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精原干細胞(spermatogonialstemcells，SSCs)位于雄性動物睪丸的曲細精管基膜上，是精子發生的基礎。它一方面可以自我增殖維持自身數目的相對恒定，另一方面可以經過數次有絲分裂后進入減數分裂，形成精母細胞，最終形成精子，既具有自我更新的潛能，又具有定向分化的潛能，是自出生后直至整個生命期間進行自我更新并能將基因傳遞至子代的唯一成體干細胞。近年來，國內外學者對SSCs進行了大量的實驗研究，在SSCs的自我更新和分化的調節機制方面有了一定的新進展(Oatley＆Brinster，2008)，這使我們更好地闡明精子發生的機理，以及對其他組織中成體干細胞增殖分化的調節機制的進一步研究提供了依據。 1SSCs的生物學特性 SSCs起源于原始生殖細胞(primordialgermcells，PGCs)，在靠近尿囊根部的卵黃囊內胚層發生。這類細胞多鑲嵌在支持細胞側面生長，呈圓形，具有比較大的細胞核，呈圓形或輕微卵圓形，胞質較少，核仁呈網狀2～3個多靠近核膜存在，核內常染色質占絕對優勢，為細密均勻的顆粒，異染色質很少，胞質內核糖體、線粒體較豐富，其他細胞器不發達，線粒體呈圓形或橢圓形，常數個聚集存在或者散布于靠近核膜的胞質區域內，內有板層狀的線粒體嵴。在小鼠第11.5d胚齡時，PGCs遷移到生殖嵴，并在此增殖，13.5d胚齡時PGCs停止分裂。在雌性，PGCs啟動減數分裂向卵母細胞分化;在雄性，PGCs在胎兒睪丸曲細精管被支持細胞包繞后變為生精母細胞(gonocyte)，經幾天分裂后停滯于G0/G1期，并保留了干細胞的潛能直到出生。出生后不久，它恢復增殖并啟動精子發生過程(Brinsteretal.，2002)，大約6d左右遷移至曲細精管基膜，成為以SSCs為主的精原細胞。SSCs的數量很少，在成年小鼠睪丸中約有108個細胞，其中約有2×104個是SSCs，僅占睪丸所有生精上皮細胞總數的0.02%～0.03%，此后始終維持在這個數量不變。在小鼠整個性成熟過程中，SSCs的數量呈漸進性增長，從出生到成年，SSCs的數量增加了約39倍(Shinoharaetal.，2000)。 2SSCs的特異性標志 目前對精子發生的分化過程已取得基本的認識，但對SSCs本身的生物學特性了解較少。因此，對SSCs主要分子標記的研究是對其進行分離、鑒定和生物學特性深入研究的前提。精原干細胞和其他干細胞表面的標志物存在一定的相似性，如SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、AP等(Gussonietal.，1999)。酪氨酸激酶受體c-kit表達于造血干細胞(haemopoe-iticstemcell，HSC)、胚胎干細胞(ES細胞)、原始生殖細胞(PGC)和減數分裂前生殖細胞，干細胞因子(stemcellfactor，SCF)和其受體c-kit在精原細胞的遷移、分裂和早期雄性生殖細胞分化中具有關鍵作用(Dobrinskietal.，1999);α6-整合素和β1-整合素在精原干細胞表面會形成二聚體，作為一種層粘連蛋白受體發揮作用，其也是鑒定精原干細胞的重要表面標志。Khaira等(2000)研究表明小鼠精原干細胞的表面標志可包括sidescatteralow，α6-和β1-整合素，CD24+，Thyl+，C-kit－av－整合素－，MHC-I－，CD9－等，而Kanatsu-Shinohara等還將EpCam+、CD34也作為精原干細胞表面特征。除此之外，還有很多對SSCs的分子標記的研究，現將哺乳動物睪丸SSCs的主要分子標記概括如下(表1)(Bartetal.，2010)。 3調控SSCs的主要進展 目前，科學家先后在體內和體外培養條件下研究了小鼠、大鼠、牛、羊、豬和人類等多種動物的SSCs的主要表型和維持體系。先后發現GDNF(Glialcelllinederivedneurotro-phicfactor，GDNF)、Plzf(poxvirusandzincfinger)、泛素、LIF(leukemiainhibitingfactor，LIF)等多種細胞因子和基因決定著SSCs的維持和分化。 3.1調控SSCs自我更新和分化的主要分子 3.1.1GDNF GDNF是第一個被確認的能夠調控精原干細胞自我更新和分化的細胞因子，它是由睪丸支持細胞產生的，以旁分泌的方式作用于精原干細胞，其對精原干細胞自我更新的調控具有劑量依賴性(Mengetal.，2000;Jonathanetal.，2009;Spinnleretal.，2010)。支持細胞分泌的膠質細胞源神經營養因子能夠使SSCs很好地協調自我更新與分化，GDNF是一個與轉化生長因子β超家族相關的成員，也是一個對特定神經元起作用的營養因子，而這種因子可通過旁分泌的方式促進SSCs的增殖，且是一個調節多種細胞發育和分化的多功能信號分子(DeRooijetal.，2006)。GDNF發揮其調控功能的具體分子機制已通過微陣列技術獲得。在培養基中培養6日齡老鼠的SSCs，SSCs能夠正常表達GDNF，之后使一部分SSCs的GDNF表達受抑制，此時調控SSCs分化起點的基因也會受影響。由此得知，GDNF在SSCs的分化過程中起到了調控作用。GDNF的異常表達，或者支持細胞的過度表達會使A型精原細胞(type-Asinglespermatoonia，As)增多，同時抑制精子發生(Yomogidaetal.，2003)。因此，當小鼠中的GDNF過度表達時，會形成大量的精母細胞，經過大約一年的時間形成干細胞瘤(Mengetal.，2001);體內缺乏GDNF的小鼠，精子發生不能正常進行。由此得知，GDNF在SSCs的自我更新和分化過程中起到了重要的調控作用，GDNF過多會抑制干細胞的分化，引起干細胞的積聚甚至干細胞的損耗(DeRooijetal.，2006)。GDNF是調控精原干細胞體外自我更新的最基礎生長因子，其調控作用具有劑量依賴性。研究顯示，GDNF對mGSCs的自我更新的調控主要通過PI3K/Akt、Ras/Erk1/2、Src家族激酶等信號通路來實現(Heetal.，2009)。 3.1.2Plzf 轉錄抑制物家族POZ(poxvirusandzincfinger)的成員早幼粒細胞白血病鋅指蛋白(promyelociticleukemiazincfingerprotein，Plzf)也與SSCs的更新、分化有關。研究表明，Plzf在luxoid突變老鼠中是破壞基因，通過正常luxoid突變的老鼠逐漸表現出SSCs的丟失(Buaasetal.，2004;Cos-toyaetal.，2004)。因此，Plzf基因對SSCs的更新、分化也起到了調控的作用。Plzf蛋白質存在于As、Apl、Aal精母細胞中。Plzf和Bcl6b都有阻止SSCs分化的作用，但只有Bcl6b受GDNF的控制(Oatleyetal.，2006)。通路下游因子Plzf和Bcl6b對SSCs的調控還有待研究，很有可能與輔阻遏物N-CoR和SMRT有關(Payne＆Braun，2006)。#p#分頁標題#e# 3.1.3Nanos Nanos在果蠅中是最先被鑒定的一個母源效應基因。隨后科學家發現在斑馬魚、線蟲、蜜蜂、人等物種中都有Nanos同源物，它們的功能也都和個體發育或生殖細胞的發育分化。小鼠中含有3個Nanos的同源物，分別命名為Nanos1、Nanos2、Nanos3。其中Nanos1在小鼠胚胎、成體睪丸和腦組織中都有表達。Nanos1對小鼠性腺的發育不是必須的，或其功能可以被其他基因代替。而Nanos2和Nanos3是生殖細胞特異性的，其基因敲除的小鼠都不能形成正常的性腺。成體中Nanos2或Nanos3的缺失將導致生殖細胞的丟失(Tsudaetal.，2003)。Nanos3在胚胎期兩性生殖細胞中都有表達，而Nanos2只在雄性細胞中表達，因此Nanos2是一個嚴格的雄性生殖特異性基因(Atsushinetal.，2007)。Nanos2不僅維持原始生殖細胞(PGC)和精原干細胞(SSC)的自我更新，而且是一種啟動雄性程序性分化的內源性因子。 3.1.4泛素 泛素(ubiquitin)是一種存在于大多數真核細胞中的小蛋白，它的主要功能是標記需要分解掉的蛋白質使其被水解。這一過程需要由泛素C水解酶(UCHs)及其同功酶(UCH-L1，UCH-L3)完成，它們在分子水平上發揮著相似的作用，包括降解細胞內蛋白、調節細胞分裂周期、參與應激反應及細胞的凋亡過程(Baarendsetal.，2000)。研究發現，組成UCH-L1、UCH-L3的氨基酸排列順序52%相同，但是存在部位卻有明顯的差異，前者的mRNA在睪丸、卵巢和腦有高度表達(Kuriharaetal.，2001)，而后者的mRNA卻幾乎存在于所有的組織中包括睪丸和腦(Kwonetal.，2003)。通過觀察UCH-L1缺乏的突變鼠發生SSCs的增殖會呈現漸進性的降低，最終導致精子發生過程的停滯(Kwonetal.，2004)。目前研究證實UCH-L1在SSCs進行自我更新時發揮作用，而UCh-L3卻在精母細胞向精子細胞分化中發揮重要作用。 3.1.5LIF LIF是一種存在于各種組織和細胞中的多功能糖蛋白，具有誘導粒細胞白血病細胞分化、抑制胚胎干細胞分化等功能。其受體存在于細胞膜上，由二聚體組成包括與LIF結合的亞單位和跨膜轉導蛋白IL6ST組成。LIF與受體結合可激活轉錄蛋白，進而調控干細胞的自我更新。實驗中發現大鼠細胞LIF受體的缺失可導致神經干細胞的減少(Shimazakietal.，2001)。在睪丸里主要由生精小管管周細胞分泌，且在胎兒期到睪丸發育成熟過程中的生殖細胞上始終有表達(Dorvaletal.，2005)。在體外培養實驗中用能分泌LIF的飼養層再添加神經生長因子(GDNF)或者用包含LIF和GDNF的培養基培養的SSCs可以形成集落并保持對數生長(Kubotaetal.，2004)。 3.1.6Piwil 基因Piwil基因家族在人類進化過程當中是高度保守的，Piwil2蛋白參與多種干細胞的自我更新，它可以調控干細胞特異性基因的表達，包括血小板生長因子、β-多肽、Slc2al及SSCs表面特異性受體Thy-1(CD90)、Itga6、Hsp90a等。Piwil2所調控表達的這些因子及受體廣泛參與干細胞本身的增殖分化，參與細胞間的信息傳導。經證實Piwil基因在SSCs高度表達，并有促進SSCs的自我更新的功能(Tokasetal.，2011)。 3.1.7Bcl6b 小鼠GDNF異常表達的實驗中，有6個基因的分化表達水平明顯降低(DeRooijetal.，2006)。其中Bcl6b基因對體外培養的SSCs起著十分重要的作用。Bcl6b基因缺陷小鼠表現出生精上皮的損傷，除此之外，SSCs的傳導路徑的信號也受影響。 3.1.8FGFR2 成纖維母細胞生長因子受體2(fibroblastgrowthfactorreceptor，FGFR2)的基因突變能使父方的某一個精原細胞的自我更新能力增強，并逐漸代替正常的SSCs，最終產生越來越多的突變細胞。然后通路下游因子FGFR2在SSCs的自我更新和分化方面也起到調控作用。由于成纖維細胞生長因子(FGF2)由支持細胞產生，這可能是另一種調控SSCs的好方法(Kuriharaetal.，2001)。 3.1.9其他調控機制 實驗表明，當把多種生長因子添加到SSCs的培養基中發現當GDNF加入時SSCs會增多，而成骨蛋白4(bonemorphogenicprotein4，BMP4)和活化素A則會減少SSCs的數目，它們都是被支持細胞包圍的蛋白質，都與增強SSCs的分化潛能有關(Naganoetal.，2003)。He等(2009)對有關SSC調控的主要信號分子及通路做了很好的綜述(表2)。Dazl(deletedinazoospermia-like)RNA結合蛋白和視黃酸(retinoicacid，RA)在調控SSCs完成減數分裂形成精子過程中起到了非常重要的作用。RA和類視色素X受體也與精母細胞的分化有關。SCF-c-kit體系與A1的分化有關(DeRoo-ij，2001)。遺傳學研究表明bcl-2基因家族在調控SSCs的存亡上起了很重要的作用，Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、A1/Bfl-1等促進細胞的生長，而Bax、Bak、Bad、Bim等加快了SSCs的凋亡(Fuchsetal.，2000)。STAT3決定著SSCs是否分化或增殖(Oatleyetal.，2010)。最近也發現一些非編碼的RNA，尤其一些miRNA等與哺乳動物SSCs的自我更新和分化調控具有很重要的關系，如miRNA-21(Niuetal.，2011)。有關miRNA與生殖細胞發育分化的研究進展，本課題組已經進行過綜述(華進聯，張珊珊，2010)。 3.2SSCs發育的微環境(niche) niche為干細胞自我更新或存活的發育環境。在睪丸內，SSCs定居的特定niches主要由支持細胞(Sertolicell)、基膜(Basementmembrane)、小管周的肌樣細胞以及生精小管外未確定的信號形成(圖)，SSCs定位在基底室，Sertoli細胞間形成的緊密連接(Tightjunctions)將基底室和連腔小室分隔開。位于基底室的SSCs在一定的條件下通過三種分裂方式完成自我更新與分化，包括一個SSCs分裂成兩個干細胞，即自我更新分裂;或者是分裂成一個干細胞和一個分化狀態的細胞，即不對稱分裂;以及分裂成的兩個細胞都進入分化狀態，即分化分裂。經分裂形成的分化狀態的細胞逐漸分化成精母細胞(Spermatocytes)，最終形成精細胞(Spermatids)。整個分裂過程正是由于支持細胞及其周圍的各類細胞形成的獨特微環境，更好的調控SSCs更新和分化的比例，保證了SSCs的獨特生物學特性。#p#分頁標題#e# 4小結及展望 體外培養條件下，在合適的精原干細胞的培養體系中加入bFGF、GFRa1、GDNF等細胞因子可促進SSCs的增殖，并抑制其分化。但這種作用通常與精原干細胞來源小鼠的遺傳品系特異性緊密相關;并且其培養體系中是否加入了血清也會對增殖、分化、移植有顯著影響。因此，如何消除SSCs來源的品系特異性，建立無血清培養體系是研究的方向。另外，常規的SSCs培養需要飼養層細胞，目前常用的飼養層細胞有小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)飼養層和STO飼養層，它們均可產生抑制SSCs分化并維持其二倍體狀態和多能性的因子，如GDNF。但由于其細胞系的動物來源和本身具有一定的免疫源性，使其使用受到限制，所以，建立高效的無飼養層無血清快速擴增體系是研究的重點。體外培養SSCs的突破性進展，會為我們更好地了解SSCs的分化和自我更新的機制奠定一定的基礎。最近，多家研究小組以體外培養的方法從成年睪丸精原干細胞獲得胚胎干細胞生物學特性的小鼠和人類雄性生殖干細胞，這進一步擴展了哺乳動物精原干細胞的應用。 雖然人們對SSCs自我更新和分化的調節、精子發生過程的調控已經有了一定的了解，如GDNF、SCF-C-kit體系、cy-clinD2、Dazl、RA、Bcl-2基因家族等都對SSCs的自我更新與分化起到調控作用，這些研究使我們能更好的了解SSCs。但目前迫切需要解決以下2個問題:(1)SSCs調控特定因子及其信號傳導通路的發現與明確;(2)SSCs長期培養體系或細胞系的建立，尤其需要建立具有重要應用前景的家畜和人類SSCs細胞系。這些問題的解決，可望為深入研究男性不育的機制及臨床治療提供理論依據。