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納米抗體技術范文1
1.1細胞分離
生物細胞分離是生物細胞學中一個十分重要的技術,它關系到研究所需要的細胞標本能不能快速獲得的關鍵問題。以往的細胞分離技術主要采用離心法,利用密度梯度原理,時間長效果差。80年代,人們開始利用納米微粒進行細胞分離,建立了用納米SiO2微粒進行細胞分離的新技術。其基本原理和過程是:先制備納米SiO2微粒,尺寸控制在15~20nm,結構一般為非晶態,再將其表面包覆單分子層,包覆層的選擇主要依據所要分離的細胞種類而定,一般選擇與所要分離細胞有親和作用的物質作為附著層。這種納米SiO2微粒包覆后形成復合體的尺寸約為30nm。第二步是制取含有多種細胞的聚乙烯砒咯烷酮膠體溶液。適當控制膠體溶液濃度。第三步是將納米SiO2包覆粒子均勻分散到含有多種細胞的聚乙烯砒咯烷酮膠體溶液中,再通過密度梯度原理,使所需要的細胞很快分離出來。
1•2細胞染色
納米微粒的出現,為建立新的細胞染色技術提供了新的途徑。最近比利時的DeMey博士等人利用乙醚的黃磷飽和溶液、抗壞血酸或者檸檬酸鈉把金從氯化金酸(HAuCl4)水溶液中還原出來形成金納米粒子,粒徑的尺寸范圍是3~40nm。接著制備金納米粒子-抗體的復合體,具體的方法是將金納米粒子與預先精制的抗體或單克隆抗體混合。不同的抗體對細胞內各種器官和骨骼組織敏感程度和親和力有很大的差別?？梢愿鶕@些差別制備此種金納米粒子-抗體的復合體,而這些復合體與細胞內各種器官和骨骼系統相結合,就相當于給各種組織貼上了標簽。由于它們在光學顯微鏡和電子顯微鏡下襯度很大,這就很容易分辨各種組織。這就是利用納米粒子進行細胞染色技術。大量研究表明,納米微粒與抗體的結合并不是共價鍵而是弱庫侖作用的離子鍵,因此制造穩定的復合體工藝比較復雜,但選擇適當條件是可以制造多種納米微粒-抗體的穩定復合體。細胞染色的原理與金屬的超微粒子光學特性有關,一般來說超微粒子的光吸收和光散色很可能在顯微鏡下呈現自己的特征顏色,由于納米微粒尺寸小,電子能級發生分裂,能級之間的間距與粒徑大小有關,電子從低能級的躍遷很可能吸收某種波長的光,納米微粒的龐大比表面中原子振動模式與顆粒內部不同,它的等離子共振也會對某種波長光的吸收產生影響,由于上述幾種原因,金納米粒子-抗體在白光或單色光照下就會呈現某種特定的顏色。試驗已經證實,對10nm直徑以上的金納米微粒在光學顯微鏡的明場下可觀察它的顏色為紅色。
2納米微粒在抗菌殺菌材料上的應用
近年來對半導體光催化材料的研究[5,6]表明,半導體材料(如TiO2,ZnO,CdS,ZnS,Fe2O3)由于具有滿的價帶和空的導帶,當受到能量大于半導體能隙的光照射時,會吸收光使價帶電子激發到導帶上形成導帶電子,同時在價帶上產生空穴,分離的電子和空穴可分別與吸附在半導體表面上的水和氧反應,產物為O-2和•OH,O-2是強還原劑,•OH具有幾乎能使全部有機物分解的氧化力,可以氧化分解構成細菌微生物主要成分的各種有機物,干擾細菌蛋白質合成,從而有效抑制細菌等微生物的繁殖,達到抗菌凈化目的,可用于殺菌除臭防霉及消毒,比常用的氯、次氯酸、H2O2等具有更大效力,因此半導體材料將會成為最具希望的環境友好光催化抗菌殺菌材料,目前已成為物理學家、材料學家和生物學家的熱點課題之一。但傳統的光催化材料,由于光產生的電子-空穴對極易復合,導致其光催化活性低,而且反應過程中需紫外光照射,因而很難在工業化實踐中得到應用。納米材料由于尺寸小、比表面積大,使得表面原子配位不飽和,同時存在很多表面缺陷成為光生電子和空穴分離的有效位置,使得納米半導體材料具有高的光催化活性。對納米微粒,當粒子細化到納米尺度時,具備很多優異的特征[7],如(1)通過量子尺寸限域造成吸收邊的藍移。(2)由離散的能級和躍遷選律造成光譜吸收及發射行為結構化。(3)與體材料相比,量子阱中的熱載流子冷卻速度下降,量子效率將提高。(4)光生電子和空穴的氧化還原能力增強。(5)室溫下激子效應顯著。這些特征將使得納米微粒成為高效的光催化抗菌殺菌材料。作者近來的研究結果表明,納米TiO2微粒對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有高的抗菌殺菌性能,其抑菌率均在99%以上。
3納米微粒在藥物上的應用
3•1納米微粒藥物
目前肝動脈栓塞化療(TAE)已成為治療肝癌的有效方法,拴塞物有明膠海綿、碘油-藥物乳劑及各種微米級含藥微囊(如白蛋白、葡聚糖、聚乳酸等),他們的不足之處在于(1)藥物緩釋后造成肝癌細胞耐藥、而載體對耐藥性無對抗作用;(2)微囊材料生物相容性差引起肝細胞的不良反應;(3)大部分微球粒徑較大,肝靶向性差。針對上述情況,吳道澄等人[8]采用小粒徑(納米級)脂質體-碘油乳劑及聚氰基丙烯酸正丁酯納米微粒-碘油乳劑用于肝癌的拴塞化療,經動物(白鼠)試驗,與各種微米級含藥膠囊相比,由于它們具有良好的肝靶向性、緩釋性及可生物降解性,還具有抗耐藥性,因而納米阿霉素微粒-碘油乳劑對肝癌具有良好的療效。光照條件下納米TiO2粒子具有高的氧化還原能力,能夠分解組成微生物的有機物(蛋白質)從而殺死微生物,且經動物試驗證實TiO2微粒對動物無生理毒性[9,10],因此Cai等人[11]將其用于癌細胞治療實驗中,實驗結果表明紫外光照射(10min)下TiO2微粒能全部殺滅癌細胞,目前該實驗正在進行中。
3•2表面包覆的磁性納米粒子藥物[12]
磁性納米粒子表面涂覆高分子,在外部再與蛋白相結合可以注入生物體中,這種技術目前僅處于實驗階段,已通過了動物臨床試驗。這種載有高分子和蛋白的磁性納米粒子作為藥物的載體,然后靜脈注射到動物體(小鼠、白兔)內,在外加磁場下(2125×103/π(A/m))通過納米微粒的磁性導航,使其移向病變部位,達到定向治療的目的。這就是磁性超微粒子在藥物學應用的基本原理。這里最重要的是選擇一種生物活性劑,根據癌細胞和正常細胞表面糖鏈的差異,使這種生物活性劑僅僅與癌細胞有親和力而對正常細胞不敏感,表面包覆高分子的磁性納米微粒載有這種活性劑就會達到治療的目的。動物臨床實驗證實,帶有磁性的Fe3O4納米微粒是發展這種技術的最有前途的對象,純金屬磁性納米Ni、Co粒子由于有致癌作用,不宜使用。例如10~50nm的Fe3O4的磁性粒子表面包覆甲基丙烯酸,尺寸約為200nm,這種亞微米級的粒子攜帶蛋白,抗體和藥物可以用于癌病的診斷和治療,這種局部治療效果好,副作用少,很可能成為癌病的治療方向。但目前還存在不少的問題,影響這種技術在人體的應用,如何避免包覆高分子層在生物體中的分解,是今后應該加以研究的問題。磁性納米粒子在分離癌細胞和正常細胞方面經動物臨床試驗已獲成功,顯示出了引人注目的應用前景。通常情況下,癌病、腫瘤手術后要進行放射性輻照,以殺死殘存的癌細胞,與此同時大面積輻照也會使正常細胞受傷害,尤其是對生命極端重要的具有造血功能和免疫功能的骨髓干細胞很可能受到更為嚴重的傷害,通常的做法是,為了避免骨髓細胞受到損害,在輻照治療前將骨髓抽出,輻照后再重新注入,但在較多的情況下癌細胞已擴散到骨髓中,因此在把癌細胞從骨髓液中分離出來是至關重要的,否則將含有癌細胞的骨髓液注回輻照治療后的骨髓中還會舊病復發。磁性納米粒子分離癌細胞的技術主要采用約50nm的Fe3O4納米粒子,包覆聚苯乙烯后直徑為3μm,用于小鼠骨髓中癌細胞分離試驗。首先從羊身上取出抗小鼠Fc抗體(免疫球蛋白),然后與上述磁性粒子的包覆物相結合,如圖1所示,將小鼠帶有正常細胞的骨髓取出,加入小鼠雜種產生的抗神經母細胞(尚未徹底分化的癌化神經細胞)單克隆抗體,此抗體只與骨髓液中的癌細胞結合(見圖中B),最后將帶抗體和包覆層的磁性粒子放入骨髓液中,它只與攜帶抗體的癌細胞相結合(見圖中C),利用磁分離裝置很容易將該細胞從骨髓中分離出來,分離率達99•9%以上。最近倫敦的兒科醫院、挪威工科大學和美國噴氣推進研究所利用這種技術成功地進行了人體骨髓液癌細胞的分離來治療癌病患者。
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掃描探針顯微鏡,其探針可以沿樣品表面逐點掃描,針尖能隨樣品的高低起伏作上下運動,用光學方法測量針尖的運動,就可以得到分子的圖像。目前已經用于人體多種正常組織和細胞的超微形態學觀察,而且可以在納米水平上揭示腫瘤細胞的形態特點。通過尋找特異性的異常結構改變,以解決腫瘤診斷的難題。另一種新型的納米影像學診斷工具———光學相干層析術(OCT)已研制成功,OCT的分辨率可達納米級,較CT和核磁共振的精密度高出上千倍。它不會像X線、CT、磁共振那樣殺死活細胞。通過應用納米技術,在DNA檢測時,可免去傳統的PCR擴增步驟,快速、準確。美國NASAAmesCen-terforNanotechnology與中南大學衛生部納米生物技術重點實驗室合作,將碳納米管用于基因芯片,可以在單位面積上連接更多的更高,樣本需要量低于1000個NDA分子(傳統DNA檢測的樣本需要量超過106個DNA分子);需要的樣品量更少,可以免去傳統的PCR擴增步驟;結果可靠,重復性好;操作簡單,易實現檢測自動化。其基本原理是:連接在碳納米管上的DNA探針通過雜交捕獲特異性的靶DNA或RNA,靶DNA或RNA中的尿嘧啶將電荷轉到碳納米管電極,電荷的轉移通過金屬離子媒介的氧化作用變成信號并放大。國外在80年代末開始著手研究超順磁性氧化鐵超微顆粒的研究,90年代把這種造影劑應用于臨床。
其技術要點是:制備出高順磁性氧化鐵納米顆粒,在其表面耦連肝癌組織靶向性物質(如肝腫瘤特異性單克隆抗體、肝腫瘤細胞表面特異性受體的配體)制成特異性的MRI造影劑。我國科學家也成功開發了應用超順磁氧化鐵脂質體納米粒進行肝癌診斷的技術,可以發現直徑3mm以下的肝腫瘤,還能發現更小的肝轉移癌病灶。目前不加造影劑的磁共振檢查能發現直徑1.0cm的肝癌病灶,因此該成果大大提高了肝癌早期診斷的敏感性。國家863資助課題“納米復合包裹生物微系統制備、超聲造影和控制釋藥”,研制了納米包膜微米微泡超聲造影劑與包裹藥物和氣體的微球,造影后對比效果明顯增強,有利于疾病的早期診斷和鑒別診斷。目前利用磁性納米分離癌細胞在動物實驗上已獲得成功。其方法是:在直徑為50nm的Fe3O4納米粒表面包覆聚苯乙烯,將特異抗體連接其上,此抗體全只與骨髓中的癌細胞結合。因此,利用磁性分離技術裝置很容易將癌細胞從骨髓中分離出來,分離率達99.9%以上,其意義重大。腫瘤切除術后加放療,為目前腫瘤治療的一種方案,但放療的同時也會使正常細胞受到傷害,尤其是殺傷骨髓細胞,從而產生造血功能障礙,因此在放療前將骨髓抽出,并分離出腫瘤細胞,將極大的提高放療的療效。
二、在治療技術方面的應用
納米生物材料可以作為基因治療藥物攜帶材料或靶向材料。通過納米材料的篩選、納米粒徑的控制及靶向物質的加載,可大大提高藥物載體的靶向性,降低藥物的毒副作用。用于研究的模型藥物包括阿霉素(ADM)、米托蒽醌和單克隆抗體以及近年來迅速發展的反義藥物。我們可將藥物包埋在納米粒內部,也可吸附或偶聯在其表面,通過血管內注射納米粒后,納米粒主要被網狀內皮系統吞噬,肝臟中有數目眾多的網狀內皮細胞,且位置固定,因此藥物能在肝內聚集,然后逐步放入血液循環,使肝臟藥物濃度增加,對其他臟器不良反應減少,對肝臟有被動靶向作用;當納米粒足夠小(100~150mm)便可逃過kupffer細胞的吞噬,可將其表面覆以特殊包被后,靠其連接的特異性抗體等物質定位于其他靶向器官發揮作用。
腫瘤基因治療是近年來基因治療和腫瘤治療領域內研究的熱點,腫瘤基因治療的方法主要有:①腫瘤抑制基因療法;②腫瘤免疫基因療法;③“自殺”基因療法;④耐藥基因療法;⑤其他基因療法。盡管基因治療在基礎研究取得很多成績,然而臨床試驗研究的結果尚不令人滿意。造成這種現象的原因是多方面的。這些問題主要有:①腫瘤基因治療缺乏靶向性;②基因轉移載體的效率、安全性及容量等問題;③絕大多數治療方案目的基因只有一個。傳統的DNA傳遞系統分為病毒載體介導系統和非病毒載體介導系統。病毒性載體在體內、體外均有高效表達,但是病毒性載體具有抗原性,體內應用誘導免疫反應和炎癥反應;而且病毒性載體有可能將外源性病毒基因插入人的基因組中,引起嚴重的毒副作用。非病毒性載體一般不會造成基因的永久表達、無抗原性、體內應用安全;組成明確,易大量制備,但傳遞效率低。研制具有高效轉染、安全低毒和器官甚至腫瘤細胞特異性的基因載體已成為制約基因治療藥物發展的瓶頸。納米技術的出現為解決基因轉移載體提供了新的思路。采用納米載體轉運核苷酸有很多優越性:①有助于核苷酸高效率轉染細胞;②能夠靶向定位輸送核苷酸;③能有效保護核苷酸,防止體內生物酶的降解;④無機納米粒本身具有殺傷癌細胞的作用,且對正常細胞無損害。納米生物材料亦可應用于制造各類組織的支架(如血管、氣管、輸尿管、韌帶與肌腱),組織工程用支架材料,內固定件,骨組織缺損修復材料。衛生部納米生物技術重點實驗室與美國合作開發的具有自塑能力的可吸收注射型納米骨漿,已在美國、中國等多個國家開展臨床實驗,療效顯著,該納米骨漿具有高度生物相容性且無致熱源性。
衛生部納米生物技術重點實驗室還與美國匹滋堡大學組織工程中心合作,已開始出骨組織工程納米生物活性材料,該材料由氨基酸及其他無毒的生物活性物質構成(如:葡萄糖、甘油、膠原蛋白、聚二醇等),采用國際上稱為“綠色化學”技術進行合成。并且材料中含有骨生長因子可促進新骨的生成及骨組織功能的恢復,從而縮短骨修復周期,增強再造骨的功能,提高再造骨的質量,而且可以修復大面積的骨缺損。同時在成骨過程中,納米材料亦可作為填充物質和骨生長因子的載體起著橋梁的作用。伴隨著新骨的生長,生物材料逐步降解,待新骨形成時,納米材料將被組織安全吸收。該材料的下一步開發計劃是使材料攜帶骨生長因子基因,納米材料既作為填充物質,又是基因轉染的載體。納米機器人是幾百個原子、分子組成的顆粒,尺寸只有幾十個納米,表面活性很大,可進入血管中。科學家設想將這些機器人放在血液、尿液和細胞介質中工作,例如可以專門清除血管壁上的沉積物、疏通腦血管中的血栓。
納米抗體技術范文3
【關鍵詞】 納米顆粒探針; 蓖麻毒素; 核糖體失活蛋白; 場流分離; 掃描電鏡; 聚苯乙烯
1 引 言
核糖體失活蛋白(Ribosomeinactivating proteins， RIP)存在于許多植物中，植物核糖體失活蛋白的生理功能是起防御作用，即抵抗病蟲害或者惡劣的環境[1]。根據蛋白質的一級結構，RIP 可以分成兩類：Ⅰ型，由一條多肽鏈組成;Ⅱ型，是雙鏈蛋白。Ⅱ型雙鏈RIP 由2條或者4條多肽鏈組成，分子量約為60 或120 kDa，其中一條是A (Active)鏈，具有N糖苷酶活性;另一條是B (Binding)鏈，這兩條鏈通過二硫鍵和非共價鍵連接[2，3]。蓖麻毒是一種典型的核糖體失活蛋白，由于蓖麻毒來源廣泛，禁止化學和生物武器公約把蓖麻毒列為最為嚴格的控制對 [4，5]。因此，開展對蓖麻毒等核糖體失活蛋白的檢測研究具有重要意義[6～8]。目前，檢測核糖體失活蛋白的方法有免疫分析法和生物質譜法[9～11]。納米材料因具有顆粒尺寸小、比表面積大、表面能高、表面原子所占比例大等特點而被廣泛應用于蛋白檢測中[12，13]。場流分離(Field flow fractionation， FFF)是Giddings提出的一種新的分離分析理論[14，15]，它將流體與外加場聯合作用于樣品，實現樣品組分的分離。場流分離技術可分離提純、收集流體中范圍為0.02～1 μm的懸浮物顆粒， 也可作為一種表征技術對樣品中納米顆粒的質量、密度、電荷及其它物理參數的準確測定。場流分離技術根據外加場的不同，可分為沉降場、流體場、熱力場、電場和磁場等多種分支，其中沉降場流分離(Sedimentation field flow fractionation)技術較為完善且應用較多[16，17]。
本研究建立了納米顆粒探針檢測核糖體失活蛋白的方法。以聚苯乙烯納米顆粒為載體，經表面修飾后在其表面固定特異性單抗，利用沉降場流儀對納米顆粒探針進行準確表征，測量出單個聚苯乙烯納米顆粒結合的目標分子數目，并利用掃描電鏡比較聚苯乙烯納米顆粒的形貌變化。通過掃描電鏡圖片能夠觀察到聚苯乙烯納米顆粒表面結合的蛋白，此納米顆粒探針能夠與核糖體失活蛋白的特異性結合，可應用于目標蛋白的檢測。
2 實驗部分
2.1 儀器與試劑
沉降場流分離儀(Postnova， UT， USA);Anton Paar DMA (60/602)振動管密度計(奧地利Anto Paar公司); 場發射掃描電鏡 (LEO 1550 EDS/OPAL/EBSD/STEM， Zeiss， Thornwood， USA); Sputter Coater SC7640 離子濺射儀(Quorum Technologies， UK); NAP5及NAP10凝膠滲透柱(通用公司); 5417C離心機(德國Eppendrof公司)。
蓖麻毒素A鏈(Ricin A Chain， 純度 98.99%)及其單抗IgG均由美國農業部西部研究中心友情提供;聚苯乙烯納米顆粒 (240 nm，10%，w/V， Bangs Laboratories Inc. PA， USA);NH4HCO3 (>99.5%)、表面活性劑FL70(Fisher公司);實驗用水為MilliQ超純水 (> 18 MΩ)。納米顆粒探針制備用試劑套裝(含聚氧乙烯聚氧丙烯聚氧乙烯嵌段共聚物(F108PDS)、3(2吡啶二巰基)丙酸N羥基琥珀酰亞胺酯 (SPDP)、二硫蘇糖醇(DTT)和磷酸鹽緩沖液，pH 7.4)購自Sigma公司。
2.2 實驗方法
2.2.1 離心沉降分離檢測技術 場流分離技術可視為一種單相的色譜技術，其系統設計為在超薄的樣品分離通道的垂直方向上引入一個可調控的外加場(如重力場、離心場等)[11～13]。含有納米顆粒懸浮液樣品在流動相的作用下流過分離通道。當樣品進入通道后，樣品將暫停一段時間(即Relaxation time，停留注射或松弛步驟)。此時樣品中的不同組分由于物理性質的差異， 在外加場的作用下，靠近通道壁的流體比中心處流得慢，不同質量的納米顆粒在通道中的流速差別會導致其相應的保留時間較大的差異，在流體及外加場的聯合作用下，樣品組分就得到了分離，沉降場流分離儀結構[18]及分離原理如圖1所示。
分 析 化 學第38卷第5期全 燦等：納米顆粒探針檢測核糖體失活蛋白 圖1 (a)沉降場流分離儀結構圖[18]和(b)沉降場流通道分離原理示意圖
Fig.1 (a) Structure diagram of the fieldflow fractionation(FFF) system[18]and (b) working principle scheme of FFF channel納米顆粒在尺度為940 mm×20 mm×0.254 mm的線型光滑通道中進行，該通道的空隙保留體積為4.49 mL，死體積為0.439 mL，外加場為離心力場。檢測時將線型光滑通道置于離心場中隨離心機軸向旋轉，距離離心機軸的徑向距離為15.5 cm。流動相為流速為1.5 mL/min的0.1% FL70溶液。樣品進樣體積為10 μL，松弛時間為12 min以確保樣品在分離通道中平衡，離心機轉速500～2000 r/min，紫外檢測器波長為254 nm。聚苯乙烯納米顆粒的密度為1.053 g/cm3[19]。利用振動管密度計測定0.1% FL70的流動相密度為997.1 kg/m3 [20]。
2.2.2 納米顆粒表面修飾 利用修飾劑F108PDS對聚苯乙烯表面進行修飾，并利用離心沉降分離儀進行表征：按比例取適量修飾劑F108PDS (10 g/L)加入到聚苯乙烯納米顆粒懸浮液中，在一定條件下使聚苯乙烯顆粒表面物理吸附足夠量的修飾劑F108PDS，經分離機離心分離未結合或結合不緊密的修飾劑F108PDS，棄去上清液后用磷酸鹽緩沖液重新稀釋納米顆粒，重復上述步驟3次并合并懸浮液渦旋混合，取10 μL納米顆粒懸浮液樣品進行離心沉降分析。
2.2.3 蓖麻毒單抗表面修飾 利用修飾劑SPDP對蓖麻毒單抗進行修飾，并利用離心沉降分離儀進行表征：按比例取適量修飾劑SPDP 加入到蓖麻毒單抗溶液(2.0 g/L)中，在一定條件下反應后，利用NAP5柱分離除去過量的修飾劑SPDP及一些小分子反應產物，再加入適量修飾劑DTT，再利用NAP10柱分離除去過量的修飾劑DTT。
2.2.4 納米顆粒固定單抗 將端基化的抗體與經表面修飾后的聚苯乙烯納米顆粒溫和反應，離心除去未結合及結合松散的抗體上清液，用緩沖鹽再次懸浮并渦旋混合，再離心沉淀的納米顆粒，即得到具有特異性抗體修飾的納米探針顆粒，取10 μL納米探針顆粒懸浮液進行FFF分析，測定其表面抗體結合的程度。
2.2.5 蓖麻毒蛋白的檢測 取5 μL蓖麻毒蛋白，加入到2.2.4節制備得到的納米顆粒探針中，恒溫反應。取10 μL納米探針顆粒懸浮液進行FFF分析，測定其表面抗體與蓖麻毒蛋白的結合程度。
2.2.6 掃描電鏡法 將固含率為1%的聚苯乙烯納米顆粒懸浮， 液滴在帶有碳膜的電鏡用銅網上，待懸浮液中的載液用氮氣吹干后，利用離子濺射儀進行離子濺射鍍膜，最后將樣品放入電鏡樣品臺上進行掃描電鏡觀測。 圖2 納米顆粒探針制備機理
3 結果與討論
3.1 實驗機理
以聚苯乙烯納米顆粒為載體，經表面修飾后在其表面固定特異性單抗，利用離心沉降場流儀對納米顆粒探針進行準確表征，測量出單個聚苯乙烯納米顆粒結合的目標分子的數目，實驗機理如圖2所示。由于聚苯乙烯納米顆粒比表面積大，在溶液中分散性好，本實驗中納米顆粒的抗原包被、免疫反應均在準均相溶液中進行，反應更充分，反應物用量更少，反應更完全，可用于痕量、超痕量目標分子的快速檢測。
3.2 沉降場流分離法
在2.2.1節的實驗條件下，聚苯乙烯納米顆粒典型的沉降場流分離譜圖如圖3所示，保留時間約為46 min。 圖3 聚苯乙烯納米顆粒典型的沉降場流分離譜圖
Fig.3 Fractogram from typical FFF analysis of bare polystyrene(PS) particles
利用沉降場流分離技術測定納米粒徑的原理的報道較多，根據在外加力場作用下，不同質量的納米顆粒在分離通道中具有不同的保留時間進行分離。在一定實驗條件下，通過測定的納米顆粒的保留時間Tr， 計算納米顆粒的水力學粒徑d， 如式(1)：R=V0/Vr=6λ[coth0.5λ-2λ](1)
Vr=TrF(2)其中，V0為分離通道空隙體積(Void volume)，Vr為一定粒徑的保留體積，F為流動相流速，根據實驗測得的保留體積值，由式(1)計算出λ，同時λ=KT/[ma(1-ρc/ρα)Gw]=6kT/d3(ρa-ρc)πGw(3) 其中，d為聚苯乙烯納米顆粒的粒徑，k為玻爾茲曼常數(k=1.3806503×10-23)，T為實驗溫度(K)， ρc為流動相密度(997.1 kg/m3)， ρa聚苯乙烯納米顆粒的密度(1.053 g/cm3)，w為分離通道的厚度(0.0254 cm)， G為外加離心力場，由式(3)得出: G=2πv602×dc(4)其中v為離心機的轉速， dc為分離通道距離離心機軸的徑向距離，本儀器中為dc=15.5 cm。
由式(3)和式(4)可計算出粒徑d，經多次重復測量，聚苯乙烯納米顆粒的粒徑為246 nm。
3.3 反應條件的影響
實驗研究了反應條件的影響，考察反應時間以及攪拌對納米顆粒表面修飾效果的影響。利用沉降場流分離儀進行測定，保留時間越長，表明聚苯乙烯納米顆粒的表面修飾效果越好。沉降場流分離譜圖如圖4所示。由圖4可知， 在24 h的反應時間中，通過攪拌可以增強表面修飾效果，保留時間從46.9 min 增加到50.1 min。在表面修飾反應過程中，不論是否攪拌，延長反應時間均有利于改善表面修飾效果，保留時間有顯著增大趨勢;反應6 d后進一步延長時間則無顯著性效果。通過優化實驗，本實驗反應時間選擇24 h，并伴隨攪拌。
圖4 聚苯乙烯納米顆粒典型的沉降場流分離譜圖
Fig.4 Fractogram from FFF analysis of 240 nm polystyrene particles
A. 聚苯乙烯祼珠(Bare PS particles， RT=45.288 min); B. 1天沒有攪拌(1 Day without stiming， RT=46.860 min); C. 3天沒有攪拌(3 Days without stiming， RT=48.368 min); D. 7天沒有攪拌(7 Days without stiming， RT=53.556 min); E. 1天有攪拌(1 Day with stiming， RT=50.060 min); F. 6天有攪拌(6 Days with stiming， RT=54.220 min)。3.4 納米顆粒探針的準確表征
圖5 聚苯乙烯納米顆粒典型的沉降場流分離譜圖
Fig.5 Fractogram from FFF analysis of 240 nm polystyrene particles
A. Bare PS particles; B. F108; C. F108IgG; D. F108IgGRicin.制備得到的納米顆粒探針基體為聚苯乙烯納米顆粒、依次包被了F108PDS、蓖麻毒抗體以及蓖麻毒蛋白。圖5為聚苯乙烯納米顆粒及其經過多層包被的沉降場流分離譜圖，各層的密度均大于沉降場流分離過程中流動相的密度，各層吸附在聚苯乙烯納米顆粒上使其總質量增大，表現為沉降場流分離過程中保留時間的延長。
吸附各層的質量可通過各自的保留時間計算，結果見表1。單個納米顆粒的粒徑為246 nm; 根據其密度可以計算出單個聚苯乙烯納米顆粒的質量為9.4×10-18 g/PS; 根據吸附各層的質量可計算出每個聚苯乙烯納米顆粒上結合約16510個F108PDS分子，923個IgG抗體分子和1665個Ricin 蛋白分子。表1 納米顆粒探針多層表面組成沉降場流分離計算結果
3.5 掃描電鏡法測定結果
圖6A和6B分別為聚苯乙烯納米顆粒及其結合了蛋白的掃描電子顯微鏡圖。圖6A可見清晰的球形聚苯乙烯納米顆粒，而圖6B則非常模糊，包被有其它物質，且納米顆粒也略呈橢球型不規劃顆粒，表明聚苯乙烯顆粒在探針制備前后其形貌有顯著性變化。但鑒于儀器的分辨率限制，本實驗中未能觀測到聚苯乙烯顆粒在探針制備前后納米顆粒粒徑的顯著性變化。
研究結果表明，研制的納米顆粒探針能夠與蓖麻毒蛋白等核糖體失活蛋白的特異性結合，可應用于目標蛋白檢測，對于痕量、超痕量的核糖體失活蛋白的檢測具有重要意義。
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納米抗體技術范文4
生物傳感器是由生物活性單元(如酶、抗體、蛋白質、核酸和細胞等)和信號轉換器組成并利用生物識別原理來進行檢測的一種裝置［1］。它是一種由生物、化學、物理、醫學和電子技術等多種學科互相滲透成長起來的高新技術，具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低、在復雜的體系中進行在線連續監測，及其易于自動化、微型化與集成化的特點。特別是近年來分子生物學、微電子學、光電子學、微細加工技術及納米技術等新學科和新技術的進展，使生物傳感器的研究蓬勃發展，成為新興的高技術產業的重要組成部分。根據分子識別元件與待測物結合的性質可將生物傳感器分為生物催化型(代謝型)和生物親和型(受體型)。生物親和型傳感器是利用分子間特異的親和性，即生物活性物質對底物的親和或鍵合作用而建立起來的，如免疫傳感器、受體傳感器和DNA傳感器等。根據生物反應產生信息的物理或化學性質，可采用電化學、光譜、熱、壓電和表面聲波等技術進行檢測［1］。本文按照傳感信號方式的不同，對近年來親和型生物傳感器在生物醫學上的進展予以綜述。
1免疫傳感器
癌癥是人類健康的殺手，是否能較早診斷出癌癥的前期征兆是影響癌癥患者恢復的關鍵因素。眾所周知，在腫瘤發展的過程中，腫瘤組織或細胞會釋放出一些特異性的蛋白質進入循環體系，而這些特異性蛋白在血液中的含量水平標志著腫瘤發展的階段，所以在生物醫學上常將這些特異性蛋白稱為腫瘤標記物。臨床醫學上常將這些腫瘤標記物的檢測作為臨床檢驗和診斷的重要依據［1］。生物化學、酶聯免疫和分子生物學等多種方法已用于腫瘤標記物的檢測，雖然這些方法具有較高的選擇性、準確度，但是存在輻射威脅、耗時和費用較高等缺點。由于免疫傳感器結合了免疫反應的特異性分子識別和便利的檢測技術而得到研究者的普遍關注，故開發快速而準確的腫瘤標記物的免疫傳感器成為生物醫學檢測的研究熱點。腫瘤標記物一般分為以下幾類:酶、糖蛋白、粘糖蛋白、激素、免疫分子和癌基因等。臨床醫學實踐表明，甲胎蛋白(AFP)、降血鈣素(CT)、癌胚抗原(CEA)、人絨毛膜促性腺素(hCG)、前列腺特異抗原(PSA)、鱗狀上皮細胞抗原(SCCA)、神經元特異性烯醇酶(NSE)和CA(CarcinomaAntigen)等均是典型的腫瘤標記物［1］。如腸癌的腫瘤標記物為CEA、CA19-9和CA24-2;前列腺癌的腫瘤標記物為F-PSA、PSA和PAP。按照免疫傳感器檢測信號的不同，可分為電化學型、光學型和質量敏感型等。
1．1電化學免疫傳感器
電化學免疫傳感器可再分為電位型、電容型和電流型。電位型傳感器在免疫傳感中應用不多。梁茹萍等［2］利用戊二醛交聯CA15-3抗體的電位型免疫傳感器用于乳腺癌CA15-3的檢測，獲得了良好的檢出限(5U/mL)和穩定性(30d)。Fu等［3］制備了40nm的氧化鐵納米柱修飾碳糊電極，用于固定CEA建立了測定CEA的電位型免疫傳感器。其線性范圍為1.5～80μg/L，檢出限為0.9μg/L。對臨床血液樣本的檢測結果與酶聯免疫法相符合。Zhou等［4］將納米金吸附在溶于PVC的鄰苯二胺的氨基上，制備了一種增塑的PVC膜的電位傳感器用于α-AFP的檢測。該傳感器的響應時間短(4min)、檢出限低(1.6μg/L)。但電位型免疫傳感器的不足之處在于:信噪比較低，線性范圍窄，非特異性抗體-抗原作用及背景信號較高。電容型免疫傳感器是一種高靈敏非標記型免疫傳感技術。在電容型免疫傳感器的制作中，傳感界面的構建和生物識別層的固定是影響其性能的重要因素。可采用半導體氧化物膜、自組裝單分子膜、電聚合膜、溶膠凝膠膜和等離子體聚合膜等來構建電容型免疫傳感器。Fernandez-Sanchez等［5］研制了可以用于檢測PSA的免疫傳感器。他們將對pH敏感的聚合物附著在電化學傳感器的表面，用于快速而靈敏地檢測親和反應過程中的電容及阻抗變化，實現了對PSA的靈敏檢測。Quershi等［6］在納米晶鉆(NCD)-interdigitatedgold(GID)電極表面固載抗體，進而通過電容法測定心血管標記物CRP。結果表明，電容器的靈敏度表現在兩個方面，一是當抗體與抗原結合后，極化常數和弛豫時間常數明顯增大，二是傳感器的靈敏度與抗體濃度及施加頻率緊密相關。袁若等［7］報道了一種在玻碳電極表面修飾金納米粒子，進而吸附CEA抗體，用鐵探針離子的阻抗特性來檢測CEA，獲得了良好的檢出限和靈敏度。
Rajesh等［8］在ITO修飾電極上利用自組裝膜固定α-CRP，利用電化學阻抗法檢測α-CRP抗體與抗原的親和作用，其檢出限達到3.5μg/L。由于電容法和阻抗法可以獲取直接、非標記的親和信號，所以在臨床診斷上具有良好的發展前景。但電容法存在的問題在于響應電容易受到非特異性吸附的影響，其重現性不如法拉第阻抗法與伏安法。所以如何優化傳感界面，改善響應電容的重現性和穩定性仍是電容型免疫傳感器發展中的關鍵問題。電流型免疫傳感器備受研究者的關注。由于大多數待測物不能直接參與電化學反應，常采用加入電子媒介體和標記酶來催化底物轉化為電活性物質來制備傳感器。雖然加入電子媒介體會降低檢出限，但其分離和洗滌步驟限制了它在生物醫學上的廣泛應用。而基于標記酶的直接電子傳遞的免疫傳感器則簡化了分離和洗滌步驟，在生物醫學上的應用更有吸引力。鞠幌先研究組曾對腫瘤標記物的電流型傳感器進行了深入的研究［9-12］。如將硫堇和HRP標記的CEA抗體通過戊二醛交聯在電極表面，制成了一種具有良好穩定性的傳感器。該傳感器減少了加入電子媒介體的麻煩，并且不需乳化和洗滌，線性范圍為0.5～3.0和3.0～167μg/L，檢出限為0.1μg/L，重現性良好［10］。他們還研究了基于HRP的直接電子傳遞的免疫CEA傳感器，對CEA的檢出限為0.3μg/L，并將實際樣品的檢測結果與臨床檢測方法相比照，獲得了滿意的結果［12］。除此之外，研究人員還結合納米粒子的電子傳導、絲網印刷技術、微流控裝置、毛細管電泳和流動注射等技術對腫瘤標記物的檢測進行了研究。
Jin等［13］結合毛細管電泳和電化學檢測技術，對腫瘤標記物CA125進行了檢測。Kojima等［14］設計了一種包含36個Pt微電極的陣列，運用不同的抗體來捕獲腫瘤標記抗原，采用電化學免疫檢測技術實現了多標記物的同時檢測。Wilson等［15］采用雙電極的免疫傳感器同時采用安培法測定了CEA和AFP，獲得了1μg/L的低檢出限，并有效抑制了交叉干擾。研究表明，這些新技術在免疫傳感器中的引入，不僅降低了待測物的檢出限，而且可以有效降低共存物質的干擾，并可實現多通道同時檢測多種腫瘤標記物。由于納米材料的獨特性質，使其在實時、靈敏檢測標記物方面具有廣泛的應用前景。如Zheng等［16］利用抗體功能化的二氧化硅納米線制備了一種新型傳感器，用于在血漿中的癌癥標記物的非標記實時監測。Ramanathan等［17］和Willner等［18］曾報道利用聚合物納米線和碳納米管進行相關生物親和體系內標記物的檢測。Wu等［19］將CEA/納米金通過殼聚糖固定在絲網印刷電極上，結合流動注射法建立了一種快速而方便的CEA電化學免疫傳感器，CEA檢測的線性范圍為0.50～25μg/L，檢出限為0.22μg/L。該傳感器通過流動注射HRP-anti-CEA，故可以控制乳化時間，并易于自動化。Wang等［20］將聚鳥嘌呤功能化的二氧化硅納米粒子標記壞疽抗體的夾心型傳感器用于壞疽因子的電化學測定，可直接用于生物樣品中壞疽因子的檢測，檢出限為2.0pmol/L。Chen等［21］在玻碳電極表面氣相沉積納米金/硅溶膠，將HRP功能化的hCG抗體固定于其上，建立了一種無試劑的電化學免疫傳感器用于hCG的靈敏檢測，其檢出限為0.3mIU/mL。Wang等［1］對近年來功能化碳納米管在腫瘤標記物上的應用進行了綜述。#p#分頁標題#e#
1．2光學免疫傳感器
由于光學免疫傳感器具有非破壞性操作、快速獲取信號及使用可見光輻射等優勢，故在腫瘤標記物的檢測中占有重要地位。根據其檢測原理，光學免疫傳感器可分為熒光、化學發光和表面等離子體共振等類型。近年來，熒光檢測在臨床診斷和檢測中獲得了很大的進展。Nakamura等［35］結合流動注射系統和陽離子交換樹脂毛細管柱制備了hCG免疫傳感器。利用離子交換柱來分離FITC-IgG和FITC-IgG抗體，然后利用熒光檢測hCG，其線性范圍為25～1500mIU/mL。Yan等［36］將免疫親和反應柱與流動注射體系相連接，然后通過時間分辨熒光免疫檢測法進行CEA的測定(如圖1所示)。納米材料特別是量子點的引入，使熒光型生物傳感器的發展尤為引人矚目，Zhong［37］對近年來基于熒光生物傳感中納米材料的應用進行了綜述。Hong等［38］對納米金、溶劑對熒光團的熒光效應進行了比較研究，發現納米金試劑的熒光增強效應可以使腫瘤標記物的檢出限降低10倍，并且對心血管標記物CRP的檢出限可低至數10pmol?；瘜W發光免疫傳感器多采用直接化學發光、化學發光基底標記和酶標記等3種技術。但大多數化學發光免疫傳感器是利用酶增大檢測信號，并與流動注射系統相結合來提高其檢測自動化性能。Ju等［39］對化學發光免疫傳感器的自動化進行了較多研究，并對近年來電化學發光傳感器在腫瘤標記物方面的應用進行了綜述。
Jie等［40］首次以gold/silica/CdSe-CdS雜交納米結構制備了靈敏的電化學發光生物傳感器，用于測定CEA，獲得了良好的效果。雖然化學發光免疫傳感器的靈敏度高，選擇性好，但是改善腫瘤標記物的固定化技術和傳感器的微型化、集成化仍是化學發光免疫傳感器的發展方向。表面等離子體共振(SPR)是利用金屬膜/液面界面光的全反射來分析生物分子相互作用的一項新興技術，生物傳感芯片是SPR傳感器的核心部分。它對免疫特異識別、蛋白質折疊機理、生物特異相互作用的結合位點及濃度分析上具有獨特的優勢，并且可以獲得很低的檢出限(10－13～10－9mol/L)。可實時監測生物大分子之間的相互作用及其影響因素的作用環節，成為疾病診斷和機理研究的有效工具。Chou等［41］將抗人鐵蛋白單克隆抗體固定在SPR敏感的金表面，建立了人鐵蛋白的SPR免疫傳感器，可以測定非特異性腫瘤標記物人鐵蛋白。Yu等［42］基于表面等離子體的衍射建立了hCG的免疫傳感器。Corso等［43］將抗體通過自組裝膜固定在金表面，建立了一種實時靈敏監測胰腺癌的腫瘤標記物間皮蛋白的聲波免疫傳感器，可以檢測納克級的間皮蛋白(mesothelin)。近年來，諸多研究集中在如何克服SPR傳感器檢測小分子靈敏度低的問題，相信隨著SPR傳感器在腫瘤標記物研究上的深入，其在生物醫學領域的應用將更為廣泛。
1．3質量型免疫傳感器
石英晶體微天平(QCM)型免疫傳感器由于其非標記和實時監測的特點使其在腫瘤標記物的檢測中也有較多應用。Zhang等［44］制備了一種2×5模式的多通道壓電QCM用于檢測血液和尿液中的hCG，其檢測效率高，比單通道檢測的速度快8倍以上。Kim等［45］在微芯片上制備了檢測心血管標記物CRP的QCM免疫傳感器，對CRP的檢測線性范圍寬，達到0.13～25016μg/L，檢出限為0.13μg/L。
1．4免疫傳感器在多分析物同時檢測中的應用
在醫學臨床診斷中，某一種非特異性腫瘤標記物的值升高并不能確診癌癥，常需要進行多個腫瘤標記物的同時檢測，才能獲得準確的診斷結果［1］。Matsumoto等［46］報道了一種利用時間分辨熒光免疫傳感器同時測定α-AFP和CEA，他們采用Eu標記的抗AFP抗體及Sm-標記的親和素來測定α-AFP和CEA，獲得了較低的檢出限，它們的檢出限分別為0.07和0.3μg/L，并在實際樣品的測定中獲得了良好的準確度。Song等［47］用微分析系統熒光免疫傳感器同時測定了CEA、AFP、β-HCG、CA125、CA19-9和CA15-3，均獲得了較寬的線性范圍，對于CEA、AFP、β-HCG為0～640μg/L，對于CA125、CA19-9和CA15-3為0～1280μg/L。Kojima等［14］將捕獲抗體固定在雙層硅氧烷層中，制備了微蛋白質芯片用于AFP和β2-微球蛋白的電化學免疫檢測，由于采用了夾心型的結構，有效降低了酶催化產物的擴散而獲得較高的靈敏度。Wu等［48］用醋酸纖維素共固定硫堇和2種抗原于絲網印刷芯片的碳電極上，用于CA19-9和CA125的電化學免疫測定，其檢出限分別為0.2和0.4U/mL。Fu等［49］采用雙通道體系化學發光免疫同時檢測α-AFP和CEA，對α-AFP和CEA的檢出限分別達到1.5和0.25μg/L。Wilson等［50-52］將微芯片技術與電化學免疫結合，分別進行了CEA、AFP，4種不同的蛋白質及7種腫瘤標記物的同時檢測。他們采用多個IrOx傳感器來降低酶催化產物的擴散，進而在電極上獲得良好的電化學響應，并獲得了較低的檢出限。Qureshi等［53］利用GID電極電容法同時檢測抗CRP、α-TNF和IL6，其檢測范圍為25pg/mL～25ng/mL，為心血管患者提供了良好的前期診斷。能同時檢測多個腫瘤標記物的免疫傳感器及微流控芯片系統的應用，在癌癥的預期診斷方面是現今重點發展的方向。
2適體生物傳感器
核酸適體是一種能夠與蛋白質、小分子、離子、核酸、甚至整個細胞等目標分子結合，通過指數富集的配位系統進化技術(SELEX)經體外篩選的人工合成寡聚核苷酸或肽分子。適配體還具有分子量小、易體外合成和修飾、化學穩定性好等優點，常被稱為“化學抗體”，故一經出現便成為化學工作者用于分子識別和靶標物檢測研究的得力工具，為生物分析方法和傳感器的設計開辟了新的思路［54］。核酸適體可形成一些穩定的三維空間結構，如發夾、假結、凸環和G-四鏈體等結構。分子識別時，在目標分析物誘導下單鏈核酸適體會折疊成特殊的二級結構。常見的適體與靶體之間的作用有單位點結合和雙位點結合(夾心型)2種。研究表明，適配體的結構稍有差異，則靶分子與其結合就受到阻礙［54］。顯然，適體的這些特點對于發展高靈敏、高選擇性和快速高通量的靶標分子分析檢測十分重要，并日漸成為分析化學領域的研究和應用熱點。研究人員已經成功地創建了大量基于核酸適體的分析新方法，包括電化學法、熒光、比色法、壓電和SPR等［55-57］。
2．1電化學適體傳感器
電化學適體傳感器集合了核酸適體和電化學傳感器的優勢，成為近年來的一個研究熱點。在阻抗型電化學適體傳感器中，適體的固定化程序至關重要。通常有混合自組裝膜和在自組裝膜上共價固定等幾種方法。Wang等［58］首次報道了識別誘導表面電荷轉換的FIS適體傳感器。結果表明，如果體系pH低于目標蛋白pI，則蛋白質的識別將扭轉表面電荷狀態，促進電子轉移，因而會降低電荷轉移阻抗。Liao等［59］將適體固定在硅電極表面，用于檢測神經炎細胞因子PDGF，建立了一種無試劑的阻抗生物傳感器，其檢出限達到40nmol/L。Kwon等［60］以抗血管內皮生長因子(VEGF)適體與羧基聚吡咯納米管構建了場效應晶體管用以測定VEGF，其檢出限為400fmol/L，可用于實時檢測VEGF。當核酸適體與特定的蛋白質結合時，有典型的構型變換，而抗體則沒有這樣的性質，利用這個性質可以設計構型變換型適體傳感器。通常，將適體信標的一端修飾官能團用于電極表面的固定化，另一端修飾電活性標記物來產生電信號。電信號的大小是由活性標記物與電極表面之間的距離決定的。Xiao等［61］將亞甲藍標記的抗凝血酶適體固定在電極表面，制備了一種基于電化學開關效應測定凝血酶的生物傳感器(如圖3A所示)，但該種傳感器在靶分子與適體結合后信號減小。為了克服這個問題，Radi等［62-63］設計了另一種開關裝置用于凝血酶的測定(圖3B)。由于四鏈體的形成，二茂鐵與電極之間的距離大大減小而顯示出電化學信號。#p#分頁標題#e#
由于適體的剛性較差，所以存在較大的背景信號，降低了信噪比和檢出限。Zuo等［64］將二茂鐵功能化的抗ATP適體固定在電極表面，在ATP存在下，互補序列解離而與ATP結合成三維的剛性結構，進而二茂鐵與電極表面發生電子傳遞，顯示出開關的作用，ATP的檢測范圍較寬(10nmol/L～1mmol/L)并具有高的靈敏度(圖3C)。Fan等［65］將3'-端連有羧基二茂鐵的發卡式結構DNA探針通過5'-巰基固定在金電極上，根據標記物雜交前后與電極表面距離的變化進行電化學檢測，對目標DNA的檢出限達到1.0×10－11mol/L。他們將該方法應用于PCR擴增產物的研究，該方法具有PCR擴增產物無需后續純化、快速檢測的優點。Chu等［66］提出了基于免疫-RCA的適體電化學傳感器用于PDGF-BB的超靈敏檢測。在電極表面形成抗體-PDGF-BB-適體-引物復合體這樣的三明治結構后，引入一種與引物結合的“C”型掛鎖探針。該方法結合了滾環擴增和酶催化兩步放大，實現了PDGF的超靈敏檢測，下限可達10fmol/L。Huang等［67］采用類似原理將PDGF-BB采用抗體和適體-引物捕獲到電極表面，通過嵌入MB產生電化學響應，其檢測限為18pg/mL。這種基于靶分子的結合而引起構型變換的電化學傳感器，提供了一種無試劑、再生和靈敏的方法用于復雜樣品中目標分析物的檢測。一些平面分子如亞甲藍、Ru(NH3)3+6、功能化二茂鐵等也可以插入雙鏈DNA中并經DNA堿基對π堆積實現電子轉移而被氧化，進而利用特異性序列與蛋白質的作用進行電化學檢測。Jin等［68］利用5'-SH的發卡式結構探針固定于金電極表面，用亞甲基蘭為雜交指示劑檢測P53基因，并對不同位置的單堿基錯配序列進行了研究。該方法無需對發卡式DNA探針進行標記，實驗證明發卡式DNA探針有很高的雜交特異性，可以識別單堿基錯配序列，并且錯配堿基位于環中央時對雜交效率影響最大。
Zhang等［69］在金電極陣列上分別自組裝巰基發卡式DNA探針，采用亞甲藍為雜交指示劑，方波伏安法檢測了人體免疫缺陷蛋白HIV-1和HIV-2，對二者的檢出限均達到了0.1nmol/L。Mir等［70］對凝血酶的不同適體生物傳感器的制備方式對測定結果的影響進行了詳細的比較研究。適體在與靶標分子特異性結合后，其三級結構將發生改變，隨之發生變化的有適體的電荷密度、吸附性質和空間位阻等一系列因素。采用納米材料不僅可以將上述這些變化因素轉化為可檢測的光學、電化學信號，而且還可以提高分析檢測的靈敏度。Numunuam等［71］首次以CdS量子點標記二級適體，建立了夾心型電位法測定蛋白質的電位傳感器，凝血酶的檢出限為0.14nmol/L。Hansen等［72］利用CdS量子點修飾適體建立了7種不同蛋白質的同時電化學檢測，其檢出限為0.5pmol/L，而且具有良好的選擇性。該方法為超痕量的生物標記物的檢測及腫瘤的早期診斷提供了可能。Polsky等［73］利用Pt納米粒子功能化的適配體進行了凝血酶的電化學檢測。由于納米粒子對過氧化氫的催化還原，放大了電信號而使凝血酶的檢測限降低到納摩爾的水平。He等［74］將含有聚腺嘌呤序列的抗凝血酶適配體對納米金予以功能化，然后基于凝血酶與抗體的特異性作用固定在電極表面，然后腺嘌呤核糖酶降解釋放而直接在熱解石墨電極上檢測。由于納米粒子可以載帶較多的適配體，所以檢測靈敏度可以降低至0.1μg/L。Li等［75］在金電極上預先修飾2種分別含有腺苷酸和凝血酶的適體，捕獲探針預先用納米金及硫化物納米粒子固定的DNA鏈雜交，構成了一種夾心型的傳感器用于腺苷酸和凝血酶的陽極溶出伏安測定，其檢出限分別為6.6×10－12和1.0×10－12mol/L。Velasco-Garcia等［76］和Hianik等［77］對適體電化學生物傳感器的研究進展進行了評述，并對其發展前景進行了展望?？偟膩碚f，雖然報道的多種構建電化學適體傳感器的方法獲得了較為滿意的分析性能，但對電化學適體傳感器的分析性能和各項參數的研究和評價還不充分，在實際體系中的應用也還需要拓展。
2．2光學適體傳感器
隨著能與蛋白質等生物大分子特異結合的適體的篩選和發現，基于納米材料的比色技術日漸成為生物大分子識別和檢測的有力工具。由于適體-納米粒子的比色檢測靈敏度高、操作簡單，因而對蛋白質分析和癌癥的診斷具有重要意義。圖4為比色法測定蛋白質的基本原理。Mao等［78］利用分子信標的特異性識別特性和金納米粒子的光學特性，建立了快速、靈敏而價廉的檢測DNA的方法。Liu等［79］報道了一種納米粒子-適體的生物傳感器可直接用于血液中癌細胞拉莫斯細胞的比色法檢測，為循環系統的癌細胞提供了一種快捷靈敏的檢測方法，對癌癥的診斷和治療具有較大的作用。Lee等［80］利用SPR適體生物傳感器檢測視黃醇結合蛋白4(RBP4)用于二型糖尿病的診斷。該種方法避免了傳統免疫學檢測的測定干擾，可直接用于血液中RBP4的檢測。Huang等［81］采用適體-納米金實現了對乳腺癌標志物PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB的檢測，其檢出限均能達到納摩爾水平。Medley等［82］以適體修飾的金納米粒子實現了急性淋巴細胞白血病CCRF-CEM細胞的檢測，并使用伯基特淋巴瘤Ramos細胞做對比檢測，探針對靶標細胞有特異識別，其檢出限為90個癌細胞。該納米比色探針的選擇性和靈敏度令人滿意。與傳統方法相比，比色法用于蛋白質分子檢測有明顯優勢，如所需藥品及材料均較廉價，避免了生物分析中的復雜修飾和分離，不僅保證了適體與靶分子的高度親和性，還極大地簡化了分析檢測步驟，能很好的滿足對現場快速檢測的需求。相信這種方法將以其高靈敏、低成本和較簡便等優勢在生物分析和醫學檢測等領域得到廣泛應用。與比色法相比，熒光法由于靈敏度高、特征參數多、動態范圍寬和適體與納米粒子作用方式靈活多樣等優點，而更具發展潛力。最常見的光學分子信標就是發卡式分子信標，即適體序列的兩端分別標記一個熒光團和淬滅團，當靶分子與特異序列結合后，原本相近的熒光團和淬滅團分開，進而顯示出熒光信號。
另一種是在一個已知DNA序列上分別配合帶有熒光團和淬滅團的DNA序列，當靶分子與適體進行特異結合后，淬滅團序列離開，而顯示出熒光，并用于檢測靶分子［83］。Huang等［84］將與DNA具有親和性的DMDAP加入到PDGF適體修飾的納米金溶膠中發生熒光淬滅，靶分子PDGF的加入使DMDAP釋放到溶液中，進而熒光恢復，實現了對PDGF的熒光檢測，其檢出限可達8pmol/L。量子點與適體的結合則大大提高了其在細胞研究中的功能，為癌細胞的影像診斷技術及細胞內的藥物轉運提供了可能。Bagalkot等［85］發展了由阿霉素、適體和CdSe/ZnS量子點組成的雙熒光共振能量轉移體系，并將其成功應用于體外前列腺癌細胞的影像、治療和藥物運輸。由于熒光檢測法固有的高度靈敏性和多種納米材料技術的使用，熒光生物傳感在生物醫學領域的研究將有更大的發展和應用空間。Zhang等［86］將釕聯吡啶衍生物作為標記物，連接到發卡式DNA上制成電化學發光探針，將其自組裝到金電極上構成新型電化學發光傳感器，根據雜交前后電化學發光信號強度的不同進行目標序列的檢測。實驗結果表明，該發卡式DNA電化學發光傳感器有較高的雜交特異性，能夠識別單堿基和多堿基錯配序列，檢出限為9×10－11mol/L。該傳感器具有較高的檢測靈敏度，且無需對目標分子進行標記，有望應用于疾病檢測等醫學領域。Huang等［87］將含有15個堿基的巰基適體固定在金電極表面，用以結合凝血酶;另以29個堿基的生物素修飾的適體與凝血酶雜交形成夾心型結構。用親和素修飾的量子點對生物素-親和素的作用進行檢測，制備了一種新穎的化學發光適體傳感器。該傳感器對凝血酶的檢測線性范圍為0～20mUg/mL。Pollet等［88］首次將光纖SPR傳感器與DNA適體相結合制備了一種可重復使用、經濟而非標記的適體傳感器用于研究DNA雜交及DNA-蛋白質之間的相互作用。該傳感器不僅可對DNA和蛋白質進行定量，而且還可以用于研究它們結合的動力學常數。#p#分頁標題#e#
2．3質量型適體傳感器
質量型適體生物傳感器是非標記的生物測定技術，包括微波傳感器、石英晶體微天平、表面聲波裝置和微機械懸梁式傳感器。微重石英晶體微天平常用于檢測靶分子與適體之間的相互作用。Tombelli等［89］和Hianik等［90］將生物素化的適體固定在金/石英晶體表面用于測定凝血酶和HIV-1Tat蛋白，其檢出限分別為1nmol/L和0.25μg/L。機械懸梁式生物傳感器具有較高的分辨率和穩定性。Savran等［91］將2個相臨近的懸梁臂上分別功能化相應的適體，一個用ssDNA阻塞，一個用以測定TaqDNA聚合酶。結果表明，聚合酶與適體的結合產生了3～23nm的懸臂彎曲，且彎曲的程度與聚合酶的濃度直接相關。Hwang等［92］用納米機械懸梁式傳感器研究了RNA適體與hepatitisCvirus解螺旋酶的相互作用，對HCV解螺旋酶的檢出限達到100pg/mL。Yang等［93］將含有20個堿基的ssDNA通過巰基固定在金表面制備了懸梁式DNA傳感器，用于研究DNA的雜交。結果表明，該傳感器能區分靶分子并為高通量實時監測DNA提供了可能。Yao等［94］以QCM適體傳感器測定人血漿中的IgE，其線性范圍為2.5～200mUg/L。該傳感器具有較高的特異性、低檢出限、樣品量少的優點，適于特異性蛋白質的檢測。質量型適體生物傳感器與傳統檢測方法相比，不需要任何標記，儀器簡單、操作方便、響應靈敏、選擇性好和便于自動化，將在生物醫學領域的檢測上發揮越來越重要的作用。
納米抗體技術范文5
【關鍵詞】量子點；生物醫學；熒光；納米粒子
1量子點的概念及特性
量子點(Quantum dots, QDs) 又稱半導體納米微晶體，是半徑小于或接近于激子玻爾半徑的一類無機半導體納米粒子，主要由ⅡB - ⅥA (如CdSe，CdTe，ZnSe 等) ，ⅢA-ⅤA( 如InAs，InP 等) 組成的，粒徑在1―10nm，能夠光致發光的半導體納米晶。
QDs具有一般納米微粒的基本性質如表面效應、體積效應和量子尺寸效應,具有寬的激發光譜、窄的發射光譜、可精確調諧的發射波長，正是基于量子點獨特的光學性質使得它克服了傳統的用于標記或衍生的熒光試劑如熒光素類、羅丹明類等有機化合物存在熒光量子產率低、易光漂白及發射光譜寬等缺點。QDs 所具有的優異的光譜性能，在生物化學、細胞生物學、分子生物學、生物分析化學等研究領域顯示出極其廣闊的應用前景，并逐步地應用于蛋白質及DNA的檢測、藥物靶向治療、活細胞生命動態過程的示蹤及動物活體體內腫瘤細胞的靶向示蹤等生物分析與醫學診斷領域，并取得了豐碩的研究成果［1］。
2量子點的應用
2.1 量子點在細胞成像中的應用
對單個活細胞的一些活動進程進行高效、靈敏的監測將有助于闡明一些重要的細胞生理過程和藥物代謝機制，有利于了解生物體的復雜性以及動力學特征。發展特異性和選擇性的QDs 是細胞和生物分子標記的一大挑戰。經巰基乙酸修飾的QDs 連接到轉鐵蛋白上后，再把QDs-轉鐵蛋白同表面存在大量轉鐵蛋白識別受體的HeLa 細胞一起培養，發現其可以被HeLa 細胞表面的受體識別并吞噬進入細胞內部，首次實現了QDs 應用于離體活細胞實驗[2]。Tokumasu等［3］用偶聯了抗體的QDs 標記血紅細胞膜上的Band3 蛋白，實驗中觀察到了Band3 蛋白在細胞膜上的分布，證實了可以通過QDs 的標記觀察在瘧原蟲入侵時紅血球細胞膜的變化情況。Orndorff 等［4］使用具有高親合性的神經毒素修飾QDs，然后標記了內在表達的癌細胞蛋白，揭示了經神經毒素修飾的QDs 可以作為一種鑒定癌細胞存在的評估標簽。
2.2 量子點在活體成像中的應用
Sungjee等人[5] 將量子點注射到小鼠的前肢皮下和豬的腹股溝皮下，通過熒光顯像系統就可以觀察到前哨淋巴結的位置，為外科術中找到前哨淋巴結創造了便利的條件。
Gao等[6]研制了一種多功能QDs 探針，能夠對動物活體內的腫瘤進行靶向并同時成像。該小組用QDs 成功實現了裸鼠前列腺癌模型的非損傷性成像,在活體模型中肉眼即可清晰觀察到腫瘤的部位，這給前列腺癌的診斷和預后的研究開辟了一條新的思路。
2.3 蛋白質研究與分析
QDs在蛋白質檢測與研究中的應用近年來引起了人們很大的興趣。Chan等[7]發現在牛血清白蛋白（BSA）中，多克隆抗體能識別量子點標記的免疫球蛋白（IgG），使QDs聚集在一起；相反，若沒有這種抗體，QDs-IgG 結合體就良好地分散于BSA中。這一試驗結果證明用量子點標記的免疫球蛋白分子（IgG）能識別專一的抗原和抗體。Wang等[8]將紅綠兩種QDs分別標記BSA 和抗牛血清蛋白抗體（IgG），當兩者形成免疫復合物時，BSA上的紅色QDs熒光增強，IgG 上的綠色QDs熒光相應減弱。Ravindran等[9]將QDs用于植物黏附蛋白的定位，并通過與傳統的免疫熒光染色技術的結果相比，證明了QDs在實際應用中的優勢。張雨琴等[10]采用光度法研究了L-半胱氨酸修飾的ZnS納米粒子與牛血紅蛋白的作用及對蛋白質二級結構的影響，拓展了QDs在生物樣品研究中的應用。
2.4 靶向藥物傳輸
癌癥早期檢測治療是目前醫學界的重大課題。如果能夠針對癌癥的特異性分子變化給予有效的診治，將會大大改善治療效果。近年來，新型靶向藥物在臨床實踐中取得了顯著的療效，已表明靶向治療理論的正確性與可行性，把癌癥的治療推向了一個前所未有的新階段。大分子藥物要命中靶標需要有很強的透過和保留在細胞內的能力［11］。Shi等［12］研制出一種具有多種功能的納米組合裝置。這種裝置以納米管為基體，納米管外表面經特殊處理后可偶聯QDs，這種QDs 可應用于體內癌細胞的局部示蹤。由于QDs 發光很強，可用于深度組織的顯像和表征。納米管外表面在經過特殊的等離子體鍍膜后，連接上一種識別癌細胞的抗體，以完成靶向錨定。納米管的空腔用于儲存抗癌藥物，這種抗癌藥物可以被定向地輸送至癌細胞附近，并且可控地釋放，以殺死癌細胞，從而達到局部治療的作用。這種方法明顯優于傳統的全身化療，為靶向藥物傳輸和治療提供了一種新的方法。
3 展望
QDs作為一類較為理想的熒光探針,它在生物醫學中的應用已顯示出誘人的前景。相信隨著QDs 制備和標記技術的不斷成熟,它必將成為新一代生物熒光標記物,在細胞成像、體內成像、疾病診斷以及研究生物大分子之間的相互作用等方面發揮獨特的作用。但要真正實現QDs 在活體的應用,需要解決的問題還很多，如低毒性或生物兼容性QDs性能的問題以及低毒性或生物兼容性QDs應用方面的問題。雖然低毒性或生物兼容性QDs有良好的生物相容性, 安全程度較高, 但是由于其使用過程將涉及到較多的生物環境問題,這些復雜環境將如何對QDs的熒光性能和穩定性產生影響，QDs在生物體內的代謝過程機理又是如何進行的也都需要作更深入的系統研究。隨著量子點科學的進一步發展，量子點的制備工藝也會有更大的提高，量子點與生物醫學之間的關系也必將更加緊密，必將為人類的生命健康事業做出應有的貢獻。
參考文獻
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[10] 張雨琴，張友玉，葉敏，等. 光度法研究L-半胱氨酸修飾的ZnS納米粒子與牛血紅蛋白的作用[J].應用化學, 2008,（9）：1011-1016.
納米抗體技術范文6
關鍵詞 納米技術 腫瘤 治療
羧基磷灰石
近年武漢理工大學李世譜教授發現羧基磷灰石的納米材料可殺死癌細胞，其委托北京醫科大學等權威機構進行了細胞生物實驗。結果表明，該納米粒子可殺死人類肺癌、肝癌、食道癌等多種癌細胞；并且認為納米材料具備殺死癌細胞而不傷害正常細胞的奇特功效，但必須具備2個條件：①納米粒子具備一定的超微尺度，一般在20～100nm之間；②納米粒子要呈均勻分布，才具有藥效［1］。
磁性材料
德國柏林“沙理特”臨床醫院已經嘗試借助磁性納米微粒治療癌癥。研究人員將氧化鐵納米微粒注射到瘤體內，然后置于可變的磁場中，在磁場的作用下氧化鐵納米微?？缮郎刂?5～47℃，這種溫度下完全可以殺滅腫瘤細胞，而周圍的組織中沒有氧化鐵微粒，所以周圍組織不會受到明顯的損傷，這樣便達到了既消滅腫瘤又保存正常組織的目的。
納米藥物
納米顆粒具有表面積大、表面反應活性高、活性中心多、吸附能力強等特性。但目前應用的微囊材料生物相容性差。特別是在肝癌的治療上，目前采用納米級脂質體-碘油乳劑及聚氰基丙烯酸正丁酯納米微粒碘油乳劑，用于肝癌栓塞化療，具有良好的肝靶向性、緩釋性及生物可降解性，還具有抗耐藥性，臨床上用阿霉素納米微粒-碘油乳劑治療肝癌效果良好［2］。
另外，納米粒子作為藥物傳遞與控釋的載體，是一種新的藥物控釋體系。納米控釋系統直徑在10～500nm，可以通過人體最小的毛細血管。其控釋機理可以是藥物通過囊壁瀝濾、滲透和擴散，也可以由基質本身的溶蝕而釋放。該系統具有緩釋性、靶向性、定時性、穩定性等優點，而且可減少藥物使用劑量，減輕或避免其不良反應。
陷阱細胞
Tomalia等采用樹形聚合物形成的納米陷阱。此陷阱為超小分子，能夠在病毒進入細胞前與病毒結合使病毒失去致病力。Tomalia把能夠與病毒結合的硅鋁酸位點覆蓋在陷阱細胞表面，當病毒與陷阱細胞結合后，就不能再感染人體細胞了。陷阱細胞能夠繁殖，生成不同的后代，體積較大的后代能夠攜帶更多的藥物，而且體積越大效果越好。目前體外實驗證明，納米陷阱能夠在流感病毒感染細胞前就捕獲它們。人們期待采用同樣的方法捕獲艾滋病病毒等更復雜的病毒。該細胞是由外殼、內腔和核3部分組成的；其內腔裝載化療藥物，可直接送達腫瘤部位對腫瘤進行局部治療［3］。
納米“智能炸彈”
為了在形成致命性的腫瘤之前早期發現并殺滅癌細胞，美國密歇根大學的Baker博士正在設計一種納米“智能炸彈”，此“智能炸彈”直徑僅有20nm左右，可以識別出癌細胞的化學特征，能夠進入并摧毀單個癌細胞。
納米生物導彈
利用磁性納米微粒表面包覆制造定向醫療藥物已經成為目前醫藥學研究的一個熱點。人們在磁性納米微粒表面涂敷高分子層，再與特殊蛋白及藥物結合，注入生物體后，此藥物載體在外界磁場的作用下，通過磁性導航，到達靶器官或靶部位，此載體如攜帶抗體、受體和核酸等，通過抗原-抗體和受體配體特異性結合，便形成了“生物導彈”［4］，可定向治療癌細胞。
納米機器人
納米機器人也稱分子機器人，它是納米機械裝置與生物系統的有機結合，是納米技術中最具有誘惑力的產品。納米機器人憑借其特有的構造與性質在許多領域都替代了傳統意義上的藥物。如將納米機器人注入血管中，它可以清除血栓和脂肪沉積物；在基因工程領域，它可以從病變基因中去除有害的DNA并把正常的DNA安裝在基因中，使引起癌癥的DNA發生逆轉；納米機器人還可以直接殺滅癌細胞。
納米激光
該技術是新近研究成功的，主要應用于腫瘤的診斷與治療。
參考文獻
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