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周末學習計劃范文1
【關鍵詞】亞洲帶絳蟲;膜聯蛋白b2;基因克隆;免疫反應性
abstract: objectiveto clone and express the gene named as annexins b2 of taenia saginata asitica so as to analyze the immunogenicity of its recombinant protein.methodsby online analysis of the gene at bioinfomatics websites to identify the gene from the taenia saginata asiatica full-length cdna plasmid library, the gene was cloned into prokaryotic expression vector pet-28a(+) and then transformed to e.coli bl21 with iptg induction. thereafter, the gene product was analyzed by sds-page and purified by ni-nta affinity chromatography. in addition, the immunoreactivity of the purified recombinant proteins was analyzed by western blotting.resultsas demonstrated by pcr, double enzyme digestion and dna sequencing indicated that the recombinant plasmid was successfully constructed and highly expressed. the recombinant protein tested with western blotting analysis could react with taenia asiatica and taeniarhynchus saginatus infected patient serum.conclusionthe annexins b2 of taenia saginata asitica has been cloned and expressed in the prokaryotic expression system and the purified protein has been confirmed with immunogenicity.
key words: taenia saginata asiatica; annexins b2; gene cloning; immunoreactivity
鑒于亞洲帶絳蟲與豬帶絳蟲及牛帶絳蟲在起源、分類學地位存在的差異[1-2]，本課題組率先構建亞洲帶絳蟲成蟲全長cdna質粒文庫，并對該蟲進行功能基因組的研究工作[3]。本文利用生物信息學工具從文庫中篩選到了一個膜聯蛋白b2(annexins b2)的同源基因，構建了原核表達載體，并對其原核表達產物進行免疫學方面的初步研究。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1血清、載體與菌株3種人體帶絳蟲患者血清取自糞檢陽性的帶絳蟲患者。原核表達質粒pet-28a(+)及大腸埃希菌bl-21/de3由中山大學熱帶病防治教育部重點實驗室惠贈。
1.1.2主要試劑和工具酶ex taq酶(含dntp)，bamhⅰ，xhoⅰ，t4 dna連接酶 (大連寶生物工程公司);異丙硫代-β-d半乳糖苷(iptg)(美國promega公司);質粒純化試劑盒(廣州東盛科技公司);辣根過氧化物酶標記的山羊抗豬igg二抗、兔抗人二抗、3，3二氨基聯苯胺(dab)顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);氯化鈣、氯化鈉等為國產分析純試劑。
1.2方法
1.2.1annexins b2基因的識別及擴增將獲得的亞洲帶絳蟲annexins b2基因進行blastx分析。并根據已獲得的該基因全長編碼序列的開放閱讀框，利用軟件設計引物(引物由上海聯合基因公司合成)，分別帶上bamhⅰ和xhoⅰ的酶切位點進行pcr反應。
1.2.2重組原核表達質粒的構建及鑒定pcr產物和pet-28a(+)載體分別用bamhⅰ和xhoⅰ雙酶切，回收、連接后轉入大腸埃希菌bl-21/de3感受態細胞，對陽性克隆依次進行質粒的提取、雙酶切和pcr鑒定，并進行重組質粒dna測序鑒定(測序由英俊科技股份有限公司完成)。
1.2.3重組蛋白的表達及純化按照常規方法進行蛋白誘導表達，考馬斯亮蘭蛋白染色液染色觀察蛋白表達情況。確定蛋白表達后，進行大量的誘導表達，并判斷重組蛋白的可溶性，再將樣品加入預先處理好的ni-ida his.bind樹脂親和層析純化柱中，最后再用pbs 24h透析以去掉過柱時留下的咪唑。
1.2.4western blotting分析重組蛋白的免疫反應性用3種人體帶絳蟲患者及正常人血清與辣根過氧化物酶(hrp)標記的兔抗人igg進行western blotting鑒定。
2結果
2.1annexins b2基因的識別和序列分析該基因全長922bp，編碼區為224～686bp。其最大orf為其完整編碼區。
2.2原核重組質粒的鑒定將重組質粒進行pcr和雙酶切鑒定，產物行0.8g/l瓊脂糖凝膠電泳。結果顯示在500bp左右有一清晰條帶，與目的基因大小基本相符。此外，重組質粒的測序報告表明插入序列與理論序列一致，證明重組質粒構建成功(圖1)。
2.2蛋白表達及純化結果將構建好的重組質粒轉化到e.coli bl/de3中，超聲裂解后sds-page電泳分析結果顯示在大約25ku處出現高效表達條帶(圖2)，與目的蛋白基本相符。測得純化產物的蛋白濃度為0.526g/l。
2.3western blotting鑒定純化蛋白的免疫反應性
用感染亞洲帶絳蟲、豬帶絳蟲、感染牛帶絳蟲的患者血清以及亞洲帶絳蟲感染豬的血清與純化蛋白反應的結果均顯示出較清晰的條帶，而陰性對照血清在相應位置未識別出該蛋白條帶(圖3)，表明該表達產物具有良好的免疫反應性。圖1重組質粒的pcr和雙酶切鑒定
fig.1 the identification of the pet-28a(+)-ta annexins b2 by pcr amplification and digestion with restriction enzymesm1：dna標準(dl2000);1：pcr產物;2：pet-28a(+)質粒雙酶切;3：pet-28a(+)-annexins b2重組質粒雙酶切;m2：dna標準(dl 15000)。圖2100g/l sds-page分析pet-28a(+)-ta annexins b2在大腸埃希菌中的表達產物及其純化產物fig.2 100g/l sds-page analysis of the prokaryotic expression product and purified product
m：蛋白marker;1：pet-28a(+)iptg未誘導;2：pet-28a(+)iptg誘導;3：pet-28a(+)-annexins b2 iptg未誘導;4：pet-28a(+)-annexins b2 iptg誘導;5：pet-28a(+)-annexins b2上清;6：pet-28a(+)-annexins b2沉淀;7：pet-28a(+)-annexins b2純化蛋白。
3討論
帶絳蟲病的流行在我國西部一直是一個嚴重的公共衛生問題。每年由帶絳蟲病造成的健康和畜牧業經濟損失上百億，嚴重影響西部欠發達地區的社會發展。目前，亞洲帶絳蟲病的防治研究的重點集中在診斷和疫苗候選抗原、藥物靶標、致病的分子機制研究。圖3重組蛋白的western blotting 鑒定fig.3 western blotting analysis of the recombinantsm：蛋白marker;1：純化蛋白與亞洲帶絳蟲患者血清的反應結果;2：純化蛋白與牛帶絳蟲患者血清的反應結果;3：純化蛋白與豬帶患者血清的反應結果;4：純化蛋白與亞洲帶絳蟲感染豬血清的反應結果;5：純化蛋白與正常人血清的反應結果。
本實驗通過生物信息學方法從已經構建好的亞洲帶絳蟲成蟲cdna質粒文庫中篩選出了一個膜聯蛋白(annexins b2)的同源基因，并且預測出該基因位于胞漿，無跨膜區，二級結構基本上是以α螺旋為主。這些都符合膜聯蛋白家族的共同特征[4]。根據膜聯蛋白家族分布廣泛，表達豐富且穩定的特性，可以推測其在絳蟲的生理活動中可能起著重要的作用。
膜聯蛋白是一個廣泛存在的蛋白家族，在所有真核基因組中廣泛表達。具有內部重復單位和“g-x-g-t-(38residues)-d/e”基序[5]，即ca2+結合區域的特征，用以結合帶有負電的脂質。雖然它為鈣結合蛋白，但是在結構上卻沒有ef手，而且在和ca2+結合后，還可以與磷脂再次結合而發揮生物學效應。例如，細胞的胞吞胞吐，離子通道的形成，調節磷脂酶a2的活性及細胞內外ca2+濃度、抗炎癥反應等。在長期的生物進化過程中，膜聯蛋白家族各成員在生物學特性和生理功能方面表現出非常復雜的關系，且在研究過程中發現，annexins沒有信號肽，沒有跨膜結構，是一個典型的細胞內蛋白。但是，卻有學者發現它可以與細胞外基質發生作用。例如，抗炎[6]、抗凝[7]、抑制腫瘤[8]等。最新的研究報道，當將其作為疫苗的候選因子時，可以消除一些寄生于哺乳動物體內的寄生蟲。此外，學者們認為膜聯蛋白是維持細胞膜表面結構和信號轉導功能的重要蛋白。并可能具有激活纖維蛋白酶原的功能，有助于破壞宿主的結締組織，使蟲體抗原更加容易進入宿主機體，誘發免疫應答。因此，對該基因的研究有助于進一步了解它的生物學功能及開辟預防治療寄生蟲病的新途徑[9-10]。
目前，annexins b2已經在豬囊尾蚴的研究被發現并命名，但是具體的生理功能還不清楚，且在亞洲帶絳蟲研究領域還是空白。因此，本研究將亞洲帶絳蟲成蟲annexins克隆到原核表達質粒pet-28a(+)中，構建重組質粒，在大腸埃希菌bl-21/de3中用iptg誘導表達，表達產物通過sds-page電泳進行鑒定。sds-page結果表明，該蛋白在全菌和沉淀中都有表達，上清中有微量的表達，說明annexins主要表達在包涵體中。因此，進一步溶解包涵體[11]，經變性處理并親和層析純化后，得到了大量較純的重組蛋白。此外，還嘗試性的用上清過柱純化并用蔗糖進行蛋白濃縮，也得到部分有活性的蛋白。western blotting就是以抗體-抗原沉淀反應為基礎的，可用于不同抗原的比較和定量。其檢測結果表明所獲得的重組蛋白與豬帶絳蟲、牛帶絳蟲及亞洲帶絳蟲有較強的交叉反應且在絳蟲中的診斷特異性不高，推測其不能作為免疫診斷抗原的合適候選分子。但是，其具有免疫活性的高效表達。由此可推測它是一個具有開發潛力的基因。總之，本項研究填補了該蛋白在亞洲帶絳蟲研究領域的空白，也為進一步研究該基因的生物學功能及在診斷尤其是疫苗研究方面奠定了基礎。
【參考文獻】
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周末學習計劃范文2
[關鍵詞]英語教學；初高中銜接；高一學生；策略
學生從初中升入高中，不僅是人生的一個轉折，在學業上也將有重大轉變。高一學生的英語學習非常關鍵，教師要讓高一學生在短時間內適應高中的英語學習，當務之急是要做好初高中英語教學的銜接工作。
一、初高中英語教學銜接存在的問題
筆者從事高中英語教學多年，在每次接手高一時，發現學生學習英語時普遍感到聽不懂、念不順、譯不出，課堂氣氛沉悶，難以完成教學任務。這是為什么呢？分析原因主要由以下三個因素導致。
（一）學生的情緒發生變化，學習方式卻沒有改變
我校的高一學生都是來自各個鄉鎮，他們能考上我校，在初中學習成績不是學校的佼佼者，就是班里的領頭人，令他們產生了強烈的優越感。但他們進入高中后，發現班里的同學有的比自己更優秀，心里產生失落感。還有些學生學習方式單一，英語基礎不扎實，到了初三靠死記硬背才在中考中取的了好成績。進入高中后，隨著教學要求的不同，教材內容的增加，延用原來的學習方式無法取得他們想要的成績。由此他們對高中英語學習產生畏懼心理，甚至有的失去了信心。
（二）初高中教師的教學方法不同
初中英語知識單一，題型簡單，課時也充足。在課堂教學時，教師有足夠的時間去反復講解一個句型或一個語法點，直到學生弄明白。而高中英語知識綜合性強，課時少，教師對重難點內容在課堂上沒有多余時間進行反復教學，對各類型題也不可能講全講細和鞏固強化。教師側重對各個知識點進行精講精練，講究系統知識的學習、歸納，引導學生舉一反三，這使高一新生開始不適應高中英語學習而影響英語成績的提高。
（三）初高中教材的不同
初中教材淺顯易學，對話豐富有趣，課文篇幅較短，課堂上也有充分的時間學習，所以考試很容易得到高分。而高中教材內容豐富，知識容量大，并在初中的基礎上注入了大量的語法點、知識點，使句子結構更為復雜，所以要求學生學習教材后，還要掌握一定的學習方法。學生要想考出好成績單靠死記硬背是不夠的，它還需要靠學生平常知識的積累和對知識體系透徹完整的了解和掌握。
二、搞好初高中英語教學銜接的策略
（ 一）正確引導學生的心理轉變是做好銜接工作的前提
剛進高一的學生往往要通過一段時間才能適應新環境，接納新老師和新同學。在這段時間里，教師要和學生勤溝通，多交流，通過主題班會等形式，消除他們頭腦里的各種消極情緒。要讓他們知道高一英語在整個高中英語中所占的位置和作用，對于那些情緒上有失落感的學生，教師要告訴他們只有發奮努力，繼續發揚拼搏精神，才不至于落后于他人。
（二）選擇合適的教學策略是做好銜接工作的必要條件
高一英語教師在開學之初，要細致入微地了解每一個學生的知識面和對基礎知識的掌握情況。從學生實際情況出發，采取“低起點、小梯度、多練習、分層次”的方法，將教學目標分解成若干遞進層次逐層落實。在速度上，放慢起始進度，逐步加快教學節奏。在知識導入上，要注重由已知引入未知，幫助學生溫故而知新，從而緩解教學坡度，分解知識難度。
此外，教師要精心準備每一堂課。課堂是教師展示自己才華的最好舞臺和陣地，如何吸引學生的眼球和注意力，讓他們一節課上完回味無窮，這就需要教師提前做足功課，把每一堂課都當成自己的第一堂課，這樣才能使自已有激情，才能讓學生有新鮮感。
（三）指導學生正確的學習方法是做好銜接工作的首要條件
學生進入高中后，如果還是采取初中死記硬背的學習方法，是無法提高學習效率的，教師要教給學生正確的學習方法并提供指導。
1.制訂學習計劃。古人說：“凡事預則立，不預則廢?！币馑季褪遣徽撟鍪裁词?，事先有準備，就能得到成功，不然就會失敗。因此教師在開學初要指導學生根據自身的情況確立英語學習目標，制訂學習計劃。
2.搞好課前預習。上好每一堂課是教師完成教學任務的關鍵，所以課前教師都會認真備課。學生也要跟老師一樣，課前應根據教學內容先去預習。在我班里，我會把每一節預習內容打在講義上，要求學生課前自己查字典，自己用新詞造句，自己找出課文中的難點。讓學生在預習中發現問題自主解決，也可以跟同學討論。
