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對指導意見的意見和建議范文1
關鍵詞：王粲;劉禎;逸氣;普世性
建安文學在中國文學史上有著舉足輕重的地位，是中國燦爛輝煌的詩歌文化的濫觴。建安風骨對后來中國文學思想史上一大批文人的崛起都起到積極的作用：為文學理論提供大量的論證研究，如曹丕的《典論q論文》;對詩體的發展也起到不可忽視的貢獻，曹氏三父子對五言詩的發展;建安風骨對后世尤其是唐詩的影響是巨大的，李白詩歌“繡口一吐，便是半個盛唐”的氣度也自然少不了“建安風骨”的影響。在建安文學中，王粲和劉禎作為七子中的佼佼者，在歷史上一直被奉為很高的評價。鐘嶸在《詩品》中，“自陳思以下，禎稱獨步?！币詣⒌潪閮?《文心雕龍》中又贊“仲宣為七子之冠冕乎！”顯然又是以王粲為優。但兩人的藝術價值及在文學史上誰更勝一籌，在當今“國學熱”的大背景下，青少年如何才能更好地學習傳統文化，弘揚傳統文化都有著重要的指導意義，這都是是本文要研究和探索的。
一、劉禎的“逸氣”
（一）文采情高
劉禎以其五言詩聞名。曹丕評之，“其五言之善者，絕妙時人。”劉禎的詩文被認為是“情高以會才”，而在《文心雕龍?風骨》中可見“情高”、“會采”便是“逸氣”的兩個特征。劉禎的詩文大多亡佚，現僅存的19篇就多是反映對人生中困窘的感慨以及對生命流逝，命途多舛的家國之恨。然而其筆下的詩文卻具有超越的意識，這顯然是文章極具張力并且蘊含“逸氣”的主要原因。往往是在跌入痛苦的淵藪后又能重振信心，奮發反抗。這是劉禎詩文保留的雖不多，卻影響甚大的一個重要原因。
“悲劇精神”是建安文學的一個共同特征，在劉禎的詩文中隨處可見，但他絕地后的超越卻讓文章有了獨特的張力和思想力度。《雜詩》前半節：“沉迷薄領間，回回自昏亂”，結尾卻是：“安得肅肅羽，從爾浮波瀾。”表現出試圖掙脫痛苦的決心和勇氣，前后對比，一股豪放灑脫的“逸氣”縈繞其間。
劉禎詩文的“情高”除了在其陷入困境后的吶喊上，還體現在安逸生活中仍不忘大志的憂傷氣質。《公宴》中，同為鄴下文人的其他人大多作文表達感恩，祝賀等。如王粲作文“愿我賢主人，與天享巍巍?！倍鴦⒌潊s在“永日行游戲，歡樂猶未央?！钡臍g悅欣喜后仍不忘“投翰長嘆息，綺麗不可忘?！毖鐦分腥匀徊煌刂写笾?。難怪王夫之也評價，“《公宴》諸詩，如無公干，則當日群飲，酒肉氣深，文章韻短矣?！?/p>
（二）意象高潔
鐘嶸在《詩品》中將劉禎列為上品詩人，認為他是“仗氣愛奇，動多振絕，貞骨凌霜，高風跨俗” 而筆者認為正是在意象取材上的“高風”才成就了其詩文的“跨俗”。劉禎善于在詩文中用意象來自況，常見的有：勁松，頻藻，鳳凰等。《贈從弟三首》中，“豈不常勤勞，羞與黃雀群。”將頻藻自況，表現了對世俗的鄙視厭棄，卻不甘沉淪，奮發進取的決心。再如失題詩“青青女蘿草，上依高松枝。幸蒙庇養恩，分惠不可D?！迸}依附高松象征自己對曹氏父子既感激又不失自尊。
同樣寫鳥，建安時期大多數人筆下的是凡鳥。王粲在《雜詩》“百鳥繽翩，振翼群相追?！比欢鴦⒌潊s更善于將“靈鳥”寫入詩中。如《公宴詩》中“靈鳥宿水裔，仁獸游水梁”，再如《贈從弟》中的鳳凰。長于比興這是建安文學的共同特征，但劉禎詩文中意象取材高潔，這卻是其中較為突出的。
二、王粲的“冠冕”
（一）文采細膩
王粲文筆細膩華美，顏延之評之“四言側密”。而鐘嶸對劉禎評價是“氣過其文，雕潤恨少”。相較劉禎詩文的直抒胸臆，王粲更側重于辭藻的描寫。王粲更加擅長對場面的描寫。例如《七哀詩》中對社會現實的描繪“出門無所見，白骨蔽于野”這句與曹操《蒿里行》中“白骨露于野，千里無雞鳴”相比，更具有畫面感，沖擊力，哀鴻遍野的殘酷和悲痛失望
更甚。
（二）思想普遍性
建安時期是社會動蕩，思想高度碰撞的時期。王粲更像是一個矛盾的統一體。建安七子中的孔融視儒家傳統為審美標準，劉禎是主情文學的開拓者，而王粲詩文中的悲情卻處處蘊含普適性，因而更易引起人們的共鳴和感動?！稄能娦小贰ⅰ兜歉哔x》等都是從社會角度抒發文人群體，士兵群體，勞苦大眾的厚重的情感，正是因為他詩文中蘊含的悲劇精神的普遍性使得他作品的思想更加豐滿而有深度。
袁濟喜認為，王粲相較劉禎更具家學背景的優勢。由于王粲有著山陽王氏家族學統的先天優勢，又經歷了荊州學術解放思想的洗禮及蔡邕對他文學價值觀的多元化影響，故逐漸形成一種全面而開放的文學思想理念和思想深度?？梢?，劉勰贊其是“七子冠冕”不只是從文學審美層面對其才華進行了肯定，更是從社會全面展示的普遍性進行贊同。
三、總結
關于王粲和劉禎誰應該得“七子之冠冕”，我們很難有一個可以被說服的統一的審美標準來評定。但二人所代表的建安風骨卻是對后世的文學和思想發展都有著不可忽視的作用。尤其是當代國學熱的興起，讓越來越多的人關注到文學自覺的時代，而王粲和劉禎作為建安七子的代表人物，他們作品所體現的文學價值和思想內涵更是值得一代人思考和敬仰，這對于如何正確引導國學熱現象有重要的思考意義。
參考文獻：
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對指導意見的意見和建議范文2
[關鍵詞]口腔頜面部；多間隙感染；糖尿??；胰島素
[中圖分類號]R782 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2014）21-1790-03
Abstract： Objective To explore the optimal treatment plan of insulin on infection of oral and maxillofacial region in patients with diabetes mellitus. Methods From January 2006 to December 2012，57 cases of oral and maxillofacial multiple space infection with diabetes mellitus were randomly divided into three groups， which included Group A of three short and one long， group B of premixed insulin group， group C of neutral insulin group， meanwhiel they were given the incision drainage， anti-infection and nutrition support treatment to compare the time of blood sugar decreasing to normal range， average healing time of wound and the frequency of hypoglycaemia. Results The time of blood sugar decreasing to normal range and average healing time of wound in A group were significantly less than the other two groups （P0.05）. Conclusion Application of three short and one long strengthening method to control blood sugar can obviously shorten the treatment course and the length of hospital stay，reduce mortality and improve therapeutic effect， when patient with diabetes mellitus complicates oral and axillofacial multiple space infection.
key words：oral and maxillofacial region； multiple space infection；diabetes mellitus；insulin
糖尿病發病率呈逐年上升趨勢[1-2]，而頜面部重癥多間隙感染合并糖尿病患者往往因為病情發展快、感染控制不理想、傷口愈合不良等局部并發癥，甚者可引起失水、電解質紊亂和酸堿平衡失調等急性并發酮癥酸中毒和高滲昏迷等全身并發癥的原因，導致口腔頜面外科醫生在治療和選擇各種胰島素的應用時不免經驗不足。為此，筆者對2006年1月～2012年12月在我科治療的口腔頜面部多間隙感染合并糖尿病患者的胰島素治療做了相關對比治療，取得了較好療效，現報道如下。
1 資料和方法
1.1臨床資料：選取2006年1月～2012年12月我科收治的口腔頜面部多間隙感染合并糖尿病患者57例（男30例，女27例）。所有患者均存在累及3個或3個以上的頜面部多間隙感染，均確診為Ⅱ型糖尿?。环?999年WHO糖尿病診斷標準。其中累及頰、咬肌、顳下頜間隙感染患者12例，累及顳、顳深、顳下、咬肌間隙患者10例，累及顳下、翼下頜、咽旁間隙患者10例，累及雙側舌下、下頜下、刻下間隙19例、以及口底多間隙感染6例。將以上病例平均分為三組，各組均嚴格按糖尿病飲食。A組：“三短一長”強化注射組，白天三餐前注射3次短效胰島素（諾和銳）、睡前1次長效胰島素（甘精胰島素），共19例。B組：預混胰島素組，三餐前給予注射中效胰島素（諾和銳30）或早晚餐前注射中效胰島素、午餐時給予阿卡波糖50～100mg口服，共19例。C組：中性胰島素組，三餐前根據血糖量皮下注射，共19例。
1.2 血糖的檢測方法：每天使用微量血糖儀，測三餐前幾三餐后2h及睡前手指末梢血糖。必要時測24～72h動態血糖。
1.3 局部處理及全身治療：頜面部多間隙感染應早期切開引流，可先行局部穿刺了解膿腫形成部位及量多少，如穿刺見膿性液體即為切開標準，必要時行CT檢查。切口位置可選在引流最低位、多間隙均可顧及的位置；一個切口而貫穿多個間隙為宜，利于傷口愈合；必要時選擇多個切口、必須達到引流的目的。引流口放置引流條或引流管，減少炎癥擴散。糖尿病人手術應選在上午血糖較低時為宜，一般為餐后2h左右；局麻藥不加腎上腺素。考慮患者術后可能較晚進食，術前胰島素量應減量，防止低血糖的發生。每天換藥至少兩次、引流必須通暢，換藥時用雙氧水、慶大霉素、生理鹽水等行局部沖洗，使之改善厭氧環境。注意雙氧水注射沖洗時不要用力加壓，避免感染深層組織。穿刺物及引流物常規行細菌培養，對持續高熱患者做血培養；根據藥敏指導用藥。在抗生素使用早期應經驗性選擇半合成青霉素類+β內酰胺酶抑制劑或第三代頭孢菌素類加甲硝唑。全身及時針對性給予人體白蛋白或血漿糾正低蛋白血癥，維持水電解質平衡。其中有5例壓迫呼吸道行氣管切開。
1.4 療效判斷：切開引流口愈合，全身及局部情況良好?？崭寡?.5～7.0mmol/L，餐后2h血糖
1.5 觀察指標：血糖達標時間、切開引流口平均愈合時間、低血糖發生情況。
1.6 統計學處理： 所有數據采用SPSS12.0統計軟件進行處理，以均數±標準差（x±s）表示，進行配對t檢驗，P
2 結果
經系統治療，3組患者血糖均達標；A組血糖達標時間均優于其他組（P
A組在血糖達標時間與平均愈合時間上均優于其他組（P0.05）。
3 討論
臨床上糖尿病患者起病緩慢、病程時間長、早期不容易被發現[3]；本文57例患者有42例患者均不知道已患糖尿病，其余15例患者也沒有堅持每天定時檢測和控制血糖。由于頜面部的筋膜之間有大量的疏松結締組織或脂肪組織充填，且血運豐富，感染本身容易擴散[4-5]，加之糖尿病患者的糖代謝紊亂，血糖濃度高，有利于細菌的生長、繁殖；吞噬細胞功能下降，組織缺血、缺氧，有利于厭氧菌生長；感染又會誘發機體應激反應，促使血糖進一步升高，感染難以控制[6]。所以控制血糖和局部及全身處理顯得尤為重要。
門冬胰島素30（InsulinAspart30Injection），商品名：諾和銳30（Novomix30），化學名：含30%可溶性門冬胰島素和70%精蛋白門冬胰島素。是一種雙相人胰島素類似物，相對于人胰島素能更好地模擬生理胰島素分泌模式，皮下注射后以單體形式存在，具有快速吸收、快速起效、快速達峰、快速回落的特點，能更好地控制餐后血糖，皮下注射后，將在10～20min內起效；作用最強時間在注射后1～4h，半衰期平均為8～9h；減少夜間低血糖發生率，作為中效胰島素用于臨床。報道表明[7]，諾和銳30能夠更好地控制患者的餐后血糖。
甘精胰島素（Insulin glargine），商品名：Lantus，化學名：21A-Gly-30B a-L-Arg-30Bb-L-Arg-人胰島素。在酸性pH（pH4）注射液中，完全溶解。這是第一個不含有魚精蛋白，清亮透明的長效胰島素制劑。當靜脈注射時，甘精胰島素的半衰減期和人胰島素近似。在第1次注射后，2～4天血清胰島素濃度達到穩態。注入皮下組織后，因酸性溶液被中和而形成的微細沉積物可持續釋放少量甘精胰島素，從而得到有長效作用的、平穩、無峰值的血藥濃度/時間特性[7]。1999年獲FDA的批準。報道表明[8]，甘精胰島素能很好的控制餐前的基礎血糖。
本研究顯示，使用“三短一長”強化注射組在血糖達標時間與平均愈合時間上均優于預混胰島素組和中性胰島素組，而在發生低血糖的幾率上沒有可比性。臨床實踐表明：B組和C組適合于病情較輕，并發癥較少而胰島素用量較小的患者。“三短一長”強化胰島素治療口腔頜面部組重癥多間隙感染患者能有效控制病情并且縮短了住院時間，在提高治療效果和依從性的同時，減輕患者的經濟負擔，適于臨床推廣應用。
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對指導意見的意見和建議范文3
【摘要】
目的觀察糖平煎對2型糖尿?。═2DM）大鼠糖脂毒性和胰島素抵抗（IR）的影響。方法采取高熱量飼料喂養結合小劑量鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射的方法復制T2DM大鼠模型，分為正常對照組、模型對照組及糖平煎大、小劑量組，連續治療4周，觀察血糖（FBG）、血脂（TG，TC，HDL-C，LDL-C）、血清胰島素（FINS）、胰島素敏感性指數（IAI）的變化。結果大、小劑量糖平煎治療4周，和模型對照組比較，FBG，FINS，TG，TC，LDL-C顯著降低，而HDL-C，IAI明顯升高（P
【關鍵詞】 2型糖尿病 胰島素抵抗 葡萄糖毒性 脂毒性 糖平煎
胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR) 是2型糖尿?。═ype 2 Diabetes Mellitus，T2DM）發病的重要因素和顯著特征，而T2DM時持續存在的“糖毒性”“脂毒性”是IR的重要因素。我們以前進行的動物實驗證明了糖平煎對2型糖尿病大鼠血流變、微循環有良好治療作用［1］，本實驗進一步觀察糖平煎對T2DM大鼠糖脂毒性和IR的影響，以進一步探討其作用機理。
1
材料
雄性Wistar大鼠50只，體重180～220g。糖平煎由黃芪14 g，黃連6 g，荔枝核6 g，丹皮6 g，桑葉8 g，僵蠶10 g，山藥10 g，元參10 g，蒼術10 g組成，水煎濃縮煎液，每毫升含生藥2 g。鏈脲佐菌素（STZ）美國Sigma產品。甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C)、血糖（FBG）、血清胰島素（FINS）試劑盒由北京中杉金橋生物公司提供。
2 方法
2.1 分組及給藥 隨機取10只大鼠為正常對照組，喂基礎飼料（總熱量6.94 J/g）。其他大鼠喂高熱量飼料（基礎飼料加蔗糖、煉豬油和雞蛋，總熱量21.33 J/g）4周，再腹腔注射STZ 30 mg/kg，2周后檢測FBG、 FINS、血脂，取FBG >7.8 mmol/L，具有超重、高血脂、高胰島素血癥、胰島素敏感性指數降低的大鼠，確定為T2DM模型［2］。選擇T2DM大鼠30只，隨機分為模型對照組及糖平煎大、小劑量組，每組10只。按人與大鼠體表面積折算的等效劑量比給藥，大劑量組每日給藥7.2 ml/kg，小劑量組每日給藥3.6 ml/kg（加入3.6 ml/kg蒸餾水），模型對照組和正常對照組每天給7.2 ml/kg蒸餾水，灌胃1次/d，連續4周。
2.2 指標檢測 實驗結束頸總動脈插管取血，按照各試劑盒說明進行操作，采用酶法測定FBG、血脂；采用放免法測定FINS；采用李光偉法［3］計算胰島素敏感性指數IAI=Ln［1/ FBG×FINS］ (Ln:自然對數) 。
2.3 統計分析 組間數據以±s表示，采用SPSS 12.0統計分析軟件以方差分析進行統計處理。
3 結果
3.1
糖平煎對大鼠脂毒性影響 見表1，與正常對照組相比，各模型組TG，TC，LDL-C明顯升高， HDL-C明顯降低。糖平煎大、小劑量治療4周后，可明顯降低TG，TC，LDL-C，明顯升高HDL-C，與模型對照組相比，差異有統計學意義（P
表1 糖平煎對T2DM大鼠TG，TC，LDL-C，HDL-C的影響（略）
與正常對照組比較，*P
3.2 糖平煎對大鼠糖毒性和IR的影響 見表2。與正常對照組相比，各模型組FBG、FINS明顯增加，IAI明顯降低。糖平煎大、小劑量治療4周后， 可明顯降低FBG、FINS，明顯提高IAI，與模型對照組相比，差異有統計學意義（P
表2 糖平煎對T2DM大鼠FBG，FINS，IAI的影響（略）
與正常對照組比較，*P
4 討論
課題組認為T2DM的基本病機為“氣陰兩虛、痰淤阻絡、脾虛肝郁”，“脾虛、肝郁、痰淤”在T2DM病理及其并發癥中有著重要意義。治療上從“脾”論治，強調“滋陰兼益氣”“化痰必和血”“健脾需調肝”，擬方“糖平煎”，由黃芪、山藥、蒼術、元參、黃連、桑葉、丹皮、僵蠶、荔枝核等藥組成。方中黃芪配山藥、蒼術配元參為北京名醫施今墨經驗。黃芪、蒼術健脾益氣，燥濕化痰；山藥、元參益氣養陰，清熱解毒；黃連清熱燥濕；丹皮活血涼血；僵蠶化淤通絡；桑葉散熱平肝；荔枝核疏肝理氣。全方甘苦涼潤，清熱瀉火而滋燥生津，活血涼血而益氣淡滲，臨床治療T2DM、改善并發癥取得了良好療效。結合現代藥理研究，黃連小檗堿有胰島素增敏、抗脂質過氧化作用，能夠抑制糖原異生，有利于降低高血糖；桑葉中含有脫皮固酮、蕓香苷、槲皮素，可促進葡萄糖轉化為糖原；荔枝核中含有α- (亞甲環丙基) 甘氨酸可以使血糖下降、肝糖元降低，以及黃芪多糖、薯蕷皂苷、蒼術苷、丹皮酚等活性成分均有降血糖作用。
“糖毒性”是指持續高血糖對胰島β細胞、全身眾多組織細胞的損傷作用。持續高血糖對胰島β細胞有直接毒性作用，損害β細胞對葡萄糖刺激下正常促進INS分泌的反應，加重INS的分泌異常乃至分泌缺陷，加重受體后水平的缺陷導致IR。對全身組織的毒性作用主要是蛋白質非酶糖化的影響，許多蛋白在高糖環境中可以發生非酶糖化，進而刺激細胞合成和釋放一系列的細胞因子和生長因子，影響組織細胞的增殖與分化及基質的合成和分泌，對機體產生毒性作用［4］。血脂異常以TG、TC、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低為特征，可以導致、加重IR，稱為“脂毒性”。TG在肝臟、肌肉的沉積與FINS升高關系密切，可能在IR產生過程中發揮重要作用。而血清游離脂肪酸（FFA）流入胰腺組織，超過其氧化能力， FFA酯化為TG會導致胰腺的功能亢進或者功能異常，導致β細胞的損害，影響了胰島素分泌造成IR［5］。同時，脂毒性的產生可能依賴于糖毒性，高血脂對正常血糖環境下的大鼠胰島β細胞分泌功能無明顯損害，長期慢性高血糖可顯著促進脂毒性對胰島β細胞功能的損害［6］。在IR評價方面，采用李光偉與美國NIH的糖尿病流行病學家Peter H.Bennett于1993年提出的IAI法，經美國國立衛生院Phoenix糖尿病臨床及流行病學研究所320例胰島素鉗技術研究的材料證明，此胰島素敏感性指數在糖耐量正常、糖耐量低減和2型糖尿病人群與正常血糖高胰島素鉗技術測定的胰島素敏感性顯著相關(r分別為0.78，0.71，0.71)，是一種簡單而可靠的IR評價方法［3］。
本實驗大、小劑量糖平煎治療4周后，和模型對照組比較，FBG，FINS，TG，TC，LDL-C顯著降低，HDL-C、IAI明顯升高，差異均有統計學意義（P
【參考文獻】
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對指導意見的意見和建議范文4
[關鍵詞]成骨分化；骨髓間充質干細胞；同種異體；免疫調節
[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2012）11-1976-05
近年來，隨著組織工程的興起和發展，應用骨髓間充質干細胞（BMSCs）構建組織工程骨已成為骨組織重建修復的一個新途徑。骨髓間充質干細胞是一種具有很強自我更新能力的原始細胞，具有多向分化潛能，可分化為不同類型的細胞，如骨細胞、肌腱細胞、脂肪細胞、肌肉細胞等[1-4]，另外研究發現BMSCs免疫原性低且有免疫調節作用。它能抑制由非特異性絲裂原（PHA等）、炎癥細胞因子（IL-2、Anti-CD3 Ab）等誘導的淋巴細胞增殖[5-8]。
自體BMSCs要達到一次治療量，需要在體外大量培養擴增，其過程可能要花大約一個月的時間。因此，對于一些急性嚴重的骨缺損，可能錯過了最佳的治療時機，將無法應用于其臨床治療。同種異體BMSCs來源廣泛，易于獲取，彌補了自體細胞來源缺乏的不足，在臨床運用上有著廣闊的前景和重要的意義。同時，成骨誘導對于構建組織工程骨至關重要，成骨分化后的BMSCs是否仍能發揮免疫調節作用，在體內各種刺激因子的作用下是否能保持免疫調節功能，這是同種異體骨組織工程體內構建成功與否的重要前提。
本實驗旨在探索成骨分化的同種異體BMSCs在三種實驗條件下（雙向MLR、PHA刺激、IL刺激）是否能發揮免疫調節功能，為進一步同種異體組織工程骨的體內構建提供免疫學理論基礎。
1 材料和方法
1.1 材料：普通級成年Beagle犬3只[許可證號： SCXK （京） 2007-0005]，體重10～13kg，雌雄不限，經北京實驗動物質檢站檢測，由瑪斯公司提供，于中國醫學科學院整形外科醫院動物中心進行飼養，實驗過程中對動物的處置符合2006年科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》的規定[9]。各試劑及儀器見表1。
1.2 方法
1.2.1 犬骨髓間充質干細胞的成骨誘導分化：原代骨髓間充質干細胞接種后48h換液，去除未貼壁的細胞，繼續培養。約7天后細胞生長達80%融合，胰蛋白酶-EDTA消化，按1.6× 104/cm2密度傳代。第1次傳代后，一部分細胞加入含10nmol/L地塞米松、10mmol/L β-磷酸甘油鈉、50μmol/L L-2-磷酸抗壞血酸的DMEM成骨誘導培養基（Osteogenic Medium）；另一部分細胞作為陰性對照，仍用普通含血清培養基進行培養。以后每3天傳代1次，傳至第2代細胞，倒置相差顯微鏡下觀察。
1.2.2犬骨髓間充質干細胞的成骨誘導分化鑒定：茜素紅染色：制備經成骨誘導培養21天的細胞爬片，4%多聚甲醛固定2h，加入配制的茜素紅染液（茜素紅0.1g溶于蒸餾水100ml，調節pH值至7.2），染色5min，洗去染液后以丙酮洗數秒、丙酮/二甲苯洗數秒，樹酯封片后倒置相差顯微鏡下觀察。
堿性磷酸酶染色：制備經成骨誘導培養14天的細胞爬片，甲醛固定同上，BM-Purple試劑盒染色，染色后固定、封片、鏡下觀察同上。
1.2.3 第三方BMSCs、OM-BMSCs滅活備用：取第2代BMSCs、OM-BMSCs細胞懸液0.9ml，加入100μg/ml的絲裂霉素C 0.1ml，使其終濃度為10μg/ml，放置于37℃，CO2細胞培養箱滅活2h。之后分別用普通培養基、成骨培養基洗滌3次以去除殘余的絲裂霉素C，重懸后細胞計數。按照實驗分組，取1×104/孔接種于96孔板相應位置，隔天待BMSCs完全貼壁后將原有培養基吸出，進行后續實驗。另外分別單獨接種1×104/孔BMSCs、OM-BMSCs作為空白對照組（Blank1組、Blank2組）。
1.2.4 犬外周血單個核細胞（PBMCs）分離抽取2只互為同種異體比格犬外周血5ml，緩慢加入到含有3.5ml Ficoll Plus淋巴細胞分離液的15ml離心管中，離心2000rpm，20min。吸取中間白色云霧狀的有核細胞層，即分離得到PBMCs。用淋巴細胞培養基（RPMI1640培養基，含10%FBS、1%青鏈霉素、50μM 2-ME）重懸后離心1000rpm，5min，洗滌2次后細胞計數，分別作為供體細胞和受體細胞。
1.2.5 第三方BMSCs、成骨誘導的BMSCs（OM-BMSCs）對于雙向混合淋巴細胞反應（MLR）中PBMCs增殖的影響：96孔培養板共分三組，每組7個復孔，反應體系總量為200μl，不足者以淋巴細胞培養基補充。A組：將供體和受體犬PBMCs接種于96孔板中，5×104/孔，作為對照組；B組：A組各組分加入已鋪被1×104/孔BMSCs的96孔板；C組：A組各組分加入已鋪被1×104/孔OM-BMSCs的96孔板。96孔板放置于37℃，5%CO2培養箱內培養120h后，加入CellTiter96 Aqueous One Solution Assay 20μl，再放回細胞培養箱內孵育4h，用酶標儀在490nm波長測定PBMCs的OD值。OD值（B組-Blank1）代表B組PBMCs的增殖情況；OD值（C組-Blank2）代表C組PBMCs的增殖情況。
1.2.6第三方BMSCs、OM-BMSCs對于經PHA刺激后的PBMCs增殖的影響：96孔培養板共分三組，每組7個復孔，反應體系總量為200μl，不足者以淋巴細胞培養基補充。D組：將受體犬PBMCs接種于96孔板中，5×104/孔，加入植物血凝素A（PHA），終濃度為1μg/ml，作為對照組；E組：D組各組分加入已鋪被1×104/孔BMSCs的96孔板； F組：D組各組分加入已鋪被1×104/孔OM-BMSCs的96孔板。96孔板放置于37℃，5%CO2培養箱內培養120h后，加入CellTiter96 Aqueous One Solution Assay 20μl，再放回細胞培養箱內孵育4h，用酶標儀在490nm波長測定PBMCs的OD值。OD值（E組-Blank1）代表E組PBMCs的增殖情況；OD值（F組-Blank2）代表F組PBMCs的增殖情況。
1.2.7第三方BMSCs、OM-BMSCs對于經IL-2刺激后的PBMCs增殖的影響：96孔培養板共分三組，每組7個復孔，反應體系總量為200μl，不足者以淋巴細胞培養基補充。G組：將受體犬PBMCs接種于96孔板中，5×104/孔，加入IL-2、OKT3（anti-CD3 antibody），終濃度為100U/ml，作為對照組。H組：G組各組分加入已鋪被1×104/孔BMSCs的96孔板；I組：G組各組分加入已鋪被1×104/孔OM-BMSCs的96孔板。96孔板放置于37℃，5%CO2培養箱內培養120h后，加入CellTiter96 Aqueous One Solution Assay 20μl，再放回細胞培養箱內孵育4h，用酶標儀在490nm波長測定PBMCs的OD值。OD值（H組-Blank1）代表H組PBMCs的增殖情況；OD值（I組-Blank2）代表I組PBMCs的增殖情況。
1.2.8 統計學分析：應用SPSS13.0軟件進行統計學處理，數據以x±s表示，組間均數比較行一維方差分析，P
對指導意見的意見和建議范文5
【關鍵詞】 川芎嗪注射液; 腹膜間皮細胞; 高糖; ⅰ型膠原; 基質金屬蛋白酶1; 基質金屬蛋白酶抑制劑1; 體外實驗
zhu gs, he js. j chin integr med. 2009; 7(1): 6569.
received june 18, 2008; accepted july 22, 2008; published online january 15, 2009.
indexed/abstracted in and full text linkout at pubmed. journal title in pubmed: zhong xi yi jie he xue bao.
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doi: 10.3736/jcim20090110open access
effects of ligustrazine injection on high glucoseinduced type ⅰ collagen, matrix metalloproteinase1 and tissue inhibitor of metalloproteinase1 expressions in human peritoneal mesothelial cells in vitro
guisong zhu, jinsong he
department of nephrology, the affiliated drum tower hospital, nanjing university medical school, nanjing, jiangsu province 210008, china
objective: to investigate the effects of ligustrazine injection on type ⅰ collagen, matrix metalloproteinase1 (mmp1) and tissue inhibitor of metalloproteinase1 (timp1) expressions in human peritoneal mesothelial cells (hpmcs) cultured in high glucose conditions.
methods: hpmcs were isolated from human omenta by trypsin digestion method and subcultured. then, the hpmcs were divided into normal control group, high glucose group and high glucose plus low, medium and highdose ligustrazine (10, 20 and 40 mg/l ligustrazine respectively) groups. semiquantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction was used to detect the expressions of type ⅰ collagen, mmp1 and timp1 mrnas in hpmcs. proteins of type ⅰ collagen, mmp1 and timp1 in culture supernatants were measured by enzymelinked immunosorbent assay (elisa). cell protein concentration was measured by trace bicinchoninic acid method to correct the elisa assay results.
results: ligustrazine injection could significantly decrease high glucoseinduced type ⅰ collagen and timp1 expressions in a dosedependent manner both in protein and gene levels (p<0.05, p<0.01). in addition, medium and highdose ligustrazine injection could significantly increase mmp1 expression which was inhibited by high glucose concentrations (p<0.05).
conclusion: ligustrazine injection does not only decrease type ⅰ collagen synthesis, but also promote its degradation by modulating unbalanced mmp1/timp1 expression in hpmcs cultured in high glucose conditions.
keywords: ligustrazine injection; human peritoneal mesothelial cells; high glucose; type ⅰ collagen; matrix metalloproteinase1; tissue inhibitor of metalloproteinase1; in vitro
腹膜纖維化是腹膜透析治療的主要并發癥，最終導致腹膜功能衰竭，這是腹膜透析患者退出治療的主要原因［1］。腹膜纖維化以細胞外基質（extracellular matrix, ecm）的過度沉積為特點［2］。研究表明，ecm的過度沉積是由于ecm合成與降解失衡而引起［3］。ⅰ型膠原是腹膜纖維化中主要的ecm［4］，其降解過程受基質金屬蛋白酶1（matrix metalloproteinase1, mmp1）及其特異性抑制劑金屬蛋白酶組織抑制劑1（tissue inhibitor of metalloproteinase1, timp1）調控［5］。有研究證實，高糖能上調腹膜間皮細胞（human peritoneal mesothelial cells, hpmcs）ⅰ型膠原和timp1的表達，降低mmp1活性［3］。本研究通過觀察川芎嗪注射液對高糖刺激下hpmcs ⅰ型膠原、mmp1和timp1表達的影響，探討川芎嗪在防治腹膜纖維化中的作用及其機制。
1 材料和方法
1.1 試劑和主要儀器 川芎嗪注射液（江蘇蘇中藥業集團股份有限公司，批準號為國藥準字h20020630）；50％葡萄糖注射液（江蘇方強制藥廠，批號為200710111）。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution, pbs）、胎牛血清（fetal calf serum, fcs）、trizol和rpmi1640粉劑等（gibco公司）；胰蛋白酶和瓊脂糖粉等（promega公司）；ⅰ型膠原、mmp1和timp1酶聯免疫吸附測定（enzymelinked immunosorbent assay, elisa）試劑盒（adl公司）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, bca）蛋白含量檢測試劑盒（南京凱基生物科技公司）；ⅰ型膠原、mmp1、timp1和βactin引物，mmlv第一鏈cdna合成試劑盒和taq酶等（invitrogen公司）；抗細胞角蛋白抗體、抗細胞波形蛋白抗體、第ⅷ因子抗體和抗白細胞cd45抗體（北京中山生物技術有限公司）。nu2500e二氧化碳培養箱（nuaire公司）；全自動酶標儀（biobank公司）；生物電泳圖像分析系統（上海復日科技有限公司）。
1.2 實驗方法
1.2.1 hpmcs的培養與鑒定 取來自南京大學醫學院附屬鼓樓醫院普外科擇期腹部手術患者（排除尿毒癥、腹膜炎）捐獻的大網膜組織，按文獻［3］方法原代培養hpmcs，按1︰3傳代，第3代細胞用于實驗，每次實驗均由來自3個患者的標本進行3次獨立實驗。倒置相差顯微鏡觀察hpmcs呈多邊形，似鋪路鵝卵石樣外觀；免疫組化鑒定抗細胞角蛋白抗體和抗波形蛋白抗體染色陽性，抗第ⅷ因子抗體和抗白細胞cd45抗體染色陰性。
1.2.2 實驗步驟和分組 hpmcs用含1％fcs的rpmi1640培養液同步培養24 h后分為5組（每組設3個樣本）：正常組（完全培養液）、高糖對照組（2.5％葡萄糖）和高糖（2.5％葡萄糖）加低、中、高劑量川芎嗪（10、20和40 mg/l）組。各組完全培養液均為含有15％ fcs的rpmi1640培養液。細胞置于37 ℃、5％ co2培養箱培養48 h。
1.2.3 elisa法檢測細胞上清液中ⅰ型膠原、mmp1和timp1含量 分組干預48 h后，離心收集上清液，按elisa試劑盒說明書檢測ⅰ型膠原、mmp1和timp1表達水平。用0.1 mol/l naoh溶解細胞沉淀，bca蛋白檢測試劑盒測定細胞沉淀中蛋白質濃度，用相應蛋白質濃度結果校正檢測結果。
1.2.4 半定量rtpcr 分組處理同上。采用trizol一步法提取總rna，2 μg總rna進行逆轉錄合成cdna，50 μl反應體系進行pcr擴增，以βactin作內參照（引物序列及反應條件見表1）。1.5％瓊脂糖凝膠電泳（110 v，15 min）進行pcr產物鑒定，電泳圖像分析儀掃描分析，mrna相對含量用其pcr產物吸光值（absorance, a）與βactin a值的比值表示。引物及pcr反應條件見表1。
1.3 統計學方法 實驗數據用x±s表示，采用spss 15.0軟件進行統計分析，組間差異比較采用單因素方差分析，兩組間均數比較采用lsdt檢驗。檢驗水準α=0.05。 表1 ⅰ型膠原、mmp1、timp1和βactin引物序列及pcr反應條件
2 結 果
2.1 上清液中ⅰ型膠原、mmp1和timp1蛋白質水平 與正常組比較，高糖對照組上清液中ⅰ型膠原和timp1含量顯著升高（p<0.01），mmp1含量顯著下降（p<0.01）；與高糖對照組比較，低、中和高劑量川芎嗪組上清液中的ⅰ型膠原和timp1含量顯著降低（p<0.05, p<0.01），且兩者均呈量效關系，中、高劑量川芎嗪組上清液mmp1含量顯著增加（p<0.01）。見表2。表2 各組上清液中ⅰ型膠原、mmp1和timp1蛋白質表達
2.2 hpmcsⅰ型膠原、mmp1和timp1 mrna的表達 與正常組比較，高糖對照組hpmcs ⅰ型膠原/βactin mrna和timp1/βactin mrna分別上升（15.43±0.83）倍和（4.19±0.09）倍（p<0.01），mmp1/βactin mrna下降（86.9±0.44）%（p<0.01）；與高糖對照組相比，低、中、高劑量川芎嗪組ⅰ型膠原/βactin mrna和timp1/βactin mrna表達水平均顯著下調（p<0.05），兩者均呈量效關系，中、高劑量川芎嗪組mmp1/βactin mrna表達顯著增加（p<0.05）。見圖1和圖2。
3 討 論
高糖透析液導致ecm過度沉積是腹膜纖維化的病理基礎［2］，研究表明，高糖不僅增加hpmcsⅰ型膠原的表達，并且引起ⅰ型膠原降解酶系mmp1/timp1的表達失衡［3］。我們的研究結果與之基本相同，此外我們發現，川芎嗪能顯著對抗高糖的上述作用。
在生理條件下，hpmcs可以產生一定量的ecm和mmps/timps［3, 6］。mmps是降解ecm的蛋白水解酶系，幾乎能降解全部ecm成分。timps是內源性分泌蛋白，作為mmps的特異性抑制因子，其n'端可與相應的mmps催化活性中心的鋅離子結合而抑制其催化活性［7］。本實驗通過研究川芎嗪對hpmcs在高糖刺激下主要ecm ⅰ型膠原及其降解酶系mmp1/timp1分泌及表達的影響，旨在探討川芎嗪對hpmcs在高糖環境下ⅰ型膠原的合成和降解的干預作用及其機制。結果顯示，川芎嗪能顯著降低高糖所致的ⅰ型膠原的過度合成，同時顯著下調timp1的表達，增加mmp1的表達，提示川芎嗪亦能通過調節mmp1/timp1的平衡，從而促進ⅰ型膠原的降解，減少ecm沉積。由此我們推測，川芎嗪可能具有預防或延緩腹膜纖維化的作用。
川芎嗪是中藥川芎的有效成分之一，屬酰胺類生物堿，具有活血化瘀的功效。藥理實驗證明，川芎嗪具有擴張血管、改善微循環、調節免疫和鈣離子拮抗的作用［8］。目前川芎嗪抑制ⅰ型膠原、timp1和增加mmp1表達的機制尚不清楚。以往的研究發現這可能與抑制轉化細胞生長因子β1（transforming growth factorβ1, tgfβ1）表達有關［9, 10］。tgfβ1是重要的致纖維化細胞因子，參與了腹膜纖維化的病理過程［2］。tgfβ1可增加ⅰ型膠原的合成，并且抑制mmps的活性而激活timps，使ⅰ型膠原降解減少［3, 11］。有研究報道，川芎嗪能降低多種細胞如心肌細胞、肝細胞和血管內皮細胞的膠原合成和timp1表達，而增加mmp1的分泌和表達，進一步的研究發現這可能是通過抑制tgfβ/smads信號傳導通路繼而抑制tgfβ1表達的結果［9, 10, 12］。我們前期研究證實，川芎嗪能下調高糖致hpmcs tgfβ1的表達（文章待發表）。因此我們推測，川芎嗪抑制tgfβ1的表達可能是其抑制hpmcs ⅰ型膠原合成和調整mmp1/timp1表達平衡的機制之一，其具體機制將是我們下一步要研究的內容。
綜上所述，川芎嗪能抑制高糖致hpmcs ⅰ型膠原的過度合成，并且通過調節mmp1/timp1的平衡，促進ⅰ型膠原降解，從而減少ecm的沉積，防止腹膜纖維化的發生和發展。因此，川芎嗪可能具有預防或延緩腹膜纖維化的作用，這對腹膜纖維化的機制及其防治的研究有一定借鑒和應用價值。
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對指導意見的意見和建議范文6
關鍵詞: 檢察機關/量刑程序/求刑權/制度構建
檢察機關參與量刑程序，是指刑事訴訟活動中，檢察機關在向審判機關指控被告人犯罪事實的基礎上，參與對被告人進行量刑的庭審程序，依法就其刑罰和執行提出具體的司法請求，并對審判機關作出的裁判進行法律監督的活動。2005年7月最高人民檢察院正式下發《人民檢察院量刑建議試點工作實施意見》，2009年6月最高人民法院制定了《人民法院量刑指導意見（試行）》和《人民法院量刑程序指導意見（試行）》決定在全國開展量刑規范化試點工作，檢察機關的量刑建議權作為量刑改革的重要內容得到進一步明確。借此契機，筆者從探索檢察機關參與量刑程序的法理基礎入手，對量刑程序的制度構建提出相關建議。
一、檢察機關參與量刑程序的法理基礎
檢察機關參與量刑程序，理論依據在于其作為指控犯罪的機關所擁有的量刑建議權。量刑建議制度在兩大法系許多國家已得到廣泛建立，但我國還處于起步階段。而且，關于量刑建議權的內涵和可行性，實務界和理論界都沒有達成一致觀點。
（一）量刑建議權的概念
目前，國內對于量刑建議權的定義論述的比較多，但觀點很不統一，總體可概括為以下幾種：1.從刑罰權的角度定義。有觀點認為，公訴權或求刑權，是訴訟法上的權力，即檢察機關或被害人依照刑事訴訟程序提起刑事訴訟，要求法院對犯罪定罪科刑的權力。 [1] WriteZhu('1'); href="civillaw.com.cn/article/default.asp?id=51572#m1" name=1>[1]
2.從訴訟活動或訴訟階段的角度定義。有觀點認為，量刑建議權是檢察機關在公訴過程中，基于刑罰請求權，對具體案件的刑罰提出公訴意見的一種訴訟活動。 [2] WriteZhu('2'); href="civillaw.com.cn/article/default.asp?id=51572#m2" name=2>[2]并認為，量刑建議權是指檢察機關在刑事訴訟的最后一個階段，根據案情向法院提出對案件的具體定罪量刑意見，以確定對被告的適當處理。 [3] WriteZhu('3'); href="civillaw.com.cn/article/default.asp?id=51572#m3" name=3>[3]
3.從訴權的角度定義。有觀點認為，量刑建議權是指檢察機關在刑事訴訟中就被告人所應判處的刑罰向人民法院提出建議意見的一種權力。 [4] WriteZhu('4'); href="civillaw.com.cn/article/default.asp?id=51572#m4" name=4>[4]并認為，檢察機關量刑建議權是指公訴人在提起公訴或出庭支持公訴活動的過程中，根據犯罪的事實和情節，就被告人的量刑問題向法院提出具體意見的訴訟權力。 [5] WriteZhu('5'); href="civillaw.com.cn/article/default.asp?id=51572#m5" name=5>[5]
