/abl基因跨越融合點的523bp基因片段（93aa-265aa）.PCR引物的序列為:上游引物:5’-CTCGAGACGTTCCTGATCTCCTCT;下游引物:5’-GGATCCTTAGTAGTTGCTTGGGACC-CA.PCR產物經電泳回收純化后插入pGEM-T載體（Promega），進行DNA序列分析.從正確克隆的載體中，用Xho I和BamH I雙酶切下含有bcr/abl融合基因插入片段，插入質粒pET-16b，得到表達BCR/ABL融合蛋白的質粒pET-bcr/abl（Fig1），以下簡稱pEb.
1.3 重組蛋白的誘導表達和純化 用表達質粒pEb轉化大腸桿菌BL21，加入IPTG至終濃度1mmol?L-1 ，誘導不同時間后，收集菌體.懸浮于PBS，超聲裂菌，離心棄去上清.向沉淀中加入2mol?L-1 尿素，離心除去雜蛋白.再用8mol?L-1 尿素溶解沉淀的蛋白，在Ni-NTA-agarose柱（Vector公司）上進行親和層析.用250mmol?L
-1 咪唑洗脫.收集洗脫的蛋白，透析后凍干保存.
圖1 略
1.4 抗血清的制備 BALB/c小鼠由第四軍醫大學實驗動物中心提供，用50μg基因重組的BCR/ABL融合蛋白與等量的福氏佐劑混后皮下多點注射，每周一次，第四周腹腔注射加強一次，加強免疫后14天取血，分離血清備用.
1.5 酶聯免疫試驗（ELISA） 向96孔板中加入純化的BCR/ABL融合蛋白（5μg/μL）100μL，4℃包被過夜.加入稀釋的經免疫小鼠的血清與未經免疫小鼠的血清，血清稀釋度均為1∶500，1∶1000，1∶2000，1∶4000，1∶8000，1∶16000，設一陰性對照孔， 37℃水浴1h，加入酶標抗體，37℃1h，TMB顯色15～30min，酶聯免疫檢測儀測定，測定波長為492nm.
1.6 DNA序列分析 按說明書用PE公司的熒光DNA序列測定試劑盒（Big-dye）進行序列測定反應，用310型DNA序列測定儀進行電泳及結果分析.
2 結果
2.1 bcr/abl基因的亞克隆 為表達BCR/ABL融合蛋白融合點兩側約200個氨基酸的片段.以全長bcr/abl基因為模板，用PCR擴增了這一片段的cD-NA.Fig2顯示523bp的目的片段被擴增出來.將這一片段插入T載體后，進行DNA序列分析，但在5’和3’端分別插入了設計的Xho I和BamH I酶切位點.
圖2 略
2.2 BCR/ABL融合蛋白的誘導表達 用bcr/abl表達質粒pEb轉化大腸桿菌BL21，培養后用IPTG進行誘導.SDS-PAGE分析結果表明，與用pET-16b轉化的BL21及未轉化質粒的BL21裂解產物相比，在21kd處有一新生蛋白帶，與預期的融合蛋白分子大小相同.灰度掃描顯示IPTG誘導3h后融合蛋白的表達約占細菌總蛋白的20%.
2.3 BCR/ABL融合蛋白的純化 用Ni-NTA-a-garose親和層析柱進行BCR/ABL融合蛋白的純化.收集蛋白峰，PBS透析后，進行SDS-PAGE分析（Fig3）.表達的融合蛋白被純化為單一條帶.
2.4 BCR/ABL融合蛋白在小鼠中的抗體應答 收集免疫小鼠的抗血清，ELISA檢測結果見圖4，與正常對照比較，接受融合蛋白免疫的小鼠產生了較高滴度的血清，說明基因重組的BCR/ABL融合蛋白對小鼠具有免疫原性.
圖3 － 圖4 略
3 討論
bcr/abl融合基因是CML的分子標記，bcr/abl融合基因編碼一個分子量為Mr21×104 的融合蛋白.由于融合蛋白連接區的氨基酸序列是其他任何正常蛋白質不具有的，被認為是CML細胞所特有的.BCR/ABL融合蛋白是一種胞漿內蛋白，研究bcr/abl融合蛋白在細胞表面的表達的類型和該融合蛋白的免疫學特點對開展CML的免疫治療有重要意義［3-6］ .然而，由于融合蛋白很難從患者體內獲得，而且在細胞內加工和提呈的效率也難以檢測，為此，本文用體外基因重組的方法獲得了bcr/abl融合蛋白的原核表達產物，經純化復性后，用于免疫小鼠，得到了可識別該抗原的小鼠抗血清，為隨后的單克隆抗體制備及免疫治療的研究奠定了基礎.
參考文獻
［1］Kurzrock R，Gutterman JU，Talpaz M.The molecular genetics of Philadelphia chromosome-positive leukemias ［J］.N Engl J Med，1988;319（15）:990-998.
［2］Shtivelman E，Lifshitz B，Gale RP，Canaani E.Fused transcript of abl and bcr genes in chronic myelogenous leukaemia ［J］.Na-ture，1985;315（6020）:550-554.
［3］Liang Y M，Sun Q，Jiang S S，Cheng P，Wang J S，Liu L，Han H.Expression of PTD-bcr/abl fusion oncoprotein fragment carrying protein transduction domain and its transmembrane transportation ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（7）:Cover2.
［4］Feng Q，Sun BZ，Zhao YT，Sun K，Yan Z，Han W，Zhang YQ.Study on the cleavage ability of three ribozymes specific to the different sites of bcr-abl fusion gene ［J］.Di-si Junyi Dax-ue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（4）:284-287.
表白的話語范文5
【關鍵詞】 玻璃體視網膜病
關鍵詞: 玻璃體視網膜病，增生性;肌動蛋白類;免疫組織化學
摘 要:目的 觀察PVR增生膜中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達. 方法 用免疫組化染色法和免疫熒光法對14例視網膜脫離伴PVR行玻切術時切除的增生膜（PRM）進行檢查、分析. 結果 免疫組化染色法顯示α-SMA在14例PRM中均有表達，位于胞質中，其分布與PRM的收縮方向一致.在200倍視野下，PRM C級膜中α-SMA陽性細胞比例為35/80，D級膜中α-SMA陽性細胞比例為50/60;免疫熒光法結果與染色法相符.熒光定量分析:PRM C級膜中α-SMA陽性熒光總量12.31.D級膜中α-SMA陽性熒光總量23.09，約為C級膜的1.88倍（P
Keywords:vitreoretinopathy proliferative;actins;immuno-histochemistry
Abstract:AIM To investigate the expression of alpha-smooth muscle actin（α-SMA）within the periretinal mem-brane（PRM）of PVR.METHODS Fourteen specimens of PRM were obtained during vitrectomies of patients suffered from PVR of different grades.α-SMA expression in PRM were detected by immunohistochemical staining，and quanti-tative analysis performed by image process of immunofluorescence.RESULTS α-SMA expression was detected in all14PRMs.The distributions ofα-SMA were present in the cytoplasma，and accordance with the direction of stress fibers..α-SMA expression was stronger in PVR/D than in PVR/C.CONCLUSION Expression ofα-SMA was a com-mon feature of PRM，and the expression correlated with severity of PVR and the process of membrane traction.
0 引言
增生性玻璃體視網膜病變（proliferative vitreo-retinopathy，PVR）屬于眼內組織創傷愈合的一種特殊表現，可以分為炎癥期、細胞增生期和瘢痕期三個階段，其中在細胞增生期可以形成視網膜表面的增生膜組織（PRM），這些膜組織在瘢痕期可以明顯收縮，形成對視網膜的牽拉而導致視網膜脫離［1，2］ .視網膜色素上皮細胞（RPE）是參與增生膜形成的主要細胞之一，在PVR病變過程中可以有明顯的形態改變，部分RPE可以轉化為肌纖維母細胞樣細胞而具有收縮功能［3］ .α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）是一種有收縮功能的細胞骨架微絲結構
［4］ .McGillem［5］ 等曾報道:在PVR病變的增生膜中有多種細胞表達α-SMA，但針對α-SMA在增生膜中的整體表達及其與PVR病變程度的相關性研究，尚未見報道.本實驗采用免疫組化技術，觀察PVR的視網膜前膜中α-SMA的表達情況.
1 材料和方法
1.1 材料
標本來源于1998-07/1999-11在本院眼科住院的孔源性視網膜脫離伴PVR患者14名，年齡4～63歲，病程2mo～2a.PVR分級標準參照1983年美國視網膜學會分級方法，分級為C3-D3.以上患眼行玻璃體切割術時取視網膜表面增生膜，其中下膜5例，前膜9例.以上組織用40g?L-1 多聚甲醛固定30min，4℃.經脫水、透明和浸蠟，制成臘塊，然后制成5μm厚的切片，貼附于載玻片上.小鼠抗人的α-SMA單克隆抗體（1∶200;中國博士德公司），DAB免疫組化試劑盒（DAKO公司，丹麥），Avidin標記的Texas Red（Molecular Probes，美國）. 1.2 方法
1.2.1 免疫組織化學染色及免疫熒光
切片浸入7.5mL?L-1 H2 O2 -PBS，37℃，30min，以阻斷內源性過氧化物酶.正常羊血清封閉消除非特異性染色.滴加小鼠特異性抗體，在濕盒內37℃保溫30min.PBS振洗3次，滴加生物素化羊抗小鼠IgG，在濕盒內37℃保溫30min，免疫組織化學染色法滴加ABC復合劑，37℃保溫30min.加入顯色劑顯色，鏡下觀察，水洗中止反應，蘇木精復染核，脫水透明封片.免疫熒光法加入抗生物素化標記的Texas Red，37℃保溫30min.緩沖甘油封片.采用人大隱靜脈血管組織作為陽性對照;采用人類角膜移植后供體眼的眼后段組織，包括視網膜色素上皮細胞（RPE）、視網膜組織、脈絡膜和鞏膜，以及不加一抗的標本作為陰性對照，與手術取材標本平行染色.
1.2.2 結果判定和分析
免疫組織化學DAB染色法的結果:在OLMPUS顯微鏡（BX50）下觀察，以背景清晰、棕黃色部位定位明確的細胞作為陽性細胞，在200倍視野下，計數陽性細胞比例.
Texas Red熒光標本在BIO-RED共聚焦顯微鏡（MR-1024）下觀察，作定量分析:任意選一視野，在相同面積下計數熒光總量.
2 結果
陽性對照組顯示均對所用的單克隆抗體呈陽性反應:DAB染色陽性細胞胞質中呈現棕色或深棕色的顆粒，細胞核經復染成藍色;Texas Red在595nm激光激發下，陽性部位發出深紅色顆粒樣熒光.陰性對照組中未見陽性染色及熒光.
DAB染色結果顯示，在14例PRM中α-SMA均有陽性表達，但其表達的程度有所差別.在6例PVR/C3級的PRM中，可見細胞成份較多，細胞間質較少，α-SMA表達陽性細胞的比例為35/80，呈散在分布，隨分布區域的不同細胞染色以及形狀表現有差異:在膜的表面可見少量染色較深，胞體呈梭形，胞核呈圓形或卵圓形的陽性細胞;在細胞較多的區域，陽性細胞數目較多，染色較淺淡，胞體為長圓形，胞核呈圓形，在部分陽性細胞中可見色素存在（Fig1（略））;在膜的中央組織中可見少量陽性細胞，胞體呈狹長的梭形，與標本的長徑走行方向平行;在8例D級PRM中，α-SMA陽性細胞比例約為50/60，多分布在膜的表面，染色深，細胞呈梭形，胞核為長圓形（Fig2（略）），常可見此類細胞在膜組織的起伏處呈“搭橋樣”存在，在組織的中央區域陽性細胞較少.
免疫熒光與DAB染色結果相一致.在C級膜中，陽性部位多位于膜的周邊，量較少（Fig3（略））;在D級膜中，陽性部位多位于膜的表面，量較多（Fig4（略））.
3 討論
在本實驗中，我們觀察到在14例不同時期PVR病變組織中α-SMA均有表達，α-SMA陽性細胞在C級和D級的PRM中有不同的表達程度，在C級膜中呈散在分布，大部分陽性細胞染色較淺淡;在D級PRM中主要分布在膜的表面，陽性細胞的走行多與膜標本橫斷面的長徑一致或呈“搭橋樣”存在，陽性染色為明顯的深棕色.這一結果提示在PVR病變中存在α-SMA的表達以及陽性細胞數量存在著動態變化的過程，這個過程對PRM的重新塑形以及收縮能力的改變可能有重要作用.
α-SMA是一組表達在多種類型細胞胞質中的具有收縮功能的微管微絲結構，是細胞移行和具有收縮 功能的基礎.同時可以作為一種特異性免疫組化染色標志來標識肌纖維母細胞［6］ .肌纖維母細胞多存在于一些需要收縮功能的組織中，如肺泡的間隔、血管等［7］ .在病理條件下，肌纖維母細胞是參與傷口收縮的主要成份，其收縮功能對減小創面的面積以及后期的瘢痕重新塑形有重要的作用［8］ .
RPE是參與PVR形成的重要細胞成份［9］ ，RPE脫離原位后可以發生明顯的形態和功能的變化［10，11］ .Lewis等［12］ 報道，在PRM中存在一種有足突的RPE細胞，電鏡觀察下這種細胞內有大量呈集束狀排列的微絲，同時細胞核有明顯的切跡，提示其可能有收縮現象，在這些細胞與細胞之間以及細胞與細胞外基質之間存在多種形式的聯結，這些聯結被證實對組織的收縮功能是有相當重要的作用.而這些特點與肌成纖維母細胞［13］ 是十分相似的. 轉貼于
RPE的異常轉型過程可能對PVR的發生過程有重要的意義［14］ .脫離原位后的RPE上皮表型以及胞質內的色素顆粒逐漸消失，合成多種細胞外基質，并表達α-SMA ［5］ ，導致眼內過度的損傷愈合過程以及收縮能力的持續增加.特別是α-SMA的持續表達對PVR的發生有重要意義［15］ .
從我們實驗的結果來看，在C級的PRM中，有較多的細胞成份存在，同時也有較多α-SMA陽性細胞，但著色淺淡，提示在這些細胞中α-SMA的表達較弱;在D級PRM中雖然細胞數目明顯減少，而α-SMA陽性細胞的著色明顯加深，定量分析顯示α-SMA在D級膜中的表達量是C級膜的1.88倍.從分布上看，其附著點位于PRM收縮的“受力點”位置.從RPE轉型的特點來看，RPE在C級PRM中輕度表達α-SMA的過程可能與細胞本身合成細胞外基質、移行以及具有一定的收縮能力有關;而在D級PRM中，RPE明顯表達α-SMA可能與其增強的收縮能力有關，這種α-SMA陽性細胞在數量上的變化和空間重新分布的表現，可能是RPE細胞在PRM中處于不同位置受到不同應力作用的結果.同時也提示PVR病變中，大部分RPE細胞可以在轉型的過程失去其收縮功能，而處在某些特殊空間位置的RPE其收縮的功能反而明顯增強，這種變化與牽拉性視網膜脫離的形成會有相當重要的作用.
參考文獻
［1］Weller M，Wiedemann P，Heimann K.Proliferative vitreo-retinopathy is it anything more than wound healing at the wrong place ［J］.Int Ophthalmol，1990;14（2）:105-117.
［2］Hui YN，Sorgente N，Ryan SJ.Posterior vitreous separation and retinal detachment induced by macrophages ［J］.Graefe’s Arch Clin Exp Ophthalmol，1987;107（3）:1147-1151.
［3］Vinores SA，Campochiaro PA，Mcgehee R.Ultrastructural and immunocytochemical changes in retinal pigment epithelium，retinal glial，and fibroblasts in vitreous culture ［J］，InvestOph-thalmol Vis Sci，1990;31（12）:2529-2545.
［4］Stodtler M，Mietz H，Wiedemann P.Immunohistochemistry of anterior proliferative vitreoretinopathy ［J］.Int Ophthalmol，1994-95;18（6）:323-328.
［5］McGillem GS，Dacheux RF.Rabbit retinal muller cells undergo antigenic changes in response to experimentally induced prolif-erative vitreoretinopathy ［J］.Exp EyeRes，1999;68（5）:617-627.
［6］Grisanti S，Guidry C.Transdifferentiation of retinal pigment epi-thelial cells from epithelial to mesenchymal phentype ［J］.In-vest Ophthalmol Vis Sci，1995;36（2）:391-405.
［7］Schurch W，Seemayer TA，Gabbiani G.Myofibroblast in stern-berg ss ed Histology for pathologists ［M］.New York:Raven Press，1992;109-114.
［8］Nedelee M，Ghahary A，Scott PG.Control of wound contrac-tion.Basic and clinical features ［J］.Hand Clin，2000;16（12）:289-302.
［9］Toti P，Greco G，Catella AM.Morphological and pathogenetic aspects of proliferative vitreo-retinopathy.A histological and immunohistochemical study ［J］.DocOphthalmol，1994;88（2）:105-112.
［10］Vinores SA，Campochiaro PA，Mcgehee R.Simultaneous ex-pression of keratin and glial fibrillary acidic protein by the same cells in epithelial membranes ［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1992;33（12）:3361-3366.
［11］ Campochiaro PA.Pathogenic mechanisms in proliferative viteroretinopathy ［J］.Arch Ophthalmol，1997;115（2）:237-241.
［12］Lewis GP，Matsumoto B，Fiaher SK.Changes in the organiza-tion and expression of cytoskeletal proteins during retinal de-generation induced by retinal detachment ［J］.Invest Ophthal-mol Vis Sci，1995;36（12）:2404-2416.
［13］Gabbiani，Majno G.Dupuytren’s contracture:Fibroblast con-traction?an ultrastructural study ［J］.Am J Pathol，1972;66（1）:131-146.
表白的話語范文6
【關鍵詞】 惡性腫瘤； E-鈣黏蛋白； 上皮-間充質轉化
中圖分類號 R730.2 文獻標識碼 A 文章編號 1674-6805（2014）10-0158-03
近年來，國內外眾多學者研究發現，上皮間充質轉化（EMT）在惡性腫瘤的發生發展過程中起到不可或缺的作用。EMT賦予了正常組織細胞遷移和侵襲的特性，從而獲得類似于干細胞的潛質，使細胞正常的程序性衰老、凋亡減少，甚至導致免疫抑制。在EMT發生過程中，E-鈣黏蛋白（E-Cad）的缺失被認為是最主要、最基礎的因素，而直接或間接地導致E-鈣黏蛋白缺失的原因有很多。本文就分析影響E-黏蛋白在惡性腫瘤細胞中的表達的各個因素與上皮-間充質轉化的關系研究進展作一綜述。
1 E-鈣黏蛋白
E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-Cad）編碼基因定位于16號染色體擇q22.1附近，是介導上皮細胞間粘連的一種細胞粘附分子，對Ca2+有高度敏感性[1]。其編碼的蛋白質位于大多數上皮細胞的細胞膜上，屬于抑癌蛋白。在生理條件下，E-Cad通過增加細胞間的黏附力，并抑制細胞的增殖活動來維持人體各個器官組織結構的生理形態，從而發揮其抑制癌癥的功能。
目前研究認為，E-Cad基因在腫瘤組織中出現表達異常時，腫瘤細胞有很大概率的可能性從原發灶上脫落下來，即發生了腫瘤的轉移行為。E-Cad基因在各種因素的影響下表達下調，與腫瘤的分化程度、是否有遠處轉移和局部的侵襲性、區域淋巴結的轉移以及腫瘤的預后和患者的遠期生存率有十分密切的關系。E-Cad基因的表達下調是由多種因素影響而導致的，這些因素包括Snail、Slug、TGF-β、Twist等轉錄、調控因子，還包括PI3K/AKT、Wnt、Smad、EGFR、Notch等多條信號轉導通路。
2 上皮-間充質轉化
上皮-間充質轉化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）是一種基本的病理生理現象，在胚胎發育、慢性炎癥、多種纖維化疾病、腫瘤侵襲轉移等過程中發揮了重要作用。正常狀態的上皮細胞具有典型的頂面-底面極性，在人體中起保護、支持及分泌等作用。但近年來越來越多的研究發現，在多種病理的因素作用下，上皮細胞會失去細胞極性和細胞之間的黏附功能，具有類似間質細胞的形態和特性，從而獲得浸潤性和遷移能力，這種改變被定義為上皮間-充質轉化現象。因此上皮-間充質轉化是以上皮細胞極性消失，以及獲得間質特性為主要特征，在形態學上發生成纖維細胞或間充質細胞的轉化，并獲得遷移轉移的能力[2]。在上皮-間充質轉化過程中，一個重要的分子事件就是E-Cad表達下調，導致細胞間的黏附功能喪失，細胞遷移能力增加。
3 影響E-鈣黏蛋白表達下調因素與上皮-間充質轉化的關系
3.1 E-Cad表達下調與波形蛋白（Vimentin）表達升高
在EMT發生過程中，E-Cad表達下調的同時，常伴隨有多種間充質相關蛋白的升高，其中較為明顯的是波形蛋白（Vimentin）的表達升高。波形蛋白表達升高會干擾E-Cad介導的細胞黏附，從而增加腫瘤細胞的遷移性。轉移中的腫瘤細胞可以伸出偽足，內有許多肌動蛋白聚集成絲，這些肌絲的收縮推動了細胞的前進；同時，癌細胞分泌蛋白酶降解細胞外基質，使基底膜產生局部缺損，以允許癌細胞通過[3]。Irie等[4]的研究中提到了蛋白激酶B（AKT或PKB）在調節腫瘤細胞轉移和侵襲時的功能特異性。AKT1的下游調節可增強表皮生長因子（EGF）應答刺激中的遷移，從而誘導出EMT的表型：即抑制E-Cad表達，而波形蛋白表達略有增加。相比之下，AKT2下游調節就不能加強細胞遷移或改變E-Cad的表達，但其可以減少波形蛋白的表達。
徐浩翔等[5]在綜述中提到了Singh在2003年發表的一個實驗：比較高侵襲性前列腺癌細胞LNCap和低侵襲性癌細胞CL1的差異蛋白時發現，LNCaP中波形蛋白的含量是CL1細胞含量的20倍，向LNCaP細胞和CL1細胞分別導入表達反義波形蛋白和正義波形蛋白的載體以改變波形蛋白的含量，結果發現原本高侵襲性LNCaP細胞的遷移數量明顯減少，低侵襲性CL1細胞的波形蛋白表達水平升高但其遷移程度未明顯改變，所以他們認為癌細胞中波形蛋白的高表達與細胞的侵襲性相關，波形蛋白可能通過作用于其他蛋白或者影響細胞侵襲過程較晚的階段才能最終改變細胞的遷移能力。
3.2 轉化生長因子β（TGF-β）在上皮-間充質轉化中的重要作用
TGF-β為一種腫瘤抑制基因，能夠抑制上皮細胞增殖、促進凋亡、刺激上皮分化、增強基因組穩定性及促進細胞衰老。因此，在許多惡性腫瘤中均可出現TGF-β信號通路組份表達下調。TGF-β可通過參與調控細胞生長、增殖、凋亡、侵襲、血管生成、免疫監視等眾多關鍵過程誘發上皮-間充質轉化，進而影響腫瘤的轉移。其主要機制是TGF-β可通過Smad依賴通路從而誘發EMT的發生。另外TGF-β還可與低氧環境協同抑制E-Cad表達。TGF-β信號通路中的TGFBR是一種腫瘤抑制基因，其缺失可導致腫瘤的發生。
Vincent等[6]研究表明：典型的Smad依賴通路誘導的EMT過程如下：TGF-β首先與胞膜上的兩個TGF-βⅡ型受體（TpR Ⅱ）及兩個TGF-βⅠ型受體（TpR I）的復合物作用。TpR Ⅱ激活TpR I后與下游的Smad 2和Smad 3以及胞內的Smad 4結合成三聚體，進入細胞核，作用于多個轉錄因子如CAR、occuludin、claudin-3以及E-cad，促進EMT發生。Theys等[7]在2011年進行了E-Cad缺失與EMT在人類腫瘤細胞中聯合促進放射線抗性的研究，研究者運用微陣列在缺氧條件下分析基因表達的改變，并用實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）的方法進行驗證；用Western blot和免疫組化來研究暴露在低氧環境中的上皮表型轉換，加入轉化生長因子β（TGFβ）或腫瘤基因的激活；用克隆存活方法分析電離輻射后的細胞生存狀態。實驗結果發現在低氧狀態、加入TGF-β或EGFR Ⅷ表達的情況下都可導致MCF7、A549和NMuMG上皮細胞出現紡錘體形，以及失去細胞之間的接觸；將低氧和TGF-β或EGFR Ⅷ表達聯合作用，可出現更快更顯著的EMT樣表現。在血管內皮生長因子（VEGF）基因表達和EMT環境中可觀察到TGF-β和低氧的協同作用，且兩者都是抑制E-Cad活性的重要物質。
3.3 其他因子
Snail、Zeb、E47和KLF8因子與E-Cad啟動子E-box結合并抑制其表達，而Twist、Goosecoid、E2.2和FoxC2因子則是間接地抑制E-Cad轉錄[8]。
洪倫[9]總結文獻表明，目前研究較成熟的信號通路下游有關EMT的轉錄因子主要有轉錄因子Snail、Slug、SIP1及調控因子Twist等。這類DNA結合蛋白可以通過同SIP1競爭性結合E-Cad基因啟動子部位的E-box連接序列，直接下調E-Cad及上調間質來源的波形蛋白表達，從而引起EMT。Twist還能直接增強Snail的表達從而導致腫瘤發生EMT。Eduard[10]研究也表明了Snail同樣也可作用于E-box而抑制E-Cad的表達，并在MDCK（狗腎傳代細胞，Madin-Darby canine kidney）上皮細胞、口腔癌、肺癌A549細胞等研究中均有此發現。
3.4 信號通路，如EGFR、PI3K/AKT、Wnt、Smad及Notch通路也參與E-Cad表達下調
在轉移性惡性腫瘤中，PI3K/AKT是研究得比較深入的一條重要通路。AKT是信號轉導途徑中重要的蛋白激酶，其中PI3K下游的靶蛋白，是PI3K/AKT信號轉導通路的核心，目前大量研究表明在人類許多種類的腫瘤中可發現AKT過表達，PI3K/AKT通路的持續活化與腫瘤的發生發展密切相關。PI3K/AKT通路主要通過增加腫瘤細胞的運動能力、對生長因子受體（如IGF-IR）的調節作用、降低細胞間的黏附力、對細胞外基質的影響、增加核轉錄因子的活性（如活化的AKT可增加轉錄因子NK-κB活性，從而上調MMP-2＼MMP-9和COX-2的表達，促進癌細胞侵襲）、對轉移相關的酶的磷酸化及其本身的活化具有細胞膜轉位的能力等幾個方面來促進惡性腫瘤轉移。
Grille等[11]研究表明，人類鱗癌細胞株SCC15轉染myr-AKT（激活型AKT）后喪失了鱗狀上皮細胞的形態學特征，呈現了成纖維細胞樣特點。Western-Blot檢測親代SCC15無彈性蛋白（間充質細胞標記）的表達。而轉染v-AKT（非激活型AKT）細胞則反之。共聚焦顯微鏡顯示SCC15的平均高度為6.0 μm，而轉染了AKTc（AKT抑制基因）的SCC15細胞大約有3.8 μm。由此得出結論：激活的AKT誘導產生EMT。在轉染v-AKT的細胞中β-連環蛋白和p130cas都顯示為表達下降。AKT直接影響了上皮細胞的形態學特征、成瘤性、細胞運動力和侵襲力。研究數據顯示，PI3K被SRC和RAS激活后激活下游AKT，再激活靶蛋白Rac和Rho（兩種小G蛋白），它們與細胞骨架重構，細胞遷移和侵襲有關。AKT還能抑制E-Cad的基因的轉錄[12]。
Luika[13]研究觀察到：N1IC可能通過snail誘導降低了血管內皮鈣黏蛋白（VE-Cad）的表達。故Notch通路可在體外培養的永生化內皮細胞中誘導snail，導致EMT的發生。朱智杰等[14]總結國內外文獻資料表明，Wnt信號通路可通過下調E-Cad表達從而誘導EMT。其主要機制：在沒有Wnt信號時，大部分β-連接蛋白與E-Cad和細胞骨架蛋白結合形成復合物維持其穩定性，使胞質內游離的β-連接蛋白維持在低水平，不能進入核內激活作用靶點；在有Wnt信號存在時，形成Wnt蛋白、Frizzled和LRP5/6的復合物，信號通過作用于胞質內復合物，使復合物失活，并發生解離，結果導致β-連接蛋白在細胞質內積累，轉位進入細胞核，誘發EMT發生。
Irie等[4]研究發現：在頭頸部鱗狀細胞癌腫瘤中，過度激活EGFR通路與腫瘤更強的侵襲性和不良的預后有關。EGFR通路的逐級激活反過來可導致基因的轉錄，這是細胞周期進行的主要原因。EGFR通路在許多人類癌癥中有高表達，包括頭頸部癌，導致輻射抗性和腫瘤發展。越來越多的證據表明EGFR通路可在若干種腫瘤發生EMT時調節蛋白質的表達，這個發現可用高表達E-Cad的頭頸部腫瘤模型來證明，這個腫瘤模型對抗EGFR抗體西妥昔單抗高度敏感，然而一個表達波形蛋白的腫瘤品系顯示出對西妥昔單抗的低度敏感性。研究者發現，盡管在高表達E-Cad和高表達EGFR片段之間有著微弱的聯系，但并不是所有表達E-Cad的腫瘤細胞都會表達EGFR。人類多種惡性腫瘤中均可檢測到EGFR mRNA或蛋白質過度表達，伴有或不伴有EGFR基因的擴增。EGFR的表達或與其配體的共表達也與結腸癌、乳腺癌、胰腺癌的預后不良有關。
3.5 EMT誘導物
還有一些新發現的EMT誘導物，如兩個酪氨酸磷酸酶：Pez和PRL3，兩者均可促進EMT發生。TGF-β可誘導Pez，且Pez的充分表達可通過Snail通路和Zeb基因在MDCK細胞中引發EMT。Pez也可誘導TGF-β生成，形成一個自分泌激活循環回路。PRL3則是通過在克隆出的癌細胞中激活PI3K/AKT來誘導EMT發生。這些通路的作用加強可增加PTEN的降解，并激活Snail1；因為在輻射誘導細胞凋亡中PTEN是Snail抑制的直接靶點，因此這些通路也可能加強抑制PTEN表達。Podoplanin黏蛋白在MDCK細胞中通過激活RhoA誘導EMT發生。盡管在體外培養的胰腺腫瘤模型的浸潤前沿細胞中有E-Cad表達，但Podoplanin在此區域也依然可表達，這個現象可推延至其他高發的高度惡性腫瘤中。也許提高人類腫瘤樣品的浸潤前沿細胞的單個細胞分辨率，對其進行更深入的研究可明確E-Cad和Podoplanin表達的關系[8]。另外一些實驗表明，在口腔癌的進展過程中，E-Cad表達下調可由遺傳和表觀遺傳基因導致，如基因突變和啟動子序列的甲基化[15]。
根據以上文獻資料顯示，導致E-Cad表達下調的因素有多種，其中較為重要的主要有：轉錄因子Snail、Slug；調控因子Twist[16]；波形蛋白[17-18]；信號通路PI3K/AKT、Wnt、TGF-β的Smad依賴通路、EGFR通路、Notch通路；基因甲基化等。各因素最終結果均可通過下調E-Cad表達，從而誘導上皮細胞發生EMT，使腫瘤細胞獲得轉移及侵襲能力。多項研究已經證實，在消化系統惡性腫瘤（如口腔癌、食管癌、肝癌、胰腺癌[19]、胃癌等）、呼吸系統惡性腫瘤（喉癌、鼻咽癌、肺癌等）、乳腺癌、惡性黑色素瘤[19]等處的腫瘤侵襲和轉移過程中均有EMT的發生，并且其程度與腫瘤的惡性程度呈明顯正相關。
4 展望
正是由于EMT的發生，在臨床上治療惡性腫瘤較為困難且難以做到靶向治療。其原因在于細胞表型的變化以及有關信號通路及轉錄因子的改變與腫瘤對化療藥物的治療反應間存在聯系。隨著放療化療的進行，多種腫瘤細胞能通過逐漸發生EMT來“逃避”治療所致的凋亡，進而使得細胞具有更強的轉移特性。另外，由于腫瘤上皮細胞發生了EMT，細胞將表達間質分化標志物，同時對靶向治療上皮的化學治療藥物敏感性下降。因此，深入了解導致E-Cad表達下調的因素可在一定程度上有目的地針對該因素進行抑制，阻止EMT發生，或減少其發生程度，使惡性腫瘤治療生存率提高。
參考文獻
[1]陳宇，杜勇，李浩渤，等.E-鈣黏蛋白在口腔鱗狀細胞癌中的表達及意[J].河北醫藥，2012，34（13）：1942-1943.
[2]李飛鳳，周建華，胡永斌.核轉錄因子Snail調控上皮-間質轉型機制的研究[J].現代生物醫學進展，2011，11（20）：3961-3963.
[3]胡逢春.上皮-間充質轉化的生物學作用[J].國際口腔醫學雜志，2011，38（2）：207-213.
[4] Irie H Y，Pearline R V，Grueneberg D，et al.Distinct roles of Akt1 and Akt2 in regulating cell migration and epithelial-mesenchymal transition[J].Cell Biol，2005，171（14）：1023-1034.
[5]徐浩翔，閆言.波形蛋白表達和功能的研究進展[J].北京大學學報，2009，41（5）：605-607.
[6] Theresa Vincent，Etienne P A Neve，Jill R Johnson，et al.A SNAIL1/SMAD3 or 4 transcriptional repressor complex promotes TGF-beta mediated epithelial-mesenchymal transition[J].Nature Cell Biology，2009，21（8）：943-950.
[7] Theys J，Jutten B，Habets R，et al. E-Cadherin loss associated with EMT promotes radioresistance in human tumor cells[J].Radiotherapy and Oncology，2011，99（14）：392-397.
[8] Jean Paul Thiery.Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease[J]. Cell，2009，139（41）：871-890.
[9]洪倫.上皮-間質轉化及相關microRNA分子與腫瘤的惡的研究進展[J].中國癌癥雜志，2011，21（9）：725-730.
[10] Eduard Batlle.The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumor cells[J].Nature Cell Biology，2000，12（1）：84-89.
[11] Grille S J，Bellacosa A，Upson J，et al. The protein kinase Akt induces epithelialmesenchymal transition and promotes enhanced motility and invasiveness ofsquamous cell carcinoma lines[J].Cancer Res，2003，63（14）：21722178.
[12]胡蕾.PI3K/AKT信號轉導通路與腫瘤轉移及其機制的研究進展[J].醫學綜述，2006，12（22）：1375-1377.
[13] Luika A.Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation[J].Genes Dev，2004，18（9）：99-115.
[14] 朱智杰，阮君山，李堯，等.Wnt信號通路誘導腫瘤細胞上皮間質轉化的研究進展[J].中國藥理學通報，2012，28（7）：904-907.
[15]劉墨，張斌，王成，等.轉化生長因子β1誘導人舌鱗狀細胞癌上皮-間質轉化及其順鉑耐藥性研究[J].中華口腔醫學研究雜志，2012，6（3）：223-230.
[16] E H Gort. The TWIST1 oncogene is a direct target[J].Oncogene，2008，27（16）：1501-1510.
[17] Monique M.Expression of E-cadherin and vimentin correlates with metastasis formation in head and neck squamous cell carcinoma patients[J]. Radiotherapy and Oncology，2011，99（24）：344-348.
[18] Chaw S Y.Epithelial to mesenchymal transition （EMT） biomarkers E-cadherin，beta-catenin，APC and Vimentin in oral squamous cell carcinogenesis and transformation[J]. Oral Oncology，2012，48（12）：997-1006.