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摘要：為研究我國內蒙古特色干制發酵乳制品中微生物物種多樣性、游離氨基酸和短鏈脂肪酸組成的其相關性。該研究通過高通量測序技術對內蒙古地區5種特色干制發酵乳制品中的微生物16SrDNAV4~V5區測序分析其細菌多樣性，利用GC-MS和HPLC分別測定短鏈脂肪酸和游離氨基酸含量。結果表明奶渣子的微生物，群落多樣性和總體豐度最高。5種樣品之間的微生物群落物種組成差異較大，在屬水平上阿如勒、奶豆腐和酸奶豆腐的優勢細菌為乳球菌屬（Lactococcus）和乳桿菌屬（Lactobacillus），奶皮子的優勢細菌為假單胞菌屬（Pseudomonas）和不動桿菌屬（Acinetobacter），奶渣子的優勢細菌為乳球菌屬（Lactococcus）和沙雷氏菌屬（Serratia）。在主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA）中，酸奶豆腐和奶豆腐的樣兩者之間的物種組成度相似度最高。短鏈脂肪酸分析中，共檢測出23種短鏈脂肪酸，奶皮子含有短鏈脂肪酸的種類最多，游離氨基酸分析中，共檢測出24種游離氨基酸，奶豆腐包含24種游離氨基酸，且含量也明顯高于其他4個樣品，5種樣品中所包含同種的短鏈脂肪酸和游離氨基酸含量均存在顯著差異（P＜0.05）。在冗余分析（redundancyanalysis，RDA）中，羥脯氨酸和谷氨酸與乳球菌（Lactococcus）和乳桿菌（Lactobacillus）呈現正相關，綠膿桿菌（Pseudomonas）與丁酸、己酸、辛酸和癸酸呈現正相關。研究揭示了內蒙古特色干制發酵乳制品中微生物組成、短鏈脂肪酸和游離氨基酸之間的關系，為傳統發酵干制乳制品產業發展優化提供一定的理論依據。
關鍵詞：短鏈脂肪酸；游離氨基酸；微生物多樣性；高通量測序；干制乳制品
發酵是一種有著數千年歷史的食品保存和加工的方法[1]，發酵賦予食品豐富的微生物組成使其具有獨特的風味和營養組分[2]。傳統發酵制品多采用自然發酵的方式，而自然發酵過程中的微生物多來自于外部環境[3-4]，因此不同的地理環境和氣候條件造就了各具特色的發酵制品。內蒙古地區位于我國北部地區，獨特的氣候條件和自然資源成功造就了內蒙古地區“世界黃金奶源帶”的地位，豐富和優質的奶資源為各類乳制品的產業化發展提供了堅實的基礎。發酵乳制品作為乳制品中的典型代表，已成為不同牧區主要的創收乳制品。阿如勒、奶豆腐、奶皮子、奶渣子和酸奶豆腐作為內蒙古地區最具代表的干制發酵乳制品，因其營養豐富且風味獨特而一直受到消費者的青睞。食品發酵中微生物的代謝決定食品的風味和營養[5]，發酵食品的風味主要來源于食品中的呈味物質如游離氨基酸[6]。短鏈脂肪酸的產生受到微生物群的數量和類型的影響[7]，與發酵食品的營養品質和理化性質密切相關[8]。產生短鏈脂肪酸的益生菌主要有乳球菌、乳桿菌、雙歧桿菌等，有助于促進干制發酵乳制品中蛋白和脂肪的酶解，產生游離氨基酸和短鏈脂肪酸，可以改善干制發酵乳制品的風味和營養特性[9-10]。傳統的發酵技術極好的保存了自然條件下的微生物組成，微生物在發酵過程中占據主要作用[11]。傳統培養方法對于微生物群落的組成研究方法具有一定的局限性，高通測序技術屬于非培養方法，具有通量高，不偏向優勢菌群的條件下測序真實、客觀、準確等特點，能夠全面解析食品中微生物群落結構，逐漸成為微生物群落多樣性解析的主要工具[12]。麻和平等[13]基于高通量測序分析比較不同保存溫度下牦牛酸奶細菌多樣性，周繼福等[14]基于高通量測序技術比較不同來源原料乳中的細菌特征，馬靜等[15]基于高通量測序技術分析青藏高原牦牛和犏牛乳中微生物多樣性的研究。本研究通過采集內蒙古地區五種最具特色的干制發酵乳制品，通過分析微生物物種多樣性組成，測定游離氨基酸和短鏈脂肪酸含量，探討微生物、游離氨基酸和短鏈脂肪酸對干制發酵乳制品品質風味和營養物質之間的關系。
1材料與方法
1.1材料與試劑
干制乳制品阿如勒（ARL）、奶豆腐（NDF）、奶皮子（NPZ）、奶渣子（NZZ）和酸奶豆腐（SNDF）采自內蒙古自治區錫林郭勒盟西烏珠穆沁旗地區；E.Z.N.A.®soil試劑盒，美國OmegaBio-tek公司；瓊脂糖，西班牙biowest公司；FastPfu聚合酶，北京全式金生物技術有限公司；AxyPrepDNA凝膠提取試劑盒，美國Axygen公司；測序試劑盒，美國Illumina公司；鄰苯二甲醛（o-Phthalaldehyde，OPA）（分析純）、氯甲酸-9-芴基甲酯（9-fluorenylmethyloxycarbonylchloride，FMOC）（分析純）、3-巰基丙酸（分析純）、17種氨基酸混合標準品（2.5μmol/mL）（天冬酰胺、谷氨酰胺、瓜氨酸等），sigma；硼酸（分析純）、二水合磷酸二氫鈉（分析純）、十二水合磷酸氫二鈉（分析純）等，廣州化學試劑廠；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）等，上海安譜實驗科技股份有限公司CNW。
1.2儀器與設備
N13462C型移液器、5430R型小型離心機，德國Eppendorf公司；MiFly-6微型離心機，合肥艾本森科學儀器有限公司；NanoDrop2000超微量分光光度計，美國ThermoFisherScientific公司；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；ABIGeneAmp®9700型PCR儀，美國ABI公司；MISEQ測序儀，美國Illumina公司；QL-901型旋渦混合器，海門其林貝爾儀器制造有限公司；TL-48R型粉碎研磨儀，上海萬柏生物科技有限公司；7890A-5975CGC-MS氣相色譜質譜聯用儀、Agilent1100液相色譜儀，安捷倫科技有限公司。
1.3實驗方法
DNA抽提、PCR擴增和IlluminaMiseq測序根據E.Z.N.A.®soil試劑盒說明書進行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量；用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物對V3~V4可變區進行PCR擴增。委托深圳微科盟科技有限公司進行IlluminaMiseq測序。1.3.2GC-MS分析GC條件：進樣口溫度250℃；氣質接口溫度250℃；載氣流速1.5mL/min；分流比3:1；進樣量1μL；升溫程序：初始70℃，保持3min；以10℃/min升溫到100℃保持2min；8℃/min升溫到180℃保持0min；10℃/min升溫到250℃保持15min。MS條件：離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，EI電離70eV，全掃描35~550da。1.3.3標準品配制數據和定性定量標準品定性，特征離子外標法定量[16]。
1.4液相檢測條件
液相檢測條件[17]：采用安捷倫公司自動在線衍生化方法，一級氨基酸與OPA、二級氨基酸與FMOC衍生后過柱檢測。用Agilent1100液相色譜儀，配VWD檢測器。色譜條件：ZORBAXEclipseAAA（4.6mm×75mm，3.5μm）；檢測信號：紫外338nm（0~19min），266nm（19.01~25min）；流動相A：40mmol/L磷酸二氫鈉（pH7.8），流動相B：乙腈:甲醇:水=45:45:10，流速：1.0mL/min，梯度洗脫數據。
2結果與分析
2.1Alpha多樣性分析
Alpha多樣性反映出不同干制發酵乳制品的物種多樣性與豐度，本研究對內蒙古地區5種特色干制發酵乳制品的細菌微生物多樣性進行分析，結果如下表所示。Chao1指數和Shannon指數能夠評估干制乳制品中的物種豐度和多樣性。由表2可知，奶渣子中的細菌Chao1指數最高，奶皮子的Shannon指數最高，結果表明奶渣子中細菌微生物群落的種群豐富度最高，奶皮子的物種多樣性最高且樣本較為復雜。
2.2操作分類單元（operationaltaxonomicunits，OTU）分布的韋恩分析
如圖1所示阿如勒、酸奶豆腐、奶渣子、奶皮子和奶豆腐分別有402、241、479、225、195個OTU，其中5個樣品間所共有35個OTU。Chao1指數也是OTU數量的一個反映指標，結果表明奶渣子的OTU數量最多，進一步證明了奶渣子中的細菌微生物群落多樣性及總體豐度比其他4個樣品要高。
2.3物種組成分析
圖2-a和圖2-b分別列出相對豐度前20的物種。在門水平上5種樣品的優勢細菌為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），其中阿如勒的厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度最高，為95.3%，奶皮子的變形菌門（Proteobacteria）相對豐度最高，為80.8%。在屬水平上阿如勒、奶豆腐和酸奶豆腐的優勢細菌為乳球菌屬（Lactococcus）和乳桿菌屬（Lactobacillus），其中阿如勒的乳桿菌屬（Lactobacillus）相對豐度最高，為83.5%，奶豆腐的乳球菌屬（Lactococcus）相對豐度最高，為38.2%。奶皮子的優勢細菌為假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、拉恩氏菌屬（Rahnella）和乳球菌屬（Lactococcus），其中假單胞菌屬（Pseudomonas）的相對豐度最高，為25.9%。奶渣子的優勢細菌為乳球菌屬（Lactococcus）和沙雷氏菌屬（Serratia），其中乳球菌屬（Lactococcus）的相對豐度最高，為76.3%。圖3-a和圖3-b取相對豐度前20個門進行聚類分析。根據門水平分類上熱點圖樣本的聚類樹縱向來看，樣本大致可以分為四類，第一類樣本NZZ03、NPZ02、NZZ02之間較為相似，第二類樣本NDF03、NZZ01、SNDF03之間較為相似，第三類NPZ01、NPZ03之間較為相似，第四類為其他樣本之間。橫向來看，厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）之間的相似性最為接近，相對豐度也最高。根據屬水平分類上熱點圖樣本的聚類樹縱向來看，樣本大致可以分為四類，第一類樣本SNDF03、NDF01、SNDF01、SNDF02之間較為相似，第二類樣本NPZ01、NPZ02、NPZ03之間較為相似，第三類ARL01、ARL02之間較為相似，四類為NDF03、NZZ03、NZZ01、NZZ02、ARL03、NDF02。橫向看，乳球菌屬（Lactococcus）和乳桿菌屬（Lactobacillus）之間的相似性最為接近，不動桿菌屬（Acinetobacter）、拉恩氏菌屬（Rahnella）和假單胞菌屬（Pseudomonas）之間的相似性最接近。如圖4所示在屬水平上進行LEfSe分析，可以發現阿如勒的特征菌種有乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、海單胞菌屬（Marinomonas）、海洋螺菌科（Oceanospirillaceae）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）；奶豆腐的特征菌種有無色桿菌屬（Achromobacter）、窄食單胞菌屬（Stenotrophomonas）；奶皮子的特征菌種有變形菌綱（Gammaproteobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、假單胞菌目（Pseudomonadales）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、假單胞菌屬（Pseudomonas）；奶渣子的特征菌種有鏈球菌科（Streptococcaceae）、乳球菌屬（Lactococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）；酸奶豆腐的特征菌種有乳桿菌目（Lactobacillales）、厚壁菌門（Firmicutes）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、腸球菌科（Enterococcaceae）、腸球菌屬（Enterococcus）。
2.4短鏈脂肪酸分析
由表3可知，共檢測出23種短鏈脂肪酸，硬酯酸在阿如勒、奶豆腐、奶渣子、奶皮子和酸奶豆腐中的占比最高，其次是棕櫚酸。奶皮子中檢測出的短鏈脂肪酸種類和含量均高于其他四個樣品，其中以丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬酯酸最為明顯。其中只有奶皮子中含有異丁酸、異戊酸+2-甲基丁酸、庚酸、壬酸。
2.5游離氨基酸分析
由表4可知，共檢出游離氨基酸24種，其中奶豆腐包含檢測出的24種游離氨基酸，且含量明顯高于其他4個樣品。阿如勒包含檢測出的23種游離氨基酸，除谷氨酰胺。其次是酸奶豆腐、奶皮子和奶渣子，分別包含檢測出的游離氨基酸分別為21種、18種和16種。5種樣品中，只有奶渣子不包含天冬酰胺和色氨酸；奶皮子不包含精氨酸。阿如勒、奶豆腐、奶皮子中羥脯氨酸含量最高，奶渣子和酸奶豆腐中的谷氨酸含量最高。
2.6預測功能主成分分析
細菌微生物群落與短鏈脂肪酸和游離氨基酸的關系如圖5所示，根據圖5-a可知，樣品之間，阿如勒樣品之間的距離最近，奶渣子樣品之間的距離最遠，表明阿如勒樣品之間的物種組成相似度最高，奶渣子樣品之間的物種組程度最低，阿如勒的樣品主成分較穩定，奶渣子的樣品組成成分最不穩定。阿如勒、奶皮子和奶豆腐聚集在不同的3個區域，酸奶豆腐和奶渣子分散在兩個區域之間，酸奶豆腐和奶豆腐聚集在同一區域，分散較密集，表明酸奶豆腐和奶豆腐組成差異性較小，奶皮子與其他樣品之間無任何重合區域，距離其他樣品距離最遠，表明奶皮子與其他樣品之間的的組成差異最大。根據圖5-b可知，RDA1和RDA2分別占總方差的68.44%和31.56%。在奶豆腐中，羥脯氨酸和谷氨酸與乳球菌（Lactococcus）和乳桿菌（Lactobacillus）呈現正相關，在奶皮子中，綠膿桿菌（Pseudomonas）與丁酸、己酸、辛酸和癸酸呈現正相關，且相關性明顯較高。
3.討論
本研究采用IlluminaMiSeq高通量測序技術，對內蒙古5種傳統干制發酵乳制品的微生物多樣性進行分析。結果顯示奶渣子中的細菌Chao1指數和OTU數量明顯高于其他4個樣品，在PCA中，奶渣子樣品分布松散，且樣品間距離較大，說明奶渣子的微生物群落多樣性和總體豐度最高，其組成成分不穩定，樣品間的差異性較大，這可能與奶渣子繁雜的制作過程及發酵過程微生物本身的不穩定性和復雜性有關。檢測發現在屬水平上5種樣品的的優勢菌群雖然有很大差異，但是乳球菌、乳桿菌、鏈球菌、明串珠菌等優勢菌種能夠水解蛋白質，降解乳蛋白，代謝氨基酸，產生揮發性風味物質，在改善發酵干制乳制品的質地和風味方面發揮巨大的作用[18-19]。由于5種樣品的制作方式各不相同，使其與環境中的微生物接觸及保留的優勢菌種存在差異，這種差異賦予了各樣品獨特的香氣。短鏈脂肪酸和游離氨基酸作為樣品風味的重要載體，其與微生物多樣性存在密切的關系。本研究利用GC-MS和HPLC分別對5種樣品中短鏈脂肪酸和游離氨基酸檢測，結果顯示5種樣品短鏈脂肪酸、游離氨基酸種類和含量均不相同。5種樣品中共檢測出23種短鏈脂肪酸和24種游離氨基酸，短鏈脂肪酸由乳脂肪反映分解產生，是乳酸發酵的代謝產物之一[20]，游離氨基酸由蛋白質水解產生[21]，兩者都是重要的風味物質[22-23]。短鏈脂肪酸乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異戊酸等具有揮發性，能產生揮發性氣味，奶皮子的短鏈脂肪酸種類和含量最高，從而可能使奶皮子散發出獨特豐富的香氣。不同的游離氨基酸呈現不同的風味，天門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸呈現現鮮味，丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸呈現甜味，蘇氨酸、天門冬氨酸呈現酸味，奶豆腐中的游離氨基酸種類和含量最高，游離氨基酸由協同效應和抑制作用使風味呈現多樣性[24]，因此奶豆腐可能比其他4個樣品的口感和風味更加富有層次。在冗余分析（redundancyanalysis，RDA）分析中發現，羥脯氨酸和谷氨酸與乳球菌和乳桿菌呈現正相關，綠膿桿菌與丁酸、己酸、辛酸和癸酸呈現正相關，綜合細菌多樣性及短鏈脂肪酸和游離氨基酸組成可發現，奶皮子的優勢菌種種類最多，其短鏈脂肪酸的種類和含量也最多，奶豆腐中的乳球菌相對豐度最高，其游離氨基酸的種類和含量也最多，說明細菌微生物影響短鏈脂肪酸和游離氨基酸的種類和含量。干制發酵乳制品的制作方式停留在傳統手工制作上，能更好保留環境中的微生物，由于5種樣品的制作方式有所不同，樣品中的細菌微生物種類也有所差異，不同細菌微生物代謝分解導致的短鏈脂肪酸和游離氨基酸種類和含量也不同，從而影響風味物質的產生，使樣品呈現出各自獨特的風味。
4.結論
綜上所述，本研究通過采用高通量測序技術對內蒙古地區5種干制發酵乳制品的細菌微生物多樣性進行分析，同時測定短鏈脂肪酸和游離氨基酸的含量進行分析。結果表明，奶渣子的微生物群落的種群差異性相對較大，群落多樣性較高，物種豐富度最高。物種組成上，5種樣品的優勢菌群有所差異，阿如勒樣品之間的物種組成相似度最高，主成分較穩定，奶渣子樣品之間的物種組成相似度最低，樣品組成成分最不穩定。奶皮子的短鏈脂肪酸種類最多且含量均高于其他4個樣品，奶豆腐包含檢測出的24種游離氨基酸且含量普遍高于其他4個樣品。5種樣品中所包含同種的短鏈脂肪酸和游離氨基酸含量均存在顯著差異（P＜0.05）。在RDA分析中，羥脯氨酸和谷氨酸與乳球菌（Lactococcus）和乳桿菌（Lactobacillus）呈現正相關，綠膿桿菌（Pseudomonas）與丁酸、己酸、辛酸和癸酸呈現正相關。由此可看出，5種干制發酵乳制品由于制作工藝的不同，導致細菌微生物多樣性不同，從而影響短鏈脂肪酸和游離氨基酸的種類和含量有所差異，使樣品呈現出各自獨特的風味。此研究為傳統發酵干制乳制品產業發展優化提供一定的理論依據。
作者:李思敏 邢書源 宋佳慷 高乾陽 劉研 索朗群培 程秀峰 劉振東 單位:西藏農牧學院 食品科學學院 西藏特色農牧資源研發省部共建協同創新中心
