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單擺周期范文1
用單擺測定當地重力加速度是中學物理教學過程中的一個重要的學生實驗，而測定周期對實驗產生很大的誤差，傳統的方法是用人工計時、計數，多次測量（30～50次）取平均值的方法，這種方法雖然能消除偶然誤差的影響，但計時起點和終點位置選擇，以及人的反應時間，實驗習慣，會對實驗產生很大的影響.
本裝置采用磁性傳感器采集數據，能將振動時間和振動次數同步顯示在兩組數碼管上，利用磁傳感器，很好地解決同步難的問題，大大節省實驗時間，提高了實驗效率.本裝置有聲光提示功能，趣味性強，器材成本低，便于學生動手制作，是中學物理分組實驗首選方案之一，值得推廣.
2研究報告
2.1該項目的背景和改進的基本思路
測定單擺全振動的周期，傳統的方法會產生很大誤差，實驗室中傳感器只能看到實驗結果，不能看到實驗過程.用單片機來完成測定振動時間及振動次數一般不能做到同步顯示數據，原因是單片機只能一步步執行程序，做到兩件事同時同步很難，因為單片機每執行一步程序都要做判斷，會費時間.本裝置利用兩塊顯示屏，一個單片機，一個計時器，很好地解決同步難的問題，且可以脫離電腦，直接通過面板來編程.
2.2研究方法
文獻資料收集法、科學實驗對比法.
2.3工作原理
通過單片機編程實現輸入單擺全振動次數，測定總時間，實現聲光同步，高精度測定單擺振動周期.
2.4創新思路
（1）本裝置由于采用磁性傳感器采集數據，計時準確，對計時起點選擇無特殊要求，只要測幾次即可，大大節省實驗時間，提高了實驗效率.且可以通過與磁性傳感器串聯的手動開關實現排除前幾次不穩定的全振動，振動過程中隨時打開手動開關，即可采集數據.
（2）本裝置能將振動時間和振動次數同步顯示在數碼管上，直觀鮮明，便于學生進行分組實驗.
（3）本裝置利用兩塊顯示屏，一個單片機，一個計時器，一個磁性傳感器，很好地解決同步難的問題.且可以脫離電腦，直接通過面板來實現C語言編程，用機器碼來代替程序.
（4）本裝置與同類產品相比，智能計數，同步顯示，同步計時，且計時開始和結束都可通過面板編程來實現所需要的聲音提示，優勢更明顯，趣味性強，制作成本低，便于學生制作，值得推廣，是中學物理實驗首選方案之一，具有較高的經濟社會價值.
2.5單片機程序
地址機器碼文字說明
0008 13 00按DA鍵開始執行程序
0309 13 03是否松開DA鍵了
0604 00數碼管顯示00
0808 12 08按下減1鍵沒有
1109 12 11松開減1鍵來嗎
1406 01數字加1
1600 00端口0號燈亮
1803 00 00 用音樂休止延時0.1秒
2101 00關閉0號燈
2303 27 02奏高音7，半拍
2608 12 26再次按下減1鍵了嗎
2909 12 29松開減1鍵了嗎
3206 01數字加1
3411 10 39是否感應了10次了，等于10次了跳轉到39
地址去執行程序，不滿10次轉26地址繼續
3710 26轉向26地址執行
3908 12 39按下減1鍵了嗎
4209 12 42松開減1鍵沒有
4506 01 數字加1
4700 00端口0號燈亮
4903 00 04用音樂休止延時1秒
5201 00關閉0號燈
5403 27 02奏高音7
5708 12 57等待按下減1鍵
6009 12 60等待松開減1鍵
6310 00感應滿11次了，轉向00地址重新開始
2.6進一步完善的設想
用液晶顯示屏同步顯示單擺振動時間和振動次數.用電容、電感傳感器或光電傳感器讀取全振動次數，比磁傳感器效果更好，用磁傳感器的缺點是單擺做阻尼振動，全振動次數會減少.
2.7制作方法
（1）安裝鐵架臺、鐵夾，細線和磁性擺球.
（2）制作小木盒，安裝cd2051單片機、數碼管、干簧管、電源開關、手動開關.
（3）為單片機輸入用C語言編寫代碼程序.
（4）設定全振動次數，進行實驗和調試.
2.8使用方法
（1） 單片機啟動方法如下：先按一下復位鍵，按住D/A鍵（不要松手），再按+1鍵，使數碼管顯示帶電的“10”，松開+1鍵（D/A鍵仍然按住）同時按一下W鍵后松手.
（2）斷開手動開關，按一下+1鍵等待計數.
（3）讓擺球偏離平衡位置放手，剔除前幾次全振動，待穩定后接通手動開關開始計數.
（4）開始計數（第1次，有聲音提示），設定次數到（例如：全振動5次，n取11），結束計數（第11次，有聲音提示），讀出記錄的總時間t.
（5）由周期公式T=2tn-1計算單擺周期.
3數據分析
單擺周期范文2
一、由于重力加速度變化而引起的周期變化
【例1】單擺在半徑為R1、質量為m1的地球表面的周期為T1，若通過宇宙飛船帶到半徑為R2的另一顆星球表面時，其周期為T2，試求兩種情況下的周期之比.
解析：根據萬有引力定律有= m′g，再根據單擺周期公式T =2π可得，=.
一般來說引起重力加速度變化的原因有：緯度的變化、高度的變化、場環境的變化，為此可將單擺運動知識與萬有引力知識、天體運動知識結合起來求解.
二、由于擺球受到浮力而引起的周期變化
【例2】用一根長為l的細線懸掛一個密度為ρ的小球，并將其放在密度為ρ0（ρ0 < ρ）的液體中，不計液體對小球的運動阻力，試求小球在平衡位置附近做小幅振動的周期.
解析：將重力mg = ρgV和浮力F = ρ0gV（V為小球的體積）合成一個等效重力mg′，則有mg′= ρgV- ρ0gV，即g′= （1-）g.
由此可得小球的振動周期為T =2π=2π.
三、由于單擺處于非慣性系中而引起的周期變化
【例3】如圖2所示，沿平直軌道以加速度a做勻速直線運動的車廂中，用一根長為l的細線懸掛一質量為m的小球，求小球在平衡位置附近做小幅振動的周期.
解析：小球在相對車廂靜止時，根據物體受力平衡得到等效重力mg′為mg′=，即mg′=m，則g′=.
故此可得小球的振動周期為T=2π=2π.
【例4】如圖3所示，將一單擺掛于小車上，將小車放于一輛傾角為θ的斜面上，當小車在斜面上加速下滑時，擺線與豎直方向的夾角也為θ.已知擺球直鏈狀為m，擺長為l，重力加速度為g，求此單擺的周期及小車與斜面間的動摩擦因數.
解析：由圖示可知小車運動過程中，擺線的拉力F = mgcosθ，則g′ = gcosθ，故T =2π.
再由受力分析可知，動摩擦因數μ = 0.
一般這些階段的非慣性系系統指處于勻變速直線運動的力學裝置，在此前提下就可用類比法快速求解此類問題.
四、由于單擺處于勻強電場中而引起周期的變化
【例5】將一帶電擺球置于一水平向右的勻強電場中，如圖4所示.擺球靜止時與豎直方向之間的夾角為α，已知擺球質量為m，擺長為l，帶電荷量為Q.現若將擺球拉離靜止位置一個很小的角度釋放，求其振動周期；若要使擺球擺到豎直方向時速度為零，應將擺球拉離豎直方向一個多大的角度？
解析：擺球靜止在平衡位置時的拉力F=，則g′=，故此擺球的振動周期為T=2π=2π.
一般當單擺處于勻強電場中時，由于所受的電場力為恒力，與重力的合力仍為恒力，運用類比法求解簡捷、快速.
五、單擺周期公式的拓展運用
【例6】有一擺鐘在地面上走時準確，其標準周期T0 = 2s，現將其移到高山上，發現它一晝夜慢了1min，求此山的高度.已知地面重力加速度g0=9.8m/s2，地球半徑R0=6400km.
解析：設擺鐘在標準時間內的振動次數為N，則其在標準時間內指示的時間t=N?T，在標準時間內慢的時間就應為t=N?T，其中N=，T=T-T0.
再由=（），代入已知數據可解得h=4450m.
由上述解題過程可歸納出一個有用的結論：鐘在標準時間里指示的時間與擺振動的次數成正比，跟鐘擺的振動頻率成正比.寫成比例關系式為：=====.據此可根據題目的特點，達到快速、簡捷求解的目的.
【例7】豎直放置的光滑圓弧形球面半徑R較大，在弧面中心O正上方高h處放置一個小球A，當A自由下落的同時，另一個小球B從球面某處C（OC弧遠小于半徑R）由靜止開始滾下，為時兩球相碰，h應滿足什么條件？
解析：根據題意，小球B在光滑圓弧面上滾動等效于單擺，擺長即為圓弧半徑，周期T=2π，考慮到單擺運動的周期性，由相碰的條件有（2n-1）=，解得h=R（n= 1，2，3，…）.
一般類單擺模型的計算，主要是求解其等效擺長或等效重力加速度.
練習
1. 已知北京的重力加速度g1=9.812 m/s2，南京的重力加速度g2=9.795 m/s2，在北京準確的鐘擺，如果放在南京，鐘將走慢還是走快？一晝夜差多少？要使其走時準確，如何調整擺長？
單擺周期范文3
【摘要】 腎臟細胞增殖與凋亡異常在腎臟疾病中具有重要意義，其調控最終發生在細胞周期水平上，細胞周期抑制蛋白P27屬于細胞周期負向調控蛋白，與多種腎小球疾病中細胞增殖和凋亡異常有關，可能影響腎臟疾病進展，對此深入研究可為腎臟疾病的防治提供新的啟示。
【關鍵詞】 細胞周期； 細胞周期調控蛋白；腎小球疾??；P27
【Abstract】 Evidence is accumulating that those directly responsible for the rate of progression of glomerular disease are specific positive（cyclins and cyclin-dependent kinase）and negative （cyclin-kinase inhibitors） cell cycle regulatory proteins.P27 diffects glomerular cell proliferation and apoptosis as a kind of negative cell cycle regulatory proteins and may highly relate to the progress of renal disease.Ultimately the goal is to find ever more appropriate therapeutic strategies to arrest or prevent progressive renal disease.
【Key words】 cell cycle; cell cycle regulatory proteins;glomerular disease;P27
腎小球硬化是多種原因引起腎小球損傷后出現的共同轉歸，是腎功能衰竭的主要病理基礎。而導致腎小球硬化最主要的原因就是系膜細胞增生和細胞外基質增多。其中細胞外基質的增多與系膜細胞增生又密切相關［1］。因此，探討腎小球系膜細胞增生的內部機制及如何對其進行調控，已成為腎臟病領域的一個研究熱點。
近年研究表明，細胞增生的調節最終都發生在細胞周期水平上，而細胞周期又受細胞周期調控蛋白的調控，細胞周期調控蛋白按其功能分為細胞周期正控蛋白和負控（抑制）蛋白。正控蛋白促進細胞周期進程，負控蛋白抑制細胞增生［2,3］。
1 細胞周期的概念
細胞增殖周期通常簡稱細胞周期，是指細胞從上一次細胞分裂結束到本次分裂終了的過程或間隔時間。根據細胞周期不同時相的特點，可將細胞周期分為4個連續階段，即G1期 （gap phases 1），S期 （synthesis phase）,G2期（gap phases 2）及M期（mitotic phase）。細胞周期具有單向性和階段性，細胞可因某種原因在某時相停滯下來，待生長條件好轉后，細胞可重新活躍起來過渡到下一時相［4,5］。
1.1 G1期 是指從上一次有絲分裂完成到本次DNA復制之前的過程，持續時間一般為6～12h。G1期細胞的主要任務是積累能量和原料，為DNA的復制做準備，故又稱DNA合成前期。
1.2 S期 即DNA合成期，持續時間一般為6～8h。S期末DNA含量增加1倍，細胞由二倍體變為四倍體。S期DNA的復制極其準確，每一段DNA只復制一次，從而可保證分裂后子細胞的遺傳物質平均分配。
1.3 G2期 是指從DNA復制完成到有絲分裂開始的時間區間，持續時間一般為3～4h，只有完成了所有DNA復制后，細胞才進入G2期。故G2期又稱DNA合成后期或有絲分裂前期。
1.4 M期 即有絲分裂期，一般持續時間為1h。在M期，細胞一分為二，一次細胞周期即告結束。本質上看，有絲分裂就是把細胞內已經倍增的大分子平均分配到2個子細胞中去。
此外，G0期 （靜止期）不包括在細胞周期內，細胞在適宜刺激下能被觸發，從G0期進入G1期。G1期在一定條件下也可退入G0期。此外，在細胞周期中至少有兩個檢查點，分別在G1/S和G2/M期。細胞周期的進程可停滯或終止于該處［6］。
2 細胞周期調控蛋白
2.1 細胞周期正控蛋白
2.1.1 周期素家族 （cyclin） 是一組結構類似能結合并調節周期素依賴蛋白激酶（CDK）的蛋白質，統稱為cyclin家族。目前知道的有8種成員，即cyclinA，cyclinB，C，D…H。每一種cyclin有若干亞型，如D型包括D1，D2，和D3。周期蛋白在細胞周期的不同時相程序性合成與釋放。它們作為調節亞基，需與特定的CDK結合，才能形成具有活性的全酶而促進細胞周期的進程。
2.1.2 周期依賴蛋白激酶家族（cyclin dependent kinase,CDK） 目前發現7種成員,有不同程度的同源性，故稱CDK家族，各成員命名為CDK1，2，3…7。CDK含有催化亞基，但需要cyclin提供調節亞基才有活性，所以通常以cyclin- CDK復合物形式出現［6］。其中CDK2活性于G1晚期開始升高，在S期和M期達高峰，CDK2對G1/S轉換是必須的。CDK的上游尚有CDK活化激酶，CDK也能與CDK的抑制物（負控蛋白）結合，而抑制細胞周期。
2.2 細胞周期負控蛋白（CDI） 又稱周期素依賴激酶抑制物（CDI）。這些負控蛋白可與cyclin相互作用結合CDK而抑制全酶活性，從而抑制細胞增生。根據結構和所抑制的cyclin-CDK復合物的不同，可分為INK4（Inhibitor of CDK4）家族和CIP/KIP家族。INK4家族包括P15，P16，P18，P19等，可特異抑制cyclin-CDK4/6的磷酸化激酶活化而抑制細胞增生。CIP/KIP家族包括P21，P27，P57等，可抑制已知的大多數cyclin-CDK復合物的激酶活性，對G1期的早期與晚期、S期等各期都有重要作用，且分布與功能在不同的細胞各異，是目前的主要研究對象。其中P27作為一種重要的細胞周期負控蛋白，在腎小球疾病中的表達受到廣泛的重視［7］。
2.3 關于P27 1994年發現并克隆出P27基因。P27最初從用TGF-β或細胞接觸生長抑制的水貂肺細胞中分離出來的，被認為是一種熱穩定蛋白。P27與cyclin-CDK結合成復合物，對后者有無抑制作用主要取決于P27的量，即所謂以化學劑量方式起作用。G0期細胞P27水平較高，從G0期到S期逐漸降低，在經過一個臨界值后失去對cyclin D CDK4或cyclin D CDK6的抑制作用［8］。P27 在G1期維持較高水平，主要由于下述情況引起的周期阻滯：TGF-β處理、接觸抑制、血清去除、Lovastatin處理、CAMP處理等［8］。IL-2可誘導外周血T細胞P27水平降低。單獨用CSF-1（集落刺激因子-1）刺激巨噬細胞可使P27水平下降，改用“CSF-1+CAMP”刺激，則P27不下降，P27主要受細胞外刺激誘導表達。P27與P21有協同作用。P27的作用特點：（1）非特異性，P27可抑制所有CDK的活性。（2）化學劑量依賴性。
3 P27與腎小球疾病
作為一種重要的細胞周期負控蛋白，在正常靜止狀態下，P27在三種腎小球固有細胞都有相當強的結構型表達，它在腎小球疾病的細胞周期調控中起重要作用［2］。
3.1 對腎小球系膜細胞的影響 腎小球系膜細胞（MC）的增生及相應的系膜擴張是腎臟疾病的常見病理現象。以前的研究多局限于細胞外刺激因子（如細胞因子等）對細胞增生的影響，而對細胞外刺激因子怎樣通過細胞內信號傳導影響細胞增生的機制研究較少?，F已明確，細胞增生受細胞周期調控蛋白控制。很多研究表明，P27可抑制MC增殖［3］。
近來研究發現，體外培養的MC予促分裂原如血小板源生長因子（PDGF）、內皮素-1或堿性成纖維細胞生長因子（bFGF） 刺激后早期細胞周期素D和CDK4增加，隨后CDK2與細胞周期素E，繼而細胞周期素A數量及生物活性增加，而P27明顯降低；予體外培養的MC轉染針對P27的反義寡核苷酸可增強對PDGF、bFGF等的增殖反應；Terada等也證實舒降之 （lovastatin）通過提高P27蛋白水平可抑制系膜細胞增殖，使細胞周期停止于G1期，也可抑制細胞外基質如IV型膠原，層粘連蛋白和纖維連接蛋白的合成與積聚，并明顯改善腎功能［9］。大鼠抗Thy1腎炎模型中P27與MC的增生程度呈負相關，早期P27明顯下降，至MC增生最甚的第5天幾乎不能測及，隨后在MC停止增殖的恢復期P27水平回復到基礎值，表明P27的下降可使細胞周期從G1期進展到S期，從而產生細胞增殖［10］；另外，有發現盡管Thy1腎炎大鼠及正常大鼠間腎小球P27水平差異有顯著性，但兩者P27mRNA水平差異無顯著性，這同細胞上獲得的結果相似，提示體內腎小球細胞可能是在轉錄后水平調節P27的表達，從而使Thy1腎炎腎小球P27水平降低［11,12］。在P27野生型（P27+/+）與P27基因敲除 （P27 -/-）小鼠試驗中發現，正常生理狀況下缺乏P27對腎臟DNA合成無影響，但在增生性腎小球腎炎模型中，P27-/-小鼠腎小球DNA合成及細胞增殖早，且在各時間點其程度皆明顯甚于P27+/+小鼠；將前者作全身照射，并予正常P27+/+小鼠的骨髓移植后再行腎炎模型，證明上述結果與免疫反應的差異無關，腎小球內P27的水平調控著對損害的增生閾值及程度。在抗腎小球基膜抗體誘發的新月體腎炎模型中，與P27+/+相比，P27-/-小鼠的腎臟反應（包括細胞增生、新月體形成和基質蛋白合成積聚等）發生更早，程度更為劇烈，損害也更為嚴重［2］。在實驗性腎小球腎炎模型中，P27-/-小鼠腎小球細胞凋亡較P27+/+的小鼠為著，而予P27-/-的小鼠再轉染P27又可避免凋亡，提示P27有防止腎小球細胞凋亡的作用［3］。
3.2 P27對足細胞增殖與分化的影響 足細胞（腎小球臟層上皮細胞）是獨特而高度分化的細胞，其對損害的反應不同于MC或內皮細胞，成熟足細胞通常已喪失增殖能力；在胚胎發育過程中腎小球發生的早期階段未成熟足細胞具有增殖能力，但S狀生腎囊泡形成后即退出增殖周期而成為終末分化的靜止細胞，且維持此終末分化靜止狀態是成熟足細胞保持正常功能結構，履行生理功能特別是腎小球濾過屏障所必需［13］。動物實驗提示在生腎過程中具有增殖能力的足細胞轉型為靜止細胞有賴于P27的表達上調，而維持成熟足細胞靜止和終化狀態可能與P27持續表達有關［2,3］。近年研究發現失去增殖能力的足細胞可能是許多類型腎小球硬化發生的基礎。Wolf等［14］認為雖然隨著年齡的增長，足細胞逐漸老化，但由于腎臟足細胞缺乏增生能力，導致足細胞不能相應的分裂增生，從而使足細胞功能受損，不能很好的覆蓋腎小球基底膜，繼而腎小球基底膜功能受到損害，導致腎臟硬化，因而推測P27可能是老年人腎臟功能逐漸喪失的重要因素。在實驗性膜性腎病動物模型（被動性Heymann腎炎）中，予足細胞FxLA抗原的抗體可造成對足細胞補體依賴性損害，免疫染色顯示足細胞內細胞周期素A和CDK2并無降低，甚有增高，但P27顯著增高。免疫沉淀反應示P27與細胞周期素A- CDK2復合物的結合增加從而抑制DNA合成。由于足細胞缺乏修復損傷或丟失細胞的能力使腎小球基膜致腎小球壁層上皮細胞侵占基膜以及腎小球毛細血管粘連是足細胞損害后階段性腎小球硬化進展的重要因素［3,13］。正常成人腎小球足細胞有相當高的P27結構性表達，但缺乏P21；人類大多數累及足細胞的腎臟疾病如微小病變，膜性腎病等皆缺乏足細胞增生，也未證實有相關的細胞周期素與CDK上調及（或） CDI明顯降低。但在特發性塌陷性腎病和人類免疫缺陷病毒相關腎病以及細胞性局灶節段性腎小球硬化的足細胞可檢及細胞周期素A表達增加及P27明顯降低甚或不能檢及，伴P21的重新表達，并出現足細胞增生，常有腎功能急劇減退，提示P27等CDI對足細胞病變的結局有決定性影響［2,15］；最近研究顯示這些增生的腎小球臟層上皮細胞失去正常成熟足細胞的多種標記（如WT1,podocalyxin、synaptopodin、GLEPP-1等）,出現表型調節異常和不再分化,可能是重要的病理基礎［13］。
4 展望
總之，細胞周期抑制蛋白P27與腎小球細胞增殖有關，深入研究P27在腎小球疾病中的作用，有助于增加對腎臟疾病發病機制的認識。P27表達的調控可能影響腎臟疾病的進展，為腎臟疾病的防治提供新的途徑。
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單擺周期范文4
關鍵詞 糖腎Ⅰ號 周期蛋白 糖尿病腎病 中醫藥療法 實驗研究
糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見的并發癥，也是引起終末期腎病(ESRD)的主要原因之一。如何有效地控制糖尿病腎病的發病率及其進展已成為當今醫學界一個關鍵課題。DN確切發病機制至今仍未完全闡明，治療亦缺乏有效辦法。因此，積極尋找防治DN的有效藥物，在DN尚處于早期階段就給予針對性的防治，對控制和延緩腎臟病的進一步發展具有重要意義。糖腎Ⅰ號是筆者針對DN之氣陰兩虛、脾腎虧虛、燥熱血瘀的復雜病機，結合自己臨床多年治療DN的經驗而擬定。近年來我們通過觀察糖腎Ⅰ號對早期糖尿病腎病大鼠的生化指標及PCNA表達的影響，探討其可能的作用機理，以期為臨床防治DN提供實驗依據。
1 實驗材料
1.1 實驗動物：SD雄性清潔級大鼠50只，體重(200士20)g，由溫州醫學院實驗動物中心提供。
1.2 實驗用藥：糖腎Ⅰ號由懷山藥、粉葛根、黃芪、芡實、蓮須、白術、肉蓯蓉、貓人參、山慈姑、漏蘆、菝葜、天龍、丹參、黃柏、牛膝等組成，經常規煎煮、過濾、水浴蒸發濃縮至每毫升含相當生藥2g，由溫州市中醫院藥劑科提供；洛汀新(鹽酸貝那普利，10mg／片)，北京諾華制藥有限公司生產，批號：X1036。
1.3 主要試劑：鏈脲佐菌素(STZ)，美國Sigma公司產品，購于北京博愛科貿有限責任公司，批號：0602010。
2 實驗方法
2.1 造模方法：參考徐氏等方法，大鼠正常飲食并適應環境1周，經尿糖、尿蛋白定性檢測為陰性后開始實驗。隨機抽取10只大鼠為假手術組，僅切開大鼠皮層、肌層，暴露腎臟，隨后縫合。其余40只大鼠在麻醉下行左側腎臟切除術，術后恢復2周。將STZ溶于0.2tool/L檸檬酸緩沖液(PH=4.5)中，避光條件下迅速配成濃度為2％的STZ溶液。動物禁食12h后，按照55mg／kg，STZ一次性腹腔注射；72h后，尾靜脈取血測定空腹血糖。血糖≥16.7mmol/L，尿量>假手術組的50％作為DN大鼠模型成功標準。
2.2 分組及給藥方法：模型成功后隨機分為模型組(M)、糖腎I號組(TS)、洛汀新組(B)、糖腎Ⅰ號+洛汀新組(TS+B)、假手術組(SO)，每組10只。大鼠給藥劑量按照人與動物體表面積法換算。大鼠藥量／kg／d等于成人量／kg／d的6.25倍。糖腎Ⅰ號組：以相當于生藥27.08g／kg／d液體量，每日灌胃1次；洛汀新組：以相當于干藥18.75mg／kg／d粉末，溶于蒸餾水中，每日灌胃1次；糖洛合組：藥物用量、用法同上述兩組。假手術組及模型組：給予等量生理鹽水。連續給藥共8周。實驗期間動物自由進食、飲水，不使用胰島素及其他降糖藥物。
2.3 觀察指標及方法：具體分述于下。
2.3.1 尿微量白蛋白和β2一微球蛋白測定：代謝籠中收集24h尿液標本，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測。
2.3.2 腎重及腎臟肥大指數：麻醉后，無菌操作，取右腎，去掉被膜，濾紙吸干血跡后稱重，并計算腎臟肥大指數(腎重／體重)。
2.3.3 腎功能：酶法及苦味酸法測定Scr、BUN。
2.3.4 免疫組織化學法檢測PCNA：右側腎臟，沿矢狀正中線切開，取1/2腎臟中一小塊皮質置人4％多聚甲醛固定液中，備行免疫組織化學法觀察。方法：石蠟切片，常規脫蠟至水；0.1mol/L枸櫞酸緩沖液高壓鍋抗原修復；3％H2O2室溫封閉20min，蒸餾水沖洗；PBS洗，滴加封閉液，37℃，20min；滴加1：75稀釋的小鼠抗大鼠單克隆PCNA抗體(武漢博士德生物工程有限公司生產)單抗4℃過夜；PBS洗，滴加非生物素標記的二抗，37℃，30min；PBS洗，DAB顯色，蘇木素復染，常規酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。PBS代替一抗作陰性對照。
2.4 統計學處理：數據以均數土標準差(z±s)表示，采用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析。多個樣本均數的比較采用單因素方差分析(One-way ANO-VA)，兩兩比較采用最小顯著差法(LSD)。檢驗水準設為α=0.05，P
3 實驗結果
3.1 各組大鼠尿β2-MG和UAlb比較：詳見表1。與假手術組比較，模型組尿β2-MG、UAIb均顯著增加(P
3.2 各組大鼠右腎重、腎臟肥大指數比較：詳見表2。與假手術組比較，模型組和各治療組腎重、腎臟肥大指數均顯著增高(P
3.3 各組大鼠BUN、Scr比較：詳見表3。與假手術組比較，模型組和各治療組Scr、BUN均顯著增高(P
3.4 各組大鼠腎臟組織PCNA表達的情況：詳見圖1、表4。免疫組織化學法染色后，將所制切片在光學顯微鏡低倍鏡下觀察細胞核呈現明確的棕黃色顆粒狀染色為陽性細胞，細胞核藍染的細胞為蘇木素復染的陰性細胞。在10×20倍高倍鏡下，每張標本隨機選擇5個視野，然后取平均值。免疫組織化學法染色結果采取半定量評分：按染色區變化和染色強度分為0～4分，即O分為無染色或染色極弱；1分為局部弱染、染色區75％。PCNA陽性表達主要在細胞核(詳見圖1)，假手術組PCNA表達較少，模型組呈強陽性表達，大量細胞核呈棕褐色顆粒狀，著色較深，各治療組表達較少。與假手術組比較，模型組和各治療組PCNA表達均具有顯著性差異(P
4 討論
糖尿病屬于中醫“消渴”范疇，糖尿病腎病屬于“腎消”范疇，以脾腎虧虛、氣陰兩虛為病之本，痰瘀互結為病之標，腎絡瘀阻貫穿始終。針對本病虛實并見、陰陽并損、本虛標實的病理特點，我們以養陰益氣、活血化瘀、清熱祛濕立法，組方糖腎Ⅰ號，通過初步臨床觀察獲得較好療效。糖腎Ⅰ號以懷山藥養陰益氣，粉葛根生津止渴，黃芪補氣升陽，共為君藥；貓人參、山慈姑、漏蘆、菝葜清熱化濕解毒，芡實、蓮須固腎收斂，白術、肉蓯蓉健脾補腎，共為臣藥；天龍、丹參活血化瘀，黃柏清熱燥濕為佐藥，使補而不滯；牛膝補益肝腎、逐瘀利水、引藥下行，為使之用。諸藥同用，共奏益氣養陰、活血通絡、利水泄濁之功。
尿微量蛋白的出現是腎臟早期損傷的標志。其中尿白蛋白升高提示腎小球結構和功能的損害，β2一微球蛋白則是反映腎小管損害非常敏感的指標。本實驗結果顯示：模型組24小時β2-MG和UAlb定量均顯著高于假手術組，提示本實驗模型出現腎小球濾過膜結構和功能的改變。與模型組比較，糖腎Ⅰ號組UAlb定量顯著降低，由此推斷，糖腎Ⅰ號可能通過降低糖尿病腎病模型大鼠的尿蛋白排泄，改善腎臟高灌注、高濾過，從而減輕或延緩基底膜損傷，改善腎小球和腎小管功能。
單擺周期范文5
【摘要】 目的: 研究SPTATApoptin融合基因誘導人肝癌HepG2細胞凋亡和細胞周期阻滯， 探討其用于肝癌治療的可能性。方法: 通過DNA重組技術， 以pcDNA3.1/Apoptin質粒11為模板， 構建SPTATApoptin融合基因 plenti6V5DTOPO真核表達載體。用SPTATApoptinplenti6V5DTOPO真核表達載體轉染中國倉鼠卵巢細胞（CHO）， 轉染后Blasticidin霉素進行篩選， 并進行鑒定得到穩定表達SPTATApoptin的CHO細胞株。收集含有TATApoptin融合蛋白的篩選細胞培養上清， 用于HepG2細胞培養。于共培養后的不同時段收集HepG2細胞， 流式細胞術(FCM)檢測細胞凋亡和細胞周期。結果: 用包含SPTATApoptin融合基因的plenti6V5DTOPO真核表達載體瞬時轉染中國倉鼠卵巢細胞（CHO）， 成功篩選出穩定表達SPTATApoptin融合蛋白的CHO細胞， 收集細胞培養上清， 繼續用于HepG2細胞培養， 可觀察到HepG2細胞阻滯于G1期并引起細胞凋亡。結論: SPTATApoptin融合表達可引起HepG2細胞的細胞周期G1期阻滯。
【關鍵詞】 信號肽; 蛋白轉導域; 雞貧血病毒; Apoptin蛋白; 肝癌
二十世紀九十年代早期， 人們發現由雞貧血病毒(Chicken anemia virus， CAV)來源的一種小蛋白VP3（Apoptin）能夠誘導人轉化細胞和腫瘤細胞凋亡， 但對正常的人二倍體細胞無凋亡誘導作用［1］。 Apoptin的腫瘤細胞特異性可能與其在細胞中的亞細胞定位有關， 在轉化或腫瘤細胞中Apoptin定位于細胞核， 而在正常細胞中定位于細胞質。Apoptin誘導的細胞凋亡不依賴p53， 且不為Bcl2、 BclxL的過表達所抑制。Apoptin此種特性向我們展示了其在腫瘤治療領域誘人前景［2］。但是使用傳統的轉染方法轉染并表達活性肽， 因受到轉導效率和表達細胞的自殺死亡的限制， 難達到有效治療實體瘤的目的。HIVTAT是近年來發現的一種新型的高效運輸載體蛋白質轉導結構 （protein transductIon domains， PTDs） 或稱細胞穿膜肽（cell penetrating peptides， CPP）。HIVTAT能穿透細胞膜、 細胞核膜， 攜帶肽、 蛋白質和 DNA 分子等進入胞質和胞核發揮生物效應， 具有高效性、 無須耗能或通過受體轉運的特點， 為提高靶細胞在體內外的基因轉移效率和蛋白質表達提供了一個高效、 簡便的方法［3］。目前的體內及體外試驗顯示HIVTAT可以穿過包括神經元細胞在內的所有組織細胞， 且未觀察到明顯毒副作用［4］。我們構建了帶有分泌信號肽、 蛋白轉導結構域的融合基因SPTATApoptin從而實現轉染細胞轉染后的分泌表達TATApoptin融合蛋白的表達方式， 可使融合蛋白進入未轉染的腫瘤細胞。希望通過以上設計來實現對肝癌等實體瘤安全有效的特異性治療。1 材料和方法
1.1 材料 大腸桿菌DH5α、 TOPO10B菌種為西北大學生命科學院分子微生物實驗室保存; 質粒pLenti6/V5DirectionalTOPO和大腸桿菌Shot Stbl3TM購買于美國Invitrogen公司; 質粒pcDNA3.1(+)/Apoptin［5］為中國軍事醫學科學院放射醫學學研究所孫志賢研究員惠贈。HepG2肝癌細胞系、 CHO(中國倉鼠卵巢細胞)購買于中國科學院上海細胞庫。細胞培養于含有10 mL/L胎牛血清的DMEM高糖培養基中。LipofectamineTM2000脂質體和AntiV5FITC單克隆抗體（mAb）購買于美國Invitrogen公司。
1.2 方法
1.2.1 SPTATApoptin融合基因真核表達載體的構建 登陸GenBank拷貝雞貧血病毒， CAV（NC_001427）序列。應用Invitrogen公司生物軟件（Vector NTI Advance 9）， 選取Apoptin基因序列（bp 486～852）; 根據文獻選取分泌信號肽（signal peptide， SP）序列［6］和TAT的氨基酸序列和核苷酸序列［7］。根據以上序列設計PCR引物: primer1: 5′GTGTGGGCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAATGAACGCTCTG
CAGGAAGATACTCC3′; primer2: 5′CTGCAGTCTTATACGCCTTTTTGCGG3′; primer3: 5′CACCATGTGGTGGCGCCTGTGGTGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG3′。 以pCDNA3.1/VP3為模版加入引物1和引物2， pfu DNA合成酶PCR擴增得平末端的含部分信號肽基因序列和TATVP3融合基因(命名為產物1); 以產物1為模版及引物2和引物3， pfu DNA聚鏈酶PCR擴增得平末端的SPTATVP3重鏈基因(命名為產物2)。合成的SPTATApoptin融合基因DNA重組雙鏈定向插入plenti6V5DTOPO載體， 轉化感受態細胞后擴增提取質粒進行酶切和測序鑒定， 具體試驗步驟見文獻［8］。
1.2.2 穩定表達SPTATApoptin融合基因的CHO細胞的篩選 在6孔板內按1×105細胞/孔接種CHO細胞， 篩選從轉染后48 h開始， CHO細胞均以8 mg/L Blasticidin霉素的選擇培養基繼續培養， 約20 d至1月時出現多個Blasticidin霉素抗性的單克隆， 用消毒后的槍頭挑取單克隆細胞入24孔板， 擴大培養， 獲得穩定表達SPTATApoptin融合基因的單克隆細胞， 作為穩定轉染細胞鑒定用。
1.2.3 RTPCR對穩定表達SPTATApoptin融合基因的CHO細胞的鑒定 分別離心收集篩選出穩定表達SPTATApoptin融合基因的單克隆CHO細胞或未轉染的CHO細胞， 采用TRIzol RNA分離試劑提取生長狀態良好的細胞總RNA， 紫外分光光度計測定總RNA濃度。取5 μg總RNA， 加入1 μL的0.5 g/L oligo(dT)， 按照SuperScriptRT逆轉錄試劑盒產品說明書操作合成cDNA第一鏈。將反轉錄的cDNA-20℃凍存， 以備進行PCR反應。使用引物2和引物3檢測融合基因的表達， 使用內參引物（GS 5′caacggatttggtcgtattggg3′; GAS 5′cctggaagatggtgatgggatt3′， 210 bp）進行小鼠GADPH的PCR擴增。PCR條件為: 94℃變性30 s， 50℃退火30 s， 72℃延伸40 s， 共進行30個循環。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳， 照相。
1.2.4 Western blot對穩定表達SPTATApoptin融合基因的CHO細胞的鑒定 分別離心收集篩選出穩定表達SPTATApoptin融合基因的單克隆CHO細胞或未轉染的CHO細胞， 用冰上預冷的PBS洗3遍， 用細胞裂解處理細胞收集蛋白， 加入適量蛋白上樣緩沖液， 沸水煮5 min， 12 000 r/min離心10 min， 取20 μL 蛋白樣品進行SDSPAGE凝膠電泳并將電泳結果進行PVDF轉膜， 用一抗即AntiV5FITC mAb(Invitrogen公司， 貨號: 554243)， 用PBST按1∶1 000稀釋， 膜置于一抗稀釋液中室溫緩慢搖動1 h。將辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG多克隆抗體用PBST按1∶200稀釋， 膜在二抗中室溫緩慢搖1 h。進行Western blot分析， 具體操作步驟見試劑盒的說明書。
1.2.5 共培養 收集1×106生長狀態良好的HepG2細胞接種于6孔板中， 培養24 h待細胞貼壁后用PBS洗2遍， 加入2 mL穩定表達SPTATApoptin融合基因的CHO細胞培養上清繼續培養， 并于共培養后的不同時間收集HepG2細胞進行后續檢測。
1.2.6 FCM分析共培養后的HepG2細胞周期分析 于共培養后的24 h、 48 h、 72 h和96 h收集每孔中的HepG2細胞， PBS洗2遍， 800～1 000 r/min離心5 min， 棄上清， 加入1 mL生理鹽水制成單細胞懸液。加入預冷的無水乙醇2 mL快速混勻， 固定細胞。棄固定液， PBS洗2遍， 1 000 r/min離心5 min， 加入1 mL DNA熒光染料PI， 4℃避光染色15 min， FCM分析。
2 結果
2.1 SPTATApoptin融合基因真核表達載體的鑒定 設計并合成的SPTATApoptin融合基因DNA雙鏈定向插入plenti6V5DTOPO載體， 轉化感受態細胞后擴增提取質粒， 經限制性內切酶EcoR I和Sal I對提取的質粒做雙酶切鑒定和測序， 載體構建作用。
2.2 Blasticidin霉素篩選濃度確定和篩選穩定表達SPTATApoptin融合基因的單克隆細胞 為了獲得SPTATApoptin融合基因表達的單克隆細胞株， 本研究需篩選針對CHO細胞的Blasticidin霉素篩選濃度: 經不同濃度的Blasticidin霉素篩選后， CHO細胞在含100 mL/L FBS、 8 mg/L Blasticidin霉素的DMEM培養液中， 到第8天能殺死所有細胞。因此， 選8 mg/L Blasticidin霉素分別為轉染后CHO細胞的篩選濃度。提取篩選出的細胞總RNA， RTPCR擴增， 表明篩選細胞可有效的轉錄SPTATApoptin融合基因的mRNA。對篩選的CHO細胞裂解液所進行的Western blot檢測結果顯示表明篩選細胞可有效的表達SPTATApoptin融合蛋白（圖1）。
2.3 共培養后的HepG2細胞可觀察到細胞周期G1期阻滯 共培養后24、 48、 72、 96 h分別進行細胞周期檢測發現， 轉染SPTATApoptin融合基因表達載體至CHO細胞后的培養上清與HepG2細胞共培養， 可有效引起細胞凋亡、 細胞周期阻滯于G0/G1期(圖2）。
3 討論
Apoptin以其對腫瘤細胞的選擇性誘導、 毒性低等特點， 已經受到了廣泛的關注， 成為新型的抗腫瘤候選藥物之一。一系列的研究均顯示了以Apoptin蛋白為基礎的腫瘤特異性治療的誘人前景［9］。通過將Apoptin基因與其他對腫瘤有治療作用的基因相連接， 構建融合基因， 而獲得對腫瘤有更顯著作用的融合蛋白， 也是Apoptin應用研究的一大熱點。Guelen等［10］構建了一種新的融合蛋白TATApoptin， 這是一種將TAT跨膜功能域與Apoptin相連接的融合蛋白。將該融合蛋白與細胞共培養30 min后， 其細胞內化高達98%; 24 h后， TATApoptin融合蛋白能誘導大部分的腫瘤細胞凋亡， 而對正常細胞無殺傷活性性。
使用傳統的轉染方法轉染并表達活性肽， 因受到轉導效率和表達細胞的自殺死亡的限制， 難達到有效治療實體瘤的目的。采用基因工程， 將編碼目的蛋白的基因序列融合到編碼信號肽的DNA中可實現外源蛋白的分泌表達， 可以防止宿主細胞對表達產物的降解， 還可以使目的蛋白分泌出胞， 殺傷比鄰的未轉染的腫瘤細胞， 擴大治療效應。我們構建了帶有分泌信號肽， 蛋白轉導結構域的融合基因SPTATApoptin從而實現轉染細胞轉染后的分泌表達TATApoptin和TATGFP融合蛋白的表達方式， 可使融合蛋白可以進入未轉染的腫瘤細胞。我們在前期的實驗中證明， SPTATApoptin融合基因轉染后可有效的誘導HepG2細胞的凋亡［8］。
在本實驗中， 我們用連有SPTATApoptin融合基因的plenti6V5DTOPO真核表達載體轉染CHO細胞， 并用8 mg/L Blasticidin霉素對轉染后的CHO細胞進行篩選。其后， 用RTPCR和Western blot對篩選后的CHO細胞從轉錄和翻譯水平進行鑒定， 證明篩選的CHO細胞可有效的表達SPTATApoptin融合蛋白。收集篩選的CHO細胞的培養上清， 繼續用于接種于12孔板的HepG2細胞培養。并于共培養后的不同時間進行細胞周期的檢測。共培養后24、 48、 72、 96 h分別進行細胞周期檢測發現， 轉染SPTATApoptin融合基因表達載體至CHO細胞后的培養上清與HepG2細胞共培養， 可有效引起細胞凋亡， 細胞周期阻滯于G0/G1期。與何等［11］報道的Apoptin可引起腫瘤細胞G2/M期阻滯有一定的差異。這可能與實驗方法的不同有關， 因為何等在實驗中采用腺病毒方式進行轉染， 而腺病毒可引起細胞G2/M期阻滯。至于TATApoptin將細胞周期阻滯于哪一期， 其具體機制如何還有待于實驗的進一步驗證。
總之， SPTATApoptin融合表達可引起HepG2細胞的細胞周期G1期阻滯， 并引起細胞凋亡， 有望發展成為肝癌的等實體瘤的基因治療策略。
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單擺周期范文6
【關鍵詞】 受精 體外 注射 細胞質內 胚胎移植
Abstract: Objective: To analyze the clinical outcomes of ICSI in patients with previous fertilization failure or low fertilization rate after conventional IVF. Methods: From Oct. 2001 to May. 2007， 38 ICSI cases with previous total fertilization failure after conventional IVF were allocated to group A. 17 ICSI cases with previous low fertilization rate after conventional IVF were allocated to group B. And 281 ICSI cycles for male factor infertility in the same period were allocated to group C as control group. The fertilization rate，high quality embryo rate，implantation rate and clinical pregnancy rate of three groups were retrospectively analyzed. Results: There were no significant differences in fertilization rate，high quality embryo rate and clinical pregnancy rate among three groups，but implantation rate of group A (14.3%) was significantly lower than that of group B and C（29.5% and 26.0%）. Conclusion: For patients who have previous low fertilization rate after conventional IVF，ICSI is a good choice to improve clinical outcomes. But for patients who have previous total fertilization failure after conventional IVF，the implantation rate of ICSI embryos is lower than that of the others. It suggests fertilization failure be due at least partly to occyte abnormity，which results in the descent of embryo development potential.
Key words: fertilization，in vitro；sperm injection，intracytoplasmic；embryo transfer
約5%～10%的常規體外受精（conventional in vitro fertilization，IVF）治療周期出現完全受精失敗和低受精[1]，其原因常常難以明確。盡管隨后周期采用單卵胞漿內注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）常可避免受精失敗，但進一步的臨床結果仍有爭議。本中心自2001年10月至2007年5月共對30例IVF完全不受精和12例IVF低受精不育夫婦分別在隨后周期采取38個周期和17個周期的ICSI治療，現將結果報告如下。
1 資料和方法
1.1 研究對象 2001年10月至2007年5月，30例IVF完全不受精和12例IVF低受精（受精率低于25%）不育夫婦分別在隨后周期采取38個周期（A組）和17個周期（B組）ICSI治療，兩組的男方正常（WHO分析標準）。將同期因男性因素采用行第1周期ICSI治療的連續281個周期作為對照（C組），男性因素的標準為密度
1.2 方法
1.2.1 促排卵方案、卵泡監測、陰道B超取卵、處理、IVF受精和ICSI的操作及胚胎培養觀察的過程均按本中心常規方法進行[2，3]。
1.2.2 優質胚胎評估：取卵后第2～第3天根據卵裂球大小、形態、碎片進行評分。其中A級：卵裂球大小均勻或輕度不均，無核碎片≤5%；B級：卵裂球大小均勻或輕度不均，無核碎片≤20%。將培養2 d細胞數≥3個的和培養3 d細胞數≥6個的A、B級胚胎定義為優質胚胎[4]。
1.2.3 胚胎移植和妊娠試驗：取卵后第2或第3天，選擇質量最好的胚胎，每周期移植≤3個胚胎。所有患者取卵日起給予黃體支持，胚胎移植2周后檢查血清人絨毛膜促性腺激素（hCG）含量，5周后B超檢查確認有無胎心。
1.3 統計學處理方法 采用SPSS11.0統計軟件進行分析，多組均數間的比較采用方差分析，率的比較采用x2檢驗。
2 結果
三組的注射hCG日E2、子宮內膜厚度差異無顯著性。A、B組的女方年齡、不孕年限及基礎FSH值均高于C組（均P
ICSI治療結果見表2。三組正常受精率、優質胚胎率和臨床妊娠率差異均無顯著性，A組的胚胎種植率明顯低于B和C組(P均＜0.05)。
3 討論
人類受精過程包括頂體完整的與透明帶結合、透明帶上糖蛋白誘導頂體反應、穿透透明帶并溶解卵膜、卵子激活和原核形成等過程。上述過程中任何一個步驟的異常都可能導致受精失敗。研究表明，常規IVF受精失敗55%是由于穿透失敗和穿透異常造成，而卵母細胞激活失敗占15.1%，原核形成障礙占19.2%[5]。
Liu等[6]曾報道，卵子受精失敗與-透明帶結合和透明帶誘導的頂體反應異常有關，并認為透明帶不能誘導正常的頂體反應是低受精的一個主要原因。本研究中，IVF低受精率患者在隨后周期行ICSI治療的受精率、臨床妊娠率和胚胎種植率與因男性因素行ICSI治療者相似，這提示其低受精的原因可能只是精卵結合障礙，而ICSI治療可以直接跨越精卵結合障礙，避免了受精失敗，從而改善了治療結果，對于低受精患者來說是一個很好的選擇。
本研究資料顯示，盡管完全受精失敗組患者在隨后周期行ICSI的受精率、卵裂率、優質胚胎率與對照組和低受精組差異均無顯著性，但其種植率顯著降低。這與Tomas等[7]和Borini等[8]的報道一致，他們發現有受精失敗史的病例進行ICSI時的妊娠率與種植率均低于男性因素不育病例。Borini等[8]發現，盡管IVF受精失敗患者下一周期行ICSI的妊娠率明顯低于男性因素組，但采用供者的卵子行ICSI，其妊娠率可達到與男性因素患者相似的結果。同時我們還發現IVF完全受精失敗的患者多為原發不孕，女性年齡、不孕年限、基礎FSH值均大于對照組，在隨后周期行ICSI治療中獲卵數及卵子成熟率較低，這些可能會對卵子質量產生一定的影響。還有一些研究認為，IVF未受精的卵母細胞中有1/3的染色體有異常[9]，另外卵母細胞胞漿不成熟[10]及卵母細胞中線粒體某些基因組表達缺陷[11]等因素也可導致IVF受精失敗，它們均有可能影響胚胎發育潛能，使其不能正常妊娠。因此我們認為完全受精失敗至少部分是由于卵子異常所致，而卵子異常又導致胚胎發育潛能的下降。
總之，我們的研究表明IVF低受精組在隨后周期改行ICSI可獲得理想的臨床治療效果。完全受精失敗組有可能因卵子的某些缺陷危及胚胎的進一步發育及種植，從而影響ICSI的治療效果。
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