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細胞研究范文1
體內糖平衡主要由胰島素(INS)控制，胰島β細胞可釋放INS調節餐后的血糖，也可通過β細胞的增長適應長期的INS需求，如果其中任一環節發生障礙，引起絕對或相對INS缺乏，則可引發糖尿病。有關INS的生物合成和釋放調節已進行了廣泛的研究，但對于β細胞再生研究直到近年方引起重視。
非INS依賴型糖尿病(NIDDM)發病機理并不十分清楚。但有證據表明：對葡萄糖的刺激反應INS分泌減少和β細胞增長不足易患此病〔1〕，而老年人存在胰島再生能力低下，可能與糖尿病患病率高有關。Ⅰ型糖尿病是自身免疫引起β細胞損傷，致失代償，此病初發時常有INS的短期恢復，說明缺損的胰島細胞竭力滿足體內INS的需求。研究β細胞增長的調節將有助于了解糖尿病發病機理，對糖尿病的治療也將有重要的意義。本文對β細胞增長的難度，如何增長，調節因素等問題的研究做一簡要綜述。
1 β細胞生長能力與糖尿病
目前常用C57BL/6J小鼠作為研究NIDDM的遺傳性糖尿病動物模型，該種系1988年由美國Duke大學培育成功，為單糖尿病遺傳基因病鼠。此鼠在正常飼料喂養下不發病，在高脂肪(33%)，高單糖(38%)，低纖維素(＜3%)飼料誘導下，經過4 w(由4周齡開始至8周齡)發病。它與C57BL/KSJ鼠種的胰島再生能力不同，即用葡萄糖刺激C57BL/6J小鼠胰島，可增殖的細胞比率較C57BL/KSJ的多一倍。當發病時，C57BL/6J小鼠出現中度糖尿病、INS抵抗、肥胖和胰島過度增生，C57BL/KSJ的早期癥狀與前者相似，但隨后出現重度糖尿病，體重下降，β細胞破壞及死亡，這些觀察表明胰島素細胞再生能力決定了糖尿病的表現形式，支持人類Ⅱ型糖尿病是多因素致病的遺傳觀點。
另有證據表明，NIDDM患者的β細胞總量比相應對照組(體重匹配)少〔1〕。有人提出一種假設，認為肥胖者由于外周INS抵抗，β細胞總量應適應性地增加，假如β細胞沒有增長，INS產生將不足，便會引發糖尿病。由于胰島有生產INS的較大貯備，β細胞的適度減少不會引發糖尿病，然而長期持續增加功能負載，致β細胞總量減少，INS釋放會逐漸減少。另外，胰島也存在質的異常，如NIDDM患者血中INS原/INS比值增高，是否通過β細胞的增殖可遮掩質的異常也是今后寄望的研究課題。由此可見，除了INS分泌、抵抗外，還應研究β細胞的生長能力。
β細胞增長能力與Ⅰ型糖尿病的發病關系不大，它主要因自身免疫損傷胰島，發病初期經歷了INS的合成由增多到減少的變化過程，表明胰島為滿足機體對INS的需求進行了再生的努力，因不能充分代償，必然引發糖尿病。如及時用免疫抑制劑中止β細胞損害，可不致于發生嚴重的糖尿病癥狀。由于β細胞可再生的部分有限，此種治療需在自身免疫損傷β細胞的初期進行。
2 胰島β細胞的生長
人到成年以后，有些細胞仍然進行著細胞分型，如表皮細胞、血細胞，有的不再進行分裂增殖，如神經細胞，即損傷后不能通過增殖來修復；有些細胞正常時并不進行分裂增殖，但當損傷后，細胞可旺盛地進行分裂，達到修復目的，如肝細胞。胰島細胞平時也是處于相對靜止期，并不分裂，但當損傷后需修復時只有很少一部分細胞可以進行分裂，且隨年齡增長，可增殖細胞的部分也逐步減少。
β細胞增殖周期分裂過程同其它細胞相似，由G1期、S期、G2期和M期組成，整個細胞周期時間為14.9 h，平時處于相對穩定的G0期。分析葡萄糖對β細胞增殖的作用，見細胞周期各時期變化與葡萄糖無關，說明葡萄糖是調節部分細胞進入“可增殖部分proliferative compart，PC)”，使之進入細胞循環進行增殖。這與一般的調節機制相同，即進入細胞周期后是由與啟始刺激因子不同的一系列調節物調節。用不同刺激條件觀察細胞周期，可估計最大PC，即能夠再生的部分細胞，胎鼠的胰島約為10%，到成年時減到不足3%，而剩余大部分胰島處于不可逆的G0期，不能進行細胞增殖〔5〕。以上研究說明胰島再生能力受能夠再生細胞的存有量和刺激因子的雙方約束。
3 β細胞的增長方式〔2，3〕
β細胞的增長包括三方面：由β細胞前體衍變，即增生或化生；β細胞體積增大——肥大，β細胞數目增多——再生。
給正常成年大鼠注射鏈脲佐菌素(STZ)破壞胰島，可造成永久性糖尿病模型，而給剛出生的大鼠注射STZ14 d后血糖恢復正常，此時可見管狀上皮存在，含有INS的細胞，另外胰島隨胰管的生長而增長，表明胰島細胞可增生。雖然缺乏β細胞前體的形態標志物，不能直接測定前體，但間接證據表明存在在此過程。
關于β細胞肥大的研究較少，它主要由營養素刺激，適應INS增加的需求，致β細胞體積增大，INS產生增多，但在β細胞生長方面此種方式有限，只是部分質(INS分泌增多)上的修復。
4 β細胞生長的調節因子
4.1 營養素調節 胎兒和新生兒胰島發育變化較大，尤其是出生后受營養素的刺激，在妊娠20 d前的胎鼠胰島主要由混合必需氨基酸刺激再生，葡萄糖不起作用，而妊娠末期為對葡萄糖敏感，氨基酸降到次要地位。此種轉變似乎是為出生后作準備，何種因子調節此變化尚不清楚。氨基酸的促進作用，可持續到成年，但不再起主導作用〔4〕。
D-葡萄糖、D-甘露糖或混合必需氨基酸由β細胞代謝刺激再生，用甘露庚酮糖抑制葡萄糖代謝，刺激作用消失。不能代謝的糖類，如L-葡萄糖、3-0-甲基葡萄糖或果糖不能促進再生。這些研究表明，β細胞再生與INS合成和釋放一樣，與刺激物的代謝相關。也有報道游離脂肪酸可促進再生。
4.2 生長因子的調節 現已知體內含有一組多肽生長因子，其結構與激素相似，通過特異性膜受體傳遞生物學信息，稱之為生長因子。根據生長因子產生細胞和支配細胞間的關系，主要有下列三種模式：(1)內分泌型：產生生長因子的細胞分泌出來的生長因子，通過血液攜帶作用于遠處的細胞；(2)旁分泌型：產生生長因子的細胞分泌出來的生長因子作用于鄰近的細胞；(3)自分泌型：產生生長因子的細胞所分泌的生長因子作用于細胞本身，其本身有相應的受體〔6〕。
生長調節素或INS樣生長因子(IGFs)由生長激素刺激生產和釋放，它通過自分泌或旁分泌機制促進局部細胞增殖。鼠胰島可釋放IGFⅠ和IGFⅡ，外源性IGFⅠ和IGFⅡ的加入促進胰島細胞再生，另外用IGFⅠ抗體可抵消部分生長激素(GH)，促進增殖作用。這些研究表明，IGFs中介了GH促生長作用，INS可與Ⅰ型IGF受體作用促進胰島再生。
血小板衍生長因子(PDGF)和成纖維細胞生長因子(FGF)對某些細胞的作用，可稱為“支配”因子，因它們本身并不進入細胞循環，而是通過其后的“執行”因子，如INS、IGFs或表皮生長因子(EGF)使細胞再生。
4.3 激素的調節 已知生長素(GH)對β細胞再生和INS的合成有促進作用，與此密切相關的催乳素和胎盤催乳素也促進再生，鼠β細胞有催乳素受體，在許多組織GH是通過刺激IGFs的產生和釋放而起到促進細胞增殖效應的〔7〕。
胃腸(GI)肽類激素除調節消化器官本身的活動外，還具有促激素和促生長等生理機能。GI肽類中的胃泌素、縮膽囊素、促胰液素和抑胃肽均刺激INS釋放。有報道促胰液素和縮膽囊素可促進胰島素細胞再生，但此方面的研究較少，需進一步證實。
類固醇激素對胰島作用的研究，體內與體外的實驗結果不一致。體內給予糖皮質激素促進β細胞肥大、增殖、血中INS濃度升高；而體外實驗為糖皮質激素抑制INS釋放和細胞再生，也有報道不抑制，但未證實其促進作用。
4.4 基因的調控 為提高胰島細胞再生能力，許多學者從基因調控方面進行了探索。大鼠經90%去胰島術在數周內發生糖尿病，再用DNA修復酶多聚(ADP-核糖)合成酶抑制劑尼克酰胺治療可誘導胰島細胞再生，減低糖尿病的發病率。已鑒定其作用是由一種僅在增生的胰島表達，而正常胰島不表達的特異再生基因(regenerating gene，Reg gene)所致〔8，9〕，由此生產的Reg蛋白參與β細胞的再生增殖〔10〕。人類Reg基因也已鑒定，其結構同大鼠的相似。另外正常的胰腺泡細胞也可產生Reg蛋白，以前由人體胰石和胰液分離的胰石蛋白(Pancreatic stone protein，PSP)以及由人胰腺分離出的胰線蛋白(Pancreatic thread protein，PTP)均為由Reg基因產生的同一種蛋白〔11，12〕。Reg蛋白的作用可以看作為胰島β細胞的自分泌型生長因子，最近有人觀察到用不同營養因素和激素作用培養的大鼠胰島細胞，可見β細胞的增殖與Reg基因的表達有相關性〔13〕。用Reg蛋白治療90%去胰島大鼠，β細胞增加，血糖顯著降低〔14〕。另外Reg蛋白促進離體β細胞核中3H-TdR的摻入增多。這些結果表明，Reg蛋白有望開辟治療糖尿病的一種新途徑。
另外許多其它因子，如cAMP、胰島素原、糊精、熱休克蛋白(Heat shock protein，HSP)和超氧化物歧化酶均有報道與胰島的修復相關〔3〕。轉貼于 參考文獻
1 Kloppel G，Lohr M，Hablich K et al.Islet pathology and pathogenesis of type Ⅰand typeⅡ diabetes revisited.Sury Synth Path Res，1985；4：10
2 Swenne I.Pancreatic beta-cell growth and diabetes mellitus.Diab-
etologia，1992；35：193
3 河津 捷二，石井 主稅，大野 富雄 et al.胰ヲンダルハンス島β細胞再生.綜合臨床，1994；43(2)：255
4 Swenne I.Glucose-stimulated DNA replication of the islets during develpment of rat fetus.Effects growth hormone and triiodothyronine.Diabetes，1985；34：803
5 Pardee AB.G1 events and regulation of cell proliferation.Science，1989；246：603
6 陳詩書.醫學細胞與分子生物醫學.上海：上海醫科大學出版社，1995：313～330
7 Nielsen JH.Effects of growth hormone，prolactin and placental on insulin content and release and deoxyribonucleic acid synthesis in cultureed pancreatic islets.Endocrinology，1982；110：600
8 Terazono K，Yamamoto H，Takasawa S et al.A novel gene activated in regenerating islets.J Biol Chem，1988；263：2 111
9 Eizirik DL，Sadler S，Palmer JP.Repair of pancreatic β cells.A relevant phenomenon in early IDDM?Diabetes，1993；42：1 383
10 Ishii C，Kawazu S，Tomono S et al.Appearance of a regenerating(reg) gene protein in pancreatic islets of remissinon BB/Wor/Tky rats.Endocrine J，1993；40：269
11 Gross J，Carlson RI，Brauer AW et al.Isolation，characterization and distribution of an unusual pancreatic human secretory protein.J Clin Invest，1985；76：2115
12 De Caro A，Boncel J，Rouimi P et al.Complete amino acid sequence of an immuoreative form of human pancreatic stone protein isolated from pancreatic juice.FEBS，1987；188：201
細胞研究范文2
1DPSC的定義和基本生物學性質
成牙本質細胞是一種終末細胞，不具備進一步分化的能力，因此，一般認為成牙本質細胞在遭受損傷后，牙髓內的某些具有分化功能的前體細胞可進一步分化為成牙本質細胞，并分泌相關細胞基質，修復受損組織，這種前體細胞即為DPSC。DPSC具有較強的增殖能力和較高的分化潛能，正是這兩種生物學性質，決定了DPSC在牙源組織修復和骨性修復方面具有重要的作用〔2〕。Gronthos等〔3〕在2000年首次正式提出了DPSC的概念，把牙髓內可以快速增殖并且具有一定克隆形成能力的牙髓細胞命名為DPSC，研究人員應用酶消化法對成人第三磨牙的牙髓細胞進行培養，并與骨髓間充質干細胞進行比較，結果顯示:這兩種細胞具有極為相似的免疫學特性，并且，該研究進一步證實DP-SC經體外誘導后，可形成高密度的鈣化小結，將DPSC與羥基磷灰石/磷酸三鈣(HA/TCP)支架復合后移植到小鼠背側皮下，經過一段時間后，能觀察到類似于牙本質-牙髓復合體樣的結構。
2DPSC的多向分化潛能
作為一種成體干細胞，DPSC具備多向分化的潛能，這種潛能不僅僅局限在骨性分化方面，研究人員在成脂分化、神經分化等方面均取得了一定的研究成果，在再生醫學研究領域有著重要的指導意義。
2.1DPSC的骨性分化DPSC的骨性分化是關于DPSC定向分化研究較早的一項內容，近些年來，又有了進一步的發展。Mori等〔4〕采用成骨分化培養基進行對DPSC的骨性誘導分化，結果發現，某些典型成骨細胞基因，如:堿性磷酸酶、I型膠原、骨橋蛋白等均大量表達;應用微陣列及RT-PCR技術進一步研究發現，在成骨分化過程中，胰島素樣生長因子結合蛋白5基因(IGFBP-5)、JunB原癌基因(JUNB)和核受體相關基因(NURR1)均發生表達上調現象，這一機制在成骨分化過程中有著重要的意義。D''''Alimonte等〔5〕在人源DPSC正常成骨誘導過程中，加入血管內皮生長因子，結果顯示:這種方法可以刺激DPSC的增殖分裂的速度加快，而且促進了成骨分化的進程。
2.2DPSC的神經分化DPSC來源于胚胎時期的神經脊，在神經分化方面具備一定的潛能。Király等〔6〕采用低溫損傷的方法制備3日齡Wistar大鼠腦缺損模型，于顱內注入DPSC進行修復，研究發現:DPSC趨向分布于室下區、胼胝體下區等神經系統祖細胞區，并表達微管蛋白(N-tubulin)、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)等神經細胞標志，對損傷部位有一定的修復作用，并且具有神經系統相關細胞的電壓依從性。因此，該結果進一步顯示，DPSC在腦損傷體內修復方面，可以作為一種有效的修復細胞。Karaz等〔7〕研究表明:DPSC不僅可以分化為神經干細胞，而且在分化能力方面，高于傳統的骨髓間充質干細胞。
2.3DPSC的成脂分化除成骨分化、神經分化方面，成脂分化也是DPSC的一項重要潛能。Nozaki等〔8〕于成脂培養基中加入胰島素、地塞米松等誘導成脂，經過一段時間的作用，可見細胞中有脂滴的形成，并且在分化過程中多能性標記轉錄因子(Oct3/4、Sox2)均呈現下調趨勢，Nanog基因無顯著變化;通過基因微陣列分析，研究人員進一步發現:過氧化物酶體增生物激活受體信號通路的多種組分，均發生變化。所以，對這些基因的調控，在細胞成脂分化過程中有著重要意義。
3DPSC的分化誘導因素
在細胞分化的過程中，分化方向、分化程度、分化速度均會受到一系列物化因素、生物因素的影響，協調各方面因素對控制細胞定向分化有著重要意義。Ito等〔9〕將犬類的DPSC與不同的支架材料相結合，并用這種結合物治療骨缺損，結果發現不同的支架材料，修復效果會有較大差異，其中DPSC/富血小板血漿(PRP)復合物具備較好的修復效果。Galler等〔10〕將DP-SC接種于水凝膠支架上，并將復合物移植到經過次氯酸鈉(NaClO)、乙二胺四乙酸(EDTA)處理過的牙本質內部，培養6w后，發現經NaClO處理的牙本質與復合物結合較好，接觸面形成大量細胞陷窩;經乙二胺四乙酸(EDTA)處理的牙本質可以誘導進一步DPSC向成牙質細胞分化，進一步表達牙本質涎蛋白，提高牙本質的修復速度。Yang等〔11〕以大鼠DPSC為研究對象，在常規成骨分化培養基中添加白細胞介素β(IL-1β)，結果顯示，細胞的骨唾液蛋白、牙本質基質蛋白等礦化物質的表達均上調，體內實驗也得到了相似結果，可見，IL-1β在成骨礦化過程中有一定的促進作用。骨形態發生蛋白在誘導成骨方面有著重要作用，Liu等〔12〕分離擴增家兔DPSC后，將這種種子細胞接種在羥基磷灰石、膠原等支架材料上，并用骨形態發生蛋白II進行刺激處理，結果成骨速度明顯提高，最后制備的復合物更有利于體內移植和組織修復。
4DPSC的重編程與再分化
2006年，Takahashi等〔13〕將4個轉錄因子(Oct4，Sox2，cMyc和Klf4)導入已處于終末分化狀態的小鼠成纖維細胞中，從而獲得了一種類似于胚胎干細胞的多能性細胞，稱為“誘導性多能干細胞”(inducedpluripotentstemcells，iPScells)。這種方法可以非常穩定的制造多能干細胞，引起了極大的關注。繼此之后，人類體細胞被成功誘導為iPS的報道〔14〕和老年人皮膚成纖維細胞被誘導為iPS細胞亞群的報道〔15〕相繼出現，這種細胞被認為是一種極具前景的干細胞。體細胞通過一定誘導方式，轉變為iPS細胞亞群的過程稱為“重編程”;iPS經過定向誘導，再次分化為其他種類細胞的過程，稱為“再分化”。DPSC作為一種可以快速自我更新的成體干細胞，同樣具備重編程和再分化的潛能。Yan等〔16〕采用逆轉錄病毒介導法，將4個因子(Lin28/Nanog/Oct4/Sox2或c-Myc/Klf4/Oct4/Sox2)導入DPSC中，將DPSC重編程為iPS細胞亞群。DPSC來源的iPS細胞亞群表達階段特異性胚胎抗原-4(SSEA-4)、腫瘤壞死因子受體相關蛋白(TRA)-1-60、TRA-1-80、TRA-2-49、Nanog、Oct4、Sox2等表面標記，具備多向分化的潛能，可分化成3個胚層的組織，而且可被定向誘導分化為神經干細胞和神經元。Tamaoki等〔17〕對多株DPSC進行重編程誘導，結果顯示不同株的DPSC在重編程效率方面會有很大差別，不同株DPSC來源的iPS細胞亞群的再分化能力也有較大不同。因此，建立一種高效安全的重編程模式和再分化方法，仍是干細胞領域的研究熱點。
細胞研究范文3
【關鍵詞】肺癌;干細胞;腫瘤干細胞
【中圖分類號】R725【文獻標識碼】A【文章編號】1005-0515(2011)02-0227-02
目前，肺癌已成為世界上發病率和死亡率增長最快，嚴重危害人類健康和生命的惡性腫瘤，5年生存率低于15%?？茖W家們通過總結大量腫瘤細胞和干細胞的生物學相似性后，提出“腫瘤干細胞” (TSC)理論。該理論的提出為肺癌的治療帶來曙光。
1 干細胞
干細胞(SC)是指具有自我更新和分化潛能的細胞。干細胞的自我更新和分化在其內在機制和周圍環境中的信號調控下處于動態平衡狀態,維持了干細胞的數量穩定。一旦干細胞發生基因突變或信號傳導途徑發生錯誤,將導致這一平衡被打亂,引起高度協調的干細胞分裂增殖過程失調,導致腫瘤發生。
2 腫瘤干細胞
2001年，科學家們提出了TSC理論，認為腫瘤組織由異質性的細胞群體組成，其中很小部分細胞具有干細胞特性，決定腫瘤的發生、侵襲、轉移、播散和對各種治療是否敏感[1~3]。TSC的最早報道見于白血病。Ai-Hajj等發現乳腺癌干細胞,首次證明了在實體瘤中TSC的存在。目前已成功分離并鑒定的實體TSC包括腦腫瘤、結腸癌、前列腺癌、黑色素瘤及胰腺癌等,肺癌TSC的研究也取得很大進展。
3 肺癌干細胞
3.1 肺癌干細胞的發現 2005年Kim等從大鼠細支氣管、肺泡管結合部分離出Sca-1+CD45-Pacam-CD34- 細胞,其有很強的自我更新和分化能力, 稱之為支氣管肺泡干細胞(BASCs)，并認為BASCs可能是肺腺癌的起源細胞。2006年,黃盛東等發現,A549細胞懸浮培養可形成3種類型的克隆集落,其中Holoelone型克隆體具有干細胞特性。2007年,Summer等從鼠的肺組織中分離出肺內源的間充質干細胞。Ho等發現肺癌SP細胞較非SP細胞具有更強的致瘤性, 表達乳腺癌耐藥蛋白(ABCG2)等多種ABC家族膜轉運蛋白。Eramo等在人的肺癌組織中發現一群具有自我更新、多向分化能力的CD133+細胞，其具有腫瘤細胞的惡性特征，被命名為肺癌干細胞。
3.2 肺癌干細胞的分選方法:肺癌干細胞的分選主要采用三種方法:A.應用細胞表面特異性標記進行分選;B.根據SP表型進行TSC的分選;C.利用干、祖細胞中ALDH的含量較高進行分選。
細胞表面標志物是分選肺癌腫瘤干細胞的關鍵。Kim等應用流式細胞儀分選出Sca+/CD45-/Pecam-/CD34+的支氣管肺泡干細胞，肺腺癌腫瘤干細胞亦存在與BASCs相似的表面標志物。另一表面標志物是CD133。Eramo等發現CD133+細胞在肺癌標本中普遍存在，但含量較低?？茖W家們還發現，CD133+肺癌細胞可無血清懸浮培養，含血清培養出現分化； CD133+細胞比CD133-細胞更易形成與原發瘤表型一致的腫瘤，更具耐藥性。上述研究顯示CD133+細胞可能包含了肺癌干細胞，且和肺癌化療耐藥密切相關。但Meng等[19]對肺癌細胞株中的CD133+及CD133-細胞進行對比，發現二者均可形成移植瘤，故CD133+細胞是否代表肺癌干細胞，仍存在爭議。
人們發現造血干細胞具有將熒光染料泵出細胞外的特性,即SP特性[23]。目前利用這一特性進行純化 已成為一種常用的分離方法。SP細胞表面表達ABCG2等ABC家族膜轉運蛋白,因此,也可應用ABCG2作為標記分選TSC。
利用干、祖細胞中ALDH的含量較高進行分選肺癌干細胞。在造血系統、神經系統的干、祖細胞、乳腺癌中ALDH含量很高。在乳腺癌中發現ALDH1+腫瘤細胞具有干細胞特性，且與乳腺癌不良預后相關。美國學者應用流式細胞儀從人類肺癌細胞系中分選出ALDH1陽性細胞，發現其具備諸多干細胞特征，并表達CD133，并與肺癌患者的預后呈負相關。
3.3 肺癌干細胞的鑒定方法:目前研究認為TSC鑒定必須通過一些經典的干細胞實驗進行鑒定。自我更新是干細胞的三大重要特性之一,如 CD133+肺癌細胞能夠在含生長因子的無血清培養基中以細胞球的方式懸浮生長,這是鑒定其具有自我更新的能力,也是鑒定其是為TSC的重要方法。致瘤能力是鑒定TSC的最重要環節,目前多通過裸鼠致瘤實驗進行檢驗。分化潛能是TSC的重要特征之一，可通過單克隆實驗進行檢驗,以此鑒定其干細胞特性。
4 肺癌干細胞的展望
進入21世紀以來，肺癌的治療已經進入分子時代,對肺癌干細胞的研究越來越受到重視。直接靶定肺癌干細胞，通過尋找特異性的表面分子標志識別肺癌干細胞，制備單克隆抗體，攜帶放射性物質或化療藥物，靶向放化療，最終促使肺癌干細胞凋亡，使腫瘤失去生成新的腫瘤細胞的能力，爭取達到根治的目的。這些方法將為肺癌的治療帶來了新的曙光。
參考文獻
[1] Reya T.Stem cells,cancer,and cancer stem cells.Nature 2001;414(6859):105~111
[2] Wicha MS,Liu S,Dontu G.Cancer stem cells:an old idea a paradigm shift Cancer Res 2006;66(4):1883~1890
細胞研究范文4
1結果與分析
1．1預處理和制片條件采用4種低濃度預處理液：0．02％秋水仙素、0．05％秋水仙素、0．002mol／L的8－羥基喹啉水溶液、0．02％秋水仙素與0．002mol／L8－羥基喹啉的混合液，預處理1、2、3、4h。結果表明，4種預處理液中以0．05％秋水仙素、0．02％秋水仙素與0．002mol／L8－羥基喹啉的混合液作用效果較好，預處理時間1、2h時分裂相多處于前期和前中期，3h時中期分裂相較多且縊縮程度恰到好處，4h時染色體縊縮為難以計數的小點狀。此外，預處理時應保持穩定的低溫環境，溫度穩定在18～20℃時，中期分裂相較多，而在不穩定的條件下分裂相較少。因試驗材料為木本植物，所需解離時間較長，解離20min以下時胞質和染色體均染色較深；解離30min以上時均著色很淺；解離25min時，解離較充分，染色效果最好，胞質不著色或呈淡紅色，而染色體著色較深。本試驗最終確定野牡丹屬植物預處理和制片條件為環境溫度穩定在18～20℃，使用0．02％秋水仙素與0．002mol／L8－羥基喹啉的混合液預處理3h，解離25min。
1．2染色體數目從每個種的7～8個樣品的根尖中選取4～5張質量較好的壓片，選擇染色體染色清晰、分散較好的30個細胞進行觀察、記數。發現5個種的細胞染色體數雖然均有一定的變化范圍，但基本都集中在一個數量上，因此將出現頻率最高的這個數量作為該種的染色體數目。如表1所示，野牡丹2n＝24占70．0％，細葉野牡丹2n＝24占60．0％，多花野牡丹2n＝24占66．7％，地菍2n＝24占63．3％，展毛野牡丹2n＝24占86．7％。由此可認為，野牡丹、細葉野牡丹、多花野牡丹、地菍、展毛野牡丹染色體數目均為2n＝24。每個種中還有其他較小比例的染色體數目，這可能與野牡丹屬的無性繁殖存在染色體數目的變異或染色體過小有關。
1．3染色體大小野牡丹、細葉野牡丹、多花野牡丹、地菍、展毛野牡丹染色體組總長度分別為27．86、23．44、17．09、39．86、46．84μm；絕對長度范圍依次為0．82～1．67μm、0．71～1．45μm、0．43～1．26μm、1．01～2．36μm、1．49～2．99μm；相對長度為2．93～5．67、3．09～5．87、2．64～7．14、2．62～5．92、3．18～6．12，最長染色體與最短染色體的比值為2．0、2．0、2．9、2．3、2．0。
2結論與討論
本研究中，野牡丹屬的5個種染色體數均為2n＝24，這與Almeda［7］所研究的野牡丹科其他屬的染色體可能為n＝9到n＝12基本一致。根據染色體分類的標準［8］，野牡丹、細葉野牡丹、多花野牡丹、地菍、展毛野牡丹均為小染色體類型，不易分辨著絲點，無法作核型分析。目前，對小染色體尚無明確的分析標準，Almeda［7］在對野牡丹科其他屬植物的研究中，只分析了小染色體減數分裂的行為，但未作具體分析。最長染色體與最短染色體的比值可作為核型對稱與否的分類標準之一［9］，本研究中野牡丹屬5個種的比值為2．0～2．9，說明野牡丹屬的核型比較對稱。根據李懋學［8］的染色體相對大小差別愈大，核型越不對稱的觀點，比較5個種的染色體相對長度的標準差，野牡丹為0．86、細葉野牡丹為0．92、多花野牡丹為1．21、地菍為0．84、展毛野牡丹為0．87，說明5個種中地菍的核型較對稱，而多花野牡丹的核型對稱性較差。由于整個植物界的核型進化趨勢是由對稱向不對稱發展，所以可認為5個種從原始到進化的順序可能為：地菍、野牡丹、展毛野牡丹、細葉野牡丹、多花野牡丹。
細胞研究范文5
【關鍵詞】 肝，人工；肝/細胞學；肝細胞株；永生化程序
0引言
肝細胞是生物人工肝支持系統的核心原材料，生物人工肝對肝衰竭患者的肝支持作用依賴于所用肝細胞的生物學功能. 無論是動物肝細胞還是人肝細胞，在體外培養時均存在生長條件要求嚴格、存活時間有限、傳代困難等缺點. 采用永生化程序建立肝細胞株就成為解決生物人工肝細胞來源的重要途徑，而永生化的人肝細胞株則可為生物人工肝提供取之不盡的細胞源. 現就這一方面的研究進展綜述如下.
1腫瘤來源的肝細胞株
腫瘤來源的肝細胞株是指由腫瘤組織分離、克隆而來的具有某些正常肝細胞功能的細胞株. 其中HepG2細胞具有某些類似于正常肝細胞的代謝解毒功能，但細胞的分化功能和分化程度均較低. Khalil等［1］發現，將HepG2細胞包裹于海藻酸珠內，形成內聚性球形集落后可培養20+d，其合成與解毒功能均顯著加強，細胞增殖明顯，活力顯著增強，白蛋白、纖維蛋白原、凝血酶原等成倍增加，細胞色素P450活性顯著高于單層培養(4倍以上)，雄烯二酮代謝的5種酶活性明顯上調. 形態觀察見HepG2細胞在海藻酸鹽珠內增殖成內聚性集落，保持正常的細胞形態與結構. 最近，他們利用HepG2細胞(包裹于海藻酸珠內)構成的生物人工肝治療兔肝衰竭模型，顯示能有效地改善其肝衰系統參數(如舒張壓、血氧飽和度等)［2］.
考慮到生物人工肝所用細胞材料的轉化代謝功能較生物合成尤為重要，特別是在治療肝性腦病中，去除血氨的作用更為關鍵. Omasa等［3］將構建的谷氨酰胺合成酶(GS)基因質粒導入無氨清除能力的HepG2細胞，用含甲硫氨酸亞楓(MSX)的培養液選擇性培養，獲得新的MSX抗性GSHepG2. 該細胞株的氨清除能力可達原代肝細胞的四分之一，若提供適量鋅離子可使其氨清除能力進一步提高近50%. 并且可在循環流式反應器長期培養，細胞數量由107增至109，去氨能力大大增強［4］. GSHepG2細胞型生物人工肝可明顯延長肝衰竭動物的存活時間，并可用于長期反復治療［5］. 另外，Yang等［6］將連接蛋白32(Cx32)基因轉染到HepG2細胞內，使新的細胞株之間的縫隙連接加強，同時也使其白蛋白分泌和氨清除能力提高2倍以上. Naiki等［7］利用腺病毒將肝細胞核因子4(HNF4)基因導入無氨清除能力的細胞. 在新的細胞中，細胞色素P450、谷氨酰胺合成酶、α抗膜蛋白酶、載脂蛋白等基因的表達增加，特別是其氨清除能力提高明顯.
C3A細胞是從肝母細胞瘤分離獲得的類似但分化程度高于HepG2的肝細胞株，在空心纖維生物反應器中接種2gC3A細胞，可在1周內增殖到200 g，并具有良好的肝細胞特異功能. 但與豬肝細胞相比，C3A細胞株的P450IA1活性、氨清除以及氨基酸代謝等均較低. Filippi等［8］研究顯示，利用UoE培養基預處理的C3A后，能顯著提高其尿素、白蛋白、葡萄糖等的合成以及半乳糖的清除能力. C3A是目前唯一用于人工肝臨床研究的肝腫瘤細胞株，且己有10年之久，取得了較好的效果［9］，但至今未能進一步擴大應用，可能仍主要與安全考慮有關. 除了上述細胞外，腫瘤來源肝細胞還有HuH6， JHH2等，也開始了用于生物人工肝的基礎研究［10］，二者均能高分泌AFP，白蛋白，表達鳥氨酸氨甲?；D移酯mRNA和乙醇脫氫酶mRNA.
2病毒轉染的肝細胞株
病毒轉染是建立細胞株的常用方法之一，但所建細胞株的腫瘤性質較為突出. OUMS29是一株人胎肝細胞轉染PSV3neo質粒獲得的含有SV40LargeT腫瘤抗原(SV40Tag)的肝細胞株，表達許多特殊肝臟功能的基因，可明顯降低血氨水平，改善肝性腦病，能夠為急性肝衰竭模型動物提供代謝支持作用，提高短期生存率［11］. OUMS29細胞株移植入裸鼠并未顯示惡性特征，無轉移瘤形成，相比之下HepG2細胞可在2 wk內引起裸鼠多發性腫瘤，說明OUMS29細胞的惡性程度較低. 新近，Kobayashi等［12］為了使OUMS29細胞更接近于臨床應用的要求，成功地通過逆轉錄病毒介導基因釋放的方式，將單純皰疹病毒胸苷激酶(HSVTK)自殺基因(suicide gene)轉入OUMS29細胞，形成一種新的OUMS29/TK細胞，該細胞株具有高分化的肝細胞功能，在無血清培養基中生長良好，具有肝實質細胞的特征. 此外，采用MTT法檢測發現該細胞對GCV(ganciclovir)的敏感度是OUMS29細胞的100倍. 作者認為OUMS29/TK細胞嚴格調控，具有無限活性，有可能用于生物人工肝.
盡管SV40Tag轉染的肝細胞株能提高外科型急性肝衰竭鼠的存活率，能防治門腔靜脈分流模型鼠血氨升高所致的肝性腦病，可糾正Gunn鼠膽紅素結合缺陷. 但SV40Tag長期存在于永生化的肝細胞可增加移植受體腫瘤轉移生長的危險性. 為克服這一缺陷，Cai等［13］對SV40Tag轉染細胞株的建立方法進行了改進，建立了新的病毒轉染肝細胞株CB8. 建株方法的第一步是將含SV40Tag單純麻疹病毒胸昔激酶和潮霉素抗性基因側面連接LoxP位點的重組SSR69逆轉錄病毒導入鼠肝細胞；第二步再用含有基因編碼Cre重組酶的重組腺病毒(AdCre)，在特殊位點重組而將SV40Tag切除. 在第一步完成后，肝細胞得以永生化. 當SV40Tag被Cre重組酶切除后，細胞停止生長，DNA合成下降90%，多種肝特殊性mRNA表達出現或增多，形態和細胞極性表現出更多的分化肝細胞特征，在免疫嚴重缺陷鼠體內形成的腫瘤停止生長. 這種通過切割有害基因的辦法，為肝細胞株的應用提供了新的安全保障.
Hep Z細胞株也是從肝活檢標本中分離、經轉染獲得的人肝細胞株，該細胞株具有細胞色素P450活性等肝細胞特異性代謝功能，能永久傳代且增殖能力強. 最近，Werner等［14］采用旋轉培養系統和生物反應器分別對Hep Z細胞進行了大孔明膠型CultiSpher G微載體大量高密度培養，研究結果顯示永生化的Hep Z細胞具有原始的肝細胞代謝功能，可大量培養，適用于生物人工肝系統.
3可恢復性肝細胞株
近年來，國外學者設計了一種可恢復性永生化程序，為解決細胞材料問題提供了新的思路及手段. 其基本原理實際上就是前述Cai等建立CB8細胞株的思路，即是先將永生化基因SV40T導入原代細胞以獲得永生化細胞株，使其獲得體外增殖能力，然后再以特異性位點重組技術切除SV40T基因，使細胞株恢復到永生化前的狀態. 如Kobayashi等［15］對原代成人肝細胞進行可逆性永生化程序，建立了一株可恢復性的永生化肝細胞NKNT3(reverted NKNT3)，引起同行的極大關注，有可能為生物人工肝支持提供用之不竭的肝細胞材料［16］. NKNT3細胞很大程度上與CB8相似，系將連接有LoxP重組靶基因的SV40T逆轉入正常原代人肝細胞而建立的，NKNT3細胞具有肝實質細胞的形態學特征，可表達SV40T，可在體外進行永生化培養. 盡管NKNT3細胞株也保持了表達肝臟代謝的關鍵基因(谷酰胺合成酶、GST等)，但當切除了SV40T基因后，上述基因的表達水平戲劇性地增加，而且也只有當SV40T切除后該細胞株的白蛋白、人血凝血因子ⅩmRNA才能檢測出來. NKNT3細胞對SCID小鼠無致瘤作用. 經能表達Cre重組酶的復制缺陷重組腺病毒轉導，NKNT3不再表達SV40T，且分化程度更高，核漿比及胞漿顆粒類似肝細胞. 動物實驗己經顯示將NKNT3細胞植入90%肝切除大鼠的脾臟可顯著改善其生化指標與臨床表現，殘余肝葉增大并示明顯肝再生，脾臟“肝化”，存活率達60%(空白對照組模型大鼠全部死亡). 他們在NKNT3細胞的基礎上，將p21基因導入細胞內使細胞在GO/G1阻滯，進一步改善了肝細胞表型，提高了白蛋白和細胞色素P450的表達［17］. 同時，他們用幾乎相同的方法構建了可恢復性人內皮細胞株HNNT2［18］和肝星型細胞株TWNTs， TWNT1和NKNT3細胞共同培養時可以加強NKNT3細胞的細胞素色P4503A4和2C9的表達［19］. 可恢復性NKNT3細胞良好的肝細胞功能和無致瘤及致病毒感染之慮，再加上可復性的肝非實質細胞株共同培養，將在今后生物人工肝中有著良好應用前景.
參考文獻
［1］ Khalil M， ShariatPanbi A， Tootle R， et al. Human hepatocytes cell lines proliferating as cohesive spheroid colonies in alginate markedly upregulate beth synthetic and detoxificatory liver function ［J］. J Hepatol， 2001，297:68-77.
［2］ Rahman TM， Selden C， Khalil M， et al. Alginateencapsulated human hepatoblastoma cells in an extracorporeal perfusion system improve some systemic parameters of liver failure in a xenogeneic model ［J］. Artif Organs，2004，28(5):476-482.
［3］ Omasa T， Yamanaka M， Tanimura N， et al. Expression and amplification of glutamine synthetase gene endows HepG2 cells with ammoniametabolizing activity for bioartificial liver support system ［J］. Enzyme Microbial Technol， 2004，35:519-524.
［4］ Enosawa S， Miyashita T， Suzuki S， et al. Longterm culture of glutamine synthetasetransfected HepG2 cells in circulatory flow bioreactor for development of a bioartificial liver ［J］. Cell Transplant，2000，9:711-715.
［5］ Enosawa S， Miyashita T， Fujita Y， et al. In vivo estimation of bioartificial liver with recombinant HepG2 cells using pigs with ischemic liver failure ［J］. Cell Transplant，2001，10:429-433.
［6］ Yang J， Ichikawa A， Tsuchiya T. A novel function of connexin 32: Marked 6 enhancement of liver function in a hepatoma cell line ［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2003，18:307(1):80-85.
［7］ Naiki T， Nagaki M， Shidoji Y， et al. Functional activity of human hepatoma cells transfected with adenovirusmediated hepatocyte nuclear factor (HNF)4 gene ［J］. Cell Transplant， 2004，13(4):393-403.
［8］ Filippi C， keatch SA， Rangar D， et al. Hayes PC， Plevris JN. Improvement of C3A cell metabolism for usage in bioartificial liver support systems ［J］. J Hepatol， 2004，41(4):599-605.
［9］ Demetriou AA， Brown RS Jr， Busuttil RW， et al. Prospective，randomized，multicenter， controlled trial of a bioartificial liver in treating acute liver failure ［J］. Ann Surg， 2004，239(5):660-667; discussion 667-670.
［10］ Kobayashi N， Miyazaki M， Fukaya K， et al. Establishment of a highly differentiated immortalized human hepatocyte cell line as a source of function in the bioartificial liver ［J］. Transplant Proc， 2000，32:237-241.
［11］ Kobayashi N， Miyazaki M， Fukaya K， et al. Transplantation of highly differentiated immortalized human hepatocytes to treat acute liver failure［J］. Transplant， 2000，69:202-207.
［12］ Kobayashi H， Noguchi H， Watanabe T， et al. A tightly regulated immortalized human fetal hepatocyte cell line to develop a bioartificial liver ［J］. Transplant Proc， 2001，33:1948-1949.
［13］ Cai J， Ito M， Westermam KA， et al. Construction of a nontumorigenic rat hepatocyte cell line for transplantation: Reversal of hepatocyte immortalization by sitespecific excision of the SV40T antigen ［J］. J Hepatol， 2000，33:701-708.
［14］ Werner A， Duvar S， Muthing J， et al. Cultivation of immortalized human hepatocyte cell line HepZ on macroporous CultiSpher G microcarriers ［J］. Biotechnol Bioeng， 2000，68:59-70.
［15］ Kobayashi N， Fujiwara T， Westerman KA， et al. Prevention of acute liver failure in rats with reversibly immortalized human hepatocytes ［J］. Science， 2000，287:1258-1262.
［16］ Guha C， Chowdhury NR， Chowdhury JR. Reversibly immortalized human hepatocytes: An eternal fountain of liver support［J］? Hepatology， 2000，32:440-441.
［17］ Kunieda T， Kobayashi N， Sakaguchi M， et al. Transduction of immortalized human hepatocytes with p21 to enhance differentiated phenotypes［J］. Cell Transplant， 2002，11:421-428.
［18］ Noguchi H， Kobayashi N， Westerman KA， et al. Controlled expansion of human endothelial cells bv Cre/loxPbased reversible immortalization［J］. Hum Gene Ther， 2002，13:321-334.
細胞研究范文6
【關鍵詞】小鼠GVHD模型;T淋巴細胞；增強型綠色熒光蛋白；巨噬細胞炎癥蛋白
MigrationandDistributionofAllogeneicTLymphocytesinOrgansofGraft-Versus-HostDiseaseMouseModel
AbstractThisstudywasaimedtoinvestigatethemigrationanddistributionprocessesofallogeneicdonorTlymphocytesintheorgansofrecipientmice.GVHDmodelwasestablishedbytransfusionofthesplenocytesofeGFPtransgeneicC57BL/6micetogetherwithbornmarrowcellsharvestedfromC57BL/6miceintoBALB/cmiceunderwent8.0Gytotalbodyirradiation.ThemigrationandhomingofeGFPcellsweretrackedbystereo-fluorescentmicroscopyorinvertedfluorescentmicroscopyandflowcytometry.Theenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)wasperformedonsupernatantsfromthetissuehomogenatestodetecttheamountofMIP-1α.TheresultsindicatedthatGVHDclinicalmanifestationandpathologicalchangesoforgansappearedonday8posttransplantation.eGFP-positivedonorTcellsinrecipientorganswereobservedbyinvertedfluorescencemicroscopeinfrozensection,orbystereo-fluorescencemicroscopyinlivingorgans,suchasliver,spleen,skin,lungs,bowels,andtongue.ThehighestexpressionofMIP-1αwasonday7posttransplantationintheliver(491.3±32.1pg/ml),andday3posttransplantationinthespleen(881.5±45.2pg/ml)，respectively(P<0.05).ItisconcludedthatGVHDwasinducedbysplenocytesofeGFPtransgeneicC57BL/6mice.eGFPcellsintheorganscanbeobservedbyfluorescentmicroscopy.InthisGVHDmodel,donorTcellsproliferateandinfiltrateinliver,skin,bowels,aswellaslungsandtongue.MIP-1αmaybeinrelationwiththeinfiltrationofTlymphocytesinliverandspleen.
KeywordsmurinGVHDmodel;Tlymphocytes;splenocytes;enhancedgreenfluorescenceprotein;macrophageinflammatoryprotein-1（MIP-1α）
移植物抗宿主?。╣raft-versus-hostdisease,GVHD）是異基因造血干細胞移植（allo-HSCT）臨床應用的主要并發癥之一。目前公認GVHD是由供體T淋巴細胞在宿主體內被激活,并攻擊靶組織所引起，但對異基因T淋巴細胞在受體體內的遷移、組織分布及激活過程仍不甚清楚，GVHD累及器官的范圍也存在一定爭議。我們建立了增強型綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,eGFP)標記供體淋巴細胞的GVHD小鼠模型，觀察了GVHD模型中eGFPT淋巴細胞的分布與激活，為GVHD防治研究提供基礎資料。
材料和方法
實驗動物
BALB/c（H-2Kd）雌性小鼠、C57BL/6雄性小鼠（H-2Kb）均為6-8周齡，購自上海生命科學院實驗動物中心。eGFP-Tg-C57BL/6雄性小鼠（H-2Kb），6-8周齡，由第二軍醫大學細胞生物學教研室提供。
實驗材料
PElabeledanti-mouseCD4，PE-cy5labeledanti-mouseCD8為Biolegend公司產品。小鼠MIP-1αELISA檢測試劑盒為R&D公司產品。
供體小鼠骨髓、脾細胞懸液的制備與檢測
頸椎脫位法處死C57BL/6及eGFP-Tg-C57BL/6小鼠，無菌取其雙側的股骨和脾。用不含有牛血清的RPMI1640培養液制備骨髓細胞懸液及脾細胞懸液。以PBS重懸細胞，調整濃度至107/ml。0.4%臺盼藍染色提示骨髓細胞懸液及脾細胞懸液中活細胞在95％以上。流式細胞術檢測骨髓細胞和脾細胞中CD4T、CD8T淋巴細胞百分比。
GVHD模型的建立
用60Co-γ線全身照射受體BALB/c雌性小鼠(8.0Gy,劑量率為0.5Gy/min)，于6-12小時內每只鼠經尾靜脈輸入8×106骨髓細胞(BMC)15×106脾細胞(SC)。分組如下：A組18只BALB/c鼠，輸C57BL/6鼠BMCeGFP-Tg-C57BL/6鼠SC；B組5只BALB/c鼠，輸C57BL/6鼠BMC；C組BALB/c鼠5只，輸eGFP-Tg-C57BL/6鼠BMCC57BL/6鼠SC。
造血重建
移植后第1、3、5、11、13天，檢測外周血細胞數。移植后第13天，制備骨髓細胞懸液片，在OlympusⅨ70倒置熒光顯微鏡下觀察。骨髓細胞懸液染色體檢查采用短期培養法，顯微鏡下計數Y染色體的分裂相比例，共觀察10個分裂相。
GVHD觀察
死亡時WBC<0.5×109/L為移植失敗，WBC>1.0×109/L并具有以下癥狀者為GVHD發生:倦怠、納差、體重減輕、弓背、亂毛、脫毛、腹瀉甚至死亡。以25天為觀察期限，觀察小鼠的GVHD發生情況和生存時間。取肝、腸、皮膚組織,用4%中性甲醛固定,石蠟包埋，常規切片,HE染色,光學顯微鏡下觀察。
eGFP淋巴細胞在小鼠體內的分布
取A組小鼠，麻醉后，去毛，切開鼠胸腹部，暴露肝、脾、腸、肺、腎，皮膚、舌、腦、骨等。用LeicaMZFLⅢ立體熒光顯微鏡觀察，拍照，曝光時間0.4-1.9秒。取A組小鼠，麻醉，PBS灌注后，切取小鼠的肝、脾、單個腎臟、腸、皮膚、肺、腦實質、舌、腎臟等，冰凍切片（厚10μm），在OlympusⅨ70倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。以未輸入eGFP細胞小鼠的各組織及冰凍切片分別作對照，排除背景熒光。
MIP-1α水平和T細胞亞群檢測
取肝、脾、單個腎臟，置于200目不銹鋼網中輕輕碾碎，以1mlPBS分別收集細胞，500×g離心6分種，取上清，行MIP-1αELISA檢測，按試劑盒說明書操作，測450nmOD值。采用CurveExpert1.3軟件作標準曲線，計算樣本OD值對應的濃度值。流式細胞術檢測肝、脾、腎細胞懸液中eGFP細胞百分數及以eGFP細胞設門的CD4、CD8細胞百分數。
統計處理
數據用SPSS10.0統計軟件處理,生存分析采用Kaplan-Meier分析方法；樣本均數間比較采用獨立樣本t檢驗。
結果
小鼠骨髓細胞和脾細胞中CD4、CD8細胞百分比
檢測結果見表1。由表1可見，eGFP-Tg-C57BL/6小鼠脾細胞（SC）懸液中CD4T或CD8T淋巴細胞含量與C57BL/6小鼠相似，CD4T均在20％左右，CD8T均在13％左右。據此推測兩種小鼠在引發GVHD方面沒有區別。這兩種小鼠骨髓細胞中T淋巴細胞含量均極少，約為2％。因此，單輸骨髓細胞可能不足以引發GVHD。
移植后造血重建
移植后第3天WBC降至最低值，第8天后WBC恢復至大于1.0×109，第13天WBC恢復至3.0×109以上。移植后第13天后C組鼠的骨髓細胞大多為eGFP細胞(圖1)，說明其來源于供體eGFP-Tg-C57BL/6鼠。染色體檢查顯示受者雌性小鼠骨髓細胞10個分裂相中，8/10-10/10可見Y染色體。Table1.PercentagesofCD4,CD8cellsinbonemarrowcells(BMC)andsplenocytes(SC)ofthemice（略）
eGFP淋巴細胞在小鼠體內的分布
立體熒光顯微鏡、熒光倒置顯微鏡觀察顯示，A組小鼠肝、皮膚、腸、脾、肺、舌有eGFP細胞浸潤(圖2)；腎、腦、骨、心肌、骨骼肌等組織中均未見eGFP細胞浸潤?？梢姼?、皮膚、腸、肺、舌等組織第13天eGFP細胞多于第3天。而脾組織第13天eGFP細胞少于第3天(圖3)。
GVHD表現及轉歸
A組小鼠移植后第8天開始出現GVHD表現,主要為消瘦、弓背、脫毛、亂毛、體重減輕和腹瀉,最后全部在25天內死亡。出現GVHD表現小鼠的肝、腸符合急性GVHD的病理改變:肝組織顯著水腫，細胞濁腫、變性,可見灶性壞死，匯管區淋巴細胞浸潤；腸組織學表現黏膜脫落，腺體及絨毛水腫、壞死、糜爛，可見淋巴樣圓形細胞浸潤（圖4）。單輸骨髓細胞的B組小鼠無GVHD表現，肝、腸結構基本正常。A組、B組小鼠生存曲線比較表明，A組小鼠生存率明顯小于B組小鼠(圖5)(P<0.05)。
第3、7、13天，eGFP細胞比例，在肝細胞懸液中逐漸增多，從18.4±3.4%升高至70.8±5.3%；脾細胞懸液中逐漸減低，從60.7±8.3%降低至27.8±4.3%。肝、脾eGFP細胞中CD4T、CD8T淋巴細胞比例均逐漸升高（表2）。Table2.PercentagesofeGFPcellsinthecellsuspensionsandpercentagesofCD4,CD8cellsineGFPcells(略)
肝、腎及脾臟中MIP-1α的表達
與腎臟中MIP-1α水平相比，肝、脾中MIP-1α水平顯著升高（P<0.05）;移植后第3天脾MIP-1α水平最高，為881.5±45.2pg/ml，肝中MIP-1α高峰水平出現在第7天，達491.3±32.1pg/ml(圖6)。
討論
本研究將C57BL/6鼠骨髓細胞與轉eGFP基因的C57BL/6鼠脾細胞一起植入經8.0Gy照射的BALB/c鼠體內，成功建立了GVHD模型。eGFP可作為標記，用熒光顯微鏡或流式細胞儀可以直接檢測供體T淋巴細胞在受體鼠體內的浸潤、擴增情況。本實驗系統可用于觀察供體細胞的分布及動態變化，為GVHD的發生機理及防治研究提供了方法平臺。目前認為，激活的CD4T淋巴細胞分泌免疫應答發生必需的細胞因子，激活CD8T淋巴細胞，使其成為細胞毒性T淋巴細胞，從而攻擊受者細胞引發GVHD［1，2］。在本實驗模型中，由于供者小鼠骨髓中T淋巴細胞含量極少，單純輸注供者骨髓細胞，雖然也能實現植入和供者型造血重建，但無GVHD發生。同時輸注異基因脾細胞可使受者小鼠發生GVHD，在GVHD靶器官中出現受者T淋巴細胞的浸潤和增殖。我們觀察到受者脾與肝中eGFP細胞呈現不同的動態變化：肝中eGFP細胞逐漸增多，而脾中eGFP細胞逐漸減少。這一結果提示，供體T淋巴細胞在移植初期可能先進入脾等淋巴器官，在異基因抗原作用下，激活、擴增后，離開脾，進入肝、腸等GHVD靶器官。但不能排除肝、皮膚、腸等GHVD靶器官中存在供體T淋巴細胞的激活與擴增。例如最近有學者研究表明，供體T淋巴細胞可在肝、脾、肺中直接與抗原呈遞細胞相互作用而激活、擴增［3］。經典GVHD靶器官主要是肝、腸和皮膚組織，GVHD的臨床分級也主要根據這3個組織的損傷程度。臨床資料表明，GVHD與移植后的許多并發癥均有聯系，如間質性肺炎、黏膜炎癥或潰瘍、出血性膀胱炎、味覺喪失等。有研究顯示，腦、腎、牙齦、結締組織、舌、鼻腔等組織中均可見供體淋巴細胞浸潤，并將它們稱之為非經典GVHD靶器官［4-6］。本研究采用熒光顯微鏡觀測eGFP細胞的分布，在肝、腸、皮膚、肺、舌中發現eGFP細胞浸潤，這提示除肝、腸和皮膚等傳統GVHD靶器外，肺、舌也是潛在GVHD靶器官。我們在腎、腦、肌肉等組織中未觀察到明顯的eGFP細胞浸潤，可能與腎、腦中供體淋巴細胞浸潤較少或實驗觀測方法的敏感性有關。MIP-1α是一種重要的趨化因子，活化后的T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞和肥大細胞均可產生MIP-1α。T淋巴細胞有MIP-1α的受體CCR5、CCR7等的表達，MIP-1α對T淋巴細胞有趨化作用［7］。有研究表明，異基因造血干細胞移植的動物的肝、脾組織中MIP-1α,MIP-2和MIG水平升高；皮膚組織中可見MIP-1α,MIP-2,MCP-1和MCP-3水平升高［8，9］。本研究發現，GVHD模型中肝、脾組織的MIP-1α水平升高，表達高峰分別出現在第7天和第3天。國外有研究也顯示，移植后第3天淋巴組織中趨化因子MIP-1α表達上調，在脾中MIP-1α由激活的T淋巴細胞產生。肝中MIP-1α表達晚于淋巴組織，由激活的T淋巴細胞產生，并與供者T淋巴細胞浸潤一致，用MIP-1α單克隆抗體或輸入MIP-1α-/-供體T淋巴細胞的方法,均可減少受體肝中CD8T淋巴細胞浸潤，而且血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)水平和肝GVHD特異性病理表現均較輕［9-12］。這說明可能存在一個反饋機制，肝浸潤T淋巴細胞產生MIP-1α，吸引CD8T細胞毒性T細胞進入肝臟。
【參考文獻】
1FerraraJL.Pathogenesisofacutegraft-versus-hostdisease:cytokinesandcellulareffectors.JHematotherStemCellRes,2000;9:299-306
2居小平，王健民.移植物抗白血病作用.中華血液學雜志,1999；20：443-445
3Panoskaltsis-MortariA,PriceA,HermansonJR,etal.Invivoimagingofgraft-versus-host-diseaseinmice.Blood,2004;103:3590-3598
4ChoiEY,ChristiansonGJ,YoshimuraY,etal.Real-timeT-cellprofilingidentifiesH60asamajorminorhistocompatibilityantigeninmurinegraft-versus-hostdisease.Blood,2002;100:4259-4264
5PadovanCS,GerbitzA,SostakP,etal.Cerebralinvolvementingraft-versus-hostdiseaseaftermurinebonemarrowtransplantation.Neurology,2001;56:1106-1108
6MaM,BarnesG,PulliamJ,Sangiitisingraftvshostdisease.Neurology,2002;59:1994-1997
7ShlomchikWD.Antigenpresentationingraft-vs-hostdisease.ExpHematol,2003;31:1187-1197
8SerodyJS,CookDN,KirbySL,etal.MurineTlymphocytesincapableofproducingmacrophageinhibitoryprotein-1areimpairedincausinggraft-versus-hostdiseaseacrossaclassIbutnotclassIImajorhistocompatibilitycomplexbarrier.Blood,1999;93:43-50
9SerodyJS,BurkettSE,Panoskaltsis-MortariA,etal.T-lymphocyteproductionofmacrophageinflammatoryprotein-1alphaiscriticaltotherecruitmentofCD8Tcellstotheliver,lung,andspleenduringgraft-versus-hostdisease.Blood,2000;96:2973-2980
10NewJY,LiB,KohWP,etal.Tcellinfiltrationandchemokineexpression:relevancetothediseaselocalizationinmurinegraft-versus-hostdisease.BoneMarrowTransplant,2002;29:979-986
