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微生物多樣性分析方法范文1
【摘要】16S rRNA分析的實驗技術為微生物生態學的研究提供了新的研究方法，因此越來越多的學者利用16S rRNA進行各種實驗的研究并取得了驕人的成績。本文對16S rRNA基因的獲得做一簡單介紹，重點介紹16S rRNA基因的應用。16S rRNA在細菌菌種鑒定、環境保護、疾病診斷等方面都取得了很好的研究進展，不久的將來16S rRNA基因將會為人類做出更大的貢獻。
【關鍵詞】16S rRNA；菌種鑒定；疾病診斷；環境保護
前 言
隨著遺傳學、分子生物學、細胞生物學等學科的迅速發展，越來越多的新方法和新技術被應用于分子水平研究領域。在這樣的背景下，16S rRNA基因的研究無論在廣度和深度上都取得了顯著的成就，16S rRNA基因技術的應用在微生物多樣性、微生物種群分析、重要基因的發現、以及遺傳物質在微生物之間或微生物與非生物環境之間相互關系等方面均做出了巨大的貢獻，并開辟了微生物生態學研究新的領域。關于16S rRNA基因方面的綜合性論述尚未見報道，本文將為該領域的進一步研究提供必要的綜合信息。
1 16S rRNA基因的簡介:細菌rRNA按沉降系數分為3種，分別為5S、16S和23S rRNA。其中位于原核細胞核糖體小亞基上的16S rRNA長約1540bp，結構和堿基排列復雜度適中，較易于進行序列測定和分析比較。16S rDNA是細菌染色體上編碼16S rRNA相對應的DNA序列，存在于所有細菌染色體基因中，它的內部結構由保守區及可變區兩部分組成，因此可用PCR擴增其相應的rDN斷，來快速、靈敏地檢測樣品中是否存在某些細菌或致病菌，或進行細菌多樣性分析。
2 16S rRNA基因在細菌菌種鑒定中的應用:1977年C.Woese通過對各種生物的rRNA進行分析，認為16S rRNA基因及其類似的rRNA基因序列作為生物系統發育指標最為合適，提出了可將自然界的生命分為細菌、古菌和真核生物三域（domain），揭示了各生物之間的系統發育關系，使微生物學進入到成熟時期，因此許多研究采用測16S rRNA基因部分序列的方法進行多樣性分析。Funke等測定從人體分離到的棒桿菌依賴補體細胞毒性Ⅰ組及其類似棒桿菌的16S rRNA序列，通過對這些序列的比較發現這兩個棒桿菌組都屬于放線菌屬，再結合其它的分子實驗結果及以前的生化試驗結果，提出其為放線菌一個新種，即鈕氏放線菌。Gaydos等通過對肺炎衣原體的1554bp 16S rRNA序列與鸚鵡熱衣原體及砂眼衣原體的16S rRNA序列進行同源性比較并繪制了系統進化樹，發現肺炎衣原體與后二者的同源性分別為96%和94%，證實了以前根據其它方法研究所得出的結論，同時說明從遺傳進化角度來看，肺炎衣原體與鸚鵡熱衣原體的進化關系比與砂眼衣原體的關系更近。
隨著大部分細菌的16S rRNA序列的獲得以及核酸擴增16S rRNA序列測定自動化分析系統的問世，必將引起細菌分類的一次重大變革，它可以使人們進一步了解細菌的進化關系，從而產生以16S rRNA序列分析為主體的所有細菌的系統發育樹。
3 16S rRNA基因在疾病的診斷方面的應用:目前，幾乎所有病原菌的16S rRNA基因測序均已完成，因此被選為細菌病原體PCR擴增部分或全部序列的目標。16S rRNA序列分析為基礎的細菌檢測法在目前識別異常細菌引起的疾病上扮演著重要的角色。Relman等利用16S rRNA 序列中的保守區段設計了寡核苷酸引物，用來擴增桿菌性血管瘤病人的靶DNA序列。他們還發現現在具有一定病癥的病人的組織污染物中已發現有細菌形成，但并沒有培養出致病菌。近幾年，人歐利希氏病、腸原性脂肪代謝障和少菌性骨髓炎的致病因子也是通過PCR擴增 16S rRNA 進行序列分析發現的；同樣，疏螺旋體的不同區域分離物根據此法也已被鑒定。
由于細菌種間16S rRNA基因序列間隔區在長度、序列上具有相對多變性，所以利用保守區的基因作為引物，對間隔區進行克隆和分析，就能為病原微生物的各菌株、種、屬的鑒定、分型提供依據。該檢測技術目前已被成功的運用到了病原菌的種、屬以及家族種類的鑒定中。
4 16S rRNA基因在環境的保護中的應用:16S rRNA序列分析隨著微生物核糖體數據庫日益完善已應用于海洋、湖泊、土壤、大氣等環境微生物多樣性分析。不少學者利用16S rRNA基因序列分析技術研究了多種環境的微生物多樣性，并得到了一些有意義的結果。如Glovanoni等研究了Sargasso海洋中浮游細菌的遺傳多樣性，因此提高了海洋微生物中致病菌的檢測速度，對于提高海產品質量，維護人類身體健康有重要的實際意義；Tanner等發現不同污染物對細菌群落多樣性有顯著的作用；Oureas等發現農業土壤微生物群落顯著生理活性差異及其多樣性；Nuble等發現氧化光能利用菌群落16S rRNA基因的豐度與其形態型顯著相關。吳春篤教授等對鎮江城市污水中微生物的16S rRNA進行檢測，發現污水中細菌16S rRNA基因主要來自變形細菌(proteobacte-ria)的各亞族，占總檢序列的86.3%，還有脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)等類群，該發現為制定治理城市污水生物性污染的措施提供了科學依據。隨著各種學科的不斷發展和學科間的交叉應用16S rRNA基因將會在環境保護中發揮更大的作用。
參考文獻
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微生物多樣性分析方法范文2
Abstract: At present,with the rapid development of China's economy,the current extensive economic growth mode has the low utilization of water resources,resulting in shortage of water resources. China's economy is not yet developed,due to inadequate sewage treatment facilities and higher operating costs,many cities discharged the majority of untreated urban sewage into water bodies,causing pollution of water environment. Water pollution has become one of the main factors that restrict China's urban construction and economic development. In the author's opinion,sewage treatment technology is desperately needed.
關鍵詞:污水治理;水源保護;生態學分析
Key words: sewage treatment;water conservation;ecological analysis
中圖分類號:TU992文獻標識碼:A文章編號:1006-4311(2010)15-0170-01
0引言
水是人類社會生產和生活必不可少的寶貴自然資源,也是生物賴以生存的環境資源。工業革命以來,隨著科技進步和社會生產力的極大提高,人類創造出前所未有的物質財富,加速推進了文明發展的進程。與此同時,人類的生產生活活動產生的污染也造成了水環境質量不斷惡化和水資源危機的加劇,水環境污染與水資源短缺已演變成備受全世界關注的資源環境問題,嚴重地阻礙著經濟的發展和人民生活質量的提高,繼而威脅著人類的未來生存和發展。
1我國污水治理的技術環境
在污水治理設備方面,總體技術也落后于國際先進水平,僅為國際20世紀70-80年代的水平。這些污水治理設備僅僅可以滿足一般工業廢水和生活污水的處理需求。由于處理設備單機產品多,系列化程度低,成套裝置生產不足,嚴重缺乏生產高新生物技術處理設備的能力。我國生產的用于城市污水治理的動力設備,如鼓風機、水泵等,普遍存在能耗較大的問題,造成我國城市污水治理設施的運營費用居高不下,在一定程度上也制約了我國城市污水治理產業的發展。[1]
2我國的污水治理技術
2.1 厭氧生物處理技術厭氧生物處理技術的能耗較低,可以回收生物能(如:沼氣),污泥產量較低。厭氧微生物可以對好氧微生物所不能降解的有機物進行降解或部分降解;對溫度、pH等環境因素要求較高。但整體來說,經厭氧生物處理的出水,水質較差,需要進一步利用好氧法進行處理,伴隨氣味較大,對氨氮的去除效果不理想。
2.2 好氧生物處理技術常用的好氧生物處理工藝有三大類:活性污泥法、生物膜法、膜生物反應器工藝。
①活性污泥法工藝?；钚晕勰喾ㄖ饕▊鹘y性污泥法污水處理技術、氧化溝技術、間歇式活性污泥處理技術(SBR,Sequencing Batch Reactor)和AB法污水處理技術。SBR法的工藝流程簡單,且造價低,主體設備只有序批式間歇反應器,無需二沉池和污泥回流系統,初沉池也可省略。具有布置緊湊,占地面積小的特點,可根據水質和水量情況靈活運行,具有良好的脫氮除磷效果。[2]②生物膜法工藝。污水的生物膜處理技術既是傳統的,又是發展中的污水生物處理技術。迄今為止,屬于生物膜處理法的工藝有生物濾池(普通生物濾池、高負荷生物濾池、塔式生物濾池)、生物轉盤、生物流化床、曝氣生物濾池(BAF)、生物接觸氧化、純氧生化處理等。生物濾池是早期出現、至今仍在研究、發展中的污水生物處理技術,而后三種則是近幾十年來開發的新工藝。③膜生物反應器工藝。膜生物反應器MBR是二十世紀未發展起來的新技術,它是膜分離技術和活性污泥生物技術的結合。它不同于活性污泥法,不使用沉淀池進行固液分離,而是使用中空纖維膜替代沉淀池,因此具有高效固液分離性能,同時利用膜的特性,使活性污泥不隨出水流失,在生化池中形成超高濃度的活性污泥濃度,使污染物分解徹底,因此出水水質良好、穩定,出水細菌、懸浮物和濁度接近于零。生活污水處理后可直接回用,在污水處理方面具有傳統工藝所不具備的優點。
2.3 污水的自然處理技術污水的自然生物處理方法主要是利用自然的生態系統如土地、濕地等,通過生態系統中的動物、植物與微生物協同作用,去除污水中污染物的一種方法。我國在“七五”期間就已經對廢水土地處理技術進行了廣泛的研究,解決了許多技術上的問題,“八五”期間又列入了國家攻關重點項目,這也為我國推廣應用土地處理系統創造了條件。[3]
3PLFA方法分析曝氣生物濾池微生物的研究
3.1 PLFA方法在水體微生物群落結構和生物多樣性分析中應用在現有的關于水中微生物群落的研究中,PLFA一般只能定性的、粗略的區別革蘭氏陽性、陰性、好氧細菌、厭氧細菌、放線菌、真菌等,很少能用來定性的測量指定種屬的微生物。目前,只有少數幾種PLFA生物標志物可以指示某些種屬的細菌,如硫酸鹽還原細菌等。地下水中原生動物的PLFA標志物的發現有助于了解深層含水層中微生物食物鏈結構和微生物的活性,在地下水的微生物修復方面具有重要意義。[4]
3.2 PLFA方法在沉積物微生物群落結構和生物多樣性分析中應用江、海等沉積物的微生物區是由復雜的微生物群落組成,它能夠完成主要的礦化反應,這對營養元素的循環和大部分深海食物鏈的形成具有重要作用。使用PLFA譜圖分析方法能夠獲得有關沉積物中微生物生物量和群落結構的信息,沉積物樣品可以不進行處理,也可以是冷凍或凍干的。PLFA法在沉積物微生物群落結構和生物多樣性分析中的應用,對污水治理技術的提高有著重要的現實意義。
4結語
水是人類賴以生存的三大生命要素之一。在我國,經過幾十年的改革開放,經濟得到了迅猛發展,同時也帶來了諸多環境問題,尤其是水污染十分突出,嚴重制約著社會經濟和環境的可持續發展。隨著我國工業、農業的迅速發展和人們生活水平的提高,水體污染現象越來越嚴重,直接威脅著人類的生命健康和整個生態系統的穩定性。嚴峻的水形勢迫切要求我們必須大力進行污水處理及其資源化,同時由于我國經濟水平尚不發達,更迫切需要我們研究、推廣和應用處理高效、投資節省、運行低耗的污水處理新技術。
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微生物多樣性分析方法范文3
關鍵詞：基因芯片；土壤微生態；功能基因；微生物群落
中圖分類號：X172文獻標識碼：A文章編號：1672-1683（2013）01-0093-04
在自然微生態系統中，微生物群落在各項物質循環與能量循環中發揮著重要作用。龐大的微生物數量及其錯綜復雜的功能網絡使得微生物資源的研究和有效利用具有很大的挑戰性。在實驗室條件中很難模擬微生物群落的自然生境，無法為微生物群落提供理想的生長環境，傳統培養富集技術只能提供有限的微生物群落信息，而且實驗周期較長。分子生物學技術則直接檢測微生物的遺傳物質基礎――核酸，極大地減輕了對培養方法的依賴，由此顯著促進了自然生境中微生物的監測和定性描述。功能基因芯片是新一代分子生物學檢測技術，通過成千上萬密集排列的核酸探針能夠在短時間內分析大量的核酸分子。大部分以核酸為檢測對象的技術僅提供微生物的系統發育學信息，而功能基因芯片的檢測對象為微生物群落的功能基因。基因芯片技術作為無需培養的高通量檢測技術，解決了傳統分子生物學的低效率問題，以特異性和高度靈敏性來保證檢測結果的準確性，而且可以定量檢測目的基因。近十年來，功能基因芯片的發展很大地促進了有關土壤微生態的活動和多樣性的研究[1]。土壤微生物有類群繁多、數量巨大、分布復雜、功能多樣等特征[2]，而且現今，氣候變化、工業化、城市化以及農業的發展對土壤生態系統產生不同程度的壓力，土壤微生物的分布和功能在不斷地發生變化，然而人們對此的了解還遠遠不足以預測微生物的演替充分利用微生物的功能，因此功能基因芯片在土壤微生態的研究中也得到越來越廣泛的關注。
1功能基因芯片（微陣列）技術簡介
1.1功能基因芯片原理
基因芯片技術作為新一代的核酸雜交技術，具有高密度、平行分析、雙色測定和低背景值等優勢，非常適合于檢測自然環境中的微生物[3]。在此技術中，將大量核酸片段（寡核苷酸、cDNA、基因組DNA）以預先設計的方式固定在載玻片、尼龍膜等載體上組成密集分子排列，再根據核酸互補雜交原理，與標記樣品進行雜交；通過檢測雜交信號的強弱，判斷樣品中靶分子的數量及組成[4]。功能基因芯片是包含有功能基因序列的微陣列，這些功能基因編碼微生物的生物化學功能的相關蛋白質。
功能基因芯片可分為功能分類基因芯片和基因表達芯片，前者的目的主要是研究菌群是否具有一些涉及特定反應過程的基因，可知微生物群落的潛在功能，雜交靶標是菌群DNA的PCR產物；而后者用于研究這些特定功能基因的生理活性及其基因真實表達的情況，需提取環境樣品的mRNA，其雜交靶標是菌群cDNA的PCR產物[5]。
1.2功能基因芯片探針、雜交及數據分析
制作功能基因陣列的基因探針必須根據具體所要研究的問題進行認真選擇。制備功能基因探針的方法有3種：（1）用專一性引物從純培養物的基因組DNA中擴增所需的基因片段或以載體特異性引物從含所需基因的載體質粒上擴增；（2）通過PCR從自然環境中獲取所需基因片段；（3）使用寡核苷酸探針，根據數據庫中的功能序列信息設計并合成較長的（50～70個堿基）寡核苷酸探針，固化在陣列上。
為了與固定的探針雜交，待測基因（DNA或mRNA）要經PCR、逆轉錄、末端標記等操作，成為標記有熒光染料或同位素的核酸分子。雜交后每個斑點信號強度通過計算機進行處理得到大量信息，并進行后續的數據分析工作。數據分析一般遵循的技術路線為生物多樣性分析、群落組成和結構分析、與環境因子的相關性分析，以分子生態網絡的建立。在生物多樣性分析中，要根據檢測到的基因數量計算出各項多樣性指數，如豐度、均勻度，多樣性等等，同時要把不同樣品殊的、唯一的以及共有的基因找出來；在群落組成和結構分析中，可利用的方法有方差分析、聚類分析、除趨勢對應分析（Detrended Correspondence Analysis，DCA）、響應比分析等多種方法；群落及環境之間的關系分析中，可通過典范對應分析、矩陣相關分析、方差分解分析（VPA）等方法進行研究；建立分子生態網絡目的是為了更清楚地揭示微生物功能基因和相關群落之間的關系[6]。
1.3功能基因芯片發展
最初，功能基因芯片由89個PCR擴增探針組成，可以檢測到純培養物的nirS，nirK，amoA和pmoA等四種功能基因。后來出現的多種功能基因芯片則以關乎微生物特定功能過程的基因為目標，如氮循環[7-9]，甲烷氧化菌[10]等等。近幾年功能基因芯片已發展成為有數千個甚至數萬個探針的綜合性芯片，可同時檢測數萬個功能基因，涉及到碳、氮等各個循環、金屬還原和有機物降解等各種微生態功能。其中最具代表性的功能基因芯片是美國俄克拉荷馬大學環境基因組學研究院Zhou等[11-13]開發出的Geochip，這種綜合性高通量功能基因芯片通過數萬個探針提供有關功能基因的超大量信息，目前發展到了Geochip 4.0版本[13]。Geochip系列芯片被用于包括土壤、水生態系統等各種環境的微生態研究中，已充分證明此技術的適用性和發展前景。然而，功能基因芯片也存在有待進一步解決的問題：（1）要發展強有力的軟件工具來設計特異性探針，以應對測序技術得到的大量序列信息；（2）面對環境樣品中復雜多樣的微生物資源，需要新方法、新策略來不斷改善基因芯片的敏感性和定量準確性。
2功能基因芯片在土壤微生態研究中的應用
功能基因芯片從功能基因的視角探索土壤微生物在不同生態類型中和不同環境壓力下的分布及規律，以及土壤微生物在污染物處理、降解和土壤修復等方面的作用和機理，并深入了解碳、氮等營養物質在土壤微生態系統中循環、轉化作用機理。由此可見，功能基因芯片為土壤微生態研究提供了全新的強有力的技術分析工具，有助于更高效地利用土壤微生物對污染環境進行綜合治理，或利用生物技術改選微生物，增強對外源污染物的降解和轉化，同時為開發利用微生物資源維持陸地生態系統的穩定性提供了理念基礎。
2.1利用功能基因芯片探討不同生態系統中土壤的
微生態過程
功能基因芯片在森林生態系統、草地生態系統，農業生態系統等各種不同生態系統的土壤微生態研究中都得到了應用。He等[14]結合功能基因芯片和焦磷酸測序技術檢測二氧化碳增加壓力下的草地土壤微生物群落變化，發現在二氧化碳增加壓力下有關活性碳降解、固碳、固氮以及磷釋放的基因數量都有所增加，而對有關甲烷代謝和難降解性碳降解的基因沒有顯著影響，而且土壤微生物群落結構和代謝潛力與土壤的碳氮含量、植物生產力密切相關。這樣的結果表明二氧化碳的增加改變了微生物群落的結構和組成，微生物群落的結構和功能的改變會進一步對碳的流動產生影響。Zhang等[15]研究了四川亞高山帶森林中土地利用和覆蓋對土壤微生物有機碳降解基因多樣性的影響，其中所用的功能基因陣列包含代表123個功能基因的1 961個探針。研究結果表明，在一些土地利用類型場地中功能基因數量與基因多樣性指數與土壤有機碳的增加呈正相關。Berthrong等[16]用功能基因芯片Geochip2.0（>24 000個探針，可以同時檢測數千個基因，包括炭循環的相關基因）來比較土壤微生物和生物地理化學功能如何響應不同的土地利用類型，結果表明，草地向森林的轉變使土壤的碳氮儲存量發生了變化：桉樹的種植減少了與氨化和固氮作用相關的功能基因、碳聚合物降解相關的基因和幾丁質酶功能基因的豐度。另外，Zhou等[17]同樣利用Geochip 2.0研究了森林土壤的微生物群落空間分布模式，結果證明了物種-區域關系適用于微生物群落的分布。Reeve等[18]收集了不同管理措施下農業生態系統的土壤樣品，利用功能基因芯片探討土壤功能和微生物群落多樣性之間的關系。這些工作都把環境壓力、土壤特性，植被等相關因素與土壤微生物群落的分布和功能緊密地聯系了起來。還有涉及到極端生態系統的研究，Yergeau等[19]首次利用包含24 243個寡核苷酸探針（10 000多個與氮、碳、硫和磷循環和有機污染物降解相關的功能基因）的功能基因芯片研究了不同緯度上的南極土壤微生物群落變化，探討了生態系統中影響碳氮循環的環境因素。
大部分的研究都是檢測從土壤樣品提取的DNA，但還有一些研究把目標轉向了mRNA。Bodrossy等[20]用甲烷氧化菌的功能基因芯片對垃圾堆肥土壤進行了DNA以及mRNA的基因檢測，發現一些從mRNA中檢測到的基因在DNA的檢測中卻未出現，這說明基于mRNA的基因診斷檢測可以為微生物群落結構和功能補充更多信息。McGrath等[21]構建了一個基于mRNA的環境功能基因芯片（Environmental functional gene microarray，E-FGA），用于檢測不同的N2O通量條件下農田土壤中的微生物群落活動狀態。檢測結果顯示，109個基因表達狀況在高產N2O和低產N2O的條件下有明顯的不同，證明功能基因芯片在環境微生物基因表達檢測方面的適用性，其應用有助于利用微生物使N2O釋放最少，以便最大程度地為農作物保留土壤中的氮素。
此外，大多數的微生物多樣性研究集中在種群水平上的豐度和數量，少數學者關注了微生物群落之間的相互關系。對于數量巨大，多樣的微生物群落，定義其復雜的網絡結構是一項非常具有挑戰性的任務，而高通量功能基因芯片的應用可以使這一領域的研究成為可能。Zhou等[22]通過研究提供了一個基于隨機矩陣理論（random matrix theory，RMT）的概念框架，利用功能基因芯片獲取了不同二氧化碳濃度下土壤樣品中的數據，通過RMT方法從數據中自動識別分子網絡，結果表明功能基因的分子生態網絡在不同二氮化碳濃度下有明顯的不同，功能基因網絡的拓撲結構與土壤的地理化學參數有關。
2.2利用功能基因芯片探討污染壓力下的土壤微生態
應用功能基因分類芯片研究污染土壤的生物降解、生物修復等過程，在群落和基因的水平上對微生物進行動態檢測，為提高修復降解效率提供可借鑒的理論基礎。
Liang等[23]利用功能基因芯片對位于中國東北的油田土壤進行原位檢測，考察不同石油污染壓力下的土壤微生物群落多樣性。研究結果反映了不同污染壓力下的功能基因的響應關系，功能基因的豐度和多樣性隨著污染濃度的增加下降，含油量和土壤有效氮對微生物功能基因影響最大。鐘毅等[24]以中國大慶油田典型污染場地土壤為研究對象，利用基因芯片技術分析在石油污染、調節氮磷營養、種植植物（紫花苜蓿、高羊茅和羊草）等不同微生態環境下的土壤微生物群落結構特征。此外，Rhee等[25]為了有效地監測生物降解微生物種群，開發了基于50-mer寡核苷酸探針的功能基因微陣列，應用到多環芳烴和苯-甲苯-乙苯-二甲苯污染土壤和未污染土壤分析，證明此技術具有望成為專一、靈敏和可定量的工具來揭示污染環境樣品中微生物群落和生物降解基因的動態，但其檢測靈敏度仍需進一步改善。Zhang等[26]通過功能基因芯片Geochip進行了多環芳烴污染土壤中微生物功能基因的研究，微生物的多環芳烴相關基因與多環芳烴的濃度之間的關系有助于闡明不同污染濃度下功能基因的動態機理。研究結果表明，雖然污染濃度對整體的微生物群落產生負面壓力，但個別的多環方烴相關降解基因隨著污染濃度的增加活動更加活躍，說明一些特定的微生物群落在相應的環境壓力下存活率更高。
功能基因芯片應用于污染土壤研究的優勢在于：可以提供生物修復降解相關的關鍵基因和其他生理功能基因的動態信息，在找出引起這種動態變化的驅動力的同時，微觀地把微生物在降解修復中所發揮的功能與其他生物化學功能相聯系，從而描繪在污染壓力下的微生物功能網絡。
3前景展望
功能基因芯片是將生物學、物理學、化學及計算機科學匯集于一體的新型高通量微陣列技術，因其對功能基因的針對性而得到越來越多的關注。從功能基因角度探討微生物群落，可以深入了解微生物在各個營養物質循環與能量循環中所發揮的功能，探討在不同宏觀環境和污染壓力下微生物功能的改變，追查致使微生物群落的功能和分布發生變化的關鍵因子，為更有效地利用微生物資源提供支持。未來，在利用功能基因芯片進行土壤微生態的研究中，應在以下兩個方面深入。
（1）給合mRNA的檢測，研究微生物群落的狀態及真實的生理活動。因為檢測DNA得到的信息中包括來自無活性細胞的功能基因，因此要結合對mRNA的檢測，得到功能基因真實得到表達的信息來補充。土壤樣品中的核酸提取及純化本身就需要較高的要求，對樣品前處理的技術也要越加完善。對DNA和mRNA的共同關注有利于得到土壤微生態系統的更加全面真實的信息。
（2）重視微生態細節過程，預測微生態在環境壓力下的響應?，F今的生態模型只是把微生物群落看作是一個黑匣子，假定生物地理化學變化與微生物群落的豐度和功能沒有顯著的相關性，因此一般會忽視微生態的細節過程。通過功能基因芯片獲取的微生物群落結構和功能的信息可以打開這個黑匣子，將信息整合為看得見的微生物群落生態網絡，用于預測各種環境壓力下的微生態響應。
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微生物多樣性分析方法范文4
雙生子研究是一種經典的流行病學研究方法，主要通過對雙生子群體的研究，即比較同卵雙生子和異卵雙生子性狀的相似性來判斷遺傳和環境哪種對于疾病或性狀更為主要的一種方法。同卵雙生子（monozygotic twins）具有基本相同的遺傳物質，表型特征極為相似。同卵雙生子之間的差異可以排除遺傳因素的作用，可用以研究不同環境因素對表型的影響。異卵雙生子（dizygotic twins）具有50%相同的遺傳物質，其在特點上無異于兩次不同妊娠的同胞，但雙生子同胞之間具有相同的年齡，進行比較時可以避免年齡的混雜，同時也可以排除不同子宮環境對胎兒發育及疾病所帶來的影響。通過比較同卵及異卵雙生子性狀的差異，可以分析遺傳和環境兩個方面對個體性狀的影響。本研究擬通過雙生子法，以聚合酶鏈反應-變性梯度[專業提供寫作論文和論文寫作服務，歡迎您的光臨dylw.net]凝膠電泳（polyme-rase chain reaction-denaturing gradient gel electropho-resis，PCR-DGGE）分析雙生子兒童口腔微生物群組結構構成的差異，從而觀察遺傳及環境因素對人口腔微生物群組結構構成的影響。
1 材料和方法
1.1 試驗對象
隨機選取2011年8月—2012年3月于四川大學華西口腔醫院兒童口腔科就診的雙生子兒童20對，年齡3～11歲，根據WHO口腔健康調查基本方法第三版齲病診斷標準，記錄齲失補牙面（dmfs/DMFS）指數。其中有齲者17人，無齲者23人。
所有入選雙生子兒童為共同生活背景，無全身系統性疾病史，3個月內無全身使用抗生素史，未使用激素類藥物及免疫抑制劑，1周內口腔局部未使用抗生素。兒童及其法定監護人知情同意。
根據兒童牙列情況分為乳牙列組以及混合牙列組。乳牙列組雙生子共10對，年齡3～6歲，其中無齲（caries free）兒童13人，有齲（caries）兒童7人，dmfs指數為2.29±1.38?；旌涎懒薪M雙生子共10對，年齡6～11歲，其中無齲兒童10人，有齲兒童10人，dmfs/DMFS指數為7.20±4.42。
1.2 卵形鑒定
用無菌棉簽采集兒童口腔黏膜樣本，鑒定雙生子兒童卵形。采用16個多態標記（D3S1358，vWA，FGA，AMEL，D8S1179，D21S11，D18S51，D5S818，D13S317，D7S820，TH01，PE，D16S539，CSF1P0，PD，TPOX）的基因分型對所有雙生子進行卵形鑒定。20對雙生子中，同卵雙生子10對，異卵雙生子10對；乳牙列組中同卵雙生子3對，異卵雙生子7對；混合牙列組中同卵雙生子7對，異卵雙生子3對。
1.3 唾液樣本采集
進食后2 h取樣，清水漱口后采集非刺激性唾液，直接用加樣槍從受試者口底采集，采集量為5 mL。采集的唾液放入離心管內，冰浴下2 h內放入-80 ℃冰箱凍存。
1.4 DNA提取
將臨床采集的唾液樣本在室溫下解凍，將唾液樣本混合，2 600×g離心10 min，沉淀樣本中的殘渣及真核細胞，取上清，14 000×g離心5 min，棄上清，收集細菌沉淀用于提取DNA和PCR-DGGE分析，以獲得原始唾液細菌譜。利用QIAamp DNA Micro Kit提取全基因組DNA，提取產物使用Pigogreen熒光定量法測定濃度，A260/A280測定DNA純度。
1.5 16s rRNA基因擴增及PCR-DGGE分析
使用通用引物bal 1（5’-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC GAC TAC GTG CCA GCA GCC-3’）、bal 2（5’-GGA CTA CCA GGG TAT CTA ATC C-3’）擴增DNA樣本16s rRNA基因，擴增產物長度約300 bp。PCR反應體系：PCR master mix預混液25 μL，25 mmol·L-1引物各1 μL，100 ng純化基因組DNA，加去離子水補足50 μL。循環條件：起始步驟94 ℃變性3 min；94 ℃變性1 mi[專業提供寫作論文和論文寫作服務，歡迎您的光臨dylw.net]n，56 ℃退火1 min，72 ℃延長2 min，30個循環；72 ℃延長5 min。取PCR擴增產物5 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，0.5 μg·mL-1溴化乙錠染色后置長波紫外光下觀察。
以8%的聚丙烯酰胺凝膠形成40%（含2.8 mol·L-1尿素及24%甲酰胺）至60%（含4.2 mol·L-1尿素及24%甲酰胺）的線性濃度梯度。每個加樣孔中加入約300 ng的PCR產物。將凝膠浸沒于裝有1×TAE緩沖液（40 mmol·L-1 Tris base，40 mmol·L-1冰醋酸，1 mmol·L-1乙二胺四乙酸）的電泳槽中，使用Bio-Rad Dcode系統恒定60 V電壓，58 ℃下電泳17 h。電泳完成后，TAE緩沖液漂洗凝膠，含0.5 μg·mL-1溴化乙錠的1×TAE緩沖液染色15 min后用1×TAE漂洗15 min洗去多余染料。使用Molecular Imager Gel Documentation system獲取并記錄PCR-DGGE凝膠的數碼圖像[3]。
1.6 數據分析
使用Quantity one軟件標記PCR-DGGE圖譜條帶，并使用非加權組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）構建系統發育樹，得到相似性矩陣（similarity matrix）。使用Quantity one軟件導出實驗數據后，計算多樣性指數（Shannon index）及PCR-DGGE條帶數。
采用SPSS 16.0軟件進行統計分析。數據服從正態分布者采用獨立樣本t檢驗，不服從者采用獨立樣本t’檢驗。
2 結果
2.1 PCR-DGGE圖譜分析
乳牙列組PCR-DGGE圖譜見圖1。泳道2～6、8、11為有齲者，7、9、10、12～21為無齲者。
2.2 UPGMA系統發育樹
乳牙列組UPGMA系統發育樹見圖3。2-3、4-5、6-7、10-11、14-15、16-17、18-19為異卵雙生子，8-9、12-13、20-21為同卵雙生子。除6-7這對雙生子外，其余9對雙生子之間均出現明顯聚類（90%），但同卵雙生子和異卵雙生子間無統計學差異（P>0.05）?；旌涎懒薪MUPGMA系統發育樹見圖4。1-2、3-4、7-8、9-10、11-12、13-14、19-20為同卵雙生子，5-6、15-16、17-18為異卵雙生子。6對雙生子之間有明顯聚類（60%），但同卵雙生子和異卵雙生子之間無統計學差異（P>0.05）。
在乳牙列組中，同卵雙生子的相似性 為75.70±1.70，異卵雙生子的相似性為71.83±6.69，兩者間無統計學差異（P=0.21）；混合牙列組中，同卵雙生子的相似性為58.53±10.37，異卵雙生子的相似性為57.87±21.51，兩者間無統計學差異（P=0.86）。這說明在乳牙列及混合牙列同卵及異卵雙生子中，口腔微生物組成的相似性無明顯差異，遺傳因素對口腔菌群微生物構成的作用可能小于環境因素。
2.3 口腔微生物多樣性分析
雙生子兒童口腔微生物PCR-DGGE條帶數及多樣性指數分析見表1。乳牙列組中，有齲兒童的PCR-
DGGE條帶數及多樣性指數低于無齲兒童，且兩者間均具有統計學差異（P<0.05）。混合牙列組中，有齲兒童的PCR-DGGE條帶數及多樣性指數低于無齲兒童，但兩者間均無統計學差異（P>0.05）。
3 討論
PCR-DGGE[專業提供寫作論文和論文寫作服務，歡迎您的光臨dylw.net]是一種非培養指紋圖譜方法，通過PCR-DGGE方法可以在同一塊膠上觀察不同的細菌種類。利用細菌16S rRNA基因進行PCR特異性擴增結合DGGE分析已成為研究微生物群落多樣性的常規方法。本研究發現乳牙列組有齲兒童中，唾液細菌的多樣性較低，而無齲兒童唾液細菌的多樣性較高。在混合牙列雙生子中，雖然無齲與有齲兒童的細菌多樣性無統計學差異，但仍能看出患齲后微生物多樣性減少的趨勢。推測其可能的原因是：有齲兒童口腔內可能有更高比例的產酸菌及耐酸菌[4-5]，且其口腔微環境可能更適合致齲菌的生存，所以致齲菌的比例升高，從而導致細菌整體豐度下降[6-7]。
在本研究中，通過PCR-DGGE聚類分析可以發現，大多數雙生子出現明顯聚類，其中，乳牙列雙生子中有9對出現明顯聚類（90%），混合牙列雙生子中有6對出現明顯聚類（60%），這證明在大部分雙生子之間，口腔菌群微生物構成的相似性非常高。但同時可以看到，無論是乳牙列還是混合牙列，同卵雙生子和異卵雙生子之間的口腔菌群相似性均沒有明顯差異，說明在口腔微生物菌群構成中，環境因素（共同生活等）的影響可能更大于遺傳因素。同時，乳牙列兒童雙生子的口腔菌群構成相似程度（90%）與混合牙列雙生子的菌群構成相似程度（60%）不同，這與其他學者[8]的研究結果相吻合。
Corby等[9]的研究顯示，遺傳因素對唾液中的細菌定植有顯著影響。其他學者[10]的研究也證實遺傳因素對人及動物模型中唾液變異鏈球菌的定植及齲易感性均有明顯影響。本研究結果也顯示，有齲兒童及無齲兒童唾液微生物的種類有所不同，有齲兒童的唾液微生物種類減少。在同卵及異卵雙生子中，均發現有較高的口腔微生物菌群相似性，而這種相似性在同卵雙生子及異卵雙生子之間沒有發現差異?；旌涎懒须p生子中口腔微生物的相似性低于乳牙列雙生子，可以由此推測，在口腔微生物菌群構成中，環境的作用可能大于遺傳的作用。
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微生物多樣性分析方法范文5
關鍵詞：小白菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis Makino var. communis Tsen et Lee）；輪作；連作；有機肥；土壤微生物特性
中圖分類號：S634.3/.1+5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）24-6498-06
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.24.044
連作障礙是指在同一土壤中連續種植同一種或科的植物時，即便給予正常的栽培管理也會出現植物生長勢變弱、產量和品質下降的現象[1]；一般作物在連作5 a以后連作障礙會比較嚴重。連作障礙主要表現為幼苗死亡率高、植株生長不良、發病率增加、產量下降等[2]。研究表明，輪作是有效修復連作土壤、緩解連作障礙的措施之一[3]，但是輪作有效緩解連作障礙需要3～5 a的時間[4]。在種植業已經日益產業化、規模化的今天，長時間的輪作并不能完全實現，尤其是在設施蔬菜種植區，由于經濟利益的驅動和種植習慣的原因，有效輪作受到限制，因此必須尋找一種在短時間內可以調控連作障礙的措施來替代輪作。研究表明，連作會引起土壤微生物多樣性降低、細菌數量減少、真菌數量增加，土壤線蟲的結構也會趨向于不利于土壤質量的方向發展；而長期輪作有助于提高土壤微生物多樣性、增加細菌數量、減少真菌數量，使土壤線蟲結構得到改善[5]，土壤生物學特性的改善將改進連作土壤物理特性和化學性狀。分析輪作改善連作土壤性狀的機理可以看出，輪作與連作的區別是輪作對土壤輸入了輪作作物的根系分泌物和殘茬，而連作輸入的連作作物根系分泌物和殘茬；輪作提供了多樣性植物、有機物質，對微生物群落及其功能產生了良性影響，提高了微生物群體多樣性和功能多樣性[6]，更多能源物質的投入也增加了微生物數量[7]，進而增加了土壤酶活性，催化了土壤中生化反應。嫁接、間作、套作等栽培方式也是通過改變土壤中有機物的組成來提高土壤微生物群體活性和酶活性[8，9]。對連作土壤投入有機物料也可以改變土壤有機物組成、微生物活性、土壤酶活性[10]；然而怎樣投入有機物料才能達到輪作的效果，其對土壤的改變關鍵是什么鮮有研究。試驗以蔬菜連作土壤為對照，比較輪作模式、不同有機物投入方式對連作土壤及其作物的影響，試圖揭示有效的有機物投入模式及其對連作土壤微生物的影響機理，從而為蔬菜生產提供更加有效的連作障礙緩解措施。
1 材料與方法
1.1 試驗設計
試驗于2011～2015年在武漢市農業科學技術研究院北部園區蔬菜科學研究所基地進行。供試土壤為砂壤土，小白菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis Makino var. communis Tsen et Lee）在其中連作6 a，試驗地pH為5.8，有機質含量15.64 g/kg、堿解氮含量122.79 mg/kg、速效磷含量62.53 mg/kg、速效鉀含量87.92 mg/kg。
試驗設6個處理，處理A，小白菜連作6 a土壤，在6 a里全年種植小白菜；處理B，玉米輪作1 a，小白菜連作5 a后玉米輪作1 a；處理C，玉米、黃瓜、生菜、辣椒輪作3 a，小白菜連作3 a后種植其他作物（玉米-黃瓜-生菜-辣椒-玉米）；處理D，小白菜連作土壤施商品有機肥100 kg/667 m2；處理E，秸稈還田，小白菜連作土壤加入玉米秸稈4 500 kg/667 m2；處理F，施發酵生物有機肥，小白菜連作土壤施用自制生物發酵有機肥，其制作方法為用新鮮的牛糞，玉米秸稈和微生物制成[11]，用量為4 500 kg/667 m2。
采取露地試驗，每個處理3次重復，小區面積1.2 m×10.0 m，條播種植；于種植年的10月28日播種。小白菜播種前，D、E、F處理分別施相應的商品有機肥、秸稈和發酵生物有機肥；田間除草和防治病蟲害等栽培管理措施同正常大田生產。
1.2 樣品采集與處理
試驗于2015年11月2日采集土壤和植株樣品，土壤樣品按5點取樣法，每小區隨機采取0～20 cm層土樣，剔出大的植株殘體和石粒等雜物，混合均勻后帶回武漢市蔬菜科學研究所實驗室，風干，研磨，過100目篩后直接裝入密封袋，放入4 ℃冰箱備用；植株從子葉節處剪斷，并取作物根系，將其沖洗干凈后，置于低溫取樣盒內帶回實驗室。
1.3 測定方法
土壤微生物生物量碳含量（MBC）采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法測定，參考熏蒸提取-容量分析法[12]；土壤有機質含量采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法[13]測定；小白菜干物質重測定于105 ℃下烘干后稱重；小白菜根系活力用氯化三苯基四氮唑（TTC）法[13]測定，根系質膜P-H+-ATPase水解活性采用文獻[14]的方法測定；根系MDA含量用文獻[15]的方法測定，土壤脲酶活性測定用比色法，以1 g土中NH3-N的含量表示；土壤轉化酶活性測定用3，5-二硝基水楊酸比色法，以1 g土樣（24 h）所產生葡萄糖的質量來表示；土壤磷酸酶活性測定用磷酸苯二鈉比色法，以1 g風干土壤中的酚含量來表示[16，17]；光合速率（Net photosynthetic rate，Pn）測定采用Li-6400便攜式全自動光合測定系統（美國LI-COR公司），于晴天無風上午9：00～11：00進行測定；土壤碳源利用AWCD值采用Biolog Eco微平板對土壤微生物功能進行測定[18]，首先稱取10 g新鮮土壤，加入90 mL的去離子水，180次/min振蕩10 min，然后在4 ℃條件下靜置30 min；再吸取1 mL土壤懸浮液到999 mL去離子水中，搖勻，配成濃度10-3的稀釋液體；將稀釋液倒入滅菌的培養皿中，接種于Biolog Eco微平板，每孔125 μL樣品；每24 h利用讀板儀在590 nm下讀數1次，連續讀數7 d。
1.4 數據分析
試驗數據采用Microsoft Office Excel 2003程序處理并繪圖，應用SAS 8.1系統軟件進行差異顯著性比較；對連作小白菜的根系活力與小白菜種植地的土壤酶活性、土壤微生物生物量碳含量（MBC）、土壤碳源利用AWCD值進行相關分析。
2 結果與分析
2.1 不同處理對小白菜干物質重與光合速率的影響
6個處理對小白菜干物質重的影響情況見圖1，對小白菜光合速率的影響情況見圖2。從圖1、圖2可以看出，各處理不同程度地提高了小白菜的干物質重和光合速率。與處理A小白菜連作6 a相比，其他處理的干物質重分別比處理A增加了32.0%、83.5%、4.1%、55.7%、92.8%，光合速率分別增加了28.9%、76.3%、6.3%、52.7%、88.6%；其中添加發酵生物肥處理和玉米-黃瓜-生菜-辣椒-玉米輪作3 a處理對小白菜干物質的積累及光合作用的影響最大。這表明長期連作抑制了小白菜干物質的累積以及光合作用；而采用輪作或施發酵生物肥能有效提高其干物質重和光合速率。
2.2 不同處理對小白菜根系活力、根系質膜P-H+-ATPase活性、MDA含量的影響
6個處理對小白菜根系活力的影響情況見圖3，對小白菜根系質膜P-H+-ATPase活性。的影響情況見圖4。從圖3、圖4可以看出，各處理不同程度地提高了小白菜的根系活力及根系質膜P-H+-ATPase活性，與處理A相比，根系活力分別增加了23.0%、66.1%、6.2%、50.6%、75.9%；根系質膜P-H+-ATPase活性分別增加了29.1%、84.0%、3.4%、53.8%、78.2%；這表明長期連作顯著降低了作物自身的根系活力和根系質膜P-H+-ATPase活性。根系MDA含量可反映細胞膜的傷害程度，6個處理對小白菜根系MDA含量的影響情況見圖5。從圖5可以看出，各處理不同程度地降低了根系的MDA含量，與處理A相比，根系的MDA含量分別降低了21.8%、46.2%、10.2%、36.7%、48.4%。這表明長期連作后導致土壤環境惡化，作物積累了大量自由基，造成一定的氧脅迫，加重了根系質膜的傷害，使根系MDA含量增加；而添加發酵生物肥處理和玉米-黃瓜-生菜-辣椒-玉米輪作3 a處理對小白菜根系活力、根系質膜P-H+-ATPase活性、根系MDA含量產生了積極的影響。
2.3 不同處理對小白菜種植地土壤酶活性的影響
6個處理對小白菜種植地土壤酶活性的影響情況分別見圖6、圖7、圖8。從圖6、圖7、圖8可以看出，多數處理增加了土壤酶活性，其中玉米-黃瓜-生菜-辣椒-玉米輪作3 a處理的土壤脲酶活性較小白菜連作6 a處理增加了1.05倍；土壤酸性磷酸酶活性各處理較小白菜連作6 a處理分別增加了33.8%、30.8%、2.3%、60.9%、48.9%；添加發酵生物肥處理和玉米-黃瓜-生菜-辣椒-玉米輪作3 a處理的轉化酶活性較小白菜連作6 a處理分別增加了107%、111%。這表明長期連作使土壤微生物生態惡化，理化性質變劣，土壤營養水平下降；而采用輪作或施發酵生物肥能有效改善土壤理化性質，促進土壤微生物生長，產生更多土壤酶，使營養元素有效性提高。
2.4 不同處理對小白菜種植地土壤有機質、MBC含量和碳源利用AWCD值的影
6個處理對小白菜種植地土壤有機質含量的影響情況見圖9。從圖9可以看出，各處理的有機質含量具有一定的差異，與小白菜連作6 a處理相比，其他處理的土壤有機質含量分別增加了10.7%、32.1%、0.9%、21.4%、33.0%，其中玉米-黃瓜-生菜-辣椒-玉米輪作3 a處理與添加發酵生物肥處理的效果顯著。
6個處理對小白菜種植地土壤MBC含量的影響情況見圖10。從圖10可以看出，各處理的MBC含量變化差異較大，與小白菜連作6 a處理相比，其他處理的土壤MBC含量分別增加了1.80倍、5.39倍、0.049倍、4.18倍、5.66倍，差異懸殊。這說明栽培方式的改變以及生物有機肥的施用為土壤微生物提供了有機營養保障，促進了微生物的活動與繁殖。
6個處理對小白菜種植地土壤碳源利用AWCD值的影響情況見圖11。從圖11可以看出，各處理的AWCD值在剛開始的24 h內增長很小，在24～132 h時段中增長明顯，這個時間段微生物活性最高，132～168 h趨于穩定狀態。對比不同處理的土壤碳源利用AWCD值可以看出，在132 h前，玉米-黃瓜-生菜-辣椒-玉米輪作3 a處理與添加發酵生物肥處理的AWCD值一直處于相對較高水平，說明這2個處理的微生物代謝旺盛；施商品有機肥處理和小白菜連作6 a處理的變化幾乎一致，處于相對較低水平，說明長期連作明顯影響土壤微生物活動，而商品有機肥的使用對微生物的代謝影響不明顯。
2.5 連作小白菜根系活力與土壤微生物特性的相關分析
對連作小白菜的根系活力與小白菜種植地的土壤酶活性、土壤微生物生物量碳含量（MBC）、土壤碳源利用AWCD值進行相關分析，結果見表1。從表1分析可見，連作小白菜根系活力與土壤脲酶、酸性磷酸酶、轉化酶活性之間存在極顯著的相關關系，與MBC及AWCD之間也存在極顯著的相關關系。而土壤酶活性與土壤MBC之間，MBC與AWCD之間均存在極顯著的相關關系。
3 討論
3.1 輪作及有機肥對小白菜生長及生理的影響
設施小白菜連作障礙在形態上表現為死株、植株整體生長不良、早衰，在生理上表現為根系活力下降、地上部光合速率下降；生產上調控連作障礙的措施有輪作和施用有機肥[19，20]。盡管輪作對連作障礙的緩解效果影響很大，但由于生產需求和設施不可移動的限制，通常輪作時間未能達到3～5 a的需求，甚至只有1 a的輪作時間。試驗結果表明，相對于長期連作，輪作1 a處理的干物質累積及光合速率顯著提高，但是顯著低于輪作3年的處理，說明輪作1 a處理未能完全消除連作障礙；有機肥也是緩解連作障礙的有效措施，但是不同有機肥的施用效果并不一致?，F在生產上施用的有機肥主要有商品有機肥、利用秸稈還田、發酵生物有機肥等。本試驗結果表明，不同有機肥對于連作的緩解效果不一。商品有機肥處理下小白菜干物質重和光合速率與連作處理的差異不大，這個結果與萬菲菲等[21]的研究結果不一致，可能原因是試驗連作施肥水平不一致造成的。而秸稈還田和發酵生物有機肥的施用均顯著提高了連作小白菜干物質重及光合速率，這與徐萌等[22]、鄧接樓等[23]的研究結果一致。不過秸稈還田處理的效果低于相同使用量的發酵生物有機肥處理，說明不同有機肥處理方式及其水平對作物生長的影響較大。根系是植株攝取養分和水分的主要器官，其生長狀況和活力水平直接影響著植株地上部分的營養狀況及產量水平；根系的生理活性可以影響植株吸收水分和養分的能力，尤其是在逆境脅迫下，強壯和龐大的根系是保證植株正常生長的基礎[24]。輪作和有機肥處理對連作障礙的緩解可能與其對連作植株根系活力的提高有一定的關系[25，26]，本試驗輪作和有機肥處理對根系活力的提高及緩解連作對根系的傷害與干物質累積、光合速率的提高有相同的影響趨勢就旁證了這一觀點。
3.2 輪作及有機肥對連作土壤酶活性的影響
土壤酶來源于土壤微生物代謝、植物根系分泌物以及動植物殘體的腐解過程[27]，在土壤有機物轉化及養分循環中發揮著重要作用[28]。脲酶是土壤中最活躍的水解酶類之一，可以水解施入土壤中的尿素，釋放供作物利用的銨離子[29]；磷酸酶是一種催化土壤中有機磷化合物的酶，活性的高低直接影響土壤中有機磷的分解轉化和其生物有效性[30]；轉化酶可以提高土壤生物學活性，參與碳水化合物轉化為植物、微生物可以利用的營養物質過程[31]。試驗中，輪作、秸稈還田、生物發酵有機肥處理均顯著提高了土壤酶活性，這與杜社妮等[32]、Bastida等[33]的研究結果一致?？赡苁禽喿骱桶l酵有機肥處理向土壤輸入了大量有機質后改善了土壤理化性質、促進了土壤微生物生長、產生出更多土壤酶的緣故。
3.3 作及有機肥對連作土壤微生物生物量及碳源利用的影響
土壤微生物活性是土壤質量的重要指標[34]。相比連作作物長期對土壤輸入相對單一碳源，輪作和有機肥處理補充了大量有機碳源，更加有利于維持土壤微生物活性及多樣性。試驗結果表明，輪作顯著提高了有機質含量及土壤微生物生物量碳含量（MBC），同時土壤碳源利用AWCD值顯著提高，AWCD值反映了微生物對不同碳源代謝的總體利用能力及微生物活性強弱[35]。其中3年輪作處理土壤微生物數量及活性顯著高于1年輪作處理，表明多樣性增加及大量碳源的施入提高了土壤微生物活性。商品有機肥雖然含有大量活性生物菌，但是由于對土壤碳源施入得很少，其微生物活性相比連作處理提高不顯著，這導致商品有機肥緩解連作障礙的效果有限。秸稈還田和發酵生物有機肥顯著提高了土壤微生物數量及活性，這與它們對土壤酶活性及連作作物根系活力、光合速率的影響相一致，土壤微生物活性、酶活性、根系活力可能存在一定的聯系。
3.4 土壤酶活性、根系活力、微生物活性的相關關系
試驗結果表明，土壤酶活性、小白菜根系活力、土壤微生物生物量碳含量（MBC）之間存在顯著正相關關系，這與李明靜等[10]的研究結果一致。這是土壤肥力、土壤微生物與土壤酶協同發展的結果。土壤酶的高活性來源于土壤微生物大量繁殖[36]，土壤養分的循環依托土壤酶對底物的轉化。
總的來看，采用合理輪作及適宜的有機肥施入方式，可以顯著改善連作土壤酶活性及微生物活性，促進連作小白菜提高根系活力、加快生長，要是較長時間輪作和大量施入發酵有機肥，則緩解連作障礙的效果更好。
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微生物多樣性分析方法范文6
關鍵詞沉積物；放線菌；分離；抗菌活性；西島內港
中圖分類號 Q939.132 文獻標識碼A文章編號 1007-5739（2011）11-0017-02
StudyonSelectiveIsolationandAnti-FOC 4ActivityofActinobacteriafromSedimentofXidaoWharf
XU Xiao-xiong 1，2FENG Hui-min 1CHEN Yong-gan 1MA Hong-mei 1
（1 Qiongzhou University，Sanya Hainan 572022； 2 Hainan Key Laboratory for Herpetological Research（preparation））
AbstractAfter pretreatments of steam heat（60 ℃，10 min），the sediment suspensions collected from the wharf of Xidao island were transferred and spread onto the GA media. 44 actinobacteria including 18 Streptomyces and 26 non-Streptomyces-like were isolated according to their morphology on agar plates and under microscope. Strain 090413 revealed antagonistic effect of against Fusarium oxysporum f.sp.cubense（race 4，FOC 4）.
Key wordssediment；actinobacteria；Isolation；anti-FOC 4 activity；Xidao wharf
放線菌廣泛分布于人體、土壤、污水、海洋及礦井等環境中，是一類重要的藥用微生物資源[1]。海洋生物的多樣性、復雜性和特殊性使源于其中的海洋天然產物也具有多樣性、復雜性和特殊性，為尋找海洋生物活性物質提供了豐富的物質來源[2]。20世紀90年代末，海洋放線菌由于自身特殊的生存環境，具有復雜獨特的代謝途徑，產生了諸多結構新穎、生物活性顯著的次級代謝產物，這些活性代謝產物為新抗生素的發現提供了豐富的先導化合物，有些已經進入臨床前研究。2005―2006年，Fenical科研小組從海洋放線菌Salinispora屬[3]和Marinispora屬[4]的菌株中發現了一系列結構新穎的化合物，一些表現出更強的抗癌作用，一些具有新的抑菌作用靶點，它們具先導化合物或候選藥物的潛力，這一切對尋找新型高效抗生素具有積極作用，同時也為抗生素的發展提供了新的方向。
1材料與方法
1.1試驗材料
1.1.1土壤樣品采集。土壤樣品采集于西島內港采集沉積物（地理坐標為北緯18°14.371′，東經109°22.433′）。
1.1.2供試培養基。葡萄糖天門冬素培養基（GA）：葡萄糖2 g；天門冬素1 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4?7H2O 0.5 g、瓊脂20 g、陳海水500 mL、蒸餾水500 mL，pH值7.2～7.4。均添加了終濃度為50 mg/L的放線菌酮、制霉菌素及重鉻酸鉀；復合維生素（每1 L培養基添加V 0.5 mg、V0.5 mg、V 0.5 mg、煙酸0.5 mg、肌醇0.5 mg、泛酸0.5 mg、生物素0.25 mg，對-氨基苯甲酸0.5 mg）。ISP 2培養基：酵母粉4 g、葡萄糖4 g、麥芽浸提粉10 g、瓊脂15 g、陳海水500 mL、蒸餾水500 mL，pH值7.2～7.4。
1.2試驗方法
1.2.1預處理。土壤樣品采集后置于陰涼處7 d，自然風干，濕熱60 ℃，10 min；1 g土壤置于9 mL的1/4格林溶液10-1的稀釋液中超聲波處理10 min；然后用1/4格林溶液稀釋得到10-2、10-3的溶液。
1.2.2菌株分離純化與保藏。采用稀釋平板分離法分離菌株，取10-1、10-2、10-3稀釋液各100 μL涂布到GA培養基，3次重復。涂布平板置于28 ℃恒溫培養28 d，根據平板上菌落的形態特征，選取平板上所有的代表性菌落，挑取到ISP 2 瓊脂培養基上，采用三步劃線法純化獲得單菌落[5]。純化好的菌株保藏于20%甘油管中，置-20 ℃保藏。
1.2.3分離菌株相態分類。根據菌株在ISP 2培養基上的菌落形態及制片顯微觀察，通過氣生菌絲、基內菌絲和孢子的生長及著生方式，初步判斷其歸屬。
1.2.4拮抗對持試驗。將ISP 2培養基平均分成2個區域，將1株分離菌株接種到其中1個區域中間，置28 ℃下培養2 d以后，將香蕉枯萎病4號生理小種（FOC 4）接種到同一培養基的另一區域中間，繼續置28 ℃下培養2～4 d。以香蕉枯萎病1號種直接接種ISP 2培養基作為對照。通過肉眼觀察香蕉枯萎病1號種的生長情況，初步判斷分離菌株是否具有抗香蕉枯萎病活性。
2結果與分析
2.1放線菌的選擇性分離效果
從分離平板上觀察，基本上都是放線菌，只有少數平板上長了細菌。從GA選擇培養基上一共分離得到44株放線菌。通過在ISP 2純化培養基上的菌落觀察及在顯微觀察孢子絲的形態，初步判斷其中有18株是鏈霉菌，其他26株為非鏈霉菌。而非鏈霉菌中，以小單孢菌居多。結果說明該分離方案能選擇性分離得到較多的放線菌。預處理中的濕熱60 ℃、10 min是選擇性分離小單孢菌的預處理方法，說明該法同樣適用于海洋來源的小單孢菌。
2.2鏈霉菌抗菌活性情況
抑菌試驗結果顯示，大多數鏈霉菌中未能抑制香蕉枯萎病病原菌生長，僅有菌株090314表現出一定的抗香蕉枯萎病4號生理小種FOC 4活性（圖1）。
3結論與討論
三亞西瑁州島地處國家級珊瑚礁自然保護區，是典型熱帶海洋岸礁生態系統，蘊含著豐富的海洋生物物種。區內生產力很高，微生物資源豐富，生態保護較好，是保護海洋生物多樣性的重要海區。通過對其沉積物中的可培養放線菌進行選擇性分離、純化、保藏，收集該區域的微生物資源，為進一步開發利用提供基礎和依據。目前18株鏈霉菌僅有1株顯示出一定的抗菌活性，其他鏈霉菌將進行其他抗性模型的篩選，進一步挖掘其潛力。
香蕉枯萎病是香蕉種植產業上的毀滅性病害，該病嚴重危害產蕉區的安全生產，因香蕉枯萎病病原菌復雜的遺傳背景，化學防治和選育抗病品種防治表現出很多困難，目前生物防治控制香蕉枯萎病是很多研究者努力探索的一條途徑。吳慶菊等[6]從五指山土壤分到的45 株放線菌的發酵液對香蕉枯萎病菌具有不同程度的抑菌作用；夏啟玉等[7]發現了香蕉的內生細菌可以抑制香蕉枯萎病病原菌生長；黃 瑤等[8]發現海洋源芽孢桿菌對香蕉枯萎病也有較好的作用。Getha 等[9]從海洋分離的海洋鏈霉菌對香蕉枯萎病有較好的防治效果。本研究通過收集西島海域的放線菌資源，并探索其中可能成為香蕉枯萎病生防菌的菌株。目前發現菌株090314表現出一定的抗菌活性。因此，有必要深入研究其抗性的穩定性及在土壤中的定殖情況，為開發海洋放線菌、防治香蕉枯萎病奠定基礎。
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