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摘要：以油茶餅粕為原材料，采用微波預處理法，以水作提取溶劑，通過單因素試驗研究液固比、溫度、時間和pH值對油茶餅粕中茶皂素、蛋白質提取率的影響，并采用正交試驗確定最佳提取工藝條件。結果表明，在液固比為7mL∶1g，浸提時間為2．5h、pH值為10、浸提溫度為65℃時，茶皂素的提取率可達13．93％，蛋白質提取率可達6．92％。
關鍵詞：油茶餅粕；茶皂素；蛋白質；微波；浸提工藝
為了減輕化學農藥和化肥造成的污染，實現2020年農藥化肥零增長的目標，植物源有機藥肥的研究與開發成為當前熱點［1－4］。茶粕中含有12％～18％茶皂素、7％～12％蛋白質以及氨基酸、多糖等物質，是一種非常有市場與應用前景的植物源有機藥肥［5－7］。在實際生產中，茶粕基本上是直接被使用，有效成分利用率低，藥效、肥效差。因此，亟需將茶粕有效成分提取出來使用，以提高其利用率，增強其藥效和肥效。但一般用熱水浸提茶粕時，茶皂素浸提率低［8］，且水性茶粕提取液性能不穩定，茶粕中的水解酶可導致茶皂素水解沉淀［9］，茶粕中的霉菌易引發浸提液霉變腐敗變質，這是限制其作為藥肥使用的技術難題。微波具有熱效應和非熱效應等多種特性。微波熱效應可導致細胞內的極性物質尤其是水分子吸收微波能，使胞內溫度迅速上升，水汽化后將細胞膜和細胞壁沖破，形成微小的孔洞，使表面出現裂紋，此時胞外溶劑容易進入細胞內，溶解并釋放出胞內物質［10－11］；微波非熱效應則可殺菌除酶。本研究先用微波預處理茶粕粉末來破壁殺菌除酶，再通過熱水浸提制備茶粕基植物源有機藥肥，以期為茶粕綜合利用提供新的途徑。
1材料與方法
1．1材料與儀器
油茶餅粕由廣東省梅州市梅江區富強客家特產經營部提供，茶皂素標準樣品購于上海博蘊生物科技有限公司。生化試劑牛血清蛋白為標準樣品；酒石酸鉀鈉、五水硫酸銅、碘化鉀、氫氧化鉀、鹽酸、無水乙醇、硫酸、香草醛均為分析純。所用儀器為PHS－3C型數顯精密酸度計、RE－85Z型旋轉蒸發器、HH－1型電熱恒溫水浴鍋、DGG－9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱、DZG－6020型真空干燥箱、VIS－7200型紫外可見分光光度計、G8023CSL－K3型微波爐（格蘭仕）、HJ－3型數碼恒溫磁力攪拌器。
1．2試驗方法
1．2．1原料微波預處理
油茶粕餅干燥后，粉碎，過300目篩，取篩過物進一步干燥至含水量為4％。精確稱量20g粉末，以800W功率微波處理150s。
1．2．2熱水浸提制藥肥
對微波處理過的粉末按某一液固比、溫度、時間、pH值浸提，浸提后過濾，濾液加鹽酸調pH值為5．2，在真空（真空度0．09）、溫度為70℃條件下濃縮得到提取液，備用。
1．2．3茶皂素的測定
1．2．3．1標準曲線的繪制
精確稱取茶皂素標準樣品0．1g，用80％乙醇溶液溶解并定容至100．00mL，搖勻，配制成1．0mg／mL溶液。分別取標準溶液0．00、0．20、0．40、0．60、0．80、1．00mL置于10mL容量瓶中，并加80％乙醇分別將體積補充至1．0mL，再分別加入8％香草醛乙醇溶液1．0mL，將容量瓶移至冰水中，用77％硫酸水溶液定容，搖勻，于60℃下加熱30min，進行顯色反應；然后置于冰水中冷卻10min，取出置于室溫下，以第1支容量瓶作空白對照，于550nm下測吸光度。
1．2．3．2樣品的測定
將“1．2．2”節中待測濾液稀釋為含茶皂素量在0．7mg／mL左右的樣品溶液，精密吸取1．0mL，置于10mL具塞磨口試管中，根據標準曲線的測定方法，測定吸光度，根據標準曲線計算樣品中茶皂素的含量，進而計算茶皂素提取率。
1．2．4蛋白質的測定
1．2．4．1標準曲線的繪制
雙縮脲試劑的配制：準確稱取4．00g五水硫酸銅、2．49g碘化鉀、28．00g氫氧化鉀、10．00g酒石酸鉀鈉，分別溶解于蒸餾水中，定容到1000mL。按照牛血清蛋白試劑標簽中給出的蛋白質含量，計算稱樣量后，準確稱取牛血清蛋白，以28g／L氫氧化鉀水溶液配制成含量約為4mg／mL的蛋白質標準溶液。分別取蛋白質標準溶液0．0、0．1、0．2、0．3、0．4、0．5mL置于10mL具塞比色試管中，用蒸餾水補齊至1．0mL，然后向各比色管中加入4．0mL雙縮脲試劑，混勻，室溫（25℃）下反應30min。以第1支試管作空白對照，在540nm波長測定吸光度。
1．2．4．2樣品的測定
將“1．2．2”節中待測濾液稀釋為含蛋白質量在1．5mg／mL左右的樣品溶液，精確吸取1．0mL，置于10mL具塞磨口試管中，根據標準曲線的測定方法，測定吸光度，根據標準曲線計算樣品中蛋白質的含量，進而計算蛋白質提取率。
2結果與討論
2．1標準曲線的繪制
以茶皂素濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線（圖1），得到的曲線回歸方程為y＝0．9697x＋0．0053，其相關系數為r2＝0．9998。以蛋白質濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標作標準曲線（圖2），得到的曲線回歸方程為y＝0．2811x＋0．0035，其相關系數為r2＝0．9999。
2．2微波預處理對工藝特性的影響
取“1．2．1”節微波處理粉末10g，同時取未處理粉末10g為空白對照，分別在相同條件下（溫度60℃、液固比7mL∶1g、pH值10、2．5h）浸提，其浸提液過濾特性、霉變特性、穩定性以及茶皂素。微波處理粉末的茶皂素提取率高于未處理粉末，其原因主要是微波熱效應導致細胞內的水汽化，將細胞膜和細胞壁沖破，形成微小的孔洞，使細胞表面出現裂紋，浸提時熱水容易進入細胞內溶解胞內物質。同時，微波熱效應和非熱效應都有可能使某些蛋白質變性，改變蛋白質結構，使水溶性蛋白質減少，蛋白質提取率降低；但微波處理避免了水溶性蛋白質形成膠體溶液，使浸提后液固分離的處理（過濾）變得簡單。同時微波處理殺死了茶粕中的霉菌，并使茶皂素水解酶失活，達到了較理想的處理效果。
2．3浸提時間對提取率的影響
在浸提液固比為6mL∶1g、pH值為10、浸提溫度為60℃的條件下，考慮不同浸提時間對茶皂素和蛋白質提取率的影響，結果如圖3所示，在浸提1h時，提取率較低，隨著時間的增加，提取率首先明顯提升，這是由于浸提時間少時，浸提溶劑與茶粕粉末接觸的時間短，浸提溶劑還沒完全將茶皂素和蛋白質充分溶出。浸提在2h以后，蛋白質的提取率基本保持不變，水溶性蛋白質接近溶解平衡，茶皂素的提取率還有少量的提升。由于茶粕粉末內部溶質的溶解及擴散都需要一定的時間，所以延長提取時間有利于茶皂素提取完全，提取率會相應有所提高。但是，隨著時間的繼續增加，液相主體溶質的濃度增加，傳質推動力減小，提取的速度下降，使得生產能力降低。所以選擇2～3h作為后續試驗的提取時間。
2．4浸提溫度對提取率的影響
在浸提液固比為6mL∶1g、pH值為10、浸提時間為2h的條件下，考慮不同浸提溫度對茶皂素和蛋白質提取率的影響，結果如圖4所示，隨著溫度的升高，茶皂素和蛋白質的提取率首先有明顯提升。至60℃以后，茶皂素提取率稍有降低，由于溫度升高，茶皂素的溶解度增加，浸提液中的茶皂素濃度有所增加，同時溫度的升高會使溶液的黏度下降，擴散系數增大，這有利于茶皂素的浸出。但是，當浸提溫度超過60℃時，蛋白質的提取率明顯下降，可能是由于蛋白變性析出導致的。所以選擇55～65℃作為后續試驗的溫度范圍。
2．5浸提液固比對提取率的影響
在浸提時間為2h、pH值為10、浸提溫度為60℃的條件下，考慮不同浸提液固比對茶皂素和蛋白質提取率的影響，結果如圖5所示，在液固比較小的情況下，茶皂素和蛋白質的浸取率較低，隨著液固比的增加，提取率逐漸增加，這是因為隨著液固比的增大，浸提溶劑的量增多，達到溶解平衡時會有更多的蛋白質和茶皂素被提取出來。在液固比較大的情況下，因為蛋白質和茶皂素已基本溶出，且隨著液固比的增加，提取率增長很少，而后續濃縮的工作量和能耗增加很多。所以選擇（6～8）mL∶1g作為液固比參數范圍。
2．6浸提液pH值對提取率的影響
在浸提液固比為6mL∶1g、浸提時間為2h、浸提溫度為60℃的條件下，考慮不同浸提液pH值對茶皂素和蛋白質提取率的影響，結果如圖6所示，茶皂素的提取率首先隨著提取液pH值的逐漸增大而增大，在pH值為10．0時，提取率達到最大，隨后呈下降趨勢。其原因在于茶皂素溶液的pH值為5．5～6．5，偏酸性；當提取液偏堿性時，更容易使茶皂素從茶粕粉末中釋放到提取液中，但是當pH值過大時，茶皂素在堿性條件下會發生水解，反而使提取液中茶皂素含量降低。隨著pH值的增大，蛋白質的提取率首先增高，當pH值大于10?0時，提取率趨于平緩，或有所降低。理論上講，在堿性范圍內，pH值越高，蛋白質溶出率越高，但是堿性過強會引起蛋白質極端變性，團聚沉降，使水溶性蛋白質含量降低；同時部分蛋白質會發生水解。因此，選擇pH值為9～11作為后續試驗的pH范圍。
2．7正交試驗優化結果與分析
通過對各單因素試驗結果的分析，得到正交試驗的各因素取值范圍。綜合考慮，選擇浸提時間、液固比、溫度、pH值4個因素進行正交試驗，設計3個水平，因素水平見表2，正交試驗結果見表3。根據正交試驗結果可知，影響茶皂素、蛋白質提取率因素的主次是不相同的，各因素對茶皂素提取率的影響程度按照R值從大到小依次是pH值＞液固比＞溫度＞時間，各因素對蛋白質提取率的影響程度按照r值從大到小依次是pH值＞液固比＞時間＞溫度，其中pH值和液固比對茶皂素、蛋白質的提取率影響較大，溫度和時間的影響較小；茶皂素與蛋白質提取的最佳組合條件均為A2B2C2D3，即液固比為7mL∶1g、浸提時間為2．5h、pH值為10、溫度為65℃。對提取率最佳組合進行驗證發現，茶皂素提取率為13．93％，蛋白質提取率為6．92％。
3結論
本研究采用微波預處理法制備茶粕基植物源有機藥肥。通過對比試驗得出，茶粕粉經過微波預處理后，熱水浸提時茶皂素提取率增加，蛋白質提取率略微減少，但改善了過濾操作，產品不會霉變、穩定性好。通過4個因素的單因素試驗和正交試驗得出，茶皂素與蛋白質提取的最佳組合條件均為液固比7mL∶1g、浸提時間2．5h、pH值10、溫度65℃。通過驗證表明，在最佳條件下，茶皂素提取率為13．93％，蛋白質提取率為6．92％。該工藝為茶粕綜合利用提供了新的途徑。
作者:胡福田 周紅軍 徐華 周新華 戴修純 單位:仲愷農業工程學院化學化工學院 廣州市農業科學研究院
