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一百歲感言范文1
【摘要】 目的： 研究骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植到急性心肌梗死區心肌樣細胞再生后nesprin蛋白的表達情況。方法: 大鼠16只，隨機分為實驗組和對照組，每組8只。利用密度梯度分離法和貼壁培養MSCs，流式細胞儀檢測MSCs表面相關抗原、DAPI標記MSCs備用;SD大鼠開胸手術結扎心臟冠脈左前降支建立心肌梗死模型，并在實驗組梗死區注射MSCs，對照組注射DMEM;術后3周取梗死區心肌，利用免疫細胞學化學方法鑒定肌節肌動蛋白和肌鈣蛋白的表達，免疫熒光技術和蛋白質印跡鑒定nesprin蛋白在MSCs移植后的表達。結果: MSCs移植到梗死缺血區3周后可以用DAPI示蹤、并有心肌細胞特異蛋白呈陽性表達;免疫熒光和蛋白質印跡鑒定在MSCs移植前后有nesprin蛋白的表達，移植后出現nesprin蛋白表達量的增加。結論: MSCs在梗死心肌內移植具有分化再生的能力，nesprin蛋白在MSCs移植后出現表達量的增加，可能在MSCs分化為心肌細胞樣過程中起到一定的作用。
【關鍵詞】 nesprin蛋白; 間充質干細胞; 細胞移植; 心肌細胞再生
[Abstract] Objective: Identify the differentiation of rat bone mesenchymal stem cells(MSCs)into myocardiumlike cells after MSCs was transplanted into acute myocardial infarction.Then， identify the expression of nesprin protein. Methods: Sixteen SD rats were randomly pided into experimental group (n=8) and the control group (n=8).MSCs were isolated and purified from the bone marrow of rats by density gradient centrifugation and adhering to the culture plastics. Surfaceassociated antigens of MSCs were detected by flow cytometry. These cells were labeled with DAPI. SD rats were anesthetized， through thoracotomy，then ligated the left anterior descending coronary artery in order to establish model of myocardial infarction. The DAPI marking MSCs were injected into the infarcted area in the experimental group; DMEM was used in the control group.The expression of αsarcomeric actin， troponin I were studied by immunocytochemistry three week later when MSCs were transplanted into acute myocardial infarction. The expression of nesprin protein in MSCs was identified by immunofluorescence and westernblotting before and after transplantation. Results: MSCs can be traced by DAPI three weeks later when MSCs were transplanted into the infarcted ischemic area. The expression of αsarcomeric actin and troponin I were positive in MSCs three weeks after transplanting into the infarcted ischemic area. The expression of nesprin protein was positive in MSCs by immunofluorescence and westernblot whenever MSCs were transplanted or not. But， three weeks after MSCs were transplanted，the expression of nesprin protein in the infarcted ischemic area was higher than that of DMEM was used in the infarcted ischemic area. Conclusion: This study suggests that MSCs were capable to differentiation with subsequent myocardial regeneration，after being implanted into the infarcted myocardium; the expression quantity of nesprin protein was higher after MSCs were implanted. When MSCs are differentiating into cardiac myocytelike， nesprin protein may play a role in this procession.
[Key words] nesprin protein; mesenchymal stem cells; cell transplantation; cardiomyocyte regeneration
Nesprin蛋白是一種細胞核膜蛋白質，在很多組織均有表達，其中以骨骼肌、心肌和血管平滑肌表達較高;研究發現其除了在細胞的有絲分裂、RNA的復制轉運、細胞核膜的穩定性方面起著關鍵作用外，在細胞的分化中可能也起到相關的作用[1，2]。Nesprin蛋白的缺失將導致相關性疾病的發生，如擴張性心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)、埃德二氏肌營養不良(EmeryDreifuss muscular dystrophy，EDMD)等遺傳性疾病，影響細胞骨架組織和動態平衡，將引起細胞骨架剛性的喪失，或者導致細胞的過早成熟老化[3]。Nesprin蛋白的研究對治療一些以肌肉和心血管系統為表現的遺傳疾病有重要意義。
心肌在缺血損失后表現為功能不全或者嚴重心功能衰竭，雖然藥物和外科手術可以緩解病情，改善組織缺血，但無法改變取代受損的心肌細胞。通過移植骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)到缺血心肌組織可以分泌多種因子，如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等改善心功能，代替受損心肌細胞[4，5]。我們建立大鼠急性心肌梗死模型，將體外分離提取、培養及4′，6二脒基2苯吲哚鹽酸(DAPI)標記的MSCs經局部注射移植入梗死心肌區域內。觀察MSCs在梗死心肌移植后的分化情況，同時對nesprin蛋白進行鑒定，為臨床細胞移植治療心臟疾病打下理論基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
健康SD大鼠16只，體質量250～300 g，由上海交通大學醫學院動物實驗中心提供。隨機分為實驗組和對照組，每組8只。
1.2 主要試劑和儀器
LDMEM培養基、特級胎牛血清FBS、0.25%胰蛋白酶和EDTA(Gibco公司);密度為1.077的Ficoll(GE公司);熒光標記抗鼠CD45FITC、抗鼠CD90PE(eBioscience公司);抗鼠CD29APC(BioLegend公司);抗鼠心肌特異性肌鈣蛋白I(TnI)抗體、抗鼠肌節肌動蛋白、兔抗大鼠nesprin蛋白抗體(Abcam公司);Triton(Amresco公司);牛血清白蛋白BSA(Proliant公司);細胞分離液(Gibco公司);熒光標記山羊抗兔LgG(Abcam公司);Trizol(Invitrogen公司);BCA 試劑盒(碧云天公司)。倒置熒光相差顯微鏡(Olympus公司);FACSca流式細胞儀(Becton Dickinson公司);垂直電泳儀(GE公司);半干轉膜儀、硝酸纖維素膜(BioRad公司);ECL發光劑(GE公司);柯達活體成像儀cymentre2000(Kodak 公司);無菌DAPI 儲存液 (Sigma公司);動物小型呼吸機(浙江動物實驗儀器廠)。
1.3 MSCs的分離和培養[6-8]
密度梯度離心貼壁培養法:引頸處死SD大鼠，75%乙醇浸泡，無菌條件下取股骨和脛骨，在無菌皿中，用LDMEM反復沖洗骨髓腔;利用密度梯度離心法分離MSCs。含LDMEM，20% FBS，100 U/ml氨芐西林的培養液懸浮獲取細胞，調整細胞濃度為2×106/ml后，25 cm培養瓶、37 ℃ 5%CO2細胞培養箱培養。3～4 d后首次換液，去除不貼壁細胞，以后每2～3天換液1次，倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁及生長情況，待細胞長滿至瓶底面積的80%～90%后，用0.25%胰蛋白酶常規消化，按1∶3比例傳代培養。第2代的MSCs用來實驗研究。
1.4 MSCs的特征性抗原的鑒定[8]
取第2代MSCs，細胞分離液消化，被測細胞濃度用含1%FBS的PBS緩沖液調節至1×106/ml，吸取50 μl標本，加入抗大鼠CD45FITC、CD90PE和CD29APC各10 μl，對照未加抗體;4 ℃暗環境孵育30 min。PBS洗2遍后加入0.5 ml PBS將細胞打勻，應用流式細胞儀檢測MSCs表面抗原CD45、CD90和CD29的表達情況。
1.5 DAPI標記細胞
第2代的MSCs 80%～90%融合時，移植細胞當天將無菌的DAPI儲存液加入培養的MSCs培養液中，至終濃度為50 mg/L，37 ℃孵育染色至少30 min。細胞至少用PBS平衡鹽溶液沖洗6遍以除去未結合的DAPI。離心收集細胞，用無血清的DMEM懸浮，移植所需細胞數為3×106，置于冰上備用。
1.6 動物模型的建立及細胞的注射
通過結扎冠脈左前降支建立急性心肌梗死模型。將動物注射10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)麻醉后固定在手術臺上，用筆型靜脈置留針進行氣管插管接呼吸機(呼吸頻率85次/min;呼吸比1∶1;潮氣量18 ml)，胸部剃毛、乙醇棉球消毒，在左胸3～4肋間逐層進胸，在左心耳與肺動脈圓錐下1～2 ml左右找血管，穿70號線，拉緊絲線，形成心肌缺血，觀察線扎緊的部位上下范圍的心肌有發白，手術完成關胸。梗死模型以組織病理學驗證。心肌梗死1周后注射MSCs，使用30 G針頭、1 ml注射器把用DAPI標記的細胞0.3 ml(3×106個細胞)分3點注射到心肌梗死區內，對照組使用等量未含細胞的DMEM。
1.7 心肌梗死的病理學檢測
模型成功后將大鼠脫頸處死，打開胸腔，將心臟剪下，用生理鹽水將心臟清洗干凈并排出心臟內的淤血，分別用刀片將心臟切成1 mm厚的切片，放入0.1%的2，3，5氯化三苯基四氮唑(TTC)磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)，37 ℃水浴7～10 min，取出切片用生理鹽水沖洗數次，觀察結果。蘇木精伊紅(HE)染色按步驟進行。
1.8 組織免疫熒光化學檢測
3周后處死動物，取出心臟，取梗死區組織進行冰凍切片(8 μm/張)，在熒光鏡下觀察到有DAPI標記的細胞存在，并進行相應部位免疫熒光染色檢測肌節肌動蛋白和nesprin蛋白的表達。將冰凍切片放入4 ℃酮內固定10 min，晾干后，用0.01 mol/L，pH7.4的PBS沖洗切片3×3 min，再用0.1% Tritonx100處理15 min PBS漂洗切片，使切片保持一定濕度。0.03%過氧化氫/甲醇封閉內源性過氧化物酶20 min(25 ℃;1% BSA室溫孵育30 min 后加入各種蛋白抗體4 ℃過夜;第2天，加熒光標記二抗，25 ℃孵育60 min;PBS漂洗3×5 min;取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。立即用熒光顯微鏡觀察(實驗過程避光操作)。觀察標本的特異性熒光為陽性反應。對照組取相同部位梗死組織，操作均同，以供對照。
1.9 蛋白質印跡鑒定nesprin蛋白的表達情況
收集MSCs組和DMEM組心肌梗死區組織檢測nesprin蛋白，提取蛋白， BCA 法測定蛋白質含量。參照分子克隆實驗指南進行純化蛋白的SDSPAGE。SDSPAGE電泳、轉膜、封閉后加入1∶1 500稀釋的抗neprin多抗(用TBST稀釋)，4 ℃反應過夜。加入羊抗兔IgGHRP (TBST稀釋 1∶5 000)，室溫作用2 h，TBST漂洗，加入ECL顯色液，置于柯達活體成像儀中觀察結果，條件設置為曝光5 min，CCD自動獲取圖片結果。相應蛋白表達值為條帶的灰度值除以β肌動蛋白(1∶1 000， 43 ku)內參照校正。
1.10 統計方法
使用Image Programer軟件對圖片進行分析，利用GraphPad Prism 5 Demo和SAS v6.12軟件進行相關統計學分析，所得數據用均數±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，實驗進行3次。
2 結 果
2.1 MSCs培養和細胞的特性鑒定
培養24 h后約80%左右貼壁，貼壁細胞中見少許逗點狀或短棒狀細胞。3天后，貼壁細胞呈短梭形、多角形，細胞呈扁平多角不規則形態。7～10 天左右細胞間排列漸緊密、呈均勻一致的長梭形，并有克隆集落形成、漸融合，貼滿瓶底，原代培養結束。流式細胞儀分析MSCs表面抗原CD29和CD90陽性，CD45陰性(圖1)。
2.2 DAPI標記細胞效果情況
DAPI標記的細胞1 h染色效果較強，3周后效果明顯減弱，可能是出現熒光衰減(圖2)。
2.3 TTC和HE染色結果
TTC染色示非梗死區因脫氫酶還原TTC而呈紅色，梗死區因脫氫酶流失而呈白色;HE染色示心肌梗死區心壁明顯較正常心壁變薄(圖3)。
2.4 免疫熒光檢測結果
DAPI標記3周后在熒光顯微鏡下仍可見，移植3周的MSCs熒光染色表現出肌節肌動蛋白和肌鈣蛋白陽性結果，移植心肌梗死區MSCs檢測到有nesprin蛋白的陽性表達，對照組未見明顯的相應表達(圖4)。
2.5 蛋白質印跡鑒定nesprin蛋白的表達
結果顯示，MSCs組nesprin蛋白表達量高于DMEM組，差異有統計學意義(P
3 討 論
MSCs可以使用Ficoll密度梯度分離法和貼壁培養法得到有效的分離和擴增，MSCs可以在體外擴增和誘導最終分化成軟骨細胞、脂肪細胞、肌腱細胞、神經細胞、肌細胞和心肌細胞等。MSCs具有較好的可塑性和活力，我們課題組前期研究表明骨髓單個核細胞移植可以提高心肌缺血模型的心功能，但單個核細胞至少包含了造血干細胞、間充質干細胞和內皮組細胞等;曾用Brdu標記MSCs移植到心肌缺血模型，3周后檢測到MSCs表達MHCs、肌鈣蛋白等心肌特異性收縮蛋白和縫隙連接蛋白43，同時產生連接效應，與相關學者報告一致[4，5]。在本實驗中我們再次進行DAPI標記的MSCs移植，DAPI對細胞無明顯毒性作用。實驗3周后在熒光鏡下仍能看到DAPI標記的MSCs。使用熒光免疫學和蛋白質印跡技術檢測到3周后移植到體內缺血區的MSCs表達肌鈣蛋白和肌節肌動蛋白。進一步說明了MSCs在體內有分化為心肌樣細胞的能力，但什么原因引起MSCs分化和MSCs分化的機制并不明確，為此我們對MSCs分化前后的另一蛋白——nesprin蛋白進行了檢測和對比，以提出此蛋白可能在MSCs分化中起到一定的作用。
細胞分化中基因表達的調節控制是一個十分復雜的過程，在蛋白質合成的各個水平，從mRNA的轉錄、加工到翻譯，都會有調控的機制。在DNA水平也存在調控機制(如基因的丟失、放大、移位重組、修飾以及染色質結構的變化等)。相關研究發現:在細胞有絲分裂間期nesprin1和2與核膜附近異染色質存在表位連接[1，2]。nesprin1直接與伊默菌素結合，但由于蛋白核膜位點結合區的退化而不能和自整合障礙因子(barriertoautointegration factor，BAF)相結合，BAF蛋白質與dsDNA的連接牽涉到染色質的重塑和轉錄過程[9]。體外共沉淀實驗證明nesprin1和2蛋白的鈣調蛋白同源區域和肌動蛋白連接，在細胞遷移過程中調整組織細胞骨架肌動蛋白起到了作用[2， 3]。在骨骼肌肌節內，不同的nesprin1和2存在Z帶、A/I接頭、肌質網和線粒體膜上，肌節蛋白如鈣離子通道受體(ryanodine受體)和mAKAP與nesprins相結合[10]，有關研究表明nesprin1α為肌細胞A激酶定位蛋白(muscle Akinase anchoring protein，mAKAP)在心肌細胞核膜上的受體，而由mAKAP及相關成分組成的復合體在心肌細胞內具有傳導cAMP和鈣離子信號的作用[10]。研究證實了在肌肉形成過程中，有nesprin蛋白各亞型量的增加或者減少，說明nesprin蛋白在肌細胞中起到了關鍵的調節作用;nesprin1基因突變導致了人和小鼠心臟疾病的發生，說明nesprin蛋白的缺失將引起細胞的異常增殖、異常分化和個體器官的異常發育[11]。
本實驗中利用蛋白質印跡檢測到nesprin蛋白在移植MSCs心梗組織的表達量高于未移植MSCs的心梗組織。有關研究提示nesprin是肌細胞分化過程中復雜結構的重排和重組所必需，這在肌肉興奮/收縮過程中，對保證肌細胞內細胞器正確的空間定位以確保鈣信號正常傳遞非常重要。體外實驗:C2C12肌細胞分化成肌管，nesprins從細胞核及核膜轉移到細胞質和肌節，表明nesprins在肌肉的分化中起到特殊的作用。但其如何引起細胞的分化還不清楚。本實驗發現nesprins在MSCs移植后出現表達的增加，可能在分化中起到了作用。肌節肌動蛋白是橫紋肌肌動蛋白，僅存在于骨骼肌和心肌，是肌細胞舒縮活動的物質基礎。肌鈣蛋白是心肌細胞中的調節蛋白，由鈣離子參與調節、控制收縮蛋白的舒縮活動。正因為多種蛋白都與鈣離子的參與和調節相關、且對細胞骨架的維持和信號傳遞相關，以后的研究考慮是否能夠以鈣離子作為切入點尋找一條信號通道對MSCs分化成心肌細胞的機制進行相關研究。
(本文圖2～圖4見彩色插圖)
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一百歲感言范文2
《項脊軒志》中有語：“庭有枇杷樹，吾妻死時所手植之，如今已亭亭如蓋矣?！碧K軾曾言：“十年生死兩茫茫，不思量，自難忘?！蓖堑磕钔銎?，一個親手栽樹以表思念之綿長，一個眼淚成詩以示思念之深切。無須痛哭，無須多言，讓這思念在心中生根發芽，他年瓜瓞綿綿，亭亭如蓋。這是人對生命中摯親的真情。
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楊絳說：“我只是一滴清水，不是肥皂水，不能吹泡泡?！钡拇_，生命應如一泓清水，于簡單淡然中散發光彩。當今社會，一片喧囂，機遇與陷阱并行，簡約與浮華并存。我們不能心高氣傲，不能企圖一步登天，要保持內心的簡單安寧，腳踏實地，全情投入所做的事情中。
海子云：“目擊眾神死亡的草原上野花一片，遠在遠方的風比遠方更遠?！痹刚媲橛诤唵沃虚W耀，與你我比肩行向遠方。
教師點評
一百歲感言范文3
尊敬的各位領導、各位老師、同學們：
下午好！很榮幸能代表2014屆全體高三老師在這里與大家交流。今天是距離高考310天的日子，直面高三，高考已不再遙遠，不論你意識到還是沒意識到，不論你在學習狀態還是沒在學習狀態，高考都在悄悄地逼近你。很多同學可能今天心中還是模糊的，會默默地問：高三是什么？高三我怎樣過？
高三將促成人生中一次真正意義上的成長，無論是身體，還是思想。高三乃是大苦與大樂的最佳結合，惟有大苦，方能大樂。高三將帶來一種徹悟，"何物動人，六月鳳凰八月桂；有誰催我，三更燈火五更雞"。高三，并不只是背書，做題，成打的試卷，成堆的草稿紙，弄清高三內涵的全部，把軌道切入高三，是每個即將開始高三生活的同學刻不容緩的問題。進入高三，適應高三，從心理到行動，完成角色上的轉換，是今天要談的主題。
一、高三，首先是一種精神，一種狀態。什么是高三精神，請允許我用五個特別給大家描述：“特別能吃苦，特別能忍耐，特別有信心，特別有志氣，特別有作為"。很難想像，一個沒有理想，沒有志氣的人，會有所作為；一個沒有強大動力作支撐的人，能談得上吃苦，而且還是特別；一個沒有堅韌意志品質的人，能在"人生極處是精神"的拚殺中達到成功的彼岸，體會到苦中之樂的人生真味。因此，以咬定青山之志，鼓足信念的風帆，以飽滿的精神，以激昂的斗志，以強烈的投入拚殺的渴望，以刻不容緩，只爭朝夕的銳氣，跑步進入高三，是學校對同學們的殷切期望。
二、高三，是意志的頑強和內心的淡定。進入高三，免不了許多的考試，免不了許多的挫折與失敗。當成績不如別人而想到前景叵測，當苦拚過一段后考試成績依舊，當看到父母臉上的擔憂與關注，許多人都會感到焦慮，浮躁，對自己的信心與能力產生懷疑，甚至選擇放棄，自己扳倒自己。平庸與偉大往往只是在一念之間，而這一念往往要有頑強的意志。同學們，你不能樣樣順利，但你可以事事盡力；你不能回避挫折，但你可以東山再起，從頭再來；你不能預知明天，但你可以利用今天；你不能決定生命的長度，但可以控制它的寬度。最近看錢鐘書夫人楊絳先生的《一百歲感言》，很欣賞那一句“一個人經過不同程度的鍛煉，就獲得不同程度的修養、不同程度的效益。好比香料，搗得愈碎，磨得愈細，香得愈濃烈?！贝送?，我還欣賞另外一句話：“人生最曼妙的風景，竟是內心的淡定與從容……”，可能你們會說，這是何等的修為啊，可能要等100歲才能領悟。但我認為不是的，高三一年承載的東西太多了，但它卻如此的短暫，倘若我們樣樣焦慮，事事擔心，我們又怎能嚴謹、細心去落實我們每一天的計劃呢！所以我們在激情滿懷的同時也要保持內心的淡定與從容。
三、高三意味著科學與高效。高考需要每位同學有理性的頭腦，有科學高效的學習謀略。只有科學的，才能是高效的；只有是理性的，才能是準確的。我們的手頭有許多成功者的經驗，但模仿一個成功者的全部，未必會成為另一個成功者。借鑒別人的經驗，規劃好自己的高三，體現自己的個性特征，體現科學與高效，才是好的學習策略。規劃高三，也許很容易，關鍵在于不論風清日淡，還是電閃雷鳴；不論是坎坎坷坷，還是一馬平川，都能堅韌不撥，始終如一地執行它。堅持就是科學，堅持就是高效。
四、高三，是一種境界。有的同學可能會說，我已經規劃好高三了，我知道現在最重要的事情就是學習，其他什么事我都不管了，為什么我的成績還是不能提高。我想說你沒有觸摸到學習的精髓，你的成績當然不能提高，因為學習還需要一種境界，一種厚德載物的境界。德，當然指品德，德行，修養，我想把它抽象出來，就是根基、行為、習慣，就像種樹一樣，無數人都一心往上長，從來不往下長，結果上面不斷長，下面沒有扎根，如水中浮萍，無根之草，如何枝繁葉茂呢！關于怎樣扎根，下面給同學們四點意見供參考：
1、感恩的心。你要感謝生活和學習中的萬事萬物，身邊的每一個人，如果你擁有感恩的心，就好比在水中放進了一小塊明礬，它能沉淀所有的渣滓，沉淀很多的浮躁與不安，消融許多的不滿與不幸。擁有感恩的心，你才能快樂地學習，幸福地生活。
2、寬廣的胸懷。一個人只有心胸寬闊，才能容納得了更多的知識。你可以現在審視自己，是否經常會生氣，經常對身邊的人、事、物感到不滿意，如果這樣就說明你的心胸狹隘，當然知識就不能夠進入。
3、堅守本心。你內心的本真是什么？來象賢中學時你的夢想是什么？現在還記得嗎？你堅守住了嗎？到現在為此，你已經過了十一年的寒窗苦讀，在高三的最后310天你能否保持努力，為內心的夢想全速前進呢？同學們，只要你能堅守住內心最原始的真實，你必將加速你夢想的實現。
4、嚴謹的生活態度。其實生活即學習，生活中散漫，丟三落四，衣冠不整，紀律問題不斷，學習當然上不了層次，在上百年前弟子規對學習態度就有了很好的說明：房室清、墻壁凈、幾案潔、筆硯正、字不敬、心先病、列典籍、有定處、讀看畢、還原處。注重生活中的細節，養成良好生活習慣，是你的學習能取得突破的基本條件。
同學們，如果你提升了厚德載物的境界，你必將厚積薄發。
