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宿管申請書范文1
申請人：趙天倫 男 漢族 初中文化 56歲 住界首市王集鎮趙集行政村趙玉莊157號
被申請人：趙天現 男 漢族 初中文化 56歲 住界首市王集鎮趙集行政村趙玉莊
請求事項：請求依法確認，將位于趙玉村東頭橋西柏油路南的一宗土地的使用權（東鄰趙天現、西鄰溝北鄰路南鄰地）確權給申請人使用。
事實和理由：申請人和被申請人同住趙玉莊，申請人趙天倫的父親趙金亮和被申請人趙天現的父親趙金拔是親兄弟。申請人趙天倫的父親趙金亮在世時，因申請人趙天倫的弟弟李修賢（小時候給姓李的了）1988_1998年在趙玉村橋西路南燒吊窯，占用趙集寨瞿金佳組的荒地，申請人的父親趙金亮就把自己的可耕地1.7畝，和同村村民趙天山的可耕地（東地大園子）進行調換，趙天山又和同村村民趙錦金的可耕地（在趙集寨后）進行調換，趙錦金又和瞿金佳進行調換。這樣經過四次調整，就把趙集寨瞿金佳組在趙玉村東頭的可耕地調到了趙集寨后。1998年申請人趙天倫的弟弟李修賢不燒吊窯時，又把此1.7畝可耕地，退還給申請人趙天倫的父親趙金亮。1993年因申請人的父親趙金亮年老多病，就把此地塊交給被申請人趙天現代耕代種至今。申請人的父親趙金亮死后，有申請人趙天倫一人出錢出物辦的喪事，其他人沒有出過一分錢，因為申請人的繼母曹美榮仍然在世，申請人趙天倫并沒有主張使用權，因此地塊的收入屬于申請人的繼母曹美榮受益，現在申請人的繼母曹美榮已去世，申請人依法要回此地塊的使用權。申請人趙天倫多次找到被申請人趙天現協商解決此事，但被申請人趙天現，以替申請人的父親趙金亮看病付過藥費（沒有任何證明只是口說）和此地塊已經曹美榮調到梁莊西頭為由拒不把此地塊的使用權交給申請人趙天倫。經村干部、鎮司法所多次調解無效。申請人根據《中華人民共和國土地法》第十六條、《安徽省土地權屬爭議處理條例》第三十條 第三十四條之規定，申請王集鎮人民政府依法支持申請人的請求。
附：1、身份證復印件一份以證實自己有訴訟的權利。
2、1994年地改時趙玉村的地畝冊子以證明所爭議地塊的使用權屬于申請人的父親趙金亮。
3、2005年3月3日趙天現與趙華東簽訂的合同及被申請人領取租金的證詞一份以證明被申請人趙天現說2005年之前已調整為假話。
此致
王集鎮人民政府
申請人：
宿管申請書范文2
【關鍵詞】腎上腺切除；高血壓；相關因素
后腹腔鏡腎上腺切除術治療原發性醛固酮增多癥目前已得到廣泛的的臨床應用。據張旭等的研究結果顯示[1-2]，經后腹腔途徑行腎上腺切除術具有多方面優點，如入路較傳統方法更為直接、解剖關系也較傳統方法清楚。臨床上原發性醛固酮增多癥的患者主要表現為高血壓癥狀。本研究旨在探討影響后腹腔鏡腎上腺切除術后患者高血壓改善情況的相關因素，便于臨床醫生對原發性醛固酮增多癥患者行腎上腺切除術后高血壓是否會得到改善進行評估。
1 研究對象與方法
1.1 研究對象
收集2011年6月～2015年6月于我院外一泌尿外科科行后腹腔鏡腎上腺切除的原發性醛固酮增多癥合并高血壓患者79例。病例納入標準：（1）明確診斷為原發性醛固酮增多癥（2）合并高血壓（3）口服降壓藥不能控制血壓。病例排除標準：（1）非原發性醛固酮增多癥引起的高血壓（2）嗜鉻細胞瘤。本研究經過我院醫學倫理會批準同意，所有患者均自愿參加并簽署知情同意書。
1.2 研究方法
收集2011年6月～2015年6月于我院外一泌尿外科行后腹腔鏡腎上腺切除的原發性醛固酮增多癥合并高血壓患者79例的相關臨床資料，并于術后一年后對患者進行隨訪，統計患者血壓改善情況，將79例患者分為術后血壓改善組和術后血壓未改善組，通過統計學分析處理，探討影響患者術后高血壓改善情況的的相關因素。
1.3 統計學處理
統計分析軟件采用SPSS 19.0進行統計分析，用x±s表示計量資料，采用t檢驗進行組與組之間的比較，用百分數表示計數資料，采用卡方檢驗。差異無統計學意義則P>0.05，差異有統計學意義則P 0.05。多因素Logistic回歸分析患者術后高血壓改善情況的相關因素，結果用優勢比（OR）和95%置信區間（CI）表示。
2 結果
表1原發性醛固酮增多癥患者腎上腺切除術后高血壓改善組與術后高血壓未改善組單因素分析結果（x±s）
2.1 如表1所示，把79例患者中術后高血壓改善組有67例，占比84.81%，術后高血壓未改善組12例，占比15.19%，這表明患者經后腹腔鏡腎切除術后大部分血壓狀況能夠得到改善。通過分析處理發現，兩組之間在性別、年齡、體質指數方面沒有明顯差異（P>0.05），在高血壓病程是否大于6年上有明顯差異，差異具有統計學意義（P
2.2 如表2所示，多因素Logistic回歸分析發現，高血壓病程大于6年（P
3 討論
腹腔鏡手術在臨床上目前已經得到廣泛應用，與傳統開腹手術相比，其對腹腔干擾和損傷均較小，有利于患者術后康復。目前，后腹腔鏡腎上腺切除術治療原發性醛固酮增多癥已得到廣泛的的臨床應用。近年來，據研究提示[3-4]，原發性醛固酮增多癥患病率達到了20%，其已發展成為繼發性高血壓的首要病因。
Kim等[5]研究指出，術后血壓得到改善的患者為85.2%，未得到改善的為14.8%。本研究選取的79例患者中術后高血壓改善組有67例，占比84.81%，術后高血壓未改善組12例，占比15.19%，這與Kim等的研究結果大致相同。本研究顯示經后腹腔鏡腎上腺切除的原發性增多癥的患者血壓改善情況與性別、年齡、體質指數方面無相關性，高血壓病程大于6年是影響患者術后血壓能否得到改善的危險因素之一。
綜上所述，高血壓病程小于6年的原發性醛固酮增多癥患者通過后腹腔鏡腎上腺切除術能夠較好地改善高血壓情況，病程大于6年的患者希望經后腹腔鏡腎上腺切除術達到改善高血壓情況則有一定的風險。
【參考文獻】
[1]張旭.解剖性后腹腔鏡腎上腺切除術的手術方法和技巧[J].臨床泌尿外科雜志，2007，22（8）：561-564.
[2]張旭，傅斌等.后腹腔鏡解剖性腎上腺切除術[J].中華泌尿外科雜志，2007，28（1）：5-8.
[3]Lim PO，Rodgers P，Gardalek，et al.Potentially high prevalence of primary aldosterronism in a primary-care population[J].Lanc et，
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[4]Fogari R，Preti P，Zoppi A，et al，Prevalance of primary aldoste
ronism among unselected hypertensive patients：a prospective study based on the use of an adldosterone/reninratio above 25 as a screening test[J].Hyperten Res，2007，30（2）：111-117.
宿管申請書范文3
關鍵詞 滋陰益腎 清熱疏肝法 特發性血小板減少性紫癜激素減撤
特發性血小板減少性紫癜(ITP)是一種免疫介導的以外周血小板破壞增多而引發的疾病。以皮膚、黏膜或內臟出血為主要臨床表現，約占出血性疾病的30%。80%成年ITP患者均為慢性過程，起病隱匿，病因不明。治療上，西醫常用糖皮質激素、各類免疫抑制劑、脾臟切除、大劑量丙種球蛋白、促血小板生長因子等治療，少數難治性患者甚至需動用聯合化療或造血干細胞移植等方法治療。然而，激素依賴的問題越來越受人們的關注。為此，在給予西醫常規治療的同時加用中藥滋陰益腎，清熱疏肝治療，取得了較好的治療效果的同時也明顯減輕了患者的激素依賴性，減少了激素治療的不良反應?，F報告如下。
資料與方法
慢性型ITP患者80例，依其就診先后順序，采用隨機數字表法將其隨機分為兩組，每組40例。治療組40例，男14例，女26例，病程3.1～9.2年，平均3.5年。對照組40例，男16例，女24例，病程3.0～8.8年，平均3.4年。經統計學分析，兩組的性別、病程、臨床癥狀、血小板計數及骨髓巨核細胞等方面無顯著差異(P＞0.05)，具有可比性。
病例診斷標準及排除標準：⑴診斷標準：均符合張之南主編《血液病診斷及療效標準》(第2版)ITP診斷和分型標準［1］。所有病例除符合診斷標準外，還符合以下條件：前期經正規潑尼松治療，治療效果達到良效標準(血小板＞50×109/L)［2］，且潑尼松已減量30mg/日。⑵排除標準：如有下列情況之一不納入該研究：①有高血壓病、糖尿病、冠心病等口服糖皮質激素治療的禁忌癥者；②依從性差，不愿服用中藥；③存在心、肺、肝、腎、腦等重要臟器功能不良，影響療效觀察；④合并嚴重的腦出血，導致神志昏迷，無法從事研究。同時符合上述診斷標準及排除標準方可納入本研究。
治療方法：對照組繼續口服潑尼松，30mg/日，每周減量2.5mg，8周后減至10mg，維持治療。治療組在對照組基礎上加服滋陰益腎，疏肝清熱的中藥湯劑。處方：熟地20g，首烏20g，山茱萸10g，白芍15，旱蓮草15g，雞血藤30g，巴戟天10g，雞內金10g，白術12g，茯苓12g，石斛20g，柴胡15g，女貞子10g，黃精15g，黃芩6g。水煎，日1劑。觀察12周后判斷療效。
療效判斷標準［2］：①顯效：血小板數恢復正常，無出血癥狀，持續3個月以上；②良效：血小板回升至50×109/L，或較原水平上升＞30×109/L，無或基本無出血癥狀，持續＞2個月；③進步：血小板上升，出血癥狀改善，持續＞2周；④無效：血小板計數及出血癥狀無改善或惡化。激素減撤反跳判斷：觀察期間不能繼續維持顯效、良效、進步，導致激素減撤時間延長(或不能繼續減撤)判為反跳。反跳率=(1-該組未出現反跳的人數/該組總人數)×100%。
統計學處理：采用SPSS統計學軟件進行數據處理。
結 果
總體療效比較：治療組總有效率95%，對照組總有效率80.0%。經統計學處理，兩者有顯著性差異(P＜0.05)。見表1。
治療組與對照組比較：見表2。
討 論
試驗證明，補腎中藥與激素合用，可減輕或消除長期應用皮質激素所致的腦垂體前葉的形態改變。滋陰中藥有減輕或防止長期應用皮質激素所引起的腎上腺皮質萎縮的作用。溫陽藥有類似激素的作用，但無激素的不良反應，它可能是在改善HPA軸功能的基礎上而發揮作用［3］。在從腎論治減輕激素不良反應的同時肝亦起到重要的作用。肝藏血，具有調節血量的功能。人體在應激狀態下，肝臟對血液的調節作用可保證心腦腎等重要臟器精微物質的灌流。而且肝臟對內分泌具有促進作用。推測神經遞質、激素的釋放等神經內分泌活動均與肝臟功能有關［4］。
因此，確立滋陰益腎，清熱疏肝的治療方法。方中取熟地、首烏、黃精，補陰益腎，填精養血；石斛滋陰除熱、旱蓮草、女貞子既能滋陰清熱，又有涼血止血之功；白芍、柴胡和黃芩相伍疏肝清熱涼血，雞血藤為補中寓行，補血行血；巴戟天補腎助陽、山茱萸既能補精，又可助陽，二藥溫而不燥，于大劑滋陰藥中無傷陰化火之弊，使陽得陰助而生化無窮，陰得陽升而泉源不竭；再佐以白術、茯苓和雞內金運脾消食，防諸藥滋膩礙脾。諸藥同用，切中患者激素減撤時之病機，共奏滋陰益腎、清熱疏肝之功。
中藥防治激素不良反應由來已久，本次臨床觀察采用隨機對照的方法，發現治療組的總體有效率明顯高于對照組，且治療組治療后反跳率明顯低于對照組，進一步明確應用滋陰益腎、清熱疏肝可以穩定ITP患者激素減撤時血小板數，減少反跳復發，療效確切，值得臨床推廣應用。
參考文獻
1 張之南.血液病診斷及療效標準［M］.北京:科學出版社,1998:279-284.
2 薛志忠,周永明,何偉,等.生血靈治療原發性血小板減少性紫癜止血機制探討［J］.上海中醫藥雜志,1999,(10):19-20.
宿管申請書范文4
基金項目：蘇州市2013年“科教興衛”青年科技項目（KJXW2013026）
作者單位：215007 江蘇省蘇州， 蘇州大學附屬第二醫院急診與重癥醫學科[陸件（在讀碩士研究生）、錢會銀（在讀碩士研究生）、劉勵軍、周保純、肖鹽]，心內科[毛錦寧、安國?。ㄔ谧x碩士研究生）]，血液科[芮明忠（在讀碩士研究生）]，檢驗科[王濤（在讀碩士研究生）]；南通大學醫學院電鏡教研室（朱昌來）
通信作者：劉勵軍，Email：
【摘要】目的 觀察亞低溫（MH）對心肺復蘇（CPR）后海馬神經細胞活性氧（ROS）產生量和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）mRNA和自噬相關蛋白輕鏈3（LC3）表達的影響。方法 65只健康成年雄性SD大鼠隨機數字法隨機分為2組：空白對照組（BC，n=5）；CPR組（n=60）。CPR組制作窒息法心肺復蘇模型，在自主循環恢復（ROSC）后再隨機分為2組：常溫CPR組（NT）和低溫CPR組（HT）。NT組在ROSC后保持37 ℃恒溫，HT組在ROSC后立即行低溫32 ℃干預4 h。根據觀察時點的不同，再將兩組CPR組隨機分2個亞組：即 ROSC后12 h和24 h組（NT-12，NT24，HT-12，HT-24）。到達觀察時點先對存活大鼠進行神經功能缺損評分（NDS），然后立即取雙側海馬組織，應用流式法檢測大鼠海馬單細胞懸液ROS水平。利用透射電鏡觀察海馬神經細胞細胞核和線粒體的超微結構形態學變化。利用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術測定海馬神經細胞caspase-3mRNA的表達水平；蛋白免疫印跡法（WB）測定海馬神經細胞LC3蛋白水平。應用SPSS 19.0軟件包，計量數據以均數±標準差（x±s）表示，兩組間均數比較用成組t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。結果 60只大鼠中有44只（73%）成功ROSC，存活到觀察時點的有33只大鼠（55%）。NT和HT組各時點的NDS明顯低于BC組（F=8.107，P
【關鍵詞】亞低溫；心肺復蘇；活性氧；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；輕鏈3；自噬
The impact of mild hypothermia on the ROS and expression of caspase-3mRNA and LC3 of hippocampus nerve cells in rats after cardiopulmonary resuscitation Lu Jian， Qian Huiyin， Liu Lijun， Zhou Baochun， Xiao Yan， Mao Jinning， An Guoyin， Rui Mingzhong， Wang Tao， Zhu Changlai. Department of Emergency and Critical Care Medicine， The Second Affiliated Hospital of Soochow University， Suzhou， 215007， China
Corresponding author： Liu Lijun， Email：
【Abstract】Objective To observe the impact of mild hypothermia （MH） on the reactive oxygen species （ROS） and expression of cacpase-3mRNA and light chain 3 （LC3， a subunit of immunoglobulin） in hippocampus nerve cells of rats after cardiopulmonary resuscitation （CPR）. Methods A total of 65 healthy male Sprague Dawley （SD）rats were randomly（random number） divided into 2 groups： blank control group （n=5） and CPR group （n=60）. Cardiac arrest （CA） was induced in rats of CPR group by asphyxia. The survival rats after CPR were randomly（random number） divided into 2 groups： normothermia CPR group （NT） and hypothermia CPR group （HT）. Homeothermia of 37 ℃ was maintained in NT group after restoration of spontaneous circulation （ROSC）， and hypothermal intervention to 32 ℃ was carried out in HT group for 4 hours immediately after ROSC. Both NT group and HT group were then randomly divided to 2 subgroups 12 hours and 24 hours after ROSC （NT-12， NT-24， HT-12， HT-24 subgroups）. During observation， the neurological deficit （NDS） of rats was scored， then the bilateral hippocampi were obtained from rats' head， and monoplast suspension of fresh hippocampus tissue was made immediately to determine the level of intracellular ROS by flow cytometry. Transmission electron microscope was used to observe the ultrastructure changes of cellular nucleus and mitochondria. Reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） was used to determine the expression of caspase-3mRNA and Western-blotting （WB） was used to determine the level of LC3 in frozen hippocampus tissue. Measured data were analyzed with paired sample T test and One-Way ANOVA. Results Of 60 rats with CA， 44 were successfully resuscitated （73%） and 33 survived until the end of the experiment （55%）. The NDSs of rats in NT and HT groups were significantly reduced in comparison with BC group （F=8.107， P
【Key words】Mild hypothermia； Cardiopulmonary resuscitation； Reactive oxygen species； Caspase-3； LC3； Autophagy
隨著心肺復蘇（CPR）技術和急診醫學的發展，大多數心臟驟停（CA）患者能恢復自主循環，但均遺留有不同程度的神經功能障礙，造成家庭和社會的巨大負擔[1]。神經細胞凋亡是CA后存活患者神經功能障礙的主要病理生理過程，如何預防和控制CA后腦神經細胞凋亡的發生和發展是減少繼發性神經功能障礙的重要治療措施之一[2]。腦神經細胞在缺血缺氧后凋亡的發生與細胞自噬程度密切相關[3]，這種自噬與凋亡的關系以及其調節機制尚需進一步的明確。本研究采用窒息法大鼠心肺復蘇模型，來觀察亞低溫（mild hypothermia， MH）對CPR后大鼠海馬神經細胞活性氧（reactive oxygen species， ROS）產生量和神經功能的影響，并探討其相關機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物分組
采用雄性健康成年SD大鼠[由中科院上海動物實驗研究所提供，合格證號：SCXK（滬）2007-0005，周齡16～18 周，體質量（450±45）g，共65只；隨機（隨機數字法）分為兩組：空白對照組（BC，n=5）、CPR組（n=60）。BC組用3.6%水合氯醛（批號：120203，國藥集團化學試劑有限公司）按10 mL/kg進行腹腔內注射麻醉后，氣管插管和股動、靜脈置管，不建立窒息CPR模型，待穩定后開始計時，到達觀察時間點后進行NDS，然后在麻醉狀態下處死大鼠取腦。CPR組在麻醉后，氣管插管和股動、靜脈置管，并復制窒息大鼠CPR模型（詳見模型制備），待成功自主循環恢復（ROSC）后，再將大鼠分為常溫CPR組（NT）、低溫CPR組（HT）。NT組在ROSC后保持其體溫在
37.0 ℃，HT組在ROSC后立即予32 ℃低溫干預，持續4 h后開始緩慢復溫至正常體溫。根據觀察時點的不同，再將上述CPR組大鼠隨機分為2個亞組，即ROSC后12和24 h組（NT-12，NT24，HT-12，HT-24）。
1.2 模型制備和神經功能缺損評分
模型參照Idris等[4]所建立的方法進行。用3.6%水合氯醛（10 mL/kg）腹腔注射麻醉，然后將大鼠固定于鋪有控溫毯（型號：MODLE6900，深圳瑞沃德公司）的操作臺上。大鼠氣管插管后用24 G套管針行股動、靜脈置管，股動脈置管成功后接壓力換能器。所有大鼠均行心電、肛溫及有創動脈壓監測（8導生物信號采集系統MD3000，安徽淮北正華生物儀器設備有限公司）。操作完成后再穩定5 min，期間予心肺復蘇裝置（型號：A-CPR-IIC，中山大學心肺腦復蘇研究所）機械通氣，心肺復蘇裝置參數如下：呼吸頻率100次/min、潮氣量6 mL/kg、吸氧體積分數100%通氣1 min，然后將吸氧體積分數改為21%繼續通氣4 min。采用呼氣末夾閉氣管導管模擬窒息，CA判定標準如下：收縮壓（SBP）≤25 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），并持續至心電圖呈直線。此后，開始復蘇，予機械通氣 （呼吸頻率50次/min，潮氣量6 mL/kg，氧濃度100%）；同時，使用心肺復蘇裝置進行胸外心臟按壓，頻率250次/min，按壓深度為大鼠胸廓前后徑的1/3。復蘇開始10 s后，經股靜脈注射腎上腺素（批號：120505，上海禾豐制藥有限公司）（0.01 mg/kg）。CPR后ROSC的標志：出現自主心律和SBP≥60 mmHg，
并持續10 min以上[4]。復蘇前和復蘇時動物肛溫均控制在（37.0±0.5）℃。HT組在復蘇后立即予控溫毯、冰袋和風扇等降溫措施將肛溫降至32 ℃，持續4 h后再以0.5 ℃/h的速度緩慢復溫至37.0 ℃。到達觀察時點先按Geocadin等[5]的方法進行神經功能缺損評分（neurological deficit scores， NDS），然后在麻醉下處死大鼠獲取海馬組織標本。
1.3 檢驗取材方法
CPR組大鼠在窒息前、ROSC后0.5 h和4 h均從股動脈抽取0.5 mL動脈血（取血后補充等量生理鹽水）行血氣分析。各組大鼠在到達觀察時間點之前均予5%GNS灌胃（10 mL/kg，1次/6 h），到達相應的觀察時間點后，先對大鼠進行NDS，然后在麻醉狀態下心內注射10%氯化鉀2 mL處死大鼠，切開胸骨，分離心包，暴露心臟，將穿刺針經左心室送入升主動脈，剪開右心耳，經心臟快速灌注4 ℃生理鹽水250 mL至右房流出液清，迅速斷頭取腦，分離雙側海馬。左側海馬切取2/3立即在冰上研磨制作單細胞懸液，剩余1/3行電鏡觀察；右側海馬-80 ℃凍存，用于caspase-3mRNA和LC3B表達的測定。
1.4 流式細胞儀檢測細胞內ROS水平
左側海馬取出后切取2/3在冰上用裝有冷PBS的玻璃勻漿器內勻漿10次，經300目尼龍過濾網過濾，收集濾液600×g 4 ℃離心5 min，棄上清，冷PBS重懸沉淀，反復吹打后再離心，重復上述操作3次，最后用冷PBS重懸沉淀，用活性氧檢測試劑盒（貨號：S0033，碧云天生物技術研究所）中的DCFH-DA按1∶1000的濃度裝載探針，37 ℃孵育20 min后用PBS洗滌3次，最后重懸后用流式細胞儀（型號：FACSCalibur，美國BD公司）檢測，分析100000個單細胞內的DCF熒光強度，取其平均值。
1.5 caspase-3mRNA表達測定
采用RT-PCR法測定：用Trizol（批號：120805，美國GIBCO公司）抽提RNA；逆轉錄mRNA至cDNA；再用PCR擴增儀（型號：9700，美國應用生物系統中國公司）擴增cDNA。由invitrogen上海提供合成引物，caspase-3引物：上游5’-GCA CTG GAA TGT CAG CTC GCA-3’，下游5’-GCC ACC TTC CGG TTA ACA CGA-3’，擴增產物大小559 bp；β-actin引物：上游5’-CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA-3’，下游5’-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC A-3’，擴增產物大小300 bp。反應條件：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共30個循環；最后72 ℃終末延伸7 min。擴增產物用電泳儀（型號：三恒ECP3000，北京市六一儀器廠）電泳，電泳后攝片，并應用Vilber凝膠成像分析系統（型號：Type T2A，法國Lourmat公司）進行吸光度掃描，以目的條帶與β-actin的積分比值表示caspase-3mRNA的相對表達量。
1.6 LC3B表達測定
采用Western blot法測定：用蛋白裂解液RIPA（中）（貨號：P0013C，碧云天生物技術研究所）在玻璃勻漿器中裂解凍存組織，高速離心后得上清蛋白溶液。采用BCA蛋白含量測定試劑盒（貨號：P0010S，碧云天生物技術研究所）測定蛋白濃度；然后，用SDS-PAGE（貨號：P0012A，碧云天生物技術研究所）制備12%的分離膠和6%濃縮膠。加樣后恒壓100V電泳，電泳結束后轉PVDF膜，轉膜后加一抗（anti-LC3B 1∶1000；anti-GAPDH 1∶800）；過夜后加二抗（second anti-LC3B 1∶3000；second anti-GAPDH 1∶4000）。孵育后將膜包好進入暗室壓片并洗片，使用凝膠成像分析系統對膠片進行掃描分析，以特定的目標蛋白條帶OD值（volume）與內參蛋白GAPDH（volume）比值表示LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表達水平。
1.7 透射電鏡標本制作
將左側海馬剩余1/3新鮮組織塊用手術刀片切成1 mm3大小，并用4%戊二醛固定，然后用0.1 mol/L磷酸緩沖液洗2次，每次15 min。1%鋨酸固定1 h，再用0.1 mol/L磷酸緩沖液洗2次，每次15 min。30%丙酮脫水15 min，50%丙酮脫水15 min，70%丙酮飽和醋酸鈾過夜。過夜后再用80%丙酮脫水15 min，90%丙酮脫水15 min，100%丙酮脫水3次，每次10 min。將包埋劑與100%丙酮按1∶1比例放置1 h，然后將組織塊放入膠囊包埋，放入烘箱，制超薄切片并枸櫞酸鉛染色待檢。
1.8 統計學方法
用SPSS 19.0和office excel 2007統計軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間均數比較用成組t檢驗，多組間比較用LSD-t檢驗，以P
2 結果
2.1 CPR組大鼠窒息和復蘇時間以及存活情況
60只大鼠制模成功44只（73%），存活到觀察時點者33只（55%）。心臟驟停后大鼠主要復蘇措施以機械通氣和胸外心臟按壓為主。在復蘇過程中大鼠的心律未見長時間的心室顫動，故在復蘇過程中未使用心臟電除顫。各組大鼠窒息和復蘇時間差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。
2.2 CPR組大鼠基本生命體征及血氣分析變化
CPR組大鼠在窒息前、ROSC后0.5和4 h各項生命體征（除Tc外）差異無統計學意義（P>0.05）。動脈血氣分析結果比較，HT組ROSC后4 h乳酸水平明顯低于NT組（t=2.146，P=0.036），余各相同時點血氣分析指標間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表2、3。
2.3 ROSC后各組NDS情況
結果發現，CPR組各組大鼠的NDS顯著低于BC組（F=8.107，P
NDS滿分為80分，0分為腦死亡；BC：空白對照組；NT：常溫CPR組；HT：亞低溫CPR組；ROSC：自主循環恢復；NDS：神經功能缺損評分。NT和HT組與BC組比較，aP
圖1 各組NDS比較
Fig 1 NDS in each group
2.4 各組大鼠海馬單細胞懸液ROS的變化
與BC組比較，CPR組各組大鼠海馬組織單細胞懸液反應ROS水平的指標――DCF值均明顯上升（F=16.824，P
A：空白對照組；B：常溫CPR組ROSC后12 h；C：低溫CPR組ROSC后12 h；D：常溫CPR組ROSC后24 h；E：低溫CPR組ROSC后24 h。每組的左圖是通過流式細胞術分辨出的在單細胞懸液中不同的有形物質，白色箭頭標注的是所計數的單細胞群，右圖是該細胞群的平均熒光度
圖2 各組大鼠海馬單細胞懸液ROS檢測流式細胞圖
Fig 2 ROS flow cytometry in hippocampus monoplast suspension of each group
2.5 海馬神經細胞caspase-3mRNA表達水平
與BC組相比，CPR組各組大鼠海馬神經細胞caspase-3mRNA表達均明顯升高（F=24.527，P
BC：空白對照組；NT12：常溫CPR組ROSC后12 h；HT12：低溫CPR組ROSC后12 h；NT24：常溫CPR組ROSC后24 h；HT24：低溫CPR組ROSC后24 h；ROSC：自主循環恢復。ROSC后NT和HT組的平均熒光強度與BC組比較，aP
圖3 各組大鼠海馬單細胞懸液ROS檢測結果比較
Fig 3 ROS compare in monoplast suspension of each group rats
A：目的基因caspase-3mRNA（559 bp）的表達。從左向右依次為BC組、NT組ROSC后12 h、HT組ROSC后12 h、NT組ROSC后24 h和HT組ROSC后24 h；B：為內參照β-actin （300bp）的表達，從左向右依次為BC組、NT組ROSC后12 h、HT組ROSC后12 h、NT組ROSC后24 h和HT組ROSC后24 h。BC，空白對照組；NT，常溫CPR組；HT，低溫CPR組
圖4 各組大鼠海馬神經細胞caspase-3mRNA表達
Fig 4 Caspase-3mRNA expression in hippocampus nerve cells of each group
2.6 大鼠海馬神經細胞LC3B表達水平
與BC組相比，CPR組各組大鼠海馬神經細胞LC3B表達均明顯升高（F=6.584，P
2.7 透射電鏡觀察結果
ROSC后24 h取各組大鼠海馬組織作電鏡觀察?？瞻讓φ战M大鼠的海馬神經細胞核，核膜完整、光滑，核染色質分布均勻；線粒體，外膜完整，嵴光滑清晰可見，基質均勻。常溫復蘇組大鼠的海馬神經細胞核體積縮小，核膜有皺褶，核染色質邊集、密度不均勻；線粒體體積明顯減小，嵴紊亂、粗糙，基質濃縮。低溫復蘇組大鼠的海馬神經細胞核體積略有縮小，核膜尚光滑，核染色質略有邊集，分布尚均勻；線粒體體積略有減小，嵴可分辨，基質濃度略不均勻。見圖8。
BC：空白對照組；NT-12：常溫CPR組ROSC后12 h；HT-12：低溫CPR組ROSC后12 h；NT-24：常溫CPR組ROSC后24 h；HT-24：低溫CPR組ROSC后24 h。NT和HT組的caspase-3mRNA表達量與BC組比較，aP
圖5 各組大鼠海馬神經細胞caspase-3mRNA表達水平比較
Fig 5 Caspase-3mRNA in hippocampus nerve cells in groups
（A）目的蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ（16/18 kd）的表達，從左向右依次為BC組、NT組ROSC后12 h、HT組ROSC后12 h、NT組ROSC后24 h和HT組ROSC后24 h；（B）內參照GAPDH（36 000）的表達，從左向右依次為BC組、NT組ROSC后12 h、HT組ROSC后12 h、NT組ROSC后24 h和HT組ROSC后24 h。BC，空白對照組；NT組，常溫CPR組；HT組，低溫CPR組
圖6 各組大鼠海馬神經細胞LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達
Fig 6 LC3B-Ⅱ/Ⅰ expression in hippocampus nerve cells of each group
3 討論
治療性低溫已成為心臟驟停患者腦復蘇治療的有效措施之一；然而，它也主要對院外心室顫動心臟驟停患者有益，提示低溫可能僅對輕、中度腦損傷患者有益；但是其有效的主要機制仍有待研究。
BC：空白對照組；NT-12：常溫CPR組ROSC后12 h；HT-12：低溫CPR組ROSC后12 h；NT-24：常溫CPR組ROSC后24 h；HT-24：低溫CPR組ROSC后24 h。NT和HT組的LC3B- Ⅱ/Ⅰ表達量與BC組比較，aP
圖7 各組大鼠海馬神經細胞LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達水平比較
Fig 7 LC3B-Ⅱ/Ⅰ expression in hippocampus nerve cells of each group
A：空白對照組大鼠的海馬神經細胞核（×8000）；B：常溫復蘇組大鼠的海馬神經細胞核（×8000）；C：低溫復蘇組大鼠的海馬神經細胞核（×8000）；D：空白對照組大鼠的海馬神經細胞線粒體（×40 000）；E：常溫復蘇組大鼠的海馬神經細胞線粒體（×40 000）；F：低溫復蘇組大鼠的海馬神經細胞線粒體（×40 000）；G：常溫復蘇組大鼠的海馬神經細胞線粒體（×40 000）被雙膜結構（黑箭頭所示）包圍形成自噬體
圖8 各組大鼠海馬神經細胞核和線粒體的超微結構變化
Fig 8 Electron micrographs of nucleus and mitochondria in each group
心臟驟停后全身各器官、組織和細胞缺血缺氧，使呼吸鏈傳遞電子的效能下降，并使電子受體減少，造成缺血區ROS的產生并未增加[6]。經CPR治療恢復自主循環（ROSC）后，再灌注血液中含有大量的氧，而此時線粒體呼吸鏈的酶活性卻未能迅速恢復，致使氧經單電子還原成氧自由基增多[7]。此外，Ca2+超載也使線粒體功能受損，細胞色素氧化酶系統抑制，最終使ROS的產生超過組織的清除能力[6]，進而造成細胞膜和細胞器不同程度受損，甚至引起細胞壞死和凋亡[8]。本研究結果表明，大鼠海馬神經細胞在缺血-再灌注（I/R）后胞內ROS明顯增高，這與細胞在缺血缺氧后發生級聯反應的結果是一致的。低溫治療使ROS的產生量較相同時點的NT組明顯減少（圖2、3），其原因可能與MH能降低ROS的產生，同時具有保護清除ROS的酶系統有關。
Caspase-3是凋亡通路的最后執行者，能從一定程度上反應細胞凋亡的程度[9]，已有研究結果表明，MH能通過減少神經細胞的凋亡而使神經功能得到保護[10]。本研究中發現，MH能顯著減少腦細胞I/R后ROS的產生量，并且與caspase-3mRNA的表達有一定的相關性。其原因可能是ROS的減少，通過抑制鈣介導的興奮性氨基酸與氧自由基之間的惡性循環，使caspase-3mRNA表達減少（圖4、5），在一定程度上降低了細胞凋亡的程度。
另外，自噬通常被認為是細胞的一種保護性作用，它在維持缺血缺氧等應激狀態下使細胞存活[11]，并清除細胞內衰老細胞器和錯誤折疊蛋白中起重要作用[12]。但是，近年來也發現，在某些條件下細胞自噬也能導致細胞死亡，即所謂過度自噬[13]。除利用電鏡可觀察自噬體形成外，還可以利用WB的方法檢測LC3的形成，從而判斷自噬發生的程度[14]。由于LC3B在腦中表達較多，可以用作腦細胞自噬的分子標志[15]。在自噬過程中，LC3-I被泛素樣體系修飾和加工，產生相對分子質量為16 000的LC3-Ⅱ，并被定位到自噬小體中。故此，自噬小體中存在的LC3I和LC3-Ⅱ均可成為細胞發生自噬的分子標志，并且LC3Ⅱ的含量和發生自噬的程度成正比[16]。本研究也發現，HT組LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表達較相同時相點的NT組有所下降（圖6、7），表明MH減小了細胞的自噬程度，并可能是大鼠神經功能改善的原因之一（圖1）。提示大鼠復蘇后腦神經細胞發生的自噬是過度的、有害的。
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