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免疫組化染色范文1
【摘要】腦組織石蠟切片的染色結果，易出現切片染色不清楚，脫片、假陽性，假陰性出現。免疫組化這些結果的出現，與組織固定，抗原修復，內源性過氧化物酶活性的滅活，抗體質量，顯色試劑質量，蘇木素質量，時間上的把握及技術人員熟練程度有關，得出了免疫組化的過程的很多細節及各個步驟的主要的注意事項，提高腦組織切片的免疫組化染色操作技術。
【關鍵詞】腦組織；石蠟切片；免疫組化；染色
隨著免疫組化技術廣泛應用于科學和醫學各個領域的研究和診斷中，免疫組化的技術已經成為一種基本的檢測技術，如何提高免疫組化的技術，特別是腦組織切片在免疫組化中的檢測，是每一個科研人員在檢測中最關心的問題，現將近幾個月大鼠腦組織切片的免疫組化技術的一些體會和細節概況如下：
1 腦組織固定體會
用4%的多聚甲醛固定，固定之前要保持腦組織的平整和完整，不能被擠壓，以免影響細胞的形態，影響電鏡下觀察。
2 腦組織防脫片的處理
（1）傳統的防脫片的處理方法有延長烤片的時間、提高烤片的溫度和重新脫水［2］。免疫組化前，切片在58-60℃的恒溫箱中烤2-24 h［1］，在脫蠟和脫水過程中，把切片稍晾干后再行下一步的免疫組化過程。但不能進行高溫烤片，在干燥的條件下加熱切片可以加速組織中抗原的氧化而破壞組織中的抗原［2］。
（2）玻片進行化學試劑處理玻片為充分洗凈干燥的磨砂防脫載玻片?？梢赃x用免疫組織化學染色中常用防脫片劑即多聚-L-賴氨酸(Poly-LLysine)對載玻片進行處理，處理后載玻片不易脫片。
3 抗原修復
（1）少數抗體可以選擇酶消化法.如原位末端標記法（TUNEL）試劑盒中以蛋白酶K為消化酶，在這過程中，注意蛋白酶K的濃度不能過高，過程中不能超過10 min，以免修復太過出現假陰性，且BPS洗滌要徹底。
（2）熱修復注意事項。
高壓加檸檬酸鹽(pH6. 0)緩沖液修復，時間為5分鐘，冷卻后連續修復2次。水浴鍋修復時水溫為95℃，修復時間為15～60 min。須等緩沖液冷卻至室溫,才能把切片取出，取切片時防燙傷。
4內源性過氧化物酶活性的滅活
3%H2O2孵育時間一般8～10 min，時間過長易造成結果假陰性的出現。用BPS充分沖洗三次每次3 min，注意保證BPS的PH值在7.2～7.6。
5 滴加抗體和孵育時間
（1）試劑儲存時間過長會影響抗體的有效價,所以試驗前檢查試劑是否在有效期內,并及時調整儲存。一般抗體儲存在-20℃的冰箱內，一抗是即配即用，根據說明書上一抗的濃度比例做預示實驗，一般是1:50,1:100,1:150，1:200進行對比，然后按最佳效果的比例進行正式試驗。
（2）滴加一抗二抗時,須用濾紙將切片周圍和多余的BPS液體拭凈,以防殘留液體稀釋工作液,出現不必要的假陰性。為了避免試驗的誤差，降低試劑的耗損，先離心積液再取用抗體，移液需精準。滴加抗體時須懸空滴加，不能觸到腦組織，以免造成腦組織損傷。工作液須完全覆蓋住腦組織，如若液體分布不均勻，可輕微晃動玻片或用移液槍頭的外側面但不接觸腦組織撐開液面。
（3）不同的試劑的抗體孵育時間不同。在37℃恒溫箱中孵育時，一抗的孵育的時間一般是2.5h，二抗為30min，二抗的時間隨一抗的延長而延長。濕盒孵育可以在4℃冰箱過夜,孵育出的切片陽性率高。
6設置陽性對照片和陰性對照片
陰性對照和陽性對照需同時進行，但陰性對照組須與陽性對照組在操作上，所有步驟都應獨立，獨自漂洗，獨自孵育，防止受抗體污染而出現陽性結果。
7顯色試劑配制和時間
DAB顯色劑應現用現配,注意顏色是否正常，新鮮配制的顯色液為淡棕色，顏色過深，則不用。顯色不宜超過10 min,一般是2-3min，否則易出現背景深染，或先在低倍鏡下觀察顯色的程度，控制顯色的程度，染色充分后立即終止。
8復染注意事項
（1）注意蘇木素配置的時間，是長期還是短期的，觀察其色澤，氣味，注意蘇木素配置的方法不同，其效用也不同，不全是存儲越久，染色的質量越好。
（2）蘇木素復染需2min,復染只需蘇木素淺淡的染色,若過深的蘇木素染色有可能覆蓋已有的陽性染色。500ml蘇木素染液染800-1000張玻片后需更新換液，保證染色質量［3］。每次染色之前應將染液通過濾紙過濾，保持染液干凈，防蘇木素中的過氧化物沉淀在玻片上影響美觀。
（3）封片時宜濕封，防切片細胞龜裂，收縮或黑色結晶樣小點，滴樹膠不能過稠或稀，稠了會使樹膠外溢，易粘在切片上影響美觀，稀了封片產生氣泡，這些均不利于鏡下觀察。
免疫組化的過程，看上是一個簡單的過程，在這個過程中，每一個過程都是都是很重要的步驟，一步不慎，皆會影響到實驗的結果。因此需要操作者每一步都要做到細致規范，熟練免疫組化的每一個步驟，每一個過程中的不同的方法及效果，通過反復的比較對照掌握免疫組化的過程中的方法和時間的把握，且按上面步驟注意操作后，能做出背景清晰，不脫片，易于鏡下觀察的腦組織切片。
文獻摘要
［1］張惠球,劉奕生.免疫組織化學染色質量的影響因素［J］中國誤診學雜志,2006,6(3),571-572.
［2］王小亞,楊清海. 免疫組織化學標準化(一) ［J］. 診斷病理學雜志, 2001 (1) : 801.
免疫組化染色范文2
[關鍵詞] BrdU；免疫組織化學染色；胰酶抑制劑；牛血清白蛋白；漂片法
[中圖分類號] R392-33 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2012）02（b）-0016-03
Improvement in technique of BrdU immunohistochemical staining by bleach section
GUO Jingjing1 SHAN Lidong2 WU Gang3
1.Department of General Surgery, Huashan Hospital Baoshan Branch of Fudan University, Shanghai 200431, China;
2.Department of Neurobiology and Medical Psychology, School of Preclinical Medicine and Biological Sciences,Medical School of Suzhou University, Jiangsu Province, Suzhou 215123, China;3.Department of General Surgery, Huashan Hospital Affiliated to Fudan University, Shanghai 200040, China
[Abstract] Objective To reduce the tissue slice breakage, explore the technique of 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) immunohistochemical staining by blocking buffer in bleach section. Methods BrdU, which was detected by ABC immunohistochemistry on bleach section of brain slides, was used to incorporate the new born cells which were promoted proliferation by motor-driven wheel running. The different blocking effects of Goat serum, trypsin inhibitor and bovine serum albumin were compared in the process of immunohistochemistry. Results In the group of motor-driven wheel running in the dentate gyrus of the hippocampus in rats, the number of BrdU-positive cells was more than the control group. The breaking rate of slides was reduced obviously, especially in the groups with bovine serum albumin and trypsin inhibitor, after being added different blocking reagents. But cells in trypsin inhibitor group were appeared without specific staining. Conclusion Bovine serum albumin is preferable blocking buffer.
[Key words] BrdU; Immunohistochemical staining; Trypsin inhibitor; Bovine serum albumin; Bleach section
5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine, BrdU）是胸腺嘧啶核苷的類似物，在細胞周期的S期摻入到增殖或分裂細胞的核內，只要細胞不消亡，BrdU 將永久地存留在胞核DNA 中，且在體或離體都能通過免疫組織化學的方法檢測到，可用于標記BrdU暴露期間進行DNA合成的細胞[1]。故BrdU陽性細胞可被看作是具有增殖活性的細胞。
1 材料與方法
1.1 材料
動物：SD大鼠，雌雄不拘，體重220~230 g，蘇州大學實驗動物中心提供。試劑：BrdU（ Roche Diagnostic Co.）。
1.2 分組
踏轉輪運動對成年大鼠海馬齒狀回細胞增殖的影響。實驗分兩組，①踏轉輪運動組：轉輪速度為10 m/min，每天訓練2次（09:00，15:00），每次訓練30 min，連續6 d；②對照組：動物置于轉輪中，速度為0。放置次數與時間同運動組。在染色過程中每一組又分為三個亞組，分別為加入羊血清組、胰酶抑制劑組和牛血清白蛋白組。
1.3 BrdU標記
踏轉輪運動的第4天開始給藥，于每次運動前1 h腹腔注射BrdU（50 mg/kg，美國ROCHE公司），2次/d，連續3 d。末次給藥后24 h處死動物，從前囟后3.3~5.1 mm作連續冰凍切片，進行BrdU染色。
1.4 BrdU免疫組織化學
切片經2 mol/L HCl（室溫30 min）變性， 用0.01 mol/L PBS 充分漂洗后轉入0.1%胰酶中（37℃ 15 min）消化后，0.01 mol/L PBS漂洗（5 min×3次），分別加入羊血清組、胰酶抑制劑組和牛血清白蛋白組，室溫下30 min, 然后加入小鼠抗BrdU單克隆抗體（1∶200，Biosource）室溫孵育16 h，0.01 mol/L PBS漂洗（5 min×3次），轉入羊抗小鼠二抗（1∶200，Vector）室溫孵育2 h，再用0.01 mol/L PBS漂洗（5 min×3次），移入親和素生物素試劑（avidin-biotin complex，ABC，1∶200）室溫孵育2 h，最后用含0.03% H2O2的0.05% DAB顯色3~5 min， 0.01 mol/L PBS終止顯色。常規脫水、透明、封片。鏡檢BrdU陽性細胞計數。
1.5 統計學方法
隨機選取每只大鼠位置相同的5張不連續切片，光學顯微鏡下（×200）計數每張切片雙側海馬齒狀回顆粒細胞層（granular cell layer，GCL）免疫反應陽性細胞數。陽性細胞的均數作為統計數據，以均數±標準差（x±s）表示。用SPSS 10.0軟件作方差分析（one-way ANOVA）檢測組間差異性。
2 結果
2.1 踏轉輪運動對成年大鼠齒狀回細胞增殖的作用
經過6 d的踏轉輪運動訓練后，各組BrdU陽性細胞見圖1。免疫組織化學結果顯示，海馬齒狀回BrdU陽性細胞數，對照組為（22.55±1.91）個/切片，踏轉輪組為（57.89±1.90）個/切片，兩組相比差異有高度統計學意義（P < 0.001）。由此可見，踏轉輪運動可增加BrdU陽性細胞，促進齒狀回細胞增殖。
a、a′為對照組， b、b′ 為踏轉輪組。a、b分別是a′、b′的高倍視野
圖1 踏轉輪運動6 d后海馬齒狀回BrdU陽性細胞數
2.2 不同的封閉液對組織片染色效果的影響
末次給藥后24 h處死動物，從前囟后3.3~5.1 mm作連續冰凍切片，將切片隨機分成三組。在染色過程中，這三組分別加入羊血清、胰酶抑制劑和牛血清白蛋白作為封閉液和終止胰酶作用的抑制劑。各組BrdU陽性細胞如圖2所示。免疫組織化學結果顯示，三種方法均能使BrdU著色，但各組的本底顏色和非特異性著色程度不同：羊血清組中雖然陽性細胞與非特異性著色細胞有明顯區別，但非特異性著色細胞顯色度較深，且遍布整個視野。胰酶抑制劑組陽性細胞與非特異性著色細胞也有明顯差異，而且非特異性著色細胞顯色度較淺，整個本底相對較為干凈、清爽。牛血清白蛋白組幾乎見不到非特異性著色細胞，本底顏色非常淡。
除了本底顏色和非特異著色的觀察外，筆者還重點觀察了組織切片的破損情況。實驗結果顯示：牛血清白蛋白和胰酶抑制劑組無切片破損，而羊血清組有少部分腦片破損。細胞計數顯示：羊血清組為（23.22±2.38）個/切片，胰酶抑制劑組為（22.54±2.12）個/切片，牛血清白蛋白組為（23.14±3.12）個/切片，各組間差異無統計學意義（P > 0.05）。
3 討論
自從20世紀末神經干細胞發現以來，其目前已經成為神經科學研究的熱點之一。而研究在體或移植后的神經干細胞的增殖、遷移、分化中常用的標記新生細胞的方法有BrdU、3H、Ki-67、 PCNA（proliferating cell nuclear antige）[2-3]，前兩者在細胞增殖時整合入細胞以后，即使在細胞靜止期仍能表達；后兩者是細胞增殖過程中表達的內源性蛋白，當細胞處于靜止期時，它們并不表達。因此，BrdU和3H是常用的追蹤細胞的標記物，而BrdU的檢測又較3H更為方便、簡單，所以BrdU是最為常用的標記細胞增殖的標記物。
豐富環境對神經發生有影響，而在各種環境因素中，運動對其影響較為顯著[4-5]。本課題的前期研究建立了踏轉輪運動的模型[6]，并發現運動對神經發生的作用具有強度依賴性，這早于國內外的相關報道[7-8] 。故本課題選用運動作為促進細胞增殖的方法，觀察了不同的染色方法對切片及結果的影響。
組織切片BrdU染色時，常用的方法有貼片法和漂片法。漂片法與貼片法相比有一定的優點：前者能使抗體從兩側滲透，更有利于抗體與抗原充分反應，相應的在洗片時，也能使未結合的抗體充分漂洗干凈；漂片法比貼片法所使用的抗體數量少，而且必要時抗體還可以回收，重復利用。標本量大時，漂片法比貼片法更省時、省力。但是，用漂片法進行BrdU染色時，由于在加入抗體前要用鹽酸和胰酶對腦片進行預處理，經過處理（尤其是胰酶處理）后，進行染色的腦片極易破損，從而導致整個染色過程無法正常完成，或最終所得到的腦片極少。因此，在本實驗中針對胰酶的消化作用，筆者分別選用了與二抗同源的羊血清、牛血清的主要成分白蛋白（牛血清白蛋白）及胰酶抑制劑來抑制（或終止）胰酶的消化作用。
羊血清是免疫組織化學中常用的封閉液，但是，在本實驗中并未取得預期的成果，雖然羊血清能終止胰酶的消化作用，但并未能有效地封閉非特異性染色。其原因目前仍不清楚，有待進一步研究。胰酶抑制劑（取自火雞蛋清）組和牛血清白蛋白組非特異性染色較少，尤其是牛血清白蛋白組。其原因可能是二者的成分單一，純度較高。
[參考文獻]
[1] Brent AR，Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of themammalian central nervous system [J]. Science，1992，255（5052）：1707-1710.
[2] Cameron HA，Mckay RD. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus[J]. J Comp Neurol，2001，435（4）：406-417.
[3] Kee N，Sivalingam S，Boonstra R，et al. The utility of Ki-67 and BrdU as proliferative markers ofneurogenesis [J]. J Neurosci Methods，2002，115：97-105.
[4] Praag van H，Kempermann G，Gage FH. Running increases cell proliferation and neurogenesis in themouse dentate gyrus[J]. Nat Neurosci，1999，2（3）：266-270.
[5] Zhao C，Deng W，Gage FH. Mechanisms and functional implications ofneurogenesis [J]. Cell，2008，132（4）：645-660.
[6] Xu WP，Shan LD，Gong S，et al. Forced running enhances neurogenesis in the hippocampal dentate gyrus ofrats and improves learning ability [J]. Acta Physiologica，2006，58（5）：415-420.
[7] Kronenberg G，Bick-Sander A，Bunk E，et al. Physical exercise prevents age-related decline in precursor cell activity in the mouse dentate gyrus [J]. Neurobiol Aging，2006，27（10）：1505-1513.
免疫組化染色范文3
【關鍵詞】病理技術；無醛固定液；甲醛固定液
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.05.060文章編號：1004-7484（2014）-05-2453-02在病理診斷中傳統應用較多的是甲醛固定液，但是甲醛固定液的毒性較大，對人體危害嚴重。無醛固定液是近年來病理診斷中逐漸應用的新型固定液，其免疫組化染色效果較好，且能保證組織細胞的完整性，是病理診斷中較為理想的固定液。為了探討無醛固定液在病理技術中的應用價值，本文選擇我院臨床送檢的61例組織標本，分別用甲醛固定液和無醛固定液固定后，對免疫組化染色效果進行對比，報告如下：
1資料和方法
1.1一般資料選擇我院2009年――2012年臨床送檢的組織活體標本61例進行研究，其中11例結腸癌組織，9肺癌組織，13例乳腺癌組織，12例淋巴癌組織，10例卵巢癌組織，6例前列腺癌組織。
1.2方法
1.2.1試劑每種組織分別取2塊，組織大小為2×1×0.2cm，將每種組織分別納入兩組中，采用甲醛固定液和GS無醛固定液固定組織。試劑：GS無醛固定液、脫水液、浸蠟液、無苯透明液全部由（哈爾濱格林標本技術開發有效公司）提供。甲醛、二甲苯試劑則由（北京益利精細化學品有限公司）提供。另外，在試驗中所需的RPR、HER-2、CAl99、LCA、CD20、CD45RO、EGFR、CK、p53、CAl25等即用型單克隆抗體由（福州邁新生物技術開發有限公司）提供。
1.2.2固定方法①GS無醛固定液固定方法：無醛固定液Ⅰ和無醛固定液Ⅱ分別固定1h和3h，之后用脫水液脫水1h，無苯透明液透明1.5h，浸蠟液1.5h，石蠟包埋，常規切片，切片厚度為5μm。②甲醛固定：采用4%的甲醛液將組織分別固定2h，之后用80%的乙醇脫水1h，無水乙醇脫水1h，二甲苯透明1.5h，浸蠟液1h，石蠟包埋后常規切片，厚度為5μm。
1.2.3免疫組化染色將兩種固定液固定的切片各取一張，切片先進行脫蠟，然后用3%的H2O2室溫孵育10min，用蒸餾水洗3次，每次3min，用高壓鍋修復，溫度為140℃，時間為2.5min，之后PBS洗3次，每次5min，加抗工作液1滴，在37℃下孵育2h，再次PBS洗3次，每次5min，加入Max VisionTM試劑，37℃下孵育30min，再次PBS洗3次，DAB顯色，用蒸餾水沖洗，蘇木精復染核1min后，分化返藍，乙醇脫水，二甲苯透明，用中性樹膠封固。根據組織標本進行免疫組化染色。對同一種組織采用不同固定液固定方法得到切片的免疫組化染色效果進行對比。
2結果
經對比，采用傳統甲醛固定液固定的一組，液面較渾濁，且組織上浮，而采用GS無醛固定液固定的一組，液面清亮，組織沉底，且變硬、變白，具有較好的連續性；免疫組化染色效果顯示，無醛固定液的標本組織細胞抗原性保存較好，背景清晰，且陽性結果定位較準確。
3討論
在病理診斷中免疫組化染色是非常重要的工具，當前大部分的病理診斷均需要通過免疫組化染色。在以往免疫組化染色過程中，結果不穩定情況經常出現，近年來隨著免疫試劑質量的提高和免疫組化染色操作自動化的發展，該狀況有了一定改善，但是結果不穩定情況依然存在。對免疫組化染色結果穩定性產生影響的重要方面就是組織的固定質量，該步驟是實驗室檢測中的最初的一步，也是最關鍵的一步，通過對病理切片制作質量的影響來影響免疫組化的結果，固定液是該操作中必不可少的，而固定液的質量和性質對切片質量產生影響[1]。
在以往病理組織切片制作過程中應用較多的是甲醛固定液，除了具有較高的毒性之外，它具有較強的滲透性，組織收縮小，固定均勻，廉價以及保存組織結構好的優點，因此在病理診斷中應用較多，但是甲醛固定液也存在較大的缺點：首先其揮發性較強，保存要求高，具有強烈的腐蝕性和刺激性，釋放到空氣中對環境的污染嚴重，根據相關的醫學研究，人體直接接觸甲醛可能會引發濕疹、過敏和皮炎，另外眾所周知，甲醛具有致癌性，人長期生活在甲醛環境中，則罹患各種癌癥和呼吸道疾病的可能性增高；甲醛的存放要求高，當存放時間夠長，則會產生白色沉淀，在標本制作中應用會影響固定效果；甲醛氧化活性較高，容易氧化為甲酸，導致整個溶液呈酸性，固定后標本也變為酸性，在細胞核染色時，對其效果產生影響，同時在固定肝、脾等的陳舊組織時，甲醛容易形成甲醛色素，與含鐵血黃色混合，直接影響到病理診斷效果；甲醛固定液用完之后的處理難度較大，需要特殊處理，廢液不能直接從下水管道排出，處理成本較高[2]。
鑒于甲醛固定液存在的缺陷，在醫學研究中，研究人員在不斷尋找甲醛固定液的替代品，我國研究人員經過長期的研究，研制出了GS無醛固定液，該固定液最明顯的特點就是環保，除了無色、無刺激性、低揮發性、對環境危害較小之外，還具有如下優點：具有較強的滲透性，有效縮短了切片制作中脫水時間；具有較好的固定、脫水、脫脂、硬化等作用，減少了組織在制作中出現收縮、空泡、核固縮等；除了能保護組織形態學結構之外，還能保證細胞膜的完整性；用無醛固定液制作的標本易于分離，能有效清除脂肪組織，無需過多的清潔；減少了組織中抗原和核酸被破壞；能較為完整的保存RNA和DNA，可清除顯示細胞的內部結構，便于進行標本精細化研究；無醛固定液的處理較為簡單，以乙醇廢液處理方法相似[3]。
在本組研究中，同一標本采用無醛固定液和甲醛固定液，在相同的免疫組化條件下，在免疫組化染色效果中兩者基本一致，在部分切片中，無醛固定液組的免疫組化染色效果要優于甲醛固定液組。另外在部分研究中對甲醛固定液和無醛固定液的固定時間進行了研究，當固定時間在30d以內，甲醛固定液與無醛固定液的免疫組化染色效果無差異（p>0.05），但是當固定時間超過60d后，相比于甲醛固定液組，無醛固定液組的免疫組化陽性結果呈現較大的優勢（p0.05），說明了無醛固定液固定時間在120d內不會對免疫組化染色效果產生影響，而甲醛固定液則只在60d內不會對免疫組化染色效果產生影響。
綜上所述，無醛固定液的免疫組化染色效果與甲醛固定液基本一致，在某些組織中還優于甲醛固定液，同時固定有效時間要長于甲醛固定液，因此在病理檢查中可用無醛固定液代替甲醛固定液。
參考文獻
[1]潘黎明.環保型無醛固定液與甲醛固定液對免疫組化染色的效果比較[J].現代實用醫學，2013，25（5）：583.
免疫組化染色范文4
【關鍵詞】:小鼠組織;免疫組化技術
【中圖分類號】R392.33【文獻標識碼】A【文章編號】1007-8517(2010)06-034-1
醫學研究和科研領域經常會應用動物模型來進行研究,以此來探索人類疾病的模擬反應。在過去一個世紀的研究中,小鼠已經成為建立人類疾病的動物模型的最佳實驗材料。當科研人員應用小鼠做為研究對象時,往往采用免疫組織化學的方法對小鼠組織進行鑒定和分析。但是由于免疫組化操作的影響因素諸多,免疫組化效果不穩定等因素常常困擾著免疫組化操作者。本文就以上相關問題進行了簡單的總結和分析。
1小鼠組織的應用
小鼠經常被用作動物模型進行科學研究,因為現在小鼠的基因改造技術越來越成熟,并且它的生理生化及發育過程類似于人類,基因組也和人類有90%同源,所以小鼠模型可以基本上真實模擬人類的功能活動和反應;小鼠作為遺傳學研究材料的另一優勢還在于其基因組計劃已基本完成[1]?；蚪M序列的大量信息為研究基因功能及其表達調控、胚胎發育和人類疾病的分子機制提供了條件基礎和技術手段。
2免疫組化的原理及優點
免疫組化技術是在組織化學的方法上結合免疫學的理論和技術發展起來的一門新技術,能將形態、代謝和功能密切結合起來。簡單地說,用已知的抗原或者抗體去檢測待檢組織中的抗原或抗體,其結合后經一系列方法的處理,出現呈色反應,這樣在光鏡下就可以確定組織的來源屬性和部位。免疫組化技術還有著以下的優點。(1)特異性強,抗原抗體的結合具有高度特異性;(2)敏感性高。由于ABC發或SP法的出現時抗原抗體的結合更敏感;(3)定位準確,免疫組化技術可在組織和細胞內準確定位。
3實驗中存在的問題及注意事項
3.1組織的預處理
因為小鼠模型都十分珍貴,所以我們在試驗中應盡量減少失敗的幾率。首先,小鼠組織的剝離要迅速,固定要及時,否則很多組織比如腦組織很容易被破壞。其次,固定時間要適當。固定時間以常溫下6-12小時為宜。過度固定可能導致組織抗原的損失,影響實驗效果[2,3]。最后,組織的脫水時間要適當。拿裸鼠為例,因為其組織比較柔嫩,所以脫水時應該從低濃度乙醇開始,比如50%乙醇梯度開始,并且適當縮短脫水,透明的時間,防止小鼠組織變形,變脆變硬,影響后面的切片和形態觀察。
3.2免疫組化實驗步驟
免疫組織化學技術是多步驟、多因素決定的實驗方法,任何一個環節稍有不慎,都直接影響免疫組化的結果。下面從以下幾個方面進行闡述:(1)抗原修復。由于小鼠組織在福爾馬林或其他固定液中會引起蛋白內或蛋白間亞甲基橋的橋連,導致許多抗原簇被封閉。所以,需要先進行抗原修復或暴露。試驗中應該根據具體組織和抗體選擇最佳的修復方法。(2)減少或消除非特異染色。一般小鼠組織中免疫組化的非特異染色較深,常常干擾實驗結果的觀察。我們應該從以下方面盡量避免:①抗體濃度要適合。試驗中通過設計梯度稀釋抗體來確定最佳抗體稀釋濃度。抗體濃度過高也會產生非特異染色。②PBS洗滌要充分。試驗中盡量使用新鮮的PBS,每次的洗滌時間也要嚴格按照說明書進行。③實驗用的封阻血清要確保與一抗同源,封阻時間也要足夠。④實驗的整個過程中都要確保組織不能干掉。(3)DAB顯色:對二甲胺基偶氮苯(DAB)顯色的時間也不同程度影響免疫組化的最終效果。最好顯微鏡下控制顯色,所以操作者應具備一定的常用抗體定位的知識,不要顯色時間太長,如果無陽性物質,顯色時間過長無益,只能使假陽性的機率倍增。
3.3結果的判斷和分析
免疫組化染色結果的判斷應該是陽性染色強而非特異染色很淡或無,兩者形成鮮明的對比,陽性標記物的位置準確(核、質、膜、血管壁或間質等),細胞邊界清楚。判斷根據:根據陽性細胞的染色強度:(無著色細胞)(一),(+),(+ +),(卅)。免疫組化染色結果還要結合組織形態學判斷是真正的陽性染色而非其他著色。另外實驗的進行還必須設有對照,比如陽性對照,陰性對照,自身對照等,這對結果的分析很重要。
4總結
總之免疫組化是一項很精確的實驗技術。它在小鼠組織研究上的應用有著很重要的科研價值和潛力。近年來,由于檢測技術敏感性的不斷增強;單克隆抗體的制備;基因庫的建立;以及修復抗原性的各種措施、特別是熱預處理法的出現與發展,使得免疫組化技術的使用邁出了嶄新的一步。雖然該技術也同時存在很多困難,但是只要我們認真操作每一個步驟,一定能做出高質量的小鼠的免疫組化切片并且得到有用的實驗結果。
參考文獻
[1] 范爾鐘,李穎,劉仲燕.免疫組化技術在實驗動物組織中的應用體會[J].臨床與實驗病理學雜志,2005,21(1).
免疫組化染色范文5
【論文摘要】近年來分子生物學技術以及其它高、新技術在病理領域得到廣泛的應用，同樣作為體育界的基礎研究學科運動人體科學的發展已經不能滿足簡單的宏觀的研究，越來越多的醫學檢驗以及病理學實驗技術在運動人體科學廣泛應用，尤其是組織病理學技術中定位技術，例如免疫組化、原位雜交等。本文就以上三種病理學常用的定位技術的方法進行綜述。
1免疫組織化學實驗技術
隨著免疫組織化學染色技術的廣泛應用，病理學研究產生了劃時代的飛躍。免疫組織化學是病理學實驗中常用的方法，是在蛋白質水平用各種特異性抗體檢測細胞內各種抗原物質。根據標記物的不同，免疫組織化學技術可分為免疫熒光細胞化學技術、免疫酶細胞化學技術、免疫鐵蛋白技術、免疫金-銀細胞化學技術、親和免疫細胞化學技術、免疫電子顯微鏡技術等。
1.1免疫組織化學實驗步驟免疫組化技術是在組織化學的方法上結合免疫學的理論和技術發展起來的一門新技術。其原理是利用免疫學的核心——抗原體特異性結合的原理，用標記抗體追蹤抗原，通過化學反應使標記于結合后的特異性抗體上的顯示劑，如酶、金屬離子、同位素等顯示一定的顏色，并借助顯微鏡、熒光顯微鏡、電鏡對其顏色進行觀察，以達到檢測抗原物的目的[1]。
1.2免疫組化技術的優點免疫組化技術的優點：①特異性強，免疫組化中抗體與組織細胞中的抗原的結合是特異的。如白細胞共同抗原（LCA）顯示淋巴細胞成分。②敏感性高，而今，由于抗生物素—生物素（ABC）法和鏈酶素—過氧化物酶連接（SP）法的出現，使抗體的稀釋度(代表敏感度)達到了上千、上萬，甚至上億倍，使免疫組化技術更加可靠。③定位準確，由于抗原抗體的結合是特異的，因而免疫組化技術可在組織和細胞內準確定位，對不同抗原在同一組織或細胞中進行定位觀察，將形態與功能相結合，對疾病進行深入的研究。
2原位雜交實驗技術
原位雜交是將組織化學與分子生物學技術結合來檢測合定位核酸的技術。它是用一段已知序列的核苷酸片斷來檢測細胞內是否存在欲檢測物質的DNA或RNA，是比免疫組化更加靈敏而深入一個層次的檢驗方法。根據所選探針和待測靶序列的不同，核酸原位雜交有DNA-DNA雜交、DNA-RNA雜交、RNA-RNA雜交等。
2.1原位雜交技術的應用原位雜交由于不需要從待測組織中提取核酸，可完好的保存組織、細胞的形態結構，將形態學與基因功能活動的變化相結合進行多層面的研究。主要應用：①細胞特異性mRNA轉錄的定位可用于基因圖譜、基因表達和基因組進化的研究；②感染組織病毒DNA/RNA的檢測和定位；③癌基因、抑癌基因及各種功能基因在轉錄水平的表達及其變化的監測；④基因在染色體上的定位；⑤檢測染色體的變化；⑥間期細胞遺傳學的研究。
2.2原位雜交技術與免疫組化的比較
2.2.1兩者的區別原位雜交與免疫組化染色技術相比較，這兩種方法的共同之處均具有定位檢測的功能，且均有較高的敏感性和特異性，所不同的是免疫組化染色是用的是抗體，其檢測對象是抗原，機制是抗原-抗體的特異性結合，是蛋白質表達水平的檢測；原位雜交使用的是探針，遵循堿基互補配對的原則與待測靶序列結合，是DNA或mRNA水平的檢測。從實驗方法來看，免疫組化染色操作相對簡單，成本相對較低，受外界因素的影響相對?。辉浑s交技術無論從實驗設計上，還是從實際操作上均較免疫組化染色復雜，成本的高低與試劑的種類和來源密切相關。一般而言，直接選用商品化的標記探測和檢測試劑盒的實驗成本較高；熒光標記探針較非熒光標記探針的成本高，對樣本及實驗條件的要求較高，也更容易受到外界因素的影響。
2.2.2免疫組化與原位雜交雙標技術雙標技術是在同一張組織切片上標記兩種不同的抗體或同時應用兩種不同的檢測手段，如免疫組化和原位雜交技術，在不同層次來檢測同一細胞上某些物質的表達是否有相關性的一種實驗方法。與傳統的單項檢測相比，雙標記具有無可比擬的優越性，可以克服由于切片間各種差異而引起的時間或空間的樣本誤差。實驗方法上先進行原位雜交會減少免疫組化過程中對待測DNA或RNA的破壞或影響，一般目前均推薦先進行原位雜交后進行免疫組化標記[2，3]。具體的操作跟單純的免疫組化和原位雜交各自的方法一致。需要注意的問題就是：①所用的實驗設備必須經DEPC水浸泡或200℃烤箱過夜，操作時須帶口罩及手套；②當雜交步驟完成后，切片必須認真浸泡及長時間洗滌至少超過30min。③作免疫組化的各步驟時間均須適當延長，以增加抗原抗體間的結合，楊青春等人研究發現每個步驟均延長2～3倍時間。④免疫組化顯色后不需要用蘇木精復染，以免遮蓋核信號。
參考文獻
[1]紀小龍，施作霖.診斷免疫組織化學[M].北京：軍事醫學科學出版社，1997.5.
免疫組化染色范文6
[關鍵詞] 組織細胞壞死性淋巴結炎；臨床病理；免疫表型
[中圖分類號] R55 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2012）30-0102-02
Clinical and pathological analysis of 35 cases histiocytic necrotizing lymphadenitis
YANG Baojun1，2 LI Wencai3
1.Zhengzhou University Basic Medical College， Zhengzhou 450052，China；2.Department of Pathology，Zhongping Nenghua Medical Group General Hospital，Pingdingshan 467000，China；3.Department of Pathology，First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China
[Abstract] Objective To investigate the clinical， pathological characteristics of histiocytic necrotizing lymphadenitis. Methods Retrospective analysis of the clinical data of 35 patients histiocytic necrotizing lymphadenitis. Results The main performance of 35 cases was single or multiple lymphs enlarged node， and persistent fever； the lymph node biopsy showed different degree of coagulative necrosis with various forms of organization cells， lymphocytes， whose immunohistochemical stain reveals many organization cells and T cells， less B cells. Conclusion The histiocytic necrotizing lymphadenitis has not a specific clinical manifestations， the lymph node structure under the microscope is often destroyed，which is commonly coagulative necrosis， and bigger cellular atypia；it is easy to be misdiagnosed for lymphoma、tuberculosis；with careful observation of pathological slide， combining with the history， it can avoid misdiagnosis.
[Key words] Histiocytic necrotizing lymphadenitis；Clinical pathology；Immunotype
組織細胞壞死性淋巴結炎（histiocytic necrotizing lymphadenitis，HNL）是一種特殊類型的非腫瘤性疾病，是一種良性、自限性、全身性疾病。HNL好發于青年女性，近年發病率呈上升趨勢，2002年1月～2011年12月我院共診斷組織細胞壞死性淋巴結炎35例，現報道如下。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
本組病例35例，其中男15例，女20例，年齡14～40歲，平均24.5歲。以頸部淋巴結腫大常見，僅頸部淋巴結腫大有18例，頸部、腋下及腹股溝淋巴結同時腫大9例，僅腹股溝淋巴結腫大8例，淋巴結最大徑為0.5～3.0 cm，皮膚無紅腫、破潰，邊界清楚，無融合、粘連，質地中等，輕度壓痛，均有反復發熱病史，體溫38～40℃，血常規檢查示白細胞計數：（2.4～6.5）×109/L，其中22例血白細胞低于正常值，占62.8%。
1.2 方法
本組病例標本采用常規HE染色與免疫組化染色相結合，在光學顯微鏡下綜合觀察對比分析得出結論。所選免疫組化抗體為CD68、CD20、CD30、CD15、CD3、CD45RO、CD163、CD1a、S-100、Ki-67。
2結果
35例均為完整淋巴結切除活檢，淋巴結包膜完整，質軟，切面灰白間灰黃色，其中20例顯微鏡下可見大小不等、形狀不規則的圖樣的凝固性壞死區域，并可見形態多樣的增生組織細胞及淋巴細胞，病變淋巴結內無中性粒細胞浸潤（圖1）。組織細胞增生并明顯吞噬細胞碎片。另12例可見片狀增生的組織和少量點狀壞死；壞死周圍也可見增生的組織細胞（圖2），免疫組化顯示CD68、CD163陽性細胞較多（圖3）。另外3例在常規HE染色下既看不到大片壞死區，也看不到大片的組織細胞增生，組織細胞數量較多，彌漫分布，此時只能依靠免疫組化，CD3和CD45RO顯示增生的T細胞較多，而CD20陽性顯示濾泡生發中心細胞及少量散在B淋巴細胞，CD30陽性細胞數量較多，強弱不等。Ki-67陽性細胞數較高（圖4），可達50%以上。CD15陰性、S-100陰性、CD1a陰性。見表1。
圖1 形狀不規則的凝固性壞死區域 圖2 壞死周圍增生的組織細胞
圖3 CD68染色 圖4 Ki-67染色
表1 HNL常見的組織結構
3 討論
組織細胞壞死性淋巴結炎又稱Kikuchi淋巴結炎，是一種自限性的良性的淋巴結疾病，該病具有以下特點[1]：①學齡期兒童及青年女性好發；②常有反復發熱病史（可為高熱），熱型不規則，一般持續1～2周，有時可達一個月余；③頸部淋巴結腫大最常見，有時伴有腋下、腹股溝淋巴結腫大，也有少部分病例僅表現為腹股溝淋巴結腫大，隨發熱程度消長，偶有肝脾腫大；④外周血白細胞大多減少；⑤腫大淋巴結活檢?？梢姶笮〔坏取⑿螤畈灰巹t的圖樣的凝固性壞死區域，并可見形態多樣的增生組織細胞及淋巴細胞，病變淋巴結內無中性粒細胞浸潤，病變可累及整個淋巴結或淋巴結的一部分；⑥免疫組化顯示各種形態的組織細胞CD68、CD163陽性，CD1α、S-100陰性，活化的免疫母細胞CD30陽性，CD15陰性；⑦抗生素治療無效[2]。
因本病的臨床表現和實驗室檢查都缺乏特異性，早期容易誤診為病毒感染，所以明確診斷必須通過淋巴結活檢。常見的組織結構有三種形態[3]：①有時可見大片狀的組織細胞增生伴有碎片狀壞死，壞死周圍增生的組織細胞形態多樣，同時有增生的免疫母細胞，壞死區內組織細胞吞噬大量的核碎片。所以凝固性壞死與含有大量核碎片的組織細胞增生是本病的特征性病變之一。文獻報道此種壞死屬于細胞毒淋巴細胞介導細胞凋亡，所以病灶內一般不見或少見炎細胞浸潤[4]。以上情況出現的特征性比較明確，不容易造成誤診。但此時應與淋巴結結核、貓抓病等鑒別。淋巴結結核的干酪樣壞死呈紅染顆粒狀，可見中性粒細胞，壞死周圍可見郎罕氏巨細胞及增生的類上皮細胞；貓抓病的淋巴結內壞死中央區可見膿腫樣的大量中性粒細胞，壞死周圍可見大量放射狀的上皮樣細胞，最重要的是詢問病史，有無養寵物或者被貓狗抓傷、咬傷的病史。但有時壞死周圍除見到大量組織細胞外，還可見大量增生的T淋巴細胞，這些細胞 CD3、CD45RO（+），而CD20陽性B淋巴細胞較少，且Ki-67增殖期指數很高，有時可高達50%以上，此時極易誤診為惡性淋巴瘤，此時免疫組化CD30、CD20陽性細胞胞膜著色強弱不等可排除淋巴瘤[5]。②有時可見大片狀的組織細胞和免疫母細胞增生伴有此少量的壞死，此時應與朗格漢斯組織細胞增生癥在淋巴結單器官發生和間變大細胞T細胞淋巴瘤進行免疫組化鑒別，朗格漢斯組織細胞CD1α、S-100陽性。而HNL的組織細胞CD68、CD163陽性，有時除組織細胞外，還可見大量免疫母細胞增生，免疫組化顯示，這些轉化的免疫母細胞可表達CD30，呈強弱不等陽性，此特點可與間變大細胞T細胞淋巴瘤鑒別[6]。③有時既看不到大片狀組織細胞增生，也看不到壞死，此時需與淋巴瘤、朗格漢斯組織細胞增生癥等鑒別。
該病臨床上容易誤診為細菌性或病毒性淋巴結炎。淋巴結活檢為此病確診的主要手段，有時診斷不清時，多部位的淋巴結活檢可幫助診斷。顯微鏡下組織學形態復雜，除組織細胞增生外，有時還可見大量活化的免疫母細胞增生，當活化的免疫母細胞大量增生時，免疫組化CD30顯示這些細胞胞膜及高爾基體著色，但胞膜著色強弱不等，若不仔細觀察，此時易誤診為淋巴瘤[7]。所以免疫組化檢查非常有必要，但同時免疫組化的判讀也同樣重要，必須綜合分析、仔細觀察常規HE染色切片及免疫組化染色切片，同時結合臨床病史，才能做出正確的診斷。
[參考文獻]
[1] 郭熙哲，潘敬新，郭建欣，等. 組織細胞壞死性淋巴結炎的臨床與病理[J].臨床誤診誤治，2010，23（4）：353-354.
[2] 張寶玉. 成人Burkitt淋巴瘤一例誤診[J]. 臨床誤診誤治，2009，22（10）：99.
[3] 張鵬，李秀忠，張錦，等. 組織細胞壞死性淋巴結炎38例分析[J]. 寧夏醫學雜志，2011，33（4）：336-337.
[4] 回允中. 外科病理學[M]. 第9版. 北京：北京大學醫學出版社，2006：1894.
[5] Taguri AH，Mcllwaine GG. Bilateral panuveitis：a possible association with Kikuchi-Fujimoto disease[J]. Am J Ophthalmol，2001，132（3）：419-421.
[6] Koybasi S，Saydam L，Gungen Y. Histiocytic necrotizing lymphadenitis of the neck[J]. Am J Otolaryngol，2003，24（5）：344-347.
