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1引言 嗜鹽菌指能在高鹽環境下生長的微生物，它主要生長在鹽湖、死海、鹽場等濃縮海水中以及一些鹽制品中。而來源于最適鹽濃度超過2.5mol/L嗜鹽菌中的蛋白稱為嗜鹽蛋白。這些蛋白成為目前研究其穩定性機制的主要模式蛋白[1]。嗜鹽蛋白嗜鹽機理引起了眾多研究者的關注，目前認為主要有以下一些原因[2]：1.鹽橋，嗜鹽蛋白表面引入了酸性氨基酸(Asp、Glu)殘基，與堿性氨基酸(Lys、Arg)殘基形成鹽橋(saltbridge)，消除鹽離子的屏蔽效應，使分子結構具有剛性；2.溶劑可接觸表面，嗜鹽蛋白通過減少接觸表面從而有利于保持折疊，而酸性氨基酸的增加和lys的減少正好有利于這一變化。上述特點均和蛋白分子中氨基酸組成有關。顯然，嗜鹽蛋白在氨基酸使用上與其同源的非嗜鹽蛋白存在明顯差異。然而，目前尚未見有關嗜鹽蛋白質中氨基酸使用偏好與其理化性質之間聯系的研究，而這在嗜熱[3]、嗜冷[4]等極端蛋白質中卻得到較深入研究。近年來，幾種嗜鹽微生物全基因組及蛋白質組注釋的完成為本研究提供了可能。本文統計了362對嗜鹽及非嗜鹽同源蛋白，對其分別進行兩兩比對，通過統計同源位點氨基酸取代的情況，計算出20種氨基酸的嗜鹽不對稱指數，并同其243種物理化學性質的進行相關性分析，發現其中存在明顯相關性的理化性質，為研究嗜鹽蛋白穩定性機制提供了新視角，報道如下。 2材料與方法 2.1數據來源 選取了極端嗜鹽細菌Salinibacterruber及與其在進化上比較接近的非嗜鹽菌Pelodictyonluteolum的全蛋白質組序列，這兩種菌基因組GC含量也接近，也避免了由于基因組GC含量差異導致氨基酸使用偏向性。這些序列來源于Uniprot數據庫[5]，分別得到6078及2080條蛋白質序列。 2.2同源序列的獲取及序列比對 為了減少信息冗余，剔除了所得序列中所有長度小于100個氨基酸的序列，因為它們大多為片斷（fragment）或者部分（partial），同時也剔除了其中注釋為膜蛋白的序列。同源序列（orthologs）的選取用BlastP程序，E值為1.0×10-10，找出90%長度覆蓋范圍內，同一性（identity）大于30%的同源蛋白序列。最后共得到362對同源序列。該樣本量足夠用于探測嗜鹽蛋白在氨基酸使用上的某種趨勢。獲得同源序列后，將這362對同源蛋白兩兩進行比對，以統計同源蛋白在某些位點氨基酸發生突變的情況，進行比對的軟件為ClustalX。本文共統計了108701個氨基酸，其中52102個氨基酸在相應位點發生了突變。 2.3嗜鹽不對稱指數的計算 在正常情況下，兩種氨基酸發生互相突變的幾率應該是50:50的比例，即各占50%的幾率。若受到某種因素影響，就會偏離這種幾率，偏離程度越大，表明該因素的影響越大。嗜鹽不對稱指數（Halophilicasymmetryindex，HAI）就是基于這種理念進行計算的。本文采用JohnH.McDonald等計算嗜熱不對稱指數的方法。修訂后的計算公式為：ln(/)(1)ABBAABQQ=HAIhAI式中，A表示非嗜鹽蛋白中某位點的氨基酸，B表示嗜鹽蛋白質對應位點的氨基酸，ABQ表示非嗜鹽蛋白中氨基酸A出現的位點在嗜鹽蛋白相應位點被B氨基酸取代的比例，BAQ的意思則相反。具體計算過程詳見文獻[6,7]。最近，McDonald對該算法進行了修訂，將指數值的中點數從1改為0，他認為這能更敏感的反應數據的特性[6]。 2.4氨基酸理化性質及相關性分析 文中使用了243種氨基酸的理化性質，如：親疏水性、極性、分子量、等電點、分子表面可及性、分子體積、熱容、吉布斯自由能、形成各種二級結構的傾向性、電荷分布、側鏈相互作用參數、平均柔性指數、長距離相互作用、范德華體積、熵、非共價鍵自由能等。這些數據來源于APDbase數據庫[8],網址為：www.rfdn.org/bioinfo/APDbase/index.html。將計算所得20種氨基酸的嗜鹽不對稱指數同上述243種理化性質分別進行相關性分析，選取相關系數較大（大于0.5），顯著性較高（小于0.05）的理化性質進行分析。 3結果與分析 3.1嗜鹽環境對氨基酸使用偏好的影響 通過統計嗜鹽及非嗜鹽同源蛋白在相應位點某種氨基酸突變的總趨勢，可得到一個完整的兩種類型蛋白中氨基酸使用偏性的模式，從而看出嗜鹽環境對氨基酸使用偏好的影響，所得結果如表1所示。表中HAI值越大，表明該氨基酸更容易出現在嗜鹽蛋白中，其嗜鹽性能越強。例如：非嗜鹽蛋白中除Asp（天冬氨酸）以外的其它19種氨基酸向嗜鹽蛋白中Asp突變的總數量為2246個，而嗜鹽蛋白中除Asp（天冬氨酸）以外的其它19種氨基酸向非嗜鹽蛋白中Asp突變的總數量為4515個，這說明Asp更容易出現在嗜鹽蛋白中，因此，其嗜鹽不對稱指數（HAI）最大，為0.835，其嗜鹽性能也最強。其次分別為Glu（谷氨酸，E）、Pro（脯氨酸，P）及Gln（谷氨酰胺，Q）。而Phe（苯丙氨酸，F）、Met（甲硫氨酸，M）、Lys（賴氨酸，K）及Ile（異亮氨酸，I）則為最不嗜鹽氨基酸，其HAI值從-0.512到-0.685不等。Asp和Glu為酸性氨基酸，在正常生理條件下帶負電，而Lys為堿性氨基酸，在正常生理條件下帶正電，前者在嗜鹽蛋白中含量更高，而后者則更低[9]。因此，Asp和Glu的HAI值大，而Lys的HAI值則很小。Phe和Met非常容易形成β-折疊，而較多的β-折疊對于嗜鹽蛋白的穩定性有不利影響，因此，這兩個氨基酸的HAI值也較小。然而，Pro的剛性較強，過多的Pro容易導致蛋白分子剛性太強，不利于其穩定性[10]，同時，Pro很容易出現在轉角和無規則轉曲中，是強烈的轉角和轉曲形成子；而較多轉角或無規則轉曲會使蛋白質結構更柔性，從而增加其穩定性[11]?？赡茉谑塞}蛋白中Pro主要是通過后一種機制增強嗜鹽蛋白的穩定性。與此同時，雖然Ile的側鏈為分支的異丙基，能更有效提高蛋白分子表面的柔性，增加其穩定性[12]，但是，Ile也同時強烈的β-折疊形成子，過多的β-折疊會導致嗜鹽蛋白不穩定，因此，其HAI最小，嗜鹽性能最低。 3.2氨基酸嗜鹽不對稱指數與其理化性質相關性分析#p#分頁標題#e# 將計算所得HAI值與氨基酸的243種理化性質分別進行相關性分析，得到了相關系數較大（r>0.50,p<0.05）的16個理化性質，如表2所示。這16個理化性質包括氨基酸親疏水性參數、極性、自由能、非共價鍵能量、二級結構參數等，其中與二級結構參數相關的理化性質最多，達到6個，這說明嗜鹽和非嗜鹽蛋白在二級結構上可能存在較大差異。在這16個理化性質中，有5個與HAI值呈正相關，其它均為負相關。 在5個正相關的理化性質中，有兩個與分子極性有關，極性越強，其HAI值越高，越容易出現在嗜鹽蛋白中，處于分子表面的極性氨基酸會和起所處的溶液中的水分子發生相互作用，形成氫鍵或者靜電引力（又稱水合作用），從而增強蛋白質的穩定性，而這有可從另一理化參數——回歸分析相關系數得到印證。該參數主要是反映蛋白質分子中氨基酸與溶劑相互作用面積[13]。極性越強的氨基酸與溶劑分子相互作用的面積越大，對嗜鹽蛋白的穩定性的作用也就越強。因此，該參數與HAI值相關性最強，其相關系數為0.569（見圖1及表2），p值為0.008，達到極顯著水平。而與之對應的則是一組與HAI值呈負相關的和疏水性相關的參數，在11個與HAI呈負相關的參數中，與疏水性有關的有5個，占45.5%。疏水性氨基酸一般均為非極性氨基酸，多屬于脂肪族氨基酸，減少疏水性氨基酸對嗜鹽蛋白的穩定性有積極作用。而主成分因子I（PrincipalcomponentI）主要反映的是氨基酸側鏈的長度[14]，他與HAI值呈負相關，說明嗜鹽蛋白中傾向于使用側鏈較短的氨基酸。而側鏈較小的氨基酸其體積也較小，空間位阻小，容易占據蛋白分子內外空間，有助于蛋白質折疊。 β-折疊構象的自由能（Freeenergyinbeta-strandconformation）是指把某一個氨基酸放在β-折疊結構中由自由態轉化為固定態時所需的能量[15]。它反映了各種氨基酸對β-折疊這種二級結構的傾向程度，自由能越大，說明這個氨基酸對β-折疊傾向越小，該參數與HAI值正相關，而與之想對應的參數氨基酸在β-折疊中歸一化的出現頻率（Normalizedfrequencyofbeta-sheet）則剛好與HAI負相關，進一步說明在嗜鹽蛋白中β-折疊含量較低。這兩種參數與HAI值的相關系數分別為0.527和-0.585。而與HAI值相關性最強的是優化的β結構-無規則卷曲平衡常數（Optimizedbeta-structure-coilequilibriumconstant），該參數是反映同源蛋白三級結構一致性的重要參數，它主要是反映氨基酸對β-折疊的趨向性[16]。對β-折疊趨向性越高其HAI越小，同樣也說明嗜鹽蛋白中β-折疊含量較少，它與HAI的相關系數為-0.646，p值為0.002，表明這種相關性達到極顯著水平（見圖2及表2）。而在11個與HAI值負相關的參數中，同β-折疊有關的參數有4個，占36.4%。 4小結 高鹽環境會影響蛋白質的折疊從而導致其結構的不穩定，而嗜鹽蛋白在高鹽環境中既保持了良好的穩定性又具有很好的溶解性，這與其自身獨有的與溶劑相互作用及高級結構有關[17]。這種獨特的方式引起了眾多研究者的關注，他們從基因組及蛋白質組等方面對嗜鹽蛋白嗜鹽機理進行了研究并從中找出了某些特定的氨基酸使用傾向[2,9]。但有關氨基酸這種使用偏向與其自身理化性質之間的聯系卻未見報道。因此，了解這種相關性有助于更深入了解嗜鹽蛋白穩定性的機制，對指導其后續的改造具有重要意義。 本文嚴格選取了362對嗜鹽及非嗜鹽同源蛋白，通過統計對應位點氨基酸取代情況并在此基礎上計算其HAI值并與氨基酸的243種理化性質進行相關性分析。其中與氨基酸嗜鹽不對稱指數最為相關的理化性質主要是氨基酸的親疏水性及β-折疊傾向性。這是由于在高鹽濃度的環境中，水活度降低，為了使嗜鹽蛋白的水化層不被破壞，減少其表面的疏水成分增加親水成分，從而增加其溶解性的同時加強穩定性。而β-折疊結構的減少也可使嗜鹽蛋白三級結構在增強剛性的同時（α-螺旋增加）也可加強分子的柔性（無規則卷曲增加），使二者達到一個良好的平衡，從而使分子結構更為穩定[18]。
