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水稻是我國主要的糧食作物之一，2009年11月27日中國通過了對轉Bt抗蟲水稻的生物安全認證，這一舉措具有里程碑意義，對轉基因作物在中國、亞洲乃至全世界的應用產生重大影響。轉Bt基因抗蟲水稻因其自身能合成殺蟲蛋白，從而有效地降低了農藥施用量，展現出廣泛的應用前景。但是，隨著轉Bt基因抗蟲作物大面積商品化推廣使用，使得大量外源殺蟲蛋白以植株殘體、根系分泌物或花粉等形式進入土壤環境，進而延長土壤生物與轉基因代謝產物的接觸時間［1］。雖然Bt蛋白在短期內對土棲動物無負面作用，但由于外源Bt蛋白的殺蟲特性不同，以及復合基因代謝產物在土壤中的降解及其與土壤腐殖質酸、蒙脫石或鋁羥基等的聚合物多樣，進而對土壤生物產生諸多直接或間接的不確定性影響［2］，這也是轉基因作物生態風險評估亟待明確的問題。 跳蟲是一類廣泛分布的小型節肢動物，大多喜好陰涼潮濕的土壤環境以及地表枯枝落葉層等。跳蟲種類和數量極其豐富，與線蟲和螨類一樣是土壤生態系統中的主要功能類群，，并參與物質的分解［3-4］。跳蟲對土壤環境污染十分敏感，能敏感指示土壤環境的變化程度［5-7］。國外常用來開展土壤污染的生態風險評價，如利用土壤跳蟲的豐富度和多樣性等來開展污染物對土壤環境的影響評估［8］，利用土壤跳蟲的死亡率、繁殖率、生物富集以及行為效應等作為評估被污染土壤修復成功與否的生物標志物等［9-12］。Al-Deeb等［13］對轉Cry3Bb基因棉田土壤彈尾蟲的調查結果顯示，轉基因棉田和親本對照棉田的彈尾蟲數量沒有差異。國內，應用土壤動物進行土壤生態風險評價的研究很少，僅見于轉Bt基因作物的環境風險研究，如Yu等［14］報道轉Cry1Ab和轉Cry1Ac基因棉花以及轉CryⅢ基因馬鈴薯的外源Bt毒蛋白對土棲彈尾蟲Folsomiacandida和奧甲螨Oppianitens無顯著影響。白耀宇等［15］研究指出生活在轉Bt水稻殘體環境中的跳蟲體內檢測有微量Bt殺蟲蛋白，但這對跳蟲的發生量并無不良影響，相反，轉Bt水稻稻田中跳蟲數量反而顯著高于對照親本田。 與室內試驗研究相比，大田試驗研究是在開放的野外環境下進行的，因此，研究結果更具實用性，并能切實反映實際情況。目前，在大田層次上進行的轉基因植物安全性研究報道較少，Wolfenbarger等［16］認為轉基因植物對非目標生物的影響取決于作物被改造的特征及其與生態系統其它部分復雜的關系。因此，大田環境下轉基因水稻的安全性是目前急需解決的問題。本研究選取不同基因型(Cry1Abvs．Cry1Ab+Cry1Ac)和不同類型(恢復系和雜交系)的轉Bt水稻為研究材料，開展稻田土壤跳蟲群落組成及數量動態研究，以進一步明確轉Bt作物的土壤環境安全性。 1材料與方法 1．1供試轉Bt水稻、 試驗所用轉Bt水稻為3個轉Cry1A抗蟲水稻品系及其對照親本，包括:轉Bt水稻恢復系“克螟稻”(Cry1Ab純合基因型;簡稱KMD)及其親本“秀水11”(簡稱XSD)，稻種由浙江大學原子能研究所提供;轉Bt水稻恢復系“華恢1號”(Cry1Ab+CryAc融合基因型;簡稱HH1)及其親本“明恢63”(簡稱MH63)，轉Bt水稻雜交系“Bt汕優63”(Cry1Ab+CryAc融合基因型;簡稱Bt-SY63)及其對照親本“汕優63”(簡稱SY63)，稻種均由華中農業大學植物科技學院提供。 1．2試驗地布局及耕種 試驗地設在山東省寧津縣南京農業大學植物保護學院氣候變化創新研究基地(37．64°N，116．8°E)。試驗地由面積相等的6塊相鄰樣地組成，KMD與XSD、HH1與MH63、Bt-SY63與SY63各東西向兩塊相鄰樣地，轉基因及其對照親本由西向東排列，3個水稻品系自南往北依次排列，這樣由南向北，前兩個水稻品系為恢復系的純和基因型和融合基因型，后兩個品系為融合基因型的恢復系和雜交系;每樣地劃分為4個小區，每小區5m×20m，且小區東西向和南北向玉米隔離帶均為5m。水稻于5月15日旱作直播，播種前按每畝50kg氮肥、30kg磷肥和20kg鉀肥施底肥，大田漫灌1次，并于水稻拔節期和孕穗期分別追施N肥(20kg/666．7m2)、P肥(12kg/666．7m2)和K肥(8kg)各1次;此外，播種后間隔3周人工除草和灌溉各1次。 1．3土壤取樣、跳蟲分離及其鑒定 自水稻播種后一個月，即6月11日開始，每30d進行一次土壤采樣，試驗于11月8日結束，共采樣6次。采樣時，用100mL環刀按照品種順序逐個小區(重復)進行，每小區按S形取樣方法取6環刀，每2環刀隨機放入一自封袋中，做好標記后帶回實驗室分別進行分離鑒定。土壤跳蟲的分離采用Tullgren干漏斗法，干漏斗上部為40W燈泡，干漏斗中部為金屬網篩，網眼2mm，干漏斗下部用裝有濃度為75%酒精的白色塑料小瓶收集跳蟲［17］。將帶回的每個土樣混勻后，用100mL標準環刀量取一環刀(即100mL)土樣置于干漏斗上，每次分離時間為48h。將分離得到的跳蟲按土樣標號分別用酒精清洗，然后用霍式封固液封片，玻片做好標號后置于50—60℃的烘箱中干燥1周，使蟲體透明、肢體展開，以便進行分類鑒定。土壤跳蟲鑒定由中國科學院動物所擔任，鑒定到屬，同時記錄跳蟲數量，轉化為每平方米土壤跳蟲數量，并進一步統計跳蟲類群的多樣性(H')、種類豐富度(SR)和均勻度(J)等指數［18］。此外，按照殷秀琴等［19］的方法，將土壤跳蟲劃分為優勢類群(即個體數占總捕獲量10%以上者)、常見類群(即個體數占總捕獲量1%—10%者)和稀有類群(即個體數占總捕獲量1%以下者)。同時，按照其活動位置，將土壤跳蟲劃分為土上生(地表活動)、真土生(土下活動)和半土生(地上地下活動)三類(表1)。 1．4統計分析 用SPSS16．0統計軟件進行試驗數據的分析。對6月11—11月8日期間，共計6次采樣的數據采用“雙因子重復測量方差分析”(即Two-wayRepeatedTimeANOVA)，分別比較2對恢復系的不同基因型(Cry1Ab純合基因型KMDvs．Cry1Ab+Cry1Ac融合基因型HH1)或Cry1Ab+Cry1Ac融合基因型的2對育種品系(即恢復系HH1和雜交系Bt-SY63)轉Bt水稻及其對照親本大田土壤跳蟲不同類群百分比組成、密度、多樣性指數、種類豐富度和均勻性指數的差異。并進一步通過“群體成對T檢驗”(即Group-pairedTtest)統計分析調查期間轉Bt水稻及其對照親本間，以及不同水稻品種、不同功能群間以上指標數量動態的顯著性差異(P＜0．05)。數據分析前，對絕對值數據進行對數轉換，對百分比數據進行反正弦平方根轉化，以符合正態分布假設。#p#分頁標題#e# 2結果與分析 2．1不同基因型和不同育種品系轉Bt水稻大田土壤跳蟲群落結構 2．1．1土壤跳蟲科(屬)及其類群組成 2009年6月15日—11月15日期間，轉Bt水稻及其對照親本稻田共發現6科12屬土壤跳蟲(表1)。其中，長角跳科的長角跳屬、鉤圓跳科的鉤圓跳屬以及齒棘圓跳科的齒棘圓跳屬為土上生類群;棘跳科的棘跳屬、原棘跳屬和Cribrochiurus，以及球角跳科的球角跳屬為真土生類群;等節跳科的裔符跳屬、原等跳屬、等節跳屬、似等跳屬和類符跳屬為半土生類群。由表1可見，裔符跳屬和原等跳屬為轉Bt水稻及其對照親本大田優勢類群，長角跳屬是除XSD外其它水稻大田優勢類群;此外，棘跳屬還是XSD大田優勢土壤跳蟲類群，球角跳屬還是Bt-SY63大田優勢土壤跳蟲類群;XSD的稀有類群為齒棘圓跳屬，Cribrochiurus和等節跳屬，MH63的稀有類群為齒棘圓跳屬和似等跳屬，SY63的稀有類群為類符跳屬;除了優勢類群和稀有類群外，其它為常見類群。相對于純合基因型恢復系(如齒棘圓跳屬、Cribrochiurus和等節跳屬)、融合基因型恢復系(如齒棘圓跳屬)和融合基因型雜交系(如等節跳屬)而言，轉Bt水稻種植導致個別土壤跳蟲稀有類群的消失(表1)。統計分析進一步顯示，對轉Bt水稻恢復系處理而言，不同基因型對棘跳屬(F=17．25，P＜0．001)和球角跳屬(F=6．95，P＜0．05)影響顯著(表2);與Cry1Ab轉Bt水稻相比，Cry1Ab+Cry1Ac轉Bt水稻可顯著降低棘跳屬、球角跳屬和原等跳屬百分比的62．1%、56．7%和61．8%(P＜0．05;表1)，并顯著增加裔符跳屬百分比達88．2%(P＜0．05;表1)。對Cry1Ab+Cry1Ac處理而言，不同育種品系可顯著影響鉤圓跳屬(F=4．76，P=0．049＜0．05)、球角跳屬(F=17．02，P=0．0009＜0．001)和原等跳屬(F=10．96，P=0．0079＜0．01)百分比，且轉基因處理還可顯著影響球角跳屬百分比(F=6．63，P=0．024＜0．05;表2);與對照親本相比，轉Bt雜交稻種植可顯著增加球角跳屬百分比的212．3%;與轉Bt水稻恢復系相比，轉Bt雜交稻種植可顯著提高球角跳屬和原等跳屬百分比的312．9%和171．6%，并顯著降低裔符跳屬百分比的65．5%(P＜0．05;表1)。 2．2不同基因型和不同育種品系轉Bt水稻大田土壤跳蟲數量差異 2．2．1土壤跳蟲總發生量 對轉Bt水稻恢復系處理而言，不同基因型(F=41．0，P=0．000＜0．001)及轉Bt處理(F=8．7，P=0.012)都顯著影響土壤跳蟲總量，且存在顯著的交互作用(F=5．5，P=0．038＜0．05)(表2)。其中，與對照親本水稻相比，Cry1Ab轉Bt水稻土壤跳蟲累計發生量顯著降低了44．4%(P＜0．05;圖1D)。與Cry1Ab轉Bt水稻相比，Cry1Ab+Cry1Ac轉Bt水稻恢復系土壤跳蟲累計發生量顯著降低了51．4%(P＜0．05;圖1D)。對Cry1Ab+Cry1Ac處理而言，不同育種品系間土壤跳蟲發生動態差異顯著(F=17．0，P=0．001;表2);其中，與轉Bt水稻恢復系相比，轉Bt雜交稻土壤跳蟲發生量增加顯著，調查期間累計發生量增加233．2%(P＜0．05;圖1D)。 2．2．2土上生、真土生和半土生土壤跳蟲發生量 不同基因型(F=21．2、P=0．001和F=27．1、P＜0．001)和不同育種品系(F=11．0、P=0．006和F=18．0、P=0．001)稻田真土生和半土生跳蟲類群發生動態差異顯著，且轉Bt處理可顯著影響融合基因型轉Bt水稻處理真土生跳蟲(F=7．3，P=0．019＜0．05)和轉Bt水稻恢復系處理半土生跳蟲發生動態(F=9．9，P=0．009＜0．001;表2)。與對照親本相比，Cry1Ab轉Bt水稻顯著降低了半土生跳蟲發生動態，其累計發生量減少達54．7%(P＜0．05;圖1C);Cry1Ab+Cry1Ac轉Bt水稻雜交系顯著提高了真土生類群土壤跳蟲發生動態，其累計發生量增加達180．4%(P＜0．05;圖1B)。此外，與Cry1Ab轉Bt水稻相比，Cry1Ab+Cry1Ac轉Bt水稻恢復系顯著降低了半土生土壤跳蟲發生動態，其累計發生量降低達43．4%(P＜0．05;圖1C);與Cry1Ab+Cry1Ac轉Bt水稻恢復系相比，Cry1Ab+Cry1Ac轉Bt雜交稻顯著提高了半土生跳蟲發生量，其累計發生量增幅達302．4%(P＜0．05;圖1C)。 2．3土壤跳蟲種類豐富度，群落多樣性以及群落均勻性指標 在土壤跳蟲種類豐富度方面，對轉Bt水稻恢復系處理而言，不同基因型可顯著影響土壤跳蟲種類豐富度(F=26．38，P＜0．001;表2)。其中，與對照親本相比，Cry1Ab轉Bt水稻顯著降低了土壤跳蟲種類豐富度，發生期平均降幅達26．7%(P＜0．05;圖2A)。此外，對Cry1Ab+Cry1Ac融合基因型處理而言，不同育種品系間土壤跳蟲種類豐富度差異也達顯著水平(F=20．3，P=0．001;表2)。與轉Bt水稻恢復系相比，轉Bt水稻雜交系顯著增加了土壤跳蟲種類豐富度，發生期平均增幅達54．0%(P＜0．05;圖2A)。在土壤跳蟲群落多樣性方面，盡管不同基因型可顯著影響恢復系處理稻田土壤跳蟲群落多樣性(F=11.2，P=0．006＜0．01;表2)，但Cry1Ab轉Bt水稻與Cry1Ab+Cry1Ac轉Bt水稻恢復系稻田土壤跳蟲群落多樣性差異不顯著(P＞0．05;圖2B)。對Cry1Ab+Cry1Ac處理而言，不同育種品系間土壤跳蟲群落多樣性差異顯著(F=6．4，P=0．027＜0．05;表2);與轉Bt水稻恢復系相比，轉Bt雜交稻顯著提高了土壤跳蟲群落多樣性，平均增幅達16．9%(P＜0．05;圖2B)。在土壤跳蟲群落均勻性方面，對轉Bt水稻恢復系而言，不同基因型處理可顯著影響稻田土壤跳蟲群落均勻性(F=8．0，P=0．015;表2)，但Cry1Ab轉Bt水稻與Cry1Ab+Cry1Ac轉Bt水稻恢復系稻田土壤跳蟲群落均勻性差異不顯著(P＞0．05;圖2C)。對Cry1Ab+Cry1Ac處理而言，不同育種品系間及轉Bt水稻與其對照親本間土壤跳蟲群落均勻性差異均不顯著(P＞0．05;表2和圖2C)。 3討論與展望 土壤是生態系統中物質循環和能量轉化過程的重要場所，而土壤生物又是土壤質量評價的重要生物指標。特定環境下的土壤動物群落結構通常是穩定的，當環境發生變化時，群落結構也隨之發生相應改變。跳蟲作為土壤動物的三大功能類群之一，種類豐富，個體密度大，多樣性高，是評價土壤質量最重要的指示物種之一［20-23］。本文通過研究3種轉Cry1A品系水稻(即Cry1Ab純合基因型恢復系“克螟稻”，Cry1Ab+CryAc融合基因型恢復系“華恢1號”和雜交系“Bt汕優63”)及其對照親本(秀水11、明恢63和汕優63)稻田土壤跳蟲群落組成和數量動態，以期對轉基水稻恢復系不同基因型(即Cry1Ab純合基因型和Cry1Ab+Cry1Ac融合基因型)和Cry1Ab+Cry1Ac融合基因型不同育種類型(即恢復系和雜交系)轉Bt水稻土壤生態安全性做出評價。結果顯示，不同基因型和不同育種方式都顯著影響了大田土壤跳蟲的群落組成，發生量和相關群落指數;但與對照親本相比，轉Bt基因處理對土壤跳蟲的影響大都表現不顯著，然而對不同生活類群的跳蟲出現了不同的影響，這可能與食物源有關;其中，土上生的類群主要為植食性的，真土生的類群多為菌食性的，半土生的類群多為腐食性的。由于轉基因水稻是稻田生態系統的初級生產者，產生的毒性物質通過植株殘體和根系分泌物等進入土壤，與土壤腐殖質酸、蒙脫石或鋁羥基等的聚合，進而延長土壤生物與轉基因代謝產物的接觸時間［1］，改變根際微環境，導致根際微生物群落結構發生變化［24］，最終會破壞稻田土壤食物鏈，因此食物源的變化最終導致了不同生活類群土壤跳蟲的不同反應。James等報道轉Bt基因作物的Bt蛋白可通過根系分泌物及作物殘體進入土壤中，影響土壤中的無脊椎動物以及養分循環［25］。#p#分頁標題#e# 與融合基因型轉Bt水稻恢復系相比，融合基因型轉Bt水稻雜交系顯著提高了稻田球角跳屬百分比。此外，與對照親本相比，融合基因型轉Bt水稻也顯著提高了稻田真土生類群土壤跳蟲數量。白耀宇等［15］研究結果表明，在Bt稻殘體環境中生活的跳蟲有微量Bt殺蟲蛋白，但這對其數量的增長并無不良影響，Bt稻田中跳蟲數量反而顯著高于對照田的?？梢?，轉Bt水稻大田土壤跳蟲功能類群對不同基因型和不同育種類型的反應不同。純合基因型恢復系對對大田土壤跳蟲的負面作用較大，而融合基因雜交系對大田土壤跳蟲不但沒有不良影響，相反還能促進土壤跳蟲類群數量增加。另一方面融合基因型中的雜交系較恢復系在半土生類群和總跳蟲數量，以及群落多樣性和均勻度上影響較小。可見，生產中轉Bt水稻雜交系的推廣有利于提高土壤跳蟲數量和種類豐富度，增加土壤跳蟲群落的穩定性，進而有利于其土壤生態功能的發揮。 本研究結果還表明，不同類型土壤跳蟲對不同基因型和不同育種類型的轉Bt水稻的響應不同。各種跳蟲對環境擾動所表現出的不一致性可能與跳蟲自身的環境適應能力及其生態可塑性，以及種間競爭能力等相關。Benedict等［26］和Sachs等［27］認為溫度、土壤濕度及肥料等環境因素可影響轉Bt基因植物外源蛋白的表達量。周冬生等［28］的試驗結果也證明了這一點。Hagvar［29］指出環境脅迫下競爭可能對群落組成起著一定的作用。但僅僅通過土壤跳蟲群落生態學研究很難對轉Bt水稻的環境安全性做出正確而清晰的評價。國內外已開展了相關土壤跳蟲的生態毒性測試來評價土壤污染的生態風險研究［30-31］，包括利用同工酶凝膠電泳和酶活性檢測的方法［32］對酯酶同工酶進行研究，并以此作為評價轉基因植物對昆蟲等環境生物影響的檢測和監測手段。另外，近年來，在跳蟲繁殖率抑制實驗評估基礎上興起的跳蟲分子生態效應研究也逐漸被關注，而將土壤跳蟲生物毒性測試與新技術，如跳蟲芯片技術［33］等相結合進行土壤生態風險評價則是未來研究發展的重要方向。相信，隨著土壤學、生態學，分子生物學和環境科學等學科間的交叉滲透和發展，對土壤跳蟲生態毒理學研究將會有更深層次的認識和發展，而利用土壤跳蟲作為環境指示生物將是開展轉基因作物環境風險評價的重要研究手段和有利工具。