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地球表面積的71%左右被水覆蓋，包括海洋和淡水水域，在這些水環境中，蘊藏著豐富的蛋白資源。水產蛋白質尤其是海洋生物蛋白質的品位極高，所含必需氨基酸種類豐富、營養均衡，有著陸地蛋白資源無法替代的優越性。近年來，世界水產總量一直保持在每年一億噸左右。在如此巨大的蛋白資源中除了部分直接用于食用外，很大部分低值水產品及水產品加工過程中產生的副產物或是經過粗略的加工制成魚粉，或是直接丟棄，產品的附加值很低。無論是魚粉加工過程中產生的廢水還是直接丟棄的低值水產品，直接排放到環境中都會造成嚴重的環境污染。因此，如何運用生物技術對這些低值水產品和水產加工過程中產生的副產物進行高值化利用，是目前生物技術領域急需開展的研究課題。其中，運用微生物技術和酶技術對這些低值水產蛋白資源進行酶解利用，是開發水產蛋白資源的重要途徑。我國是一個水產大國，自上世紀90年代以來，我國水產品產量一直穩居世界第一。然而，目前我國在水產蛋白資源的酶解利用方面的研究并不多，而且不夠深入。對富含蛋白質的低值水產品和水產加工副產物進行酶解綜合利用，不僅可提高其附加值，改善水產蛋白資源的營養及功能特性，同時還可減少對環境的污染，產生良好的經濟效益。 1酶解工具蛋白酶的來源及選擇 1.1蛋白酶的來源 目前用于水產蛋白資源酶解利用的蛋白酶種類很多，根據其來源可分為植物，動物和微生物來源三類。來自植物的蛋白酶主要有木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶等，其中以木瓜蛋白酶在水產蛋白資源酶解中應用最為廣泛。來源于動物消化道的蛋白酶包括胰蛋白酶，胃蛋白酶，胰凝乳蛋白酶等，除了上述常用的動物消化道蛋白酶之外，有些學者使用自行從動物消化道中提取的消化酶作為水產蛋白酶解的工具酶，如從鯖魚腸道中提取的蛋白酶(mackerelintestinecrudeenzyme,MICE)[1]，從大西洋鮭魚幽門盲囊中提取的蛋白酶[2]和從金槍魚幽門盲囊中提取的蛋白酶[3]等。微生物發酵產生的蛋白酶在水產蛋白酶解利用中應用較多，產酶微生物有細菌，霉菌，酵母和放線菌。細菌類蛋白酶主要是枯草芽孢桿菌等芽孢桿菌產生的，一般是中性或堿性蛋白酶，如Novozymes的Neutrase，Protamex，Alcalase[4]和RohmEnzymes的Corolase7089[2]等，霉菌產生的蛋白酶有Novozymes的Flavourzyme和RohmEnzymes的CorolasePN－L等[4]。 1.2酶解工具蛋白酶的選擇 不同的蛋白酶對同一底物的水解效率不同，而且不同蛋白酶酶解產生的產物的理化功能特性和化學組成存在很大的差異，因此，酶解所用的工具蛋白酶的選擇對于水產蛋白資源酶解利用是非常重要的。不同的蛋白酶由于酶切作用方式及酶切位點的不同，酶解產物營養成分組成如肽段的分子量大小和游離氨基酸的組成上存在很大的差異。如胰蛋白酶的酶切作用位點比較少，只能裂解堿性氨基酸Arg或Lys羰基側肽鍵[5]，因此酶解產生的片斷較大。研究顯示，用細菌蛋白酶(Alcalase，Neutrase，Protamex)酶解的酶解產物，分子量小于2500Da的肽段較多，而來自動物(豬，鱈魚)胰臟的蛋白酶酶解產物中分子量較大的肽段較多，而且以氮回收率為考察指標時，細菌蛋白酶優于從動物組織中提取的蛋白酶[6]。不同的蛋白酶對酶解產物的風味的好壞也有很大的影響。酶解反應所用蛋白酶及其用量、水料比、pH值、溫度和酶解時間等因素對酶解產物的風味值均有影響[7]。在蛋白資源的酶解利用中，成本最高的是所使用的外源蛋白酶，因此，從經濟效益上講，蛋白酶的選擇至關重要。目前研究及生產上所用的蛋白酶種類較多，如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、Flacourzyme、Protamex、Alcalase、Neutrase等，研究表明，以蛋白質回收和獲得最大水解度為目的時，以Protamex[6][8]和Alcalase[2]最為合適；若以酶解產物風味為選擇指標，則使用Flacourzyme[7]為適宜。 2水產蛋白資源的酶解利用現狀 人們對水產蛋白資源的酶解利用可以追溯到上世紀六十年代，幾十年來，研究人員對水產蛋白資源的酶解利用的研究始終保持著濃厚的興趣，到目前為止，已有大量的水產蛋白資源被應用于酶解利用研究。表1所列為近十幾年來部分被應用于酶解利用的水產蛋白資源。從表1中可知，可用于蛋白酶解利用的水產資源十分豐富，許多魚類、軟體動物、甲殼動物和單細胞藻類以及魚、蝦、蟹、貝類等加工后的副產物都可以應用于酶解利用，其中種類豐富的魚類及其加工過程中產生的副產物是水產蛋白酶解利用的主要對象。通過蛋白酶解的方法對加工過程中產生的副產物進行綜合利用研究，可以盡可能多的回收這些漁業加工副產物中的蛋白質，以達到對其充分利用的目的。許多研究表明，水產蛋白質資其酶解產物與酶解前比較具有較高的營養價值和很好的功能特性，可以應用于飼料、食品、化工、醫藥等各個領域，實現對其高值化利用。 3酶解工藝、酶解過程及酶解產物特性 水產蛋白的酶解和陸地蛋白的酶解就其工藝流程和水解過程來說基本是一致的。在工藝上，所有的酶解反應都包括調節酶解條件(pH值、溫度等)、酶解、酶解反應的終止、產物的分離等過程，圖1為酶解反應工藝流程圖[2][7][9～12]。蛋白酶解的機制非常復雜，因為底物中包含了大量的不同種類的不溶性蛋白質。一般認為，所有的酶解反應至少分為兩個階段，首先，酶分子與蛋白質顆粒連接，蛋白質中一些特殊的殘基和肽鍵進入酶的活性中心，第二步，水解反應的發生，釋放出大量可溶性的多肽和氨基酸，越處于核心、結合越緊密的蛋白質水解速度越慢。一般來說，蛋白質的酶解反應在最初的0.5～2h內保持較高的水解速度，這一時間由于酶解反應的底物和所用的蛋白酶不同而有差異，Liaset等的研究顯示用Protamex對大西洋鮭魚魚排進行酶解以氮回收率(nitrogenrecovery%，NR%)為反應指標，酶解反應在最初的0.5h內保持較高的水解速度[8]；而在Guérard等的研究中，水解速度在最初的1.5h內保持較高的水平[10]。隨著酶解反應時間的延長，酶解反應速度明顯下降。蛋白質酶解反應的這一特性可以用水解曲線(如圖2)表示，在反應的初期階段，水解度隨著反應時間的增長而有較大的增高，隨著時間的延長，這種增長越來越小，水解速率明顯下降，最后，水解速率降為0而水解度達到最高。這種蛋白酶解所呈現的典型的曲線在許多水產蛋白資源的酶解研究中被發現，如對大西洋鮭魚[2][8]、金槍魚[10][14]、毛鱗魚[11]、沙丁魚[13]等的酶解都呈現了上述規律。筆者在利用Flavourzyme對羅非魚魚頭進行酶解的研究中也發現了上述規律，在酶解條件固定時α-氨基氮質量(α-aminonitrogen，AN)隨著酶解時間的變化符合水解曲線所顯示出的規律，并且α-氨基氮質量在酶解反應最初的1h內保持較大的增長。1993年，Moreno和Cuadrado通過堿性蛋白酶Alcalase(酶解條件：50℃，pH8)對鷹嘴豆蛋白(chickpeaproteins)的酶解研究，認為水解曲線所揭示的趨勢產生的原因有如下三點：①可被蛋白酶裂解的肽鍵數目的減少；②酶活力的降低；③產物抑制作用[15]。2001年，Guérard等學者用Alcalase酶解黃鰭金槍魚廢棄物，通過在酶解反應中途加入酶解底物(即金槍魚廢棄物)，發現水解度的增加和中途加入的底物的量成正相關，因此Guérard等認為可被蛋白酶裂解的肽鍵數目是控制水解速率的主要因素[10]。蛋白資源在酶解過程中除了呈現出統一的酶解規律之外，不同來源的蛋白質資源的酶解產物還具有一些普遍的特性，如溶解性增加，乳化性能增強，具有一定的發泡性能，流動性增加以及具有更高的營養價值和更易吸收等等。根據水產蛋白資源的上述特性，可以將其應用于飼料、食品、化工及功能性食品等各個領域。#p#分頁標題#e# 4水產蛋白資源酶解產物的應用 4.1水產風味調味品 隨著時代的發展，人們對調味品的追求也越來越高，水產風味調味品，由于其含有豐富的氨基酸、多肽、糖、有機酸、核甘酸等呈味成分以及?；撬岷透叨炔伙柡椭舅岬缺＝〕煞郑絹碓绞艿饺藗兊那嗖A。應用蛋白酶酶解各種低值水產品和水產加工過程中產生的副產物，獲得風味產品以提高其經濟價值。與內源蛋白酶自溶和強酸強堿分解法相比較，外源蛋白酶酶解具有反應條件溫和、水解效率高、催化反應專一，有利于確定化學性質等優點。1994年，Kim等利用小龍蝦(Crayfish)肝胰腺提取物對蟹加工過程中產生的副產物進行酶解，獲得了風味值較高的酶解產物[17]。1999年，Imm和Lee應用Flavourzyme對紅海鱈魚肉進行酶解，證明經過酶解的魚肉風味值遠高于未經酶解直接烹煮的魚肉，而且酶解產物中的風味氨基酸含量是未經酶解魚肉中的6～9倍[7]。 4.2在微生物培養中的應用－水產蛋白胨 水產蛋白資源被酶解后，酶解產物具有蛋白質含量高，水溶性好，其中多肽和游離氨基酸豐富等特點，因此，水產蛋白酶解產物即水產蛋白胨可作為發酵工業和實驗室中微生物培養所用的蛋白胨。2001年，Mukhin等將由從鱟肝胰腺中提取的蛋白酶酶解冰島扇貝加工廢棄物得到的酶解產物應用于微生物培養，對其在微生物培養基中作為氮源的應用做了評估，認為此蛋白胨可應用于微生物培養[18]。Guérard等將來自于金槍魚、鱈魚、鮭魚和雜魚的蛋白胨應用于細菌、酵母和霉菌的培養，并與酪蛋白胨相比較，結果顯示上述魚蛋白胨應用于微生物的培養效果顯著[10]。Aspmo等將從大西洋鱈魚內臟酶解獲得的產物應用于微生物培養，并與數種市售蛋白胨如胰蛋白胨、大豆蛋白胨，酵母提取物等進行比較，結果顯示，大西洋鱈魚內臟蛋白胨作為一種混合氮源，可用于替代市售蛋白胨；并且，對于培養一種對營養需求苛刻的乳酸菌(Lactobacillussakei)，其培養效果明顯高于各種市售蛋白胨[19]。 4.3在功能食品和藥品中的應用 越來越多的研究表明，蛋白質氨基酸序列中的某些多肽片斷在釋放出來之后具有一定的生物活性作用，如降血壓、促進生長、抗凝血、抗氧化、增強免疫力等，因此，蛋白質酶解產物或從中分離得到的肽可以作為藥品或作為配料應用于功能食品行業。近年來的研究表明，許多水產蛋白資源的酶解產物都具有抗氧化作用，如鱈魚[3]、鯖魚[20]、毛鱗魚(capelin)[21]等，2005年，Je等從阿拉斯加鱈魚魚排酶解產物中分離得到了一個具有抗氧化作用的六肽：Leu-Pro-His-Ser-Gly-Tyr,分子量為672Da[1]。2001年Byun和Kim從阿拉斯加鱈魚魚皮膠原蛋白酶解產物中分離得到了兩個具有血管緊張素轉化酶Ⅰ(ACEⅠ)抑制作用的三肽：Gly-Pro-Leu和Gly-Pro-Met[22]。2005年，Rajapakse等從黃鰭金槍魚(yellowfinsole，Limandaaspera)酶解產物中分離得到了一個具有凝血因子Ⅻa和血小板聚集抑制作用的蛋白質[23]。除了上述應用之外，水產蛋白資源的酶解在水產資源的開發上還有很多用途，如用于殼聚糖[24]、?；撬醄25]等的制備，用作乳制品的替代品等。 5水產蛋白資源酶解利用研究展望 5.1更優蛋白酶的篩選、酶解工藝的優化 蛋白酶是水產蛋白資源酶解利用中最昂貴的成分，也是蛋白酶解利用成本的主要來源。因此，篩選高效、廉價的蛋白酶將一直是水產蛋白資源酶解利用的研究熱點之一。酶解所用蛋白酶可以來自于工業發酵，也可以來自于動植物組織提取。利用從水產加工副產物甲殼類的肝胰腺和魚類的消化道組織中提取的蛋白酶對其他低值水產品或水產加工副產物進行酶解，如Mukhin利用從鱟肝胰腺中提取的蛋白酶對冰島扇貝加工副產物進行酶解[18]；Jeon等利用金槍魚幽門盲囊中提取蛋白酶對鱈魚魚排進行酶解[3]，都獲得了很好的效果。利用從動物廢棄內臟中提取的蛋白酶對其他低值水產品或水產加工副產物進行酶解，不僅降低了因購買蛋白酶而帶來的生產成本，而且做到了對多種水產蛋白資源的綜合利用，是水產蛋白酶解利用的研究方向之一。水產蛋白資源酶解之前的處理還需要進一步研究，并非所有的水產資源都適合作為水產蛋白酶解的對象，富脂魚類并不適合作為蛋白酶解的對象，因為它的含脂量高，去除脂肪比較麻煩、需要較高的代價，而且酶解產物極易因為脂質過氧化而影響其品質[26]。然而，水產蛋白資源中有很多都是富含脂肪的，因此，如何在進行蛋白酶解之前或酶解之后分離出脂肪，做到水產資源中蛋白質與脂肪的綜合利用將是今后水產蛋白資源酶解利用的一個重要研究課題。2002年，Gildberg等對鱈魚加工副產物進行酶解研究，在獲得酶解液的同時，對酶解之后產生的殘渣，主要是骨頭進行了提取膠原蛋白的研究[6]，Gildberg等的工作為今后對含骨質水產蛋白資源的綜合利用提供了一種全新的思路。蛋白資源的酶解是水相酶解，酶解產物通常以液體的形式存在，因此，必須將酶解液進行干燥處理，轉變為固體粉末以利于儲藏、包裝、運輸及應用。噴霧干燥是生產中常用的一種用于液體干燥的方法，2002年，Abdul-Hamid等對黑羅非魚酶解產物進行了噴霧干燥條件對酶解產物營養品質影響的研究，發現較高的干燥溫度造成了酶解產品氨基酸總量的降低，對酶解產物的營養價值造成了破壞[27]。冷凍干燥法是另一種將液體產物轉變成固體粉末的方法，優點在于能保證產品的生物活性及營養價值不被改變，不過冷凍干燥法將導致生產成本的提高。 5.2酶解產物苦味的去除和酶解液脫色 蛋白質酶解產物普遍存在苦味。Murry和Baker于1952年第一次描述了蛋白質酶解產物苦味，此后，科學家們對蛋白質酶解產物苦味產生的原因及酶解產物中的苦味成分進行了廣泛而深入的研究，取得了重大的成就。認為蛋白質酶解產物中的苦味主要是由苦味肽而不是由游離氨基酸引起的，苦味肽中的氨基酸殘基大多是含有非極性的脂肪烴或芳香環側鏈即疏水性氨基酸殘基(Val、Ile、Phe、Trp、Leu和Tyr)，而且當疏水氨基酸位于肽鏈內部時苦味值較大，位于肽鏈C或N端的時候苦味值較低。在酶解過程中，由于蛋白酶的作用，原來包藏于蛋白質內部的疏水氨基酸殘基暴露了出來，經過蛋白酶的酶切作用，含有較多疏水氨基酸殘基的肽段被釋放出來，從而使酶解產物產生了苦味[16]。目前，苦味肽是將蛋白質酶解產物應用于人類消費品的主要障礙。一般采用選擇性分離、塑蛋白反應(plasteinreaction)、掩蔽法和外肽酶的應用四種方法來減少或掩蔽蛋白酶解產物的苦味[16]。酶解產物苦味值的大小與酶解所用蛋白酶的種類及水解度的大小都有關系，蛋白酶酶切作用方式及酶切作用位點的不同，酶解產物苦味值具有較大的差異，如Alcalase的酶解位點是疏水性氨基酸的羰基側肽鍵，酶解產生的肽中疏水氨基酸位于肽的兩端，苦味值較小。酶解產物水解度的大小對其苦味值也有較大影響，水解度的增加導致了酶解產物的苦味值的增大，隨著水解度的進一步增大，苦味肽被酶切成為兩端為疏水氨基酸殘基的小肽甚至被降解成為游離氨基酸，因此酶解產物的苦味值隨著水解度的進一步增大而降低[7][16]。Flavourzyme是一種蛋白酶/肽酶復合物，含有內切蛋白酶和外切蛋白酶兩種活力，用于酶解可獲得較高的水解度且產物具有較好的風味[7]，由于其具有外切蛋白酶活力，Flavourzyme還可用于酶解苦味的脫除。蛋白質資源經酶解后，酶解液一般都帶有深淺不一的黃色，隨著水解度的增大，酶解液顏色液逐漸變深。如此濃重的顏色不利于酶解液的應用，很多研究通過活性炭[28,29]、海藻糖[29]等對酶解液進行脫色，如劉惠賓等應用活性炭對鳀魚酶解液的脫色進行了研究，結果表明在適宜的條件下活性炭對酶解液的脫色效果顯著，然而，利用活性炭對酶解液進行脫色會導致酶解液營養成分的損失，即使在最適脫色條件下，氨基酸的損失率仍高達3.5%～5.0%[28]。#p#分頁標題#e# 5.3酶解產物生理活性作用的研究，功能肽的分離純化 近年來，蛋白質酶解產物的生物活性作用研究正受到人們越來越多的重視，許多的研究都證明了水產蛋白資源酶解產物具有一些生物活性成分，如抗氧化作用[1][3][21]、血管緊張素轉化酶Ⅰ抑制作用[30,31]等。目前國內外的研究大都停留在證明蛋白質酶解液具有某一生物活性作用成分，從酶解液中分離出具有特定生物活性的多肽的研究很少，僅韓國Kim等學者報道了從水產蛋白資源中分離出了具有抗氧化作用的六肽[1]，ACEⅠ抑制作用的三肽[22]等。而且，研究的生理活性作用相對僅集中于抗氧化作用和ACEⅠ抑制作用。今后的研究應以證明更多的水產蛋白資源酶解產物具有生物活性作用；研究酶解產物是否具有更多的生理活性作用如腫瘤抑制作用、抗病毒、抗菌、抗心血管疾病、促進生長、提高機體免疫力等；從酶解產物中分離純化出具有特定生理活性的多肽等方向以滿足酶解液在功能食品和藥品等領域中應用的需求。 6結語 我國水產業發展很快，水產品總產量從1990年開始一直處于世界首位并遙遙領先于其他水產大國，但水產品加工業相對滯后，與其他漁業大國如日本、挪威等國相比相差甚遠。我國水產品加工多為初級產品，精、深加工產品少，特別是大宗低值水產品及水產加工副產物綜合利用水平較低，我國的水產品在國際市場上的競爭力較差。目前，我國急需開展水產蛋白資源尤其是大宗低值水產品及水產加工副產物的高值化綜合利用研究，通過蛋白質的酶水解開發出以水產蛋白資源為原料的高新技術產品，增強我國水產品在國際市場上的競爭力。
