前言：尋找寫作靈感？中文期刊網用心挑選的基于響應面法優化乳脂肪酶解工藝分析，希望能為您的閱讀和創作帶來靈感，歡迎大家閱讀并分享。
材料與方法
1.材料與試劑:
新西蘭無水奶油(上海愛普香精香料有限公司)；Palatase20,000L（丹麥諾維信公司）；0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(食品級)；0.1mol/L氫氧化鉀標準溶液（分析純）；95%乙醇（分析純）；石油醚（分析純）；酚酞；氫氧化鈉-乙醇溶液（分析純）；0.5mol/L鹽酸標準溶液（分析純）；中性乙醇（自制）；去離子水（自制）。
2.儀器與設備:ZNHW-Ⅱ型智能恒溫電熱套，鞏義市予華儀器有限責任公司；PL203型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JB90-SH型數顯恒速強力電動攪拌機，上海標本模型廠；DHG-9073B5-Ⅲ型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；智能數顯恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限責任公司。
3.試驗方法
原料奶油基本成分分析方法:脂肪含量的測定：酸水解法GB5009.6-2003；蛋白含量的測定：微量凱氏定氮法GB5511-2008；水分的測定：干燥法GB5497-1985；灰分的測定：馬福爐灼燒法GB5009.4-2010；過氧化值的測定：碘量法GB5538-2005；酸價的測定：滴定法GB5530-2005。
酶解產物的制備及處理:取150g無水奶油于0.2mol/L磷酸緩沖液中，將此混合物置于三角瓶中，加入0.25%的酶在50℃、以170r/min攪拌下進行酶解反應，分別在2小時、4小時、6小時、8小時、10小時取適量的反應物測定其酸價和皂化價，以脂解率為評價指標，在各個不同反應階段，研究不同的酶添加量、底物濃度、酶解時間及pH對酶解產物的影響。
脂解率的測定:測定酶解反應混合物前后的酸值（AV）和皂化值（SV），根據公式（1-1）來計算脂解率：脂解率%=反應前后酸價變化含量/反應后的皂化值×100（1-1）式中：皂化值的測定[17]：約稱量2g酶解產物加入到25ml氫氧化鈉-乙醇溶液于錐形瓶中，接上回流冷凝管，在恒溫85℃的水浴鍋中煮沸約30分鐘，待煮液透明后，取下回流冷凝管加入中性乙醇溶液10ml。向錐形瓶中滴加酚酞數滴，趁熱用鹽酸滴定紅色消失。
4.奶油酶解工藝條件優化
單因素實驗結果表明，當加酶量為底物干重的0.25%時與0.3%時基本保持水平，這時的脂解率不再隨加酶量的增加而增加，同時考慮到生產工業化的成本，因此選擇底物干重的0.25%作為酶添加量。同時隨著酶解時間的增長，脂解率也會不斷的增大，但酶解的目的不在追求脂解率的最大化，而在于能得到風味最佳的酶解基料，同時在單因素反應系列中不難發現，酶解反應到最后幾個小時，脂解率基本保持一致，不再隨反應時間增長而增大。此外，若酶解時間過長會導致長鏈脂肪酸釋放過多，以至于基料帶有明顯的皂味；若酶解時間過短必會影響到中短鏈脂肪酸的釋放，導致基料風味有缺陷，增香強度不夠[18]，所以初步選定酶解時間為6小時，以底物濃度、酶解溫度和pH值3個因素作為自變量，并以單因素試驗結果為依據，以脂解率為響應值，利用Design-Expert7.0設計三因素三水平試驗方案，建立二次回歸方程擬合因素和響應值之間的函數關系，采用響應面分析法來確定最佳的酶解條件。
結果與討論
1.原料奶油基本成分:酶法制備奶味香精基料可以選擇多種原料，不同奶油原料有著不同的風味特點，為制得氣味自然，滋味濃厚感突出的增香產物，除了乳脂肪外還需要適量能溶于水的小分子乳蛋白呈味物質。原料奶油基本成分見表1。
2.單因素試驗結果
酶添加量對脂解率影響:在反應體系總量150g不變的條件下，固定奶油底物和緩沖液的相對質量比為85%，反應溫度為50℃，pH為8，分別考察不同酶添加量（0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%）對脂解率的影響，并且分別在2小時、4小時、6小時、8小時和10小時取樣分析不同酶解時間對整個反應的影響。結果如圖1所示。圖1結果表明，隨著加酶量的增加，脂肪酶Palatase20,000L對無水奶油的酶解作用逐漸增強，當加酶量超過0.25%底物干重時，脂解率增加趨勢變緩，說明酶已經達到飽和濃度，而且反應在6-10小時這個間段與0.3%底物干重時反應體系幾乎重疊，說明當反應時間大于6小時，脂解率變化不明顯，繼續增加酶濃度及反應時間對酶解率的影響不大，所以選擇最適酶添加量為0.25%底物干重。
底物濃度對脂解率的影響:脂肪酶在油水界面上具有較大的活性，因此催化作用需要有一定的水分來維持酶分子的活性構象，同時改變其分子構象暴露活性中心，使酶處于激活狀態而表現一定的催化能力。當水分含量過低或過高時，酶分子的催化部位就不能和水分子緊密接觸，進而不能很好的維持酶的活性分子構象，導致酶解能力降低[19]，因此，油脂水解需要一個適宜的底物濃度，為此本實驗在保持反應總量不變的條件下，改變無水奶油與磷酸鹽緩沖液的相對質量比來觀察底物濃度對脂解率的影響，分別選擇75%、80%、85%、90%、95%五個底物濃度，并且在不同時間段分析酶解時間對脂解率的影響，結果如圖2所示。由圖2可見，底物濃度對脂解率影響是明顯的，在濃度處于75%到85%之間時脂解率迅速增大，而當底物濃度超過85%后脂解變化開始變緩，從90%上升到95%時脂解率反而呈減少趨勢，由于脂肪酶活性僅需少量水就可以保持酶的活性，因此只要能夠滿足酶的活性，脂解率就會隨底物濃度增大而增大，若底物濃度過大，則會產生底物對酶解反應有抑制作用，因此水解乳脂肪的最適底物濃度為85%。
pH對脂解率的影響:不同的pH值會影響到酶分子活性中心的催化基團的穩定性，進而影響整個反應體系的酶解速率，在固定酶添加量、底物濃度、溫度及不同反應時間段，調節磷酸鹽緩沖液的pH值來觀察不同pH值對脂解率的影響，結果如圖3所示。圖3結果表明，在相同的實驗條件下，當pH為8時，奶油酶解的速率是最高的，在各個不用的時間段也是在pH為8時最高，因此脂肪酶Palatase20,000L在pH為8時酶解活性最強，為此最適反應pH為8。
溫度對脂解率的影響：不同的溫度會影響到脂肪酶活性中心的分子構象分布及底物奶油的乳化狀態，進而影響到整個反應的酶解速率，在溫度低于最適溫度時，酶活性較低，則反應速度較慢；當溫度高于最適溫度時會導致脂肪酶變性而減弱甚至失去催化活性，本試驗選擇5個溫度條件，固定底物濃度、酶添加量及pH值在不同時間點分別取樣來分析不同溫度對脂解率的影響。結果如圖4所示。從圖中可以看出溫度對脂肪酶Palatase20,000L影響是很明顯的，當溫度從40℃升高到50℃時脂解率是明顯增大，而溫度升高到50℃后脂解率就出現變緩趨勢，處于50℃與55℃之間時達到最大值，但當繼續升高溫度時脂解率是明顯下降，說明脂肪酶已逐步變性失活，同時隨著反應時間的延長底物量不斷減少，酶活力的下降，從反應6小時后，脂解率的增加已趨于平緩，在6、8、10小時這時間段反應速率曲線趨于重疊。因此脂肪酶Palatase20,000L的最適酶解溫度在50℃左右。#p#分頁標題#e#
3.響應面試驗設計方案及結果:根據中心組合試驗設計原理，在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken[20-21]實驗設計優化奶油酶解工藝，選用影響脂肪酶活性的3個主要因素：A（底物濃度），B（反應溫度），C（pH值）。每一個自變量水平分別以-1、0、1進行編碼，利用Design-Expert7.0軟件進行3因素3水平的響應曲面試驗設計，實驗因素及水平設計見表2，響應面設計方案及結果見表3。
4.建立回歸方程及統計分析:根據Design-Expert7.0軟件對表3中的脂解率進行多元回歸分析，得到脂解率對底物濃度、反應溫度、pH的二次回歸模型，該式表達了脂解率與各因素之間的變化規律，其二次多元回歸模型為：脂解率（%）=28.8-2.23A+0.55B+2.26C-1.49AB+1.69AC-1.35BC-3.02A2-2.79B2-3.61C2對該模型進行方差分析，結果見表4。回歸方程中各變量對指標影響的顯著性，由F檢驗來判定，概率P的值越小，則相應變量的顯著程度就越高。由表4可以看出，對脂解率變化所建立的回歸模型是極顯著（P<0.01），失擬項不顯著（P>0.05），最顯著的因素一次項有A、B、C，二次項有AB、ACBC、A2、B2、C2。回歸方程也是高度顯著的，相關系數為R2=0.9869，說明回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，其校正決定系數RAdj2=0.9430，表明有約0.06%的脂解率變化不能由該模型進行解釋。利用該模型可以確定最佳奶油酶解工藝條件。
5.響應曲面分析
溫度與底物濃度的交互作用:由圖5分析可知，固定酶添加量0.25%底物干重、pH為8時，酶解時間在6h，當底物濃度較低時，隨著溫度的不斷上升，脂解率也會顯著增大；當溫度在50℃～55℃范圍內，奶油脂解率達到一個最大值，但當隨著底物濃度的增大，脂解率逐漸減少。
pH與底物濃度的交互作用:固定酶添加量0.25%底物干重、溫度在50℃反應6個小時，pH與底物濃度對脂解率的交互作用見圖6。由圖6可以看出，隨著底物濃度的增大，脂解率先緩慢增大后是逐漸減少；當底物濃度較低時，隨著pH值的增大，脂解率先增大后減少，在pH為8左右時，脂解率能夠達到最大值。這與pH對脂解率的單因素試驗中的分析結果是一致的。
pH與溫度的交互作用:由圖7分析可知，固定酶添加量為0.25%底物干重，底物濃度為85%，酶解時間為6小時，當酶解溫度較低時，隨著pH不斷增大，脂解率呈迅速增大后緩慢減少，在pH值為8左右時達到最大值；當pH值較低時，隨著反應溫度不斷增大，脂解率則呈先增大后減少的趨勢，這兩因素對脂解率的交互作用表現是明顯的。
6.奶油酶解脂解率的最優值預測及驗證
通過統計預測出奶油最佳酶解條件為：酶添加量為0.25%底物干重、底物濃度為83.3%、酶解溫度為51℃、pH值為8.2。在此條件下酶解，由回歸方程預測脂解率為29.47%。根據響應面分析法得到的最佳條件，進行了重復實驗驗證預測值，重復實驗結果反應響應值與回歸方程預測值吻合良好。結果見表5。
結論
本實驗通過固定最佳脂肪酶Palatase20,000L，在對奶油酶解進行單因素實驗后，固定酶添加量為0.25%底物干重，酶解時間6h之后，確定溫度、底物濃度及pH為對脂解率影響最大的三個因素，因此選用這三個因素進行響應面的優化，分析表明較高和較低的pH與溫度都不利于提高酶解反應的速率，而且較高的底物濃度也不利于提高酶解速率，最后得到酶解最佳條件：底物濃度為83%；酶解溫度為51℃；pH值為8。然后根據這幾個響應面法優化后的條件參數進行奶油酶解重復實驗，得到脂解率為28.77%，在很大程度上優化了該酶解工藝，同時在此條件下也獲得最佳的增香效果，為以后工業化生產提供了重要的理論依據。（本文圖、表略）
本文作者：黎海彬 姚正曉 劉慧娟 江津津 陳林 張挺 單位：廣州城市職業學院 廣西工學院