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三查三比對照檢查材料范文1
【關鍵詞】皮質發育不良；卡莫司?。恍缕べ|；海馬；雙向電泳；質譜；差異蛋白表達；癲癇
Comparative proteomics of rat brain in the BCNU-induced model of cortical dysplasia GUO Yi， ZHANG Man-man， DING Yao， YANG Yi， JIANG Yan， HU Jian-wen， DING Mei-ping. Department of Neurology， Second Affiliated Hospital， School of Medicine， Zhejiang University， Hangzhou 310009，China
Corresponding author： DING Mei-ping， Email：
【Abstract】ObjectiveTo screen the differential proteins in the brain （neocortex and hippocampus） between the rats with cortical dysplasia （CD） and control ones， and investigate the role of their alteration in the development of epilepsy in CD. MethodsCortical dysplasia was induced in rat pups via in utero delivery of BCNU. A two-dimensional electrophoresis （2-DE）-based approach was used to construct the expression profiles of proteins in both the neocortex and hippocampus at different age groups （postnatal day 7 and 60） and to detect proteome changes between CD rats and control ones. Following gel image analysis， protein spots that differed in abundance between CD and control rats were identified by using Matrx-assisted laser desorption/ionization （MALDI） mass spectrometry （MS） and MS/MS. ResultsA total of 57 kinds of protein were screened out（P
【Key words】Cortical dysplasia； BCNU； Neocortex； Hippocampus； 2-DE； Mass spectrometry； Comparative Proteomics； Epilepsy
皮質發育不良（Cortical dysplasia，CD）是難治性癲癇的重要病因之一，但CD的致癇機制仍有待進一步闡釋。比較蛋白質組學技術是一種新型的高通量差異蛋白篩查技術，正在逐步運用到神經病學研究的各個領域。我們采用卡莫司汀誘導的CD大鼠模型，運用雙向電泳技術對比分析CD大鼠和正常大鼠皮質及海馬組織在不同發育時期（新生期和成年期）的蛋白質表達譜，篩選出差異表達的蛋白質斑點并應用MALDI-TOF-MS技術平臺進行鑒定，以期進一步探討皮質發育不良癲癇易感性的發生機制并發現新的治療靶點。
1材料與方法
1.1動物模型的建立與實驗分組
健康懷孕Sprague-Dawley大鼠5只由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供，孕17 d（Embryonic day 17， E17），體質量270～320 g。于E17隨機選取3只孕鼠腹腔內注射卡莫司汀（天津金耀制藥廠），給藥劑量為15 mg/kg，E22仔鼠出生，所產雄性仔鼠存活11只歸入模型組；余下2只孕鼠在同一天腹腔內注射同等劑量生理鹽水，所產雄性仔鼠存活16只入對照組。仔鼠出生當天記作P0，到P21與母鼠分開飼養。P7隨機（隨機數字法）選取模型組和對照組仔鼠各3只，行病理切片對照檢查驗證制模成功。
1.2蛋白質樣品的制備與雙向凝膠電泳
在P7和P60分別隨機（隨機數字法）選取模型鼠和對照鼠各3只，留取前額部分新皮質并分離海馬組織[1]，所得標本液氮中速凍后-80 ℃保存。
取大約300 mg樣本，PBS清洗后切碎成1 mm3見方的小塊，轉移至勻漿器中，加入2D裂解液（9.5 mol/L 尿素，65 mmol/L DTT， 4% CHAPS， 0.2% IPG 緩沖液，按1∶50加入蛋白酶抑制劑約1 mL，均來自美國sigma公司），勻漿20次，全過程在冰上完成。將勻漿液轉入離心管中，超聲破碎細胞（80 W，5次，每次10s，間隔15 s，冰上完成）。12 000 g離心45 min，取上清液蛋白定量后-80 ℃低溫保存。
雙向電泳：上樣100 μg，IEF為pH 3～10 非線性膠條（瑞典Amersham公司），電泳在Ettan IPGphor Isoelectric Focusing System和Hofer SE 600（美國GE Amersham公司）中進行（電泳條件：30 V 12 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，8 000 V 8 h，500 V 4 h），SDS-PAGE為12.5%的膠，先15 mA/膠 30 m，然后換30 mA/膠至溴酚藍離膠下沿0.5 cm）。每個樣品常規進行3次雙向電泳，銀染后經UMax Powerlook 2110 XL（美國GE Amersham公司）掃描，獲得圖譜。采用ImageMaster 2D軟件對圖像進行背景消減、蛋白質點檢測和校正，獲取蛋白質點的位置坐標和表達量等分析。
1.3質譜掃描與數據庫搜索
選取并切下差異點（表達量比>1.8），做膠內酶解，每個膠粒切碎后放入離心管中，每管加入30～50 μL 30 mmol/L K3Fe（CN）6 ：100 mmol/L Na2S2O3=1∶1（體積比）脫色，凍干后，加入5μL 2.5～10.0 ng/μL測序級Trypsin （Promega）溶液，37 ℃反應過夜，20 h左右；吸出酶解液，轉移至新管中，原管加入100 lL 60% ACN /0.1% TFA， 超聲15 min，合并前次溶液，凍干；若有鹽，則用Ziptip（美國Millipore公司）進行脫鹽。
樣品與5 mg/mL HCCA基質1：1混合后，用4800 串聯飛行時間質譜儀（美國Applied Biosystems公司）進行質譜分析，激光源為355 nm 波長的Nd：YAG 激光器，加速電壓為2 kV，采用正離子模式和自動獲取數據的模式采集數據，PMF 質量掃描范圍為800～4 000 U，選擇信噪比大于50的母離子進行二級質譜（MS/MS）分析，每個樣品點上選擇8個母離子，二級MS/MS激光 激發2 500次，碰撞能量2 kV，CID關閉。
質譜結果查NCBI，IPI和EST庫。
2結果
2.1病理驗證結果
CD組仔鼠P7、P14大腦切片尼氏染色后鏡下觀察見：皮質變薄，皮層紊亂；海馬區神經元排列稀疏，可見神經元異位成團狀聚集，見圖1、2。
A：P7正常鼠皮層；B：P7模型鼠皮層
圖1P7皮質切片焦油紫尼氏染色圖（×50）
Fig 1Nissl staining in cortical tissue sections on P7 （×50）
A、B：正常鼠P14海馬；C～F：P14模型鼠海馬
圖2P14海馬區腦組織切片尼氏染色圖（×200）
Fig 2Nissl staining in hippocampus sections on P14 （×200）2.2差異蛋白組學研究結果
各實驗組組織雙向電泳重復3次，組內匹配率均高于85%。在模型組和對照組之間共篩選出57個差異表達蛋白質斑點（P
圖3P7 d皮質雙向電泳圖圖4P7 d海馬雙向電泳圖
Fig 32-DE graph for proteinsFig 42-DE graph for proteins
from neocortex at P7 dfrom hippocampus at P7 d
3討論
深入探討CD癲癇易感性的發生機制并發現新的藥物靶點是難治性癲癇治療的重要課題之一，本研究首次將差異蛋白組學的研究方法應用于該領域。海馬同多種類型癲癇發作密切相關，是癲癇研究的熱點。本研究選取皮質、海馬兩個位點，分別于新生期和成年期對差異蛋白進行篩選，樣本組織具有一定的代表性和多元性，能更全面地獲取相關目的蛋白。限于篇幅，本文僅對已有相關證據表明同癲癇相關的蛋白進行討論。這些蛋白質參與細胞骨架構成、突觸形成、線粒體功能活動和磷酸化作用等多種生理過程。
細胞骨架是一種高度動態的結構，在構成細胞腳手架、維持細胞形態、維持可塑性、胞內運輸和信號傳導等方面起重要作用。腦部細胞骨架的破壞將導致多種神經病理變化，如神經元死亡、突觸小體丟失等，可見于唐氏綜合癥、阿爾茨海默病等神經退行性疾病。細胞骨架主要由三類細胞質結構蛋白構成：微管蛋白、肌動蛋白和中間絲蛋白。我們鑒定出的蛋白涵括了這三類蛋白。
微管蛋白（表1中微管蛋白alpha-1B， 微管蛋白beta-2A）在真核細胞染色體分離、細胞形態和大小、軸突運輸、細胞器分布和神經元極性等方面起至關重要的作用；肌動蛋白（表1中Beta-肌動蛋白）支架則參與控制細胞形狀、膜蛋白分布、入胞轉運機制等[2]。
膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein， GFAP）屬于中間絲蛋白，具有多種異構體。GAFP-delta與其他異構體在C-末端的結構存在差異，形成獨特的41氨基酸序列。對人類組織GAFP-delta表達模式的研究發現該型異構體特異分布于軟膜下層、海馬顆粒下層和腦室室管膜下層等區域[3]。GAFP-delta蛋白的表達會影響神經絲的穩定和細胞的能動性。目前認為，GFAP-delta的表達改變可出現于多種與癲癇相關的病理改變中。動物實驗結果顯示GFAP在海馬和皮質的表達譜隨著癲癇發生發展的時程而改變[4-5]。對CD所致的人類癲癇患者腦組織的研究發現，氣球樣細胞中出現GAFP-delta蛋白的表達改變，類似的改變還見于海馬硬化患者膠質增生區域[6]。
這些蛋白的差異表達意味著神經細胞傳導通路中結構和功能的變化，提示它們在海馬和皮質功能中具有廣泛而重要的作用，可能參與信息存儲及長期可塑性等病理變化并最終促進癲癇的發生發展。
GAP-43是一種磷蛋白，在未成熟神經元細胞中高表達。一般而言，當軸突生長延伸到達目的部位，突觸生長完成后，GAP-43表達迅速降低。該蛋白是軸突末梢生長的調節因子，也是突觸新生的調控因子[7-8]。由于突觸聯系的重塑活動持續存在，在成熟大腦的特定區域如嗅球海馬等部位，GAP-43表達仍然維持在一定的高水平[9]。 GAP-43表達上調和興奮性突觸環路重組在多種腦損傷模型中也可出現，包括腦撞擊、液體沖擊腦損傷和興奮性毒素注射等[10]。
GAP-43 mRNA和蛋白在島葉電點燃致癇大鼠海馬中表達增高，且表達變化與海馬突觸重建時程基本一致。在鋰-匹魯卡品誘導的癲癇大鼠海馬中也發現GAP-43mRNA表達上調[11]。Bolognani等學者的研究進一步發現GAP-43mRNA在突觸重塑過程中的表達變化接受RNA結合蛋白HuD的調控[12]。對海馬嚴重硬化的人類癲癇患者的研究發現，齒狀回顆粒層的GAP-43水平上調。諸多證據表明突觸可塑性的改變可能是維持顳葉癲癇的病理基礎，且與認知功能損害密切相關[13]。而本實驗表明CD的海馬組織中GAP-43蛋白表達譜發生改變，該變化可能與CD的癲癇原性相關。該發現與Yamanouchi等學者對CD癇源性病灶的研究結果一致，他們的研究發現CD特征病理之一的異常形態神經元中GAP-43表達增高，提示可能存在突觸重塑活動的進一步激活[14]。
3.3廣泛型線粒體肌酸激酶（ubiquitous mitochondrial creatine kinase，UbCKmit）
腦是高耗能器官，其中很大一部分ATP用以維持正常分子轉運、信號傳導、樹突刺重塑和神經遞質回收等活動。此外，除極化過程或癲癇發作時鈣泵和鈉鉀泵的活動也需要消耗ATP[15]。腦型肌酸激酶（Brain-type creatine kinase，CK-B）和UbCKmit是局部磷酸肌酸-ATP循環的重要催化酶，參與維持神經元細胞和神經膠質細胞高能磷酸分子的區域穩定。線粒體功能異常可導致能量供應不足、離子穩態改變等，甚至引起細胞死亡[16]。
相關研究顯示CNS線粒體功能異常與癲癇發作相關，海馬線粒體功能異?？芍耇LE動物模型癲癇發作時程延長。Streijger等學者基于UbCKmit基因敲除鼠的研究提示UbCKmit介導的高能磷酸轉移過程在聽覺反應突觸信號傳導和海馬依賴性學習環路中起一定作用[17]。其后他們又對CK基因雙敲除（CK-B和UbCKmit-/-）的大鼠進行PTZ誘導，該型大鼠癲癇敏感性顯著下調并且可記錄到明顯的癲癇相關腦電波，這些改變可能和海馬區神經元鈣離子清除速率增高可能和有關[18]。
總之，該蛋白的表達改變將導致線粒體功能異常，并進一步引起神經細胞丟失和海馬損傷。然而，該蛋白在CD致癇過程中的作用仍有待進一步研究。
GAPDH是GABAAR αⅠ亞單位內源性磷酸化的激酶，維系著GABAAR的正常功能。本研究中成年CD大鼠皮質組織中GAPDH含量較對照組顯著降低，提示CD組織中GAPDH激酶系統可能存在缺陷。對難治性癲癇患者致癇灶的研究也顯示，這些區域皮質神經組織內磷酸化作用削弱，GABAAR功能下調，并可能進一步易化癲癇的產生和/或發作[19]。生酮飲食對小兒癲癇的療效甚佳，其對代謝的影響之一是增高細胞質基質和線粒體的NADH/NAD+的比值。對急性分離錐體細胞進行的全細胞膜片鉗記錄顯示NADH比NAD+更能加強GAPDH激酶活性和GABAAR功能，因而，Pumain等學者認為促進GAPDH對GABAAR的磷酸化功能是生酮飲食抗癲癇的機制之一[20]。
TMBr-3是腦型原肌球蛋白的一種異構體，分布于各腦區，但具體功能不詳。推測TMBr可能通過與肌動蛋白細胞骨架的互動在神經系統發育和可塑性中起特異性作用，但各異構體在腦組織中表達的區域性和時間上均不盡相同[21]。TMBr-3只出現在神經元細胞中，分布于突觸前末梢，其表達水平隨著成熟過程上升。這些證據表明TMBr-3在維持神經元網絡和突觸功能方面具有一定的作用[22]。本研究成年CD大鼠TMBr-3蛋白表達下調，可能提示病變累及組織發育遲緩、成熟度下降，在某些特征模式上趨向于不成熟化，與CD相關研究結果吻合。而這種不成熟狀態可能削弱了神經元網絡的穩定性，增加對癲癇的易感性。
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（收稿日期：2013-04-04）
DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2013.12.013
基金項目： 浙江省自然科學基金（Y2080475）；國家自然科學基金（81000556、81171227）
作者單位：310009杭州， 浙江大學醫學院附屬第二醫院神經內科（郭誼、張曼曼、丁瑤、楊怡、蔣艷、丁美萍）；中科新生命生物科技有限公司（呼建文）