前言：中文期刊網精心挑選了熱力學在生命科學中的應用范文供你參考和學習，希望我們的參考范文能激發你的文章創作靈感，歡迎閱讀。
熱力學在生命科學中的應用范文1
1．1光譜法研究含氟卟啉-蒽醌化合物與DNA相互作用卟啉類化合物具有較強的吸光和發光性能，是一種良好的大環芳香系光敏劑，蒽醌類化合物具有良好的DNA光斷裂特性，它們易于插入DNA堿基對之間，以不同的作用機理使DNA斷裂。含氟化合物具有強的生理活性，它有可能和生物組織相互作用而顯示出抗腫瘤作用。黃岡師范學院的趙勝芳等［4］采用微波輻射合成了以二肽鍵聯的含氟卟啉-蒽醌化合物及其金屬鋅配合物。用紫外可見光譜法和熒光光譜滴定法考察了兩種合成的目標化合物與質粒DNA的相互作用，探討了它們與DNA的作用模式。即卟啉-二肽-蒽醌化合物與DNA發生自堆積的外部鍵合。該研究將在生命科學、醫藥學、配位化學的研究中得到廣泛應用。
1．2基于DNA自組裝無酶循環放大猝滅化學發光法檢測核酸G-四鏈體DNA酶是一類具有催化功能的核酸分子，由于富含G的核酸分子可以在血紅素存在下，形成G-四鏈體的結構，表現出類似于辣根過氧化物酶的活性，可以催化H2O2氧化魯米諾產生化學發光。基于目標催化DNA自組裝，廣西師范大學的褚志丹等［5］基于G-四鏈體是富含鳥嘌呤堿基的DNA序列形成的一種特殊的DNA二級結構，當其與血紅素結合后，可顯示較強的過氧化物酶催化活性的事實，利用DNA自組裝、G-四鏈體的催化化學發光性能，構建了一種無酶循環放大猝滅化學發光生物傳感新體系，用于DNA檢測。該傳感系簡單、低耗、靈敏。該研究將在生命科學、醫學及生物學研究中得到廣泛應用。
1．3基于DNA鏈置換酶輔助信號放大G-四鏈體脫氧核酶DNAzyme催化化學發光檢測腺苷腺苷在各種生物組織和器官功能的生理活性調節中起著重要的作用。因此檢測生物體中腺苷含量意義重大。化學發光檢測具有靈敏度高、線性范圍寬、分析速度快等優點。廣西師范大學的李梅等［6］利用富含G堿基的DNA在血紅素和K+存在下，形成G-四鏈體結構并表現出過氧化物酶活性的特點，結合DNA鏈置換反應和核酸內切酶的置換反應，構建了一種基于DNA鏈體脫氧核酶DNA鏈置換反應和核酸內切酶輔助信號放大的G-四鏈體脫氧核酶(DNAzyme)的催化發光檢測腺苷的新方法。該方法靈敏度高、選擇性好、檢測限量為0．5μmol/L，用于人血清中腺苷的檢測效果良好。
1．4南海紅樹林真菌Fusariumsp．301次級代謝產物研究紅樹林生態系統是一種分布在熱帶、亞熱帶潮間帶具有海洋環境特有森林類型的木本植物群落，其特殊環境孕育出的紅樹林內生真菌是此生態系統的主要降解者，也是海洋真菌的第二大生態群落［7］。從1994年至今，國內外對海洋真菌次級代謝產物的研究表明，紅樹林內生真菌的次級代謝中含有極其豐富的結構新穎且在抗腫瘤、抗氧化、抗真菌、細菌等藥理方面表現出良好活性的化合物。海洋真菌活性代謝產物已經成為重要的新型藥物來源之一。為了尋找結構新穎且具有藥理活性的海洋真菌次級代謝產物，中山大學的方平等［8］對一株采自?？谕┗涞募t樹林內生菌Fusariumsp．301次級代謝產物，根據化合物的理化性質、采用正反相硅膠、凝膠柱層析法和高效液相色譜法對其次級代謝產物進行分離純化，通過波譜解析以及文獻數據對照的方法，分離得到并確定了5個鏈紅菌素類化合物的結構。該研究將在生命科學、生物學及醫藥學中得到廣泛應用。
1．5鹽酸氨溴索的電化學氧化作用鹽酸氨溴索(AMB)，trans-4-［(2-氨基-3，5-二溴芐基)氨基］環己醇鹽酸鹽，是治療呼吸系統疾病的一種特效藥物。它對活性自由基(ROS)有不同的清除能力，對羥基自由基(HO•)的清除能力強，對超氧陰離子(O2－)弱，對過氧化氫(H2O2)很少或沒有作用。因此研究AMB的氧化作用和過程對了解AMB的生化過程很有意義。為此西北大學的孫杰娟等［9］在酸性水溶液中，研究了鹽酸氨溴索(AMB)的伏安行為，參照取代苯胺的伏安特性，說明了AMB的氧化機理。該研究將在生命科學、醫藥學的研究中得到應用。
2．1殼聚糖衍生化杯［4］芳烴鍵合硅膠固定相對八種單取代苯的分離及分析殼聚糖大分子中有活潑的羥基和氨基，具有較強的化學反應能力和生物相容性;杯芳烴的孔腔大小可調，構象和取代基可以人為控制。鄭州大學的盧靜等［10］利用二者的優點將其結合制備了一種新型固定相并對八種單取代苯進行了分離分析研究。他們的做法是采用自制殼聚糖衍生化杯［4］芳烴鍵合硅膠固定相(CBS4)，對8種單取代苯(苯胺、苯甲醛、苯酚、甲苯、氯苯、溴苯、碘苯、丁苯)進行了分離、熱力學、疏水作用的研究。實驗結果表明，8種單取代苯在CBS4上分離時間短，分離效果好，符合反相色譜機理;分析物的保留時間會隨柱溫的增加而減小;疏水作用在分離單取代苯時起著重要作用。該研究將在分析分離科學、環境科學、生物學中得到應用。
2．2Cu2+-羧甲司坦絡合物的光譜特征及其應用羧甲司坦為一種黏痰調節劑，用于治療支氣管炎、支氣管哮喘等疾病引起的痰液黏稠，咳出困難者，但用量過大會有醫療副作用。為此廣西大學的林瑜等［11］根據羧甲司坦分子結構特征，推測其分子應該具有與金屬離子絡合的條件。通過紫外可見分光光度法考察了羧甲司坦與各種金屬離子絡合的可能性。他們的研究發現，羧甲司坦與Cu2+可以形成穩定絡合物，該絡合物在237nm處有一個最大特征吸收峰。確定了絡合物的絡合比羧甲司坦Cu2+為2∶1，絡合物穩定常數為4．98×109，在237nm處絡合物的摩爾吸光系數最大為4．74×103L/(mol•cm)建立了基于Cu2+絡合的紫外分光光度法定量測定羧甲司坦的新方法。該方法簡單、快速、靈敏、準確，且成功的應用于藥廠的產品分析，結果與標量相符合。
3結束語
熱力學在生命科學中的應用范文2
關鍵詞：原子力顯微鏡 探針 RNA聚合酶 分子間相互作用
一、原子力顯微鏡（AFM）簡介
原子力顯微鏡（AFM）有兩種類型：接觸式和非接觸式，分別基于排斥作用和吸引作用。原子力顯微鏡（AFM）試驗中，探針尖端近似為顯微球，則針尖與樣品表面間的作用力為：F（Z）=2πR0B/3Z3其中Z為針尖與樣品之間的距離，R0為近似顯微球針尖的半徑，B為一個與物體介電常數有特殊關系的常量。原子力顯微鏡（AFM）探針安裝在一個靈活的懸臂上，激光二極管發出的一束激光經懸臂反射后，打在一個分裂式光電二極管上，當探針在樣品表面掃描時，由于樣品表面原子結構起伏不平，懸臂也就隨之起伏，于是激光束的反射也就起伏。光電二極管將其接收、放大，即可獲得樣品表面凹凸信息的原子結構圖像。原子量級的表面形態記錄是原子力顯微鏡（AFM）特有的性能。
二、原子力顯微鏡（AFM）的技術特點
原子力顯微鏡（AFM）本身的優勢是其在生物學中得以迅速發展的主要原因。首先，原子力顯微鏡（AFM）技術的樣品制備簡單，無需對樣品進行特殊處理，因此，其破壞性較其它生物學常用技術（如電子顯微鏡）要小得多；第二，原子力顯微鏡（AFM）能在多種環境（包括空氣、液體和真空）中運作，生物分子可在生理條件下直接成像，也可對活細胞進行實時動態觀察；第三，原子力顯微鏡（AFM）能提供生物分子和生物表面的分子/亞分子分辨率的三維圖像；第四，原子力顯微鏡（AFM）能以納米尺度的分辨率觀察局部的電荷密度和物理特性，測量分子間（如受體和配體）的相互作用力；第五，原子力顯微鏡（AFM）能對單個生物分子進行操縱；另外，由原子力顯微鏡（AFM）獲得的信息還能與其它的分析技術和顯微鏡技術互補。
原子力顯微鏡（AFM）還具有對標本的分子或原子進行加工的能力，例如，可搬移原子，切割染色體，在細胞膜上打孔等等。綜上所述，原子級的高分辨率、觀察活的生命樣品和加工樣品的力行為成就了原子力顯微鏡的三大特點。
三、使用原子力顯微鏡（AFM）研究生化過程
原子力顯微鏡（AFM）能對轉錄的過程進行實時觀察，在加入核苷酸后，沉積到云母上的延長復合物沿著DNA模板單向移動。兩個對照實驗證實RNAP與DNA的相對移動與轉錄的實際情況相符。通過PAGE對反應產物進行分析，結果顯示與云母結合的復合物具有活性，而且轉錄的速度與用原子力顯微鏡（AFM）測得的近似生物分子的構象改變也是原子力顯微鏡（AFM）的重要觀察內容。將尿素酶沉積到云母上并用原子力顯微鏡（AFM）掃描，在液池中加入尿素后發現，懸臂的垂直波動明顯增加，這提示由酶活動引起的構象改變能直接通過原子力顯微鏡（AFM）記錄下來。
原子力顯微鏡（AFM）在研究分子識別中的應用分子間的相互作用在生物學領域中相當普遍，例如受體和配體的結合，抗原和抗體的結合，信息傳遞分子間的結合等，是生物體中信息傳遞的基礎。原子力顯微鏡（AFM）可作為一種力傳感器來研究分子間的相互作用。生物素（biotin）和抗生物素蛋白鏈菌素（streptavidin）間有高親和力，其相互作用的熱力學數據也較為清楚。因而，生物素和抗生物素蛋白鏈菌素是原子力顯微鏡（AFM）測定特異相互作用力的良好典型。
原子力顯微鏡（AFM）在物質超微結構研究中的應用： 原子力顯微鏡（AFM）可以直接觀察到表面缺陷、表面重構、 表面吸附體的形態和位置、以及有表面吸附體引起的表面重構等。原子力顯微鏡（AFM）可以觀察許多不同材料的原子級平坦結構，例如，可以用原子力顯微鏡（AFM）對DL-亮氨酸晶體進行研究，可觀察到表面晶體分子的有序排列，其晶格間距與X射線衍射數據相符。已有文獻報道了關于采用原子力顯微鏡（AFM）對APA薄膜的表面結構進行研究的內容，發現了APA表面的特殊結構，從而揭示了APA表面超微結構對半滲透性的重要意義。目前，利用原子力顯微鏡（AFM）已獲得了DNA、透析薄膜、烷烴分子、脂肪酸薄膜以及多糖等的超微結構的圖象。
四、原子力顯微鏡（AFM）在細胞檢測的應用
應用原子力顯微鏡（AFM）可研究活細胞或固定細胞如紅細胞、白細胞、細菌、血小板、心肌細胞、活腎上皮細胞及神經膠質細胞的動態行為。原子力顯微鏡（AFM）對體外動態細胞的分析具有非凡的能力。這些研究大都把樣品直接放置在玻片上，不需要染色和固定，樣品制備和操作環境相當簡單。用免疫膠體金標記細胞膜則打開了細胞表面抗原高分辨定位之門。原子力顯微鏡（AFM）細胞成像如：用原子力顯微鏡（AFM）研究活腎上皮細胞，可在漿膜小斑上以50nm的分辨率觀察細胞骨架元素、漿膜淺凹和膜結合絲。用原子力顯微鏡（AFM）觀察血小板的運動，可看到微絲結構、顆粒傳輸到細胞質外側及活化中細胞成份的再分配。游走上皮細胞的漿膜可用原子力顯微鏡（AFM）實時成像。
五、應用前景
原子力顯微鏡（AFM）現已成為一種獲得樣品表面結構高分辨率圖像的有力工具。而更為吸引人的是其觀察生化反應過程及生物分子構象變化的能力。因此，原子力顯微鏡（AFM）在生物學領域中的應用前景毋庸置疑。而對于原子力顯微鏡（AFM）技術本身，以下幾個方面的進展將更加有利于它在生物學中的應用。大多數生物反應過程相當快速，原子力顯微鏡（AFM）時間分辨率的提高有助于這些過程的觀察。高分辨率是原子力顯微鏡的優勢。其分辨率在理論上能達到原子水平，但目前還沒有實現，如何作出更細的針尖將有助于其分辨率的進一步提高。而隨著樣品制備技術的完善，原子力顯微鏡（AFM）必將成為生物學領域中一種常規的研究工具。
參考文獻：
[1]David p Allison Peter Hinter Dorfer and Wenhai Han ，Biomolecular force measurement and the atomic force microscope， Biotechnology 2002 volume：13 issue：1 47-51
[2]Thomas E Fisher Andres F Oberhanser， The study of protein mechanics with the atomic force microscope， Biochemical sciences 1999 volume：24 issue：10 379-384
[3]李鴻業夏國偉原子力顯微鏡及其在生物醫學中的應用，濱州醫學院學報。1997年第20卷第6期：615-617
[4]劉麗麗王金華劉安偉原子力顯微鏡對APA生物薄膜超微結構的研究，中國生物醫學工程學報。1999年第18卷第1期：30-34
[5]戴燕張平城等人免疫球蛋白G的原子力顯微鏡觀察，中國免疫學雜志。1995年第 11卷1期：45-47
[6]鄧國宏徐啟旺等細菌波動生長過程的原子力顯微鏡觀察，第三軍醫大學學報。2000年第22卷11期：1111-1112
熱力學在生命科學中的應用范文3
作為新陳代謝的活性中間體,正常狀態下自由基在生物體中保持相對穩定的動態平衡。細胞自身的細胞色素c(Cytochromec,Cyt.c)、超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase,SOD)等具有抗氧化能力，可以將自由基轉化為無害物質進行自我修復，這一系列的過程對細胞增殖、凋亡、損傷具有重要的影響,并在細胞信號轉導過程中起著十分重要的作用。當細胞受到外界剌激或發生病變過程中會產生過量O2'_自由基,使得細胞產生氧化應激，引起癌癥、神經性疾病、帕金森病等生理病變,從而對細胞的生理和病理功能產生重要的影響。因此,檢測生物體中O〗_自由基的濃度具有十分重要的現實意義。
然而，因為自由基具有氧化活性高、體內濃度低、壽命短等特點,所以需要發展原位、實時、活體的自由基檢測方法。電化學方法具有操作簡單、易微型化、靈敏度高、易于原位、實時、在體檢測等優點而備受關注,其中，基于酶傳感器的電化學分析方法最為引人注目。
2溶液/電極界面的設計及酶的直接電子傳遞
2.1溶液/電極界面的設計
針對自由基的電化學分析,對溶液/電極界面進行設計以改善和提高電極的分析性能是一個極其關鍵的問題^2?16。酶自身體積較大,而活性中心通常都深埋在其內部,從而加大了活性中心到電極表面的電子傳遞距離，不利于實現直接電子傳遞。第二代酶傳感器采用氧化還原電子媒介體在酶的氧化還原活性中心與電極之間傳遞電子，但存在媒介體的流失和干擾大的缺陷，給O〗_自由基的準確測定帶來干擾,從而極大限制了其實際應用。第三代酶傳感器的開發使這個領域向前邁進了一大步。通過界面設計優化,利用酶的直接電子傳遞機理克服了原先的不足，能夠實現細胞或生物體中自由基的直接檢測。界面設計優化是人為地設計電極表面微結構和其界面反應，通過將酶固定在電極表面上,使暴露的電活性中心更接近電極表面，實現酶與電極之間快速的電子傳遞,達到預期檢測的目標。2.1.1分子設計分子自組裝是對固體表面進行修飾最為有效的手段之一。高度有序、結構可控、定向密集的穩定分子層為保持酶蛋白質的天然結構和構象提供理想的微環境。同時，單分子作為加快電子傳遞的促進劑，可以用于探索電極表面分子微結構和宏觀電化學響應之間的關系。巰基化物在金屬表面自組裝是目前研究得最廣泛、最深入的一類物質。其自組裝膜有序性強,不易聚合,條件控制容易等優點擴展其在傳感方面研究和應用的范圍。Tian等^在金電極表面自組裝一層巰基半胱氨酸單分子膜來考察溶液中SOD的電化學活性，同時以裸金電極作為對比，實驗結果證實SOD能夠固定于分子修飾電極的表面上,使得電極反應更容易實現,這可能由于半胱氨酸在界面自發形成的一種熱力學穩定分子層，更有利于實現SOD“軟著陸”。隨后，他們又將3種SOD(Cu,Zn-SOD,Fe-SOD和Mn-SOD)分別固定在巰基半胱氨酸修飾的金電極界面上，首次同時實現3種SOD的直接電子傳遞；巰基半胱氨酸作為促進劑加快電子的傳遞。通過分子設計在界面上自組裝單分子體系考察電子轉移過程，為更深層次的分子設計和功能組裝反饋信息M。
此外,作為一種常用的選擇性結合組氨酸標記蛋白質的方式，次氮基三乙酸/組氨酸（NTA/HT)技術成為組氨酸結合最成功的模版。其將蛋白質定向有序固定在電極表面上,并加快電子傳遞。Joln_等㈣利用該通用模版技術成功將蛋白質固定在金電極表面上，通過大環效應使NTA衍生物的三氮雜環與金屬離子穩定反應,使得該體系具有更高的穩定性。Wang等^1首次利用NTA/HT技術將SOD修飾到電極表面上,極大提高了電子傳遞速率，電子傳遞常數為（24±1.1)S!1;同時，實現了SOD的直接電化學,并進一步應用于鼠腦在局部缺血和再灌注的過程中自由基濃度變化的檢測。
在簡單的蛋白質^分子仿生體系中，分子設計在提高傳感器檢測底物的靈敏度、控制活性中心與電極表面距離、加快長程電子轉移等電分析化學的應用和理論方面發揮了重要作用。
2.1.2納米材料利用酶的特異性檢測O2'_自由基時,往往受限于酶負載量過少或缺乏電子傳遞導體從而致使電信號過小或者電子傳遞過慢,影響傳感器的整體分析性能。納米材料是材料學中最基礎、最活躍的組成部分。不同于體材料和單個分子，納米材料具有小尺寸效應、表面效應和量子尺寸效應等獨特的物理化學性質,特別是良好的生物相容性和穩定性，可作為負載酶的良好基質，在傳感領域獲得廣泛的應用。
Brown等M將直徑12nm單層金溶膠顆粒修飾二氧化錫電極,實現了溶液中Cyt.c的直接、可逆電化學，且無需任何預處理步驟。金溶膠顆粒可看作是空間緊密而獨立的微電極組合體。但隨著納米顆粒的聚集,Cyt.c的電化學變的準可逆或者不可逆,表明納米金屬尺寸和形貌在實現蛋白質的直接電子傳遞中也起到極其關鍵的作用。Zhu等122首次利用1,5或二硫醇交替連接Au、Ag膠體制備多層Au/Ag膜,在溫和條件下通過氯金酸溶液去除成孔物質納米Ag,通過層層自組裝技術在氧化銦錫（ITO)電極表面制備了納米多孔金膜。Cyt.c保持其生物催化活性，電子轉移速率為3.9s!1。同時,該第三代傳感器具有良好的選擇性和穩定性,其檢出限達到6.3x106mol/L,線性范圍是1.0x105~1.2x102mol/L。
Bi等M通過將多壁碳納米管修飾玻碳電極上實現了SOD的固定。多壁碳納米管表面的晶格缺陷提供了較高的局部電子密度,有利于電子在酶蛋白和碳納米管之間傳遞；同時,特殊結構的碳納米管可以作為“分子導線”，加快電子傳遞到SOD的活性中心，以上兩方面因素致使SOD在電極表面上實現直接電子傳遞。
Deng等M利用蒸汽方法直接在預處理ITO表面沉積上一層花狀ZnO納米材料，設計出新型納米材料界面,增大了基底的比表面積和導電性。同時，生物相容性保持了SOD的高生物催化活性，結合ZnO作為“納米導線”加快電子的傳遞作用，實現了SOD的直接電子傳遞,構筑了第三代生物傳感器，異相電子傳遞常數可達（10.4±1.8)s!l。Zhu等123將Cyt.c固定在SiO:納米材料修飾的玻碳電極表面上，實現了Cyt.c的直接電化學。實驗數據證實Cyt.c的直接電子傳遞及微環境的改變與SiOi雙功能結構的空間幾何構象有關。該模型能夠定性的解釋納米材料的尺寸和濃度對氧化還原蛋白的直接電子傳遞的影響，同時也為廣泛應用無機納米材料來促進電子傳遞提供一種新思路。
隨著納米技術的不斷發展和壯大,各種納米材料在傳感器領域的應用日趨廣泛。納米材料所具有的高比表面積、高活性、特殊物理性質及生物相容等特性使其成為應用于傳感方面最有前途的材料之一。2.2基于酶直接電子傳遞的傳感器
直接電子傳遞是蛋白質分子與電極表面在沒有任何媒介和試劑的情況下直接進行電荷交換，這樣有利于電子傳遞效率的提高,更能反映生物體系內的氧化還原系統,為揭示生物體內電子傳遞的機理奠定了基礎。但是酶蛋白的活性中心通常是深埋在其內部，當其固定在裸電極表面時,沒有合適的界面微
環境來實現其直接電子傳遞,致使阻礙其在活體檢測方面的實際應用。通過界面設計使修飾電極可以建立理想的接觸界面,暴露酶的電活性中心，實現酶與電極之間快速的直接電子傳遞,并利用其對自由基的選擇性達到預期的檢測目的，對于預防和治療疾病以及抗氧化藥物的研發都具有現實意義。
2.2.1基于Cyt.c的傳感器Cyt.c是一種存在于線粒體內膜外側的金屬蛋白分子，是呼吸鏈中一個重要的電子載體。通過血紅素輔基中心鐵離子價態的變化來傳遞電子，在細胞呼吸鏈中具有舉足輕重的作用。研究其在電極上的電子傳遞及與O2'_自由基的生物作用，對于了解生命體內的能量轉化和物質代謝具有重要的意義。因此,探索實現Cyt.c與電極表面之間的直接電子傳遞成為電分析化學研究的方向之一?！ooper等將巰基半胱氨酸自組裝到裸金電極表面,通過碳二亞胺縮合反應固定Cyt.c,考察了yt.c與電極之間的電子傳遞情況,結果顯示Cyt.c在電極表面實現直接電子傳遞；其表觀電位為2mV(vs.SCE),表明此傳感器具有潛在實際應用的可行性。Cooper等M采用電化學分析方法檢測黃嘌昤/黃嘌昤氧化酶體系酶化反應產生的自由基，其原理如圖1所示。酶化反應產生O〗_自由基還原Cyt.c,自身被氧化成Oi;同時還原態的Cyt.c在電極表面正電位下迅速被氧化為氧化態。基于此反應機理,他們實現了嗜中性粒細胞中應激產生的02’_自由基的動態檢測，且引起的電流響應速率與02"自由基的產生速率成線性關系。-傳感器的靈敏度取決于負載活性酶的數量以及酶與自由基的反應速率。Wegrich等63利用定點誘變技術在Cyt.c活性位點附近引進帶正電荷的賴氨酸,考察其在巰基分子修飾的金電極上的分析性能。實驗數據表明誘變重組的Cyt.c均具有氧化還原圖10廠電流傳感器的作用機理示意圖電活性,能夠實現直接電化學，并且與O2’_自由基的Fig.1Mechanismofoperationofamperometric反應速率顯著加快?；谡T變Cyt.c構筑的電化學生sensor物傳感器在靈敏度和穩定性上都有不同程度的提
高。納米材料的不斷發展為電極界面設計提供了新的契機,其巨大的比表面積和良好的生物相容性,既
能增大酶的負載量,又能較好的保持酶蛋白的高催化活性，同時作為良好導體加快電子的傳遞。Rahimi
等M將多層碳納米管/室溫離子液體的納米復合材料與Cyt.c混勻后，直接滴涂到玻碳電極表面上,簡單有效地制備了O〗_第三代生物傳感器。首先,多層碳納米管作為電子促進劑,加快Cyt.c和電極之間的電子傳遞;其次,室溫離子液體保持了Cyt.c的空間構象結構和生物催化活性,二者協同提高了傳感器的
靈敏度、響應時間、檢測限等分析性能。正如人們所期望的，基于Cyt.c的O〗_傳感器可避免抗壞血酸、尿酸的干擾，能夠在低電位下檢測。然而,作為過氧化物酶的本質特點,Cyt.c同樣能夠還原來自酶化反應產生和體內共存的&O2,受其干擾。雖然Gobi等M報道可以通過設計電極來控制Cyt.c的過氧化酶活性,但Cyt.c不是O〗-的特異性酶,這極大限制了其在復雜生物體系中的選擇性檢測的作用。眾所周知，SOD可高活性和選擇性地將O〗-歧化為O:和H2O2M,從而完成O〗-高選擇性測定。因此,采用SOD替代Cyt.c來構筑高靈敏度和高選擇性的O〗_生物傳感器越來越受到業內人士的普遍關注。
2.2.2基于SOD與仿生SOD的O「傳感器SOD是廣泛分布于生物體內重要的抗氧化酶,也是生物體內清除自由基的首要物質。作為一種金屬蛋白酶，常見的幾種不同金屬中心SOD是Cu,Zn-SOD,n-SOD,Fe-SOD和Ni-SOD,它們都能將O；-自由基有效的歧化為%。2和。2保護機體不受毒性的侵害。但其電活性中心都包埋于蛋白質深處，致使SOD與電極表面的直接電子傳遞難以實現。
因此，實現SOD與電極之間的直接電子傳遞對第三代O2’_生物傳感器的構筑以及實際應用的發展具有現實意義。
Ohsaka等M首次將Cu,Zn-SOD修飾在半胱氨酸自組裝修飾的金電極表面上構筑了第三代傳感器。實驗結果表明，自組裝的半胱氨酸分子可作為SOD電極反應的促進劑。結合傳感器高靈敏度、高選擇性和快速響應的良好分析性能，實現對酶化反應產生O^自由基的檢測，這一工作是利用SOD直接電化學實現O;_自由基檢測的一個巨大突破。Ohsaka課題組M首次發現O;_自由基在SOD電極上能夠同時氧化和還原,并進行對比實驗證實了可以在氧化和還原電壓雙向檢測自由基，這為實現溶液中自由基的分析檢測提供了第一手資料，同時為實現持久和可靠的檢測生物體系里的O；-自由基奠定了基礎。接著，Tian等^首次在半胱氨酸膜修飾的電極上同時實現3種活性中心SOD(Cu,Zn-SOD,Fe-SOD和Mn-SOD)的直接電子傳遞。如圖2所示，通過活性中心的氧化還原循環，SODs能夠催化還原成H2O2和氧化成O2,使得陽極和陰極上的電流響應明顯增大，這說明SOD對O；-具有雙功能電催化活性。結合SOD快速電子傳遞的特性,該傳感器為雙向實現O^電化學檢測的提供了一條可行性路線。
Ge等M將Cu,Zn-SOD和Fe-SOD固定在巰基半胱氨酸修飾的裸金電極表面上,研究其動力學和吸附過程,結果表明通過不同動能學過程均能結合到電極表面上。
在實際應用檢測中，高靈敏、高選擇性的檢測方法越來越顯示出其重要性。納米技術的發展為高靈敏電化學分析方法的發展提供了機遇。例如，納米材料在生物分析檢測中得到了廣泛應用，已有多種信號放大方法用于高靈敏電化學分析方法的構建。
如圖3所示,Tian課題組[43首次在錐狀、棒狀和球狀3種不同形貌的納米金表面上同時實現了SOD的直接電化學。熱力學和動力學分析表明SOD在不同界面上的電子轉移速度，與納米金的形貌有關；同時，
良好的生物相容性讓納米金表面的SOD保持了其自身的生物催化活性，可用來構建既可在氧化電位又可在還原電位下進行0廠自由基檢測的生物傳感器。
無需其它步驟，結合良好的分析性能大大增加了其應用于實現生物體內O^測定的可行性。
綜上所述，分析檢測都是在體外分析體系中通過外來不斷加入O2'_自由基進行電分析，與體內的復雜生物環境截然不同。因此我們很有必要對體內O；-自由基進行準確的分析檢測，以便更好的深入理解O^自由基在生理和病理上中所發揮的作用。
3細胞釋放檢測
在細胞水平上，當細胞受到外界剌激或者生理病變過程中會產生過量自由基，從而對細胞生理功能產生重要影響，進而引起生理病變。因此，構筑適于檢測細胞內O2'_自由基的傳感器,原位、實時地檢測自由基濃度的變化,對疾病預防與治療的途徑具有重要的生理及病理意義。
Tanaka等[44利用碳纖維修飾電極檢測由免疫球蛋白G和卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯剌激單中性白細胞產生O^自由基的氧化電流。實驗證明自由基會在剌激1min后產生，5min達到最大值,20min后消失，這種方法獲得的電流4寸間關系與傳統方法獲得的結果一致。隨后,Tanaka課題組[45設計了一種檢測由單個噬菌細胞釋放自由基的電流方法,其靈敏度高達到fA級。
在實際樣品檢測時,天然酶的空間結構和構象變化容易致使其喪失催化活性,成為制約它們實際應用瓶頸。為了避免這些缺陷，基于活性位點■銅、鐵和錳設計的低分子量、具有SOD生物活性的仿生酶研究已陸續報道[4649]。Cabelli等^研究了錳磷酸鹽作為仿生SOD在有機活體內的抗氧化機理。為了證明結果的可靠性,他們采用兩種不同方法:脈沖輻射法和Co~60i輻射法產生自由基。實驗證明Mn2+與O「自由基反應生成暫態的MnO:+,然后MnO:+快速歧化生成O:和^O:。
Tian課題組利用M%(PO4)2具有仿生SOD的生物特性,在高導電納米針狀TiOi膜上構筑了一個具有選擇性高和穩定性好的第三代O〗_生物傳感器，提供了一種方便、快速原位直接檢測貼壁生長在修飾膜表面的正常人胚腎細胞HEK293T和CHO癌細胞釋放的O〗_自由基的電化學分析新方法。檢測原理如圖4所示,在M%(PO4)2仿生酶的催化作用下發生歧化反應的過程中，將Or分別轉化成Oi和&O2(如圖4A)。此過程可看成是分別在兩個電極上獨立進行的兩個反應。一方面,在陽極反應中圖（4B),電解液中的被MnOi+的氧化生成O2,同時MnOi+被還原成Mn2+。而生成的Mn2+能夠在電極上失去電子，重新被氧化成MnO2+。另一方面，在陰極反應中（圖4C),O；-氧化Mn2+生成MnO2+,而生成的MnO2+在電極表面得到電子被還原成Mn2+。因此,在O〗-存在的情況下,通過Mn2+修飾電極上的氧化或還原電流檢測O2'_。因此,通過兩極上氧化或還原電流信號的變化，即可實現對O2’_的檢測。電化學信號表明此生物傳感器可以實現細胞應激反應產生0廠自由基的可逆響應，暗示02'_自由基可作為_種癌癥生物標記物，為生理和病理方面的研究提供了基礎。
基于SOD生物仿生酶(PO4)2,Zhou等開發了一種可靠和持久原位實時檢測O-自由基的方法。Mn2+通過離子交換作用進入zeolite~ZSM-5的納米結構中，進一步被聚二烯丙基二甲基氯銨化覆蓋固定到電極表面上。沸石的納米微結構加快了Mn2+的直接電子傳遞，其表觀電位是（561±6)mV(vs.Ag/AgCl),位于O2'-/O2和O2'-/H2O2動力學電位內，可以將O〗_歧化為Oi和％O2。利用分子篩較好的生物相容性和細胞黏附性，讓細胞貼壁生長，
可靠、持久的原位實時測定了細胞釋放出來的O‘-自由基濃度,實現從理論到實踐應用的轉變。
作為細胞信號的傳導分子，自由基與金屬離子密切關系，包括Ca2+通道、K+通道、Na+通道等。
Tian課題組153基于Mn^TPAA(Mn-tris2-(2-pyridylmethyl)aminoethyl]amine)仿生酶構筑了O;生物傳感器,具有高的穩定性和良好的重現性。以Hela細胞為模型,他們進一步研究了細胞釋放O〗_自由基與細胞內Ca2+之間的依存關系。如圖5所示，在無抑制劑時，加入Ang后熒光強度明顯增強，說明Angn剌激細胞產生的O「促使細胞內Ca2+的釋放,Ca2+與Fluo4-AM結合,從而使熒光增強。然而，在實驗前先用NADPH氧化酶抑制劑Apo或陰離子通道阻滯劑DIDS處理10min,再進行的相同實驗時,AngH剌激細胞前后熒光強度沒有明顯變化。這說明Apo抑制細胞外O〗_的產生而影響熒光強度的增加，DIDS阻止細胞外O〗_進入細胞而抑制細胞Ca2+濃度的增大。這一研究對認識自由基信號的傳導與其它生理和病理的關系提供了一種新思路。
4活體電化學分析
電化學分析方法雖具有高靈敏性、原位、實時在線檢測等優點,適于活體內o2'_自由基的分析和檢測,但目前這方面鮮有文獻報道。
對于植物體內0廠自由基的檢測,Deng等M基于半導體ZnO納米材料成功構筑了第三代生物傳
感器，實現了豆芽體內O^的檢測。如圖6所示，活體實驗采用雙電極體系,ZnO/SOD微電極作為工作電極,鉑絲作為對電極。ZnO/SOD微電極的制備步驟如下：首先，ITO導電玻璃切割成剌狀；然后，將ZnO納米材料電沉積到導電玻璃表面上，并進一步負載Cu,Zn-SOD。結果表明，通過一步、無模版的電沉積得到新型六角形ZnO納米材料，可實現了SOD的直接電子傳遞;再結合SOD對O^自由基的催化歧化，實現了豆芽體內O^自由基的在線檢測。該項研究不僅為酶蛋白在納米結構半導體膜上構筑第三代生物傳感器建立了一個模型，也為研究生物體內O2’-作用機理開啟了一扇窗口，可以更深入的理解O；-自由基在生理學和病理學中的作用。
利用TTCA(5,2:5,2-terthiophene-3-carboxylicacid)聚合物膜依次共價鍵固定DGPD(1,2-Dipalmi-toylsn~glycero-3~phosphoethanolamine^i~dodecanylamine)和Cyt.c,Rahman等1551制備了一種高穩定、高靈敏的體內檢測O2_的第三代傳感器。他們通過持續不斷的往鼠腦注入可卡因溶液剌激產生O2_,并利用該傳感器對細胞外的o2’-進行檢測。如圖1所示，該傳感器在鹽水、急性和重復注射可卡因不同實驗條件下產生了不同程度的電流響應，其中重復注射可卡因操作下傳感器的靈敏度最高。-0.31V的低電位結合聚合物膜的屏蔽可使傳感器在測定0廠自由基時避免抗壞血酸、尿酸、過氧化氫、氧氣等干擾,從而保證此微型傳感器植入鼠腦成功測定體內02'-自由基的濃度，并且能夠實現動態檢測體內02-自由基濃度隨可卡因不斷急性注入的變化。該微型生物傳感器可以作為監測興奮劑藥物暴露引起細胞外0廠自由基濃度變化的一種有效工具。
近來，Tian等63提出了一種植入型微碳纖維電極直接實現活體內0廠自由基檢測的新思路。此碳纖維基底上固定的SOD在測定0廠上擁有顯著的高選擇性和良好的穩定性；同時背景電流的減小使得碳纖維微電極在高靈敏測定生物體內0廠自由基占有優勢。隨后,Tian課題組M首次利用NTA/HT技術實現了SOD在NTA修飾電極上的直接電化學,極大提高了電子傳遞。整個傳感器的制備過程如圖8(A和B)所示。結合傳感器的高靈敏度、高穩定性的分析性能以及碳纖維電極生物相容性和可微型化特點,該課題組成功實現鼠腦在缺血再灌注過程中0廠自由基濃度的變化檢測（圖8C)。該研究為體內活性氧的進一步研究提供了一種新思路，同時也為理解其在氧化應激和生理病理過程中的作用提供了獨特的視角。
建立基于納米材料與功能分子設計界面的02’-自由基檢測新方法和適于活體檢測的超微電極技圖8(A)NTA和SOD修飾電極過程示意圖；（B和C)碳纖維電極制備過程以及利用碳纖維電極檢測鼠腦內02’_過程示意圖
術,將為研究等活性氧在細胞信號轉導中的作用，進而解析0廠自由基等活性氧在生命活動中的作用機理,治療和預防與氧化應激等有關疾病,以及抗氧化物新藥的研制與開發等提供一種新的研究思路。
