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動物行為學研究方法范文1
摘 要:目的:以慢性焦慮應激大鼠為載體,探討其焦慮狀態及行為學的變化,旨在探索能較好模擬廣泛性焦慮障礙的動物模型。方法:采用慢性情緒應激的方法建立焦慮大鼠模型,以國際公認的高架十字迷宮試驗對其行為學進行評價。結果:應激后大鼠處于易激惹的狀態,表現出頻繁的修飾和攻擊行為,經高架十字迷宮測試發現大鼠較少進入并停留于開放臂中,傾向于探究封閉臂,且在封閉臂的停留時間延長。結論:不確定性空瓶刺激作為一種慢性心理應激模型,從病因學上較好模擬了廣泛性焦慮障礙的發病狀態和行為學表現。
關鍵詞:焦慮模型;行為學;慢性情緒應激;高架十字迷宮
中圖分類號:R332 文獻標識碼:A 文章編號:1673-7717(2010)04-0711-03
The Changes in Behaviour of Rats with Chronic Stress-induced Anxiety and
Behavioural Evaluation of The Elevated Plus-maze Test System
LI Ning 1,TANG Qisheng2,ZHAO Ruizhen2 , GOU Shengle1
(1. Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029,China;
2. The Third Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029,China)
Abstract:Objective:To study the changes in behaviour of rats model with chronic stress-induced anxiety and to explore a appropriate animal model for GAD. Methods:Rats model was established by using chronic emotional stress-induced anxiety method, then researchers observed behavioural changes of model rats and evaluation of elevated plus-maze test system. Results:Rats resceiving emotional stress was in a state of great agitation,who manifested obvious grooming and attacking behaviour.Fewer rats entered and remained in the open arm,and tended to explore and stay in the closed arm.Conclusion:Unpredictable bottle stimulation as a methd of chronic emotional stress better simulated the incidence and manifestation of generalized anxiety disorder from etiology.
Key words:anxiety model; behaviour;chronic emotional stress; elevated plusmaze
收稿日期:2009-11-21
基金項目:國家自然科學基金資助項目(30772804)
作者簡介:李寧(1980-),女,河南許昌人,博士研究生,研究方向:中醫藥防治腦血管疾病。
通訊作者:唐啟盛(1956-),男,黑龍江人,教授,博士研究生導師,研究方向:中醫藥防治腦血管。
廣泛性焦慮障礙(generalized anxiety disorder,GAD)是以過度和持續性焦慮或反復發作的驚恐不安為主要特征的神經癥,常伴有植物神經系統癥狀和運動性緊張。隨著臨床和基礎實驗研究的不斷深入與完善,人們對于本病也有了較為系統而全面的認識?，F代醫學研究表明,其發病涉及生物、心理、社會等諸多方面的因素,但確切的病因和發病機制至今尚未徹底闡明。焦慮動物模型作為基礎實驗研究的平臺與載體,在探索焦慮障礙的病因、發病機制以及新藥研發等方面發揮著重要作用。因此,選擇公認、穩定、重復性好、能反映復雜發病狀態的動物模型是深入開展該疾病研究的關鍵環節。本研究采用慢性情緒應激的方法建立焦慮大鼠模型,觀察應激前后自身行為學的變化,且通過國際公認的高架十字迷宮試驗對其焦慮狀態進行測試與評價,旨在為廣泛性焦慮障礙的研究提供較好的動物模型。
1 材 料
1.1 實驗動物
健康Wistar雄性大鼠20只,SPF級,2～3月齡,體重(200±10)g。由中國醫學科學院實驗動物研究所購買,合格證號:SCXK(京)2005-0013。動物購進后預養1周內自由攝食飲水。光照節律12L/12D(6∶00～18∶00),室溫(20±2)℃,相對濕度為50%～60%,保持安靜。
1.2 行為學測試儀器
高架十字迷宮采用國際通用的方法制作[1],由安徽省淮北正華生物儀器設備有限公司生產。
2 方 法
2.1 動物分組和焦慮模型的建立
大鼠經1周適應期后隨機分為正常組、模型組,每組10只。除正常組外,模型組單籠飼養且接受不確定性空瓶飲水刺激建立焦慮應激模型[2] 。具體方法如下:定時喂水訓練7天,即每天早9∶00～9∶10和晚21∶00～21∶10給動物飲水10min,其余時間撤去水瓶不給水。定時喂水期結束后開始應激實驗,在上述兩個時間段內給予不確定空瓶刺激,維持1天1次或1天2次,持續2周。正常組不接受任何處理,自由飲水和攝食。所有動物在應激結束后進行高架十字迷宮行為學測定,兩組交叉進行。動物均提前2h進入測試實驗室適應環境。
2.2 行為學觀察
行為學觀察包括攻擊(咬或攻擊空瓶和籠子)、探究(前后左右運動和光顧水瓶所在位置)及修飾行為(梳理皮毛和洗臉)。具體方法是將空瓶應激的10min等分10個時間段,在每個時間段內記錄每只大鼠上述3種行為,行為出現即為1,否則為0.10min內觀察的總分為0～10之間。得分基于2 名觀察者的觀察結果平均而得,其中一人為雙盲控制。14個觀察日的前3天和最后3天的平均分用于統計分析。
2.3 行為學測試
實驗室內光線昏暗(以1.5m 距離處能區分大鼠細微活動的最低亮度為準)并保持恒亮,室溫21℃,安靜。測試箱放置于實驗室一角,周圍布以2m 高黑色單調背景。實驗過程中只有一名參與日常處理的人員搬運動物。
迷宮測試前將每只大鼠放入一個60cm×60cm×35cm塑料盒中,任其自由探究5min后迅速置于EPM 的中央平臺處使其頭部正對其中一個開放臂,釋放后即開始記錄下述指標: ①進入開放臂次數(open arm entry,OE):進入到任一開放臂的次數,以大鼠4個爪子均進入到臂內為準,中途一個爪子從該臂中完全退出則為該次進入活動完成; ②進入開放臂時間(open arm time,OT):進入開放臂的時間,單位:秒; ③進入封閉臂次數(close arm entry,CE):進入任一封閉臂的次數,以大鼠4個爪子均進入到臂內為準;④進入封閉臂時間(close arm time,CT):進入封閉臂的時間,單位:秒;⑤向下探究次數(head-dipping,HD):大鼠置身于中央平臺或開放臂時,一邊用前爪握住迷宮邊緣一邊把頭部和肩部伸出開放臂的邊緣向迷宮下面探究的行為次數; ⑥封閉臂后腿直立次數(rearing,RR):大鼠在封閉臂前腿抬起以后腿支持使身體豎立的次數。
由①～④分別計算出:①進入開放臂和封閉臂的總次數(OE+CE):表示大鼠的運動活力;②進入開放臂次數比例(OE%):即開放臂進入次數/(OE+CE)×100%;③開放臂停留時間比例(OT%),即開放臂停留時間/(OT+CT)×100%,每只大鼠測試5min。
2.4 數據的統計分析
各組數據用均數±標準差(±s)表示。數據處理采用SPSS 15.0統計軟件分析處理,兩組間均數比較采用獨立樣本t檢驗。以P
3 結 果
3.1 模型組大鼠行為學的變化
如表1所示,空瓶應激期間,模型組大鼠14個觀察日的前3天和最后3天相比,探究行為無明顯差異(P>005),修飾行為增多(P
表1 模型組14個觀察日前3天和最后
3天空瓶應激時行為變化的比較(n=10,±s)
組別探究行為修飾行為攻擊行為
起始3天5.22±0.973.22±1.121.29±0.96
最后3天4.64±1.065.58±1.076.08±1.35注:n為動物只數;與起始3天比較,P
3.2 大鼠EPM測試結果
如表2所示,因正常組不施加任何干預因素,故與模型組相比OE+CE、OE%、OT%、head-dipping明顯減少,差異明顯(P
表2 各組大鼠EPM測試行為學的比較( n=10,±s)
組別OE+CE/次 OE/%OT/%HD/次RR/次
正常組 11.70±1.4934.78±5.89 35.19±4.1514.70±1.9412.50±1.81
模型組8.40±1.7814.42±4.2817.17±6.799.10±1.7913.40±2.17注:n為動物只數;與正常組比較,P
4 討 論
現代研究發現,應激和焦慮是密切相關的現象,大多數焦慮癥患者都曾經歷過嚴重的心理應激事件,因此應激事件可以成為焦慮癥發病的原因和誘因[3]。本研究采用不確定性空瓶刺激建立慢性應激焦慮大鼠模型,發現經過幾次固定時間的飲水學習之后,在飲水期間給予動物空瓶,能夠誘發動物出現攻擊,撕咬瓶子和籠子,頻繁修飾等焦慮行為。此外,模型組大鼠表現出易激惹的狀態,與臨床中焦慮癥患者的易激惹表現相似。
高架十字迷宮試驗(EPM)既可以建立焦慮應激的模型也是國際上公認的經典測量焦慮反應的方法[1-4]。其原理是利用動物對新異環境的探究特性和對高懸敞開臂的恐懼心理,形成動物的矛盾沖突來考察大鼠的焦慮狀態。EPM測試的項目中,焦慮動物的OE%和OT%會明顯降低,經典抗焦慮藥物則使兩者升高,OE+CE反映了動物的運動活性。本研究發現模型組大鼠的OE%和OT%顯著下降,運動活性也降低。HD反映了動物在非保護區內的探索行為,代表動物對陌生環境的好奇探究或因恐懼而尋求逃避,與焦慮程度有一定相關性,本研究中空瓶應激后的大鼠HD行為減少;RR可用來觀察藥物有無鎮靜作用及鎮靜強度。上述結果證實,慢性應激后的大鼠明顯處于焦慮狀態,說明慢性焦慮應激大鼠模型的制備成功,且通過量化的標準客觀反映出大鼠的焦慮程度。
GAD作為焦慮癥的臨床亞型,多呈慢性病程且易復發,癥狀反復遷延,并與許多軀體疾病相關聯,相當比例的患者還共病抑郁和其他精神障礙類疾病,患者不僅存在難以忍受而又無法擺脫的精神痛苦,嚴重者可導致社會功能受損,甚至出現自殺,給個人家庭和社會造成嚴重的經濟和精神負擔。焦慮動物模型作為焦慮癥基礎研究的載體,在探索其發病機制、新藥研發及臨床前評估的研究中發揮著重要作用,但目前尚缺乏針對GAD的動物模型?；诖?本研究從病因學的角度出發,建立慢性焦慮情緒應激的動物模型,通過其自身行為學的變化和EPM測試即橫向和縱向的比較來評價該模型的可行性和有效性。雖然動物的情緒變化遠不如人類豐富,動物身上也較難準確模擬人類發病的心境。但是,他們也存在并非單一的情緒變化,有些情緒變化如焦慮、憤怒、恐懼等與人類存在相似性,在情緒變化時同樣也存在行為學和復雜的神經內分泌變化[5-6]。本研究結果提示:不確定性空瓶刺激作為一種慢性心理應激模型,能誘導動物出現明顯的焦慮行為,從病因學上較好模擬了GAD的發病狀態,與現有的焦慮應激模型相比,該模型在很大程度上避免了摻雜物理(軀體)性應激成分,是一種相對“純粹”的心理應激模型。本課題組將在此行為學研究的基礎上,進一步開展焦慮癥神經生物學方面的探索性研究。
參考文獻
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動物行為學研究方法范文2
【關鍵詞】 腦缺血;腦損傷;動物模型;大鼠
[ABSTRACT] Objective: To investigate the application of three kinds of cerebral ischemiareperfusion animal model according to the degree of injury. Methods:The bilateral common carotid artery occlusion(BCCO)， cerebral middle cerebral artery occlusion (MCAO) by stringfastening method， global ischemia(GI) by fourartery occlusion were used to establish cerebral ischemiareperfusion animal model. The degree of brain injury was evaluated through the expression of MAP2 in hippocampal CA1 region and the Morris water maze. Results: The result of the expression of MAP2 indicated the injury of GI group was the most severe， and the damage of BCCO group was the most mild.Compared with the normal group，the behavior change of reperfusion was the significant in the MCAO and GI groups. Conclusion:The three animal models should be applied in different researches. The BCCO model could be used in prevention of mild ischemia. The MCAO model could be used in the change of cerebral function and the drug evaluation. The GI model could be used in recovery after cerebral ischemia.
[KEY WORDS] Cerebral ischemia; Cerebral injury; Animal ; Rat
腦血管疾病是世界上嚴重危害人類健康的三大疾病之一， 發病率已達到104. 53/10萬。缺血性腦血管疾病( ICVD ) 發病率有逐年增高趨勢， 死亡率可達56. 6%～80% ， 即使存活， 也留有嚴重的后遺癥影響生活質量。因此， 建立合適的動物腦缺血及缺血再灌注模型來模擬人類腦血管疾病并對之進行研究， 是深入研究其病變發生、發展和預后的基礎，也是當前神經科學的熱門課題之一。
大鼠具有腦血管解剖結構和功能與人類相近似、品種品系相對標準、良好的種內純合性等特點，目前大多利用大鼠建立腦缺血再灌模型，但是對各種模型的制作效果未見文獻報道。本文采用雙側頸總動脈阻斷再灌模型(BCCO)、線栓法大腦中動脈腦缺血再灌模型(MCAO)、四血管法全腦缺血再灌模型(GI)等3種常用的局灶性腦缺血再灌動物模型，觀察不同腦損傷情況下的形態學改變，并評價其行為學，旨在探討不同模型的適應性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及分組
健康雄性Wistar大鼠，6月齡，體重(200±50) g，經Morris水迷宮篩選后，分為正常對照組(Normal)，雙側頸總動脈結扎20 min再灌注組(BCCO)，線栓法大腦中動脈腦缺血再灌模型組(MCAO)，四血管法全腦缺血再灌模型組(GI)，每組6只。
1.2 Morris水迷宮測試
Morris水迷宮測試程序采用定位航行試驗：每天4次，共3 d，均在10:00am～5:00pm之間完成。將大鼠頭朝池壁輕輕放入水中，計時動物自入水至找到平臺時間為潛伏期，同時觀察搜索站臺的軌跡。記錄大鼠后8次測試的潛伏期，以平均潛伏期的90%區間作為篩選學習記憶功能正常大鼠的標準。
1.3 動物模型制備
BCCO模型：大鼠用2%的戊巴比妥(0.2 mL/100 g)麻醉，頸正中切口逐層切開皮膚及皮下組織，分離胸鎖乳突肌，切斷二腹肌前腹，暴露頸總動脈(common carotidartery， CCA)，頸內動脈(internal carotid artery， ICA)和頸外動脈(external carotid artery，ECA)，分離雙側頸總動脈約1 cm，用動脈夾夾閉20 min后，解除動脈夾，恢復腦血流，再灌7 d，在處死前做Morris水迷宮測試。
MCAO模型：參照Longa等[1]和羅勇等[2]報道的方法，采用經頸內動脈線栓法制備大鼠右側MCAO致局灶性永久性腦缺血模型。大鼠用2%的戊巴比妥(0.2 mL/100 g)麻醉，仰臥位固定，頸正中切口，暴露右側CCA、ICA和ECA，探查ECA在頸部發出第1分支(甲狀頸干)處，在其遠心端約0.2 cm處結扎并切斷ECA，確保ECA殘端長度不少于0.5 cm;結扎并切斷ECA與ICA之間的交通支。用動脈夾暫時阻斷CCA及ICA血流，用眼科剪于ECA 殘端作一縱行小切口，用直徑約0.2 mm的尼龍線，燒灼頭端使其成為直徑約為0.25 mm的線栓，將線栓從右側ECA殘端插入ICA;輕輕牽拉ECA殘端，使其與ICA成一條直線，調整線栓角度，使線栓弧度水平向外，與頸前正中線呈45度水平向外的夾角，移去夾閉ICA的動脈夾，輕輕將線栓送入顱內。從CCA分叉處送入ICA約1.9～2.1 cm時通?？捎鲎枇?，大鼠呼吸、心跳突然加快，部分大鼠尿失禁，據此作為大腦中動脈起始處栓塞成功的標志。栓塞成功后，用絲線結扎ECA殘端，移去夾閉CCA的蛙心夾，觀察無活動性出血后關閉切口。缺血20 min后，將栓線抽至頸內動脈起始部恢復腦血流，再灌7 d，在處死前做Morris水迷宮測試。
GI模型：參考Pulsinelli方法，采用改良的四血管夾閉方法制備四血管阻塞全腦缺血模型[3，4]。大鼠用2%的戊巴比妥(0.2 mL/100 g)麻醉，仰臥位固定，頸正中切口，暴露CCA和與之伴行的神經，鈍性分離出CCA，用棉線環CCA成1cm的線環。兩側線環相互交叉埋于皮下，縫合切口。大鼠轉移到立體定位儀上， 俯臥。頭向下傾斜30 度固定。剪去頭頸部的毛， 消毒。在枕骨下沿背正中切口，分離肌肉， 找到第1頸椎后弓上的橫突孔， 用電凝針插入2～3 mm，灼斷孔中的椎動脈， 使之永久性阻塞。電凝完畢， 縫合切口，大鼠放回飼養籠中， 讓其自然蘇醒， 禁食過夜， 自由飲水。以上手術24 h 后， 大鼠在清醒狀態下仰臥固定， 重新打開頸部切口， 用動脈夾夾閉雙側頸總動脈， 使大鼠腦部供血完全阻斷， 大鼠掙扎數秒后于30～60 s 內昏迷， 解除固定， 可見大鼠四肢上舉， 翻正反射消失， 痛覺反應消失， 雙側瞳孔散大， 眼球呈灰白色， 身體可呈角弓反張。缺血20 min后，解除動脈夾，恢復腦血流，再灌7 d，在處死前做Morris水迷宮測試。
1.4 組織制備
用2%戊巴比妥鈉(0.12 mL/50 g體重)腹腔注射麻醉后，迅速開胸暴露心臟，灌注固定后取腦，后固定2～4 h后，分別置于15%和30%蔗糖梯度溶液中直至標本沉底。冰凍切片機作連續冠狀切片，取海馬和齒狀回互包平面，片厚30μm，用小鼠抗MAP2單克隆抗體作ABC免疫組織化學染色，用正常羊血清代替一抗作陰性對照。
1.5 統計學處理
用HPIAS高清晰度彩色病理圖像測量系統測定海馬CA1區神經元胞漿MAP2反應產物的OD值，并減去同一張切片的背底OD值，即矯正的OD值(COD值)，每例標本檢測3張切片，每張切片檢測3個視野。實驗數據用SPSS 13.0統計軟件分析，采用單因素方差分析比較樣本均數。
2 結果
2.1 水迷宮檢測
正常大鼠定位航行試驗潛伏期穩定，在5 s左右可找到平臺。BCCO組大鼠搜索策略以直線式搜索策略為主，其潛伏期與正常組比較略有增加，且波動較大，但是無統計學意義(P >0.05)。MCAO組和GI組均有潛伏期增加，與正常對照組有統計學意義(P
2.2 海馬MAP2免疫組織化學染色
正常組海馬CA1區MAP2主要在神經元樹突表達，突起平滑而且完整(圖1A);而核周質弱表達。BCCO組可觀察到海馬CA1區神經元樹突MAP2的表達增加，突起斷裂不完整，粗細不一致(圖1B);GI組突起表達更加紊亂，可觀察到螺旋樣變(圖1C);MCAO組突起表達有斷裂，不完整(圖1D)。統計分析表明，MAP2表達COD值在各組之間差異有顯著性(F=354.906，P
3 討論
缺血性腦血管病的實驗動物模型是研究缺血性腦損傷和腦保護必不可少的工具，有關大鼠局灶性腦缺血再灌注模型已建立多種方法。De Reuck等[5]的研究提示，腦血管儲備功能的下降導致全腦代謝儲備消耗是血管性癡呆發生的可能機制;動物空間記憶能力下降，是由于血管結扎導致局部腦血流下降而影響與學習記憶有關的結構。孫莉等[6]采用雙側頸總動脈結扎模型發現，結扎導致實驗動物水迷宮測試成績下降，并且這種下降隨結扎天數的延長而加大。趙憲林等[7]用這種方法結扎時間長達4月，結果發現30只結扎鼠中有25只癡呆鼠，呈輕、中度癡呆分別是9只、13只。本實驗也表明，在雙側頸總動脈結扎再灌后，形態學和行為學方面有所改變。
大鼠全腦缺血再灌注模型，它的解剖學基礎在于大鼠腹側的脊髓動脈有一定向腦干的返支，四血管閉塞期間可以維持腦干的血液供應，使得大鼠在一定時間內能夠存活下來。由于全腦缺血對大鼠的腦組織損傷嚴重，而再灌注，不僅沒有使損傷的腦組織得以恢復，反而由于細胞內Ca2+超載、一氧化氮以及氧自由基等作用使損傷程度進一步加深[8]。本實驗也證實全腦缺血后引起腦形態學和學習記憶能力的嚴重損傷，是研究血管性癡呆的良好模型。
大鼠中動脈(MCA)阻塞為臨床上缺血性腦血管病的多發部位，故MCA阻斷模型被廣泛應用于腦梗塞的研究。其中，血管內直接插線閉塞法建立大鼠局灶性腦缺血/再灌注模型具有不開顱、損傷小、操作簡便、不需特殊設備、缺血區部位較恒定、可準確控制缺血和再灌注時間、易控制局部條件、全身影響小等優點，被廣泛用于腦缺血/再灌注的研究中。目前對該模型有較多的研究，劉亢丁等[9]認為該模型大鼠體重應控制在250～300 g ;馬常升等[10]發現，當大鼠體重為190～239 g 時，宜選擇插線的直徑為0.185 mm ，體重為239～300 g 時，插線直徑宜為0.200 mm;徐佳等[11]研究模型栓線插入的深度認為，要得到成動的模型栓線插入深度最少要達到1. 65 cm。與全腦缺血模型相比， MCAO模型可形成特定部位的腦梗死并進行再灌注， 對全身影響較小， 與人腦梗死的發病情況更相似， 所以目前應用更為廣泛。其中， 栓線法因其缺血部位恒定、能準確控制缺血后再灌注時間等優點， 適用于腦缺血及再灌注多方面的研究。
通過對各組再灌后的行為學檢測，分析發現3組之間行為學有明顯區別，對于在行為學的基礎上結合MAP2染色來評價腦缺血再灌注模型的腦損傷程度。觀察發現，不同模型缺血壞死程度不同，結合行為學評分我們認為，不同的缺血再灌模型的應用范圍應有所側重，不同的腦缺血模型的應用不同，雙側缺血模型可用于輕微缺血的預防，線栓法應用于局部損傷后腦功能改變及治療藥物評價，全腦缺血再灌注動物模型是研究缺血損傷后恢復相對理想的模型，對于慢性腦缺血、腦缺血的藥物及一些特殊領域的研究具有較高的價值。
各種腦缺血動物模型的制備方法各有優缺點，研究者應根據實驗目的及研究方向做出相應的選擇。目前， 腦缺血動物模型的研究在制備方法、實驗條件的控制等方面都取得了很大進展， 而且轉基因小鼠的出現， 超聲、MR、MRA、介入等新技術的發展及其在模型制備中的應用， 在很大程度上促進了腦缺血模型的研究。但還有很多問題尚待解決， 如怎樣更好地控制腦梗死灶的部位和范圍， 更準確地控制缺血和再灌注時間等。腦缺血動物模型的日趨完善， 將為人們更深刻認識ICVD 發病機制， 研究新的治療對策等提供更準確的信息。
參考文獻
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動物行為學研究方法范文3
【關鍵詞】 脊髓損傷；疾病模型，動物；大鼠；病理學
【Abstract】 AIM: To observe the functional consequence and pathological changes of spinal cord tissues in acute contusive spinal cord injury model so as to provide theoretical evidence for the clinical therapy of the impaired spinal cord. METHODS: In female adult Sprague Dawley rats， after the T10 spinous process and the corresponding vertebral lamina were removed， moderate spinal cord contusive injuries were produced by using modified Allens method in the experiment group. In control group， rats received only T10 laminectomies .The behavioral scores and the pathological alterations were recorded at different time points. RESULTS: In control group， the rats could walk after reviving， and the microstructure of spinal cord was normal.The behavioral scores of the expreriment group were lower as compared with those of the control group at different time points. The pathological alterations were very apparent in the damaged spinal cord area. When time went on， the spinal cord could be in partial functional recovery. The experimental group showed marked differences from control group. CONCLUSION: The model established in this article will contribute to understanding pathophysiological changes and screening effective therapeutic measures for this injury.
【Keywords】 spinal cord injuries; disease models， animal; rats; pathology
0引言
急性脊髓損傷是一種致殘率很高的的疾病. 隨著交通業和建筑業的迅速發展，這樣的患者呈逐年上升趨勢. 脊髓損傷后的病理生理機制非常復雜，人們對此認識還很不全面及深入. 由于無法依靠臨床開展系統的病理學研究，通過建立動物模型進行實驗研究尤為重要. 近年來， 脊髓損傷動物模型研究是熱點課題， 許多學者進行了大量的研究，以求制備可靠性高、重復性好的可檢測病理變化的動物模型. 本實驗我們利用Allen法制備急性挫傷型動物模型，模擬臨床上外傷所致的脊髓損傷，觀察其行為學變化和病理改變，為后期的脊髓搜索治療提供實驗信息.
1材料和方法
1.1材料
成年雌性SD大鼠40只，體質量200~250 g， 由安徽醫科大學動物實驗中心提供. 動物按體質量從小到大編號，按隨機數字法將這些動物等分為實驗組和對照組.
1.2方法
所以動物用20 g/L戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉后，俯臥位固定于解剖顯微鏡臺板上，胸背部剃毛備皮，常規消毒，定位于T10棘突位置，以此為中心作后背部正中切口，長約3 cm，切開皮膚和皮下組織，分離兩側椎旁肌肉，用直蚊式有齒血管鉗輕輕咬除T10棘突和兩側椎板至關節突，充分暴露硬脊膜，長約5 mm， T9和T11棘突分別用蚊式血管鉗鉗住并向兩側牽拉來固定脊髓，以T10相應區域為損傷區，后正中血管為中心，用自制改良的Allen裝置制備脊髓急性挫傷動物模型.損傷力度為(10 g×2.5 cm) 25勢能克厘米力(gramcm force， gcf)，然后沖洗創口，創面撒少量青霉素粉，用30號線逐層縫合椎旁肌肉和皮膚，對照組同法暴露脊髓，但不損傷脊髓. 傷后大鼠單籠飼養，自然光照，周期定時添足飼料，飲水不加限制，.每天早晚兩次人工按摩膀胱排尿，直至膀胱恢復自動排尿.每2~3 d更換一次墊料，保持干燥.
1.3觀察指標
1.3.1BBB運動功能評分評分采用雙盲，觀察者為熟悉評分標準的非本組實驗人員，雙人獨立觀察記錄，最后取平均值為準. 實驗動物分別在術前，術后1，2，3，4 wk進行BBB評分［1］，BBB(Basso Beattie Bresnahan)評分均在上午進行，評價前膀胱排空，觀察期為4 min.BBB評分是觀察動物的臀、膝、踝關節行走，軀干運動及其協調情況.
1.3.2組織學觀察分別在傷后24 h，3 ，7 ，14 和28 d處死等量動物(n=2). 腹腔麻醉后，仰臥固定，剪開胸腔，暴露心臟，自左心室通過靜脈導管快速灌注生理鹽水沖洗血管，待右心耳留出液體基本無色，隨即用冷的40 g/L多聚甲醛固定液灌注，量約250 mL，先快后慢，30 min后取出脊髓組織，取損傷節段和相鄰節段長約0.8 cm的脊髓，4℃下將脊髓移入40 g/L多聚甲醛固定6 h，依次移入200 和300 g/L的蔗糖溶液中直至沉底，然后脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，水平面連續切片，片厚5 μm，行HE染色，光鏡下觀察. 另在傷后2 ，4 wk處死等量動物 (n=2)，灌注固定方法同上，將損傷節段脊髓取出后，分成1 mm×1 mm×1 mm大小組織塊固定于25 mL/L的戊二醛中，按常規制作步驟進行，將環氧樹脂包埋的組織進行超薄切片，片厚70 nm，入枸櫞酸鉛染液后，在透射電鏡下觀察攝片.
統計學處理： 采用SPSS11.5統計軟件包對實驗數據進行組間t檢驗分析，數據以均數加減標準差表示，P
2結果
2.1傷后動物基本情況觀察大鼠造模蘇醒后，出現雙后肢不能自主活動，并明顯尿潴留，肌張力低，肌力0級，顯示造模成功.術后3 d內，大鼠活動較少，飲食少，體質量有所減輕，平均下降18 g左右，此后飲食逐漸恢復正常，體質量增加，活動增多.有3只大鼠術后第1日出現血尿，經過及時按壓排空膀胱后，有2只大鼠小便顏色轉為正常，1只大鼠(實驗組)因血尿于術后第3日死亡.所有大鼠切口干燥，未見感染跡象.由于定時更換墊料，SD大鼠雙后肢未見褥瘡現象.經過人工按摩膀胱，5~7 d后所有大鼠基本恢復自主排尿，實驗過程中，對照組1只大鼠因麻醉意外死亡.
2.2傷后動物行為學觀察傷后動物單籠飼養4 wk，按BBB運動評分，兩組受試動物各階段評分結果見表1.表1實驗組、對照組各階段BBB運動功能評分（略）
2.3病理觀察
2.3.1光鏡觀察假手術組組織結構致密，細胞核圓而大、染色淺、核仁清晰(圖1A).實驗組損傷后24 h神經元和膠質細胞幾乎全部消失，白質壞死崩解，呈現“一片荒涼”景象(圖1B);損傷后3 d，脊髓內斑片狀出血，灰質神經元腫脹，細胞間質水腫，白質神經纖維腫脹(圖1C);受傷后7 d，可出現灰質神經元腫脹，膠質細胞增生明顯，間質水腫，有少量炎細胞浸潤(圖1D);損傷后14 d，神經纖維排列稀疏、斷裂，膠質細胞增生，瘢痕形成(圖1E);損傷后28 d，灰質內神經元有所恢復，間質可見大量膠質細胞形成，白質神經纖維形態逐漸恢復正常(圖1F).
2.3.2電鏡觀察假手術對照組神經纖維結構正常，髓鞘完整，無分層現象(圖2A).實驗組，術后2 wk，髓鞘扭曲、分層和崩解，軸突內線粒體嵴突消失，空泡樣變性(圖2B)，神經元細胞核固縮，內質網擴張，線粒體空泡樣變性，細胞膜消失(圖2C);術后4 wk， 髓鞘壁變薄，部分松解，稍腫脹(圖2D)，細胞膜破壞，內質網和線粒體稍腫脹(圖2E)， 但較術后2 wk有明顯好轉.
3討論
3.1關于模型制備本實驗我們通過改良Allen法制成急性挫傷型動物模型是一種比較成熟、研究中使用最為廣泛的脊髓損傷造模方法.該造模與人類脊髓損傷的性質非常相近，兩者均屬一定力量撞擊后造成脊髓水腫、缺血，并繼發一系列損傷反應脊髓損傷的典型表現.同時，該法保持了硬脊膜的完整性，可有效的防止結締組織、組織間液、細菌或其他外源浸入脊髓損傷區.此外，該法脊髓損傷節段可以限定，撞擊量可以通過重物的重量或重物下落的高度進行調控，因而有較強的可重復性. 當然，人為地造成完全等同于疾病病理過程的模型幾乎是不可能的.運用A: 對照；B~F: 實驗（造模后24 h，3，7，14和28 d）.
Allen法［2］制備良好的穩定性和可重復性急性挫傷型脊髓損傷模型，應注意: ① 動物體質量應盡量一致. ② 脊髓損傷節段及暴露范圍要一致.③ 穩定脊髓以防重物撞擊時引起脊髓側向移位，導致脊髓損傷不對稱.④ 撞擊錘下落挫傷脊髓后，應及時移走，避免持續性壓迫脊髓或多次撞擊引起“反彈”損傷.
3.2行為學檢測脊髓損傷后的運動能力評估是確定脊髓損傷程度，觀察脊髓修復與再生情況及評價藥物療效的最基本的要求，所以產生了很多脊髓損傷后行為學評價方法.行為學檢測是一項重要的評價措施，可以用來評價脊髓損傷后的功能變化，功能自然恢復的程度以及干預治療的效果［1］.目前最常用的運動功能評價方法是分級為21級的較為精細詳盡的BBB評分，常用來評價大鼠的運動功能.BBB評分是一種相對可靠的評價運動功能及損傷程度的方法，有利于不同機構之間學術交流及結果比較.不過，此法在實際運用中，易主觀評分，導致結果失真.故常采用雙盲、雙人獨立觀察記錄，最后取較低值或均值為準，或不同人分別觀察兩個不同后肢、最后取均值為準，致使該標準比較客觀. 此外，其他常用的神經功能評定方法有Tarlov法［4］和Gale聯合評分法(combine behavioral score， CBS)等［5］. Tarlov法評分跨度大，只能用于脊髓損傷后損傷程度的初步判定.CBS法雖然敏感性大為提高，但所需設備較復雜，人為因素較多，不利于推廣.
3.3脊髓損傷后功能自行恢復雖然與周圍神經系統軸突損傷后擁有良好的再生能力相比，成年哺乳動物脊髓再生能力很有限［6］. 然而，很多最近的觀察發現成年哺乳動物脊髓損傷后通過內在的自我修復能力可以恢復部分功能. 這些研究認為脊髓損傷后剩余的或再生的脊髓功能歸因于椎管內循環回路的自發形成或重排，這樣可以部分的補償脊髓損傷后的功能喪失［7］. 神經回路的重建的基礎可能包括殘存的神經元，向外生長的突起，以及脊髓損區域或附近神經回路的組織再生，不僅包括神經元，而且包括膠質細胞，特別是在中樞神經系統中調節突觸發生和突觸傳遞的星型膠質細胞［8-9］. You等［10］認為殘留的4.8%的腹側角的白質神經纖維便能對脊髓運動功能恢復發揮一定的作用. Shibuya等［11］研究發現，脊髓損傷后1 wk，膠質細胞大量增生，可能通過膠質細胞形成支架或分泌神經營養因子，促進脊髓損傷的修復.也有學者研究發現脊髓損傷能誘導內源性神經干細胞增生和分化，而促進脊髓功能的恢復［12］. 本實驗發現，實驗組大鼠后肢功能可以部分自行恢復，BBB評分由傷后0.47±0.70到傷后4 wk的9.92±1.12，HE染色發現傷后2 wk膠質細胞增生明顯，傷后4 wk，白質神經纖維逐漸恢復正常，灰質神經元結構明顯好轉. 超微病理觀察，術后4 wk較傷后2 wk，髓鞘結構明顯好轉.
綜上所述，利用改良WD法可制備急性挫傷型脊髓損傷模型，為進一步深入了解脊髓損傷的機理及早期的干預治療和后期的臨床治療奠定了基礎，但在評價脊髓功能恢復時，應設立嚴格的對照，以區分脊髓再生引起的功能恢復和殘留的神經纖維代償性功能恢復.
基金項目：國家自然科學基金資助項目（30571881）；安徽省自然科學基金資助項目（050430713）
參考文獻
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動物行為學研究方法范文4
關鍵詞：帕金森??；止顫湯；干細胞移植；DA代謝；大鼠
中圖分類號：R742.5 R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1672-1349（2011）08-0975-02
帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是由于多種原因導致腦內黑質多巴胺（Dopamine，DA）能神經元退行性病變從而DA分泌減少引起的。干細胞移植是PD的理想治療方法［1］，通過干細胞中最適合于中樞神經系統細胞替代治療的神經干細胞（neural stem cell，NSC）移植以期重建PD患者DA能神經元的功能。因此如何促使移植入腦內的NSC存活且定向分化為DA能神經元，并發揮功能成為亟得解決的問題。本實驗觀察了中藥復方止顫湯對NSC移植后PD大鼠尿液中DA及其代謝產物含量的影響，以期為解決NSC移植治療PD中的疑難問題提供中醫藥實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物 Wistar大鼠48只，均為雄性，體重260 g±20 g，由上海斯萊克實驗動物中心提供，動物編號：SCXK（滬）2007-0005。
1.2 藥品與試劑 止顫湯主要由黃芪、丹參、白芍、升麻、知母、鉤藤等8味中藥組成。諸藥均經鑒定符合藥典規定的質量標準。高效液相所用的標準品DA、DOPAC、HVA：美國Sigma公司。
1.3 主要儀器 鼠腦立體定位儀：上海江灣Ⅱ型，液相色譜儀：HPLC Agilent 1200，Agilent Zorbax oligo 80 mm×6.2 mm,5 μm column。
1.4 方法
1.4.1 模型制備 采用大鼠腦立體定位MPTP注射法制模［2］。術后14 d，頸部皮下注射誘導劑阿撲嗎啡（Apo）后，測量大鼠30 min內向損毀側旋轉總次數，若大鼠旋轉圈數>210 r/30 min（>7 r/min），視為成功PD大鼠模型。
1.4.2 NSC的分離培養及鑒定 參照文獻［3］，選取孕14 d的Wistar大鼠胚胎，分離出中腦組織，機械消化成單細胞懸液，種植于塑料培養瓶中，5%二氧化碳，37 ℃環境中培養，待原代克隆出現后（7 d～10 d），離心收集神經球，胰酶消化，吹打成單細胞懸液，1×105 /mL濃度種植于新培液中，每7 d換液傳代1次，離心收集形成的神經球，經甩片到多聚賴氨酸包被的玻片上，固定后進行免疫細胞染色，檢測NSC特異性蛋白Nestin的表達，鑒定所培養細胞中NSC細胞數量及傳代后生長情況。
1.4.3 動物分組及給藥 將48只大鼠隨機分為4組。NSC移植組：大鼠PD模型制作后，將NSC注射入PD大鼠損毀側黑質紋狀體內，同時用生理鹽水4 mL，每天分2次灌胃。正常組：正常大鼠，腦內同一位置注射等量培養基，同時用生理鹽水4 mL，每天分2次灌胃。模型組：模型制作后，同正常組處理。止顫湯組：同樣方法將NSC移植入PD大鼠模型，同時將止顫湯1.2 mL/100 g用生理鹽水稀釋為4 mL，每天分2次灌胃。
1.4.4 行為學測試 分別于處理后7 d、14 d、28 d頸部皮下注射阿撲嗎啡，誘發其旋轉行為，動物旋轉時以患側后肢為支點、身體環曲、首尾相接的原地旋轉，伴覓食樣動作，旋轉360°為一轉，30 min內記錄大鼠的旋轉圈數。
1.4.5 取材及材料處理 動物在處理后第28天末次灌胃后進行行為學測試，次日晨收集尿液置入-80 ℃超低溫冰箱保存備用。測樣時，室溫下解凍，每次進樣10 μL。高效液相色譜法檢測DA、DOPAC及HVA含量［4］。
1.5 統計學處理 數據以均數±標準差（x±s）表示，組間比較用t檢驗，采用統計軟件中One-Way ANOVA進行單因素方差分析。
2 結 果
2.1 大鼠行為學測試結果（見表1）
表1 各組大鼠行為學測試結果比較（x±s）r/30 min
2.2 PD大鼠尿液中DA、DOPAC、HVA含量及DA/DOPAC、DA/HVA比值比較（見表2）
3 討 論
止顫湯是本科室李如奎教授多年治療PD的經驗效方，主要有黃芪、當歸、丹參等藥組成，有益氣養陰、清熱祛瘀、熄風通絡作用，在臨床研究中取得較好療效［5］，實驗研究中有發現天麻、當歸等中藥可以誘導骨髓間質干細胞分化為神經元樣細胞［6］，黃芪和丹參不僅有誘導間質干細胞定向分化為神經元樣細胞的作用，且可能對腦內NSC的增殖及向多巴胺能神經元分化有促進的作用［7,8］。本實驗結果顯示，止顫湯組行為學轉數隨時間延長較模型組明顯減少（P
但是，本實驗不能排除中藥對腦內損毀DA能神經元本身的修復和殘存DA能神經元功能以及內源性NSC分化為DA能神經元的促進作用，對此尚需進一步研究。
參考文獻:
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作者簡介：宋杰（1985―），男，現為上海中醫藥大學2009級中醫內科學碩士研究生（郵編:200071）；施慧芬（通訊作者），工作于上海中醫藥大學附屬上海市中醫醫院（郵編:200071）。
動物行為學研究方法范文5
【關鍵詞】 圍絕經期綜合征； 肝郁； 去勢； 慢性束縛應激； 行為學
圍絕經期綜合征指婦女絕經前后由于性激素波動或減少所致的一系列軀體及精神心理癥狀，其中雌激素水平下降是引起該病的主要原因[1-2]。隨著生活水平提高，工作壓力加大，人口老齡化加劇，圍絕經期綜合征的發病率逐年增高。肝氣郁結證是其主要中醫證型，中醫藥治療已經取得較好的療效，而且副作用小[3-4]。目前比較認可的圍絕經期綜合征肝郁模型是運用自然衰老的大鼠進行造模，然而由于其飼養周期長，成本高，來源非常稀少，因此相關的研究報道相對較少，中醫藥對其作用機制的了解受到很大的局限[5-6]。而去勢大鼠也是公認的圍絕經期綜合征模型，其陰道脫落細胞涂片及血清性激素水平均和圍絕經期發生的改變相似[7-8]。因此本研究擬用去勢大鼠模型，聯合慢性束縛應激與孤養法進行造模，從外觀特征及行為學水平來探討該模型的有效性，為進一步探討中醫藥治療圍絕經期綜合征肝郁的科學內涵提供基礎。
1 資料與方法
1.1 一般資料 健康雌性SD大鼠24只，體質量（220±20）g，
清潔級，動物許可證號為SCXK （京） 2002-2009，由福建中醫藥大學實驗動物中心提供。光/暗周期為12 h/12 h（光照時間6：00-18：00），室溫（22±2）℃，相對濕度保持為30%～40%，喂常規顆粒飼料及飲用水。適應性飼養兩周后，利用敞箱實驗對每只大鼠進行行為學評分，水平運動和垂直運動總得分低于40分和高于160分的動物予以剔除，選擇各項行為學指標得分相近的24只大鼠，按體質量分層采用隨機數字表法將大鼠隨機分為假手術組、去勢空白組、去勢模型組，每組各8只，組間體質量及曠場評分比較差異無統計學意義（P
1.2 模型的建立 （1）去勢：動物分組后行去卵巢手術。手術前，兩組大鼠均禁食12 h，按體質量腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，模型組從腹部正中線切口，切除雙側卵巢，假手術組不切除卵巢，只將卵巢旁與卵巢等大的一塊脂肪組織切除。動物手術后自然修復兩周，在慢性束縛應激前進行連續5 d陰道涂片檢測，觀察無成熟脫落細胞，證明卵巢切除完整，造模成功。假手術組動物的陰道脫落細胞依然呈典型的周期性變化。（2）慢性束縛：用慢性束縛應激結合孤養法建立肝郁證大鼠模型，將去勢模型組大鼠置于束縛筒內，管壁有若干通風口，通風良好，大鼠能夠自由呼吸，束縛應激時間為6 h（9：00-15：00），連續束縛21 d，束縛應激期間禁食禁水。假手術組和去勢空白組在同一時段內也是禁食禁水。（3）孤養：去勢模型組單籠飼養，假手術組和去勢空白組群養，4只/籠。
1.3 體質量與行為學檢測
1.3.1 外部特征及體質量 每天造模前觀察并記錄各組大鼠的飲食、二便、毛發色澤、情緒行為等外觀方面的變化。分別于手術前1天，應激前1天，應激第7、14、21天上午8：00-9：00記錄各組大鼠體質量。
1.3.2 曠場實驗 于動物分組前、應激前1天和應激第21天8：00-12：00進行測試。采用自制長×寬×高
=75 cm×75 cm×40 cm的敞箱，底面劃分成25個面積相等的方格。曠場的中央放一彩色瓶子激發大鼠的好奇心。拍攝并記錄5 min內大鼠的水平運動格數（四爪皆進入記為1分）和垂直豎立次數（兩前爪騰空或攀附箱壁記為1分）。每只大鼠均從同一角落放入，測評結束后，及時記錄糞便顆粒數，并用75%酒精擦拭以消除氣味的影響，待酒精晾干后再進行下一次實驗。
1.3.3 糖水偏好實驗 分別在分組前、造模前和造模結束后檢測各組大鼠的糖水消耗率。按照文獻[9]的方法進行部分修改，實驗進行時，每只大鼠單籠喂養，實驗前，訓練實驗大鼠適應含糖飲水12 h（20：00-次日8：00），10 h禁食禁水后，同時給予1%蔗糖水和純水各1瓶，1 h后調換蔗糖水和純水的位置，2 h后分別稱量純水消耗量及蔗糖水消耗量，計算糖水消耗率（糖水消耗率=糖水消耗量/總液體消耗量×100%）。
1.4 統計學處理 使用SPSS 19.0軟件，計量資料采用（x±s）表示，對所得一般性數據做正態分布檢驗和組間方差齊性檢驗，其中體質量、糖水消耗率、曠場實驗的水平得分及垂直得分符合正態分布和方差齊性，用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗進行分析；曠場實驗中的修飾得分、糞便數目不符合正態分布則采用采用非參數檢驗進行分析，以P
2 結果
2.1 三組外部特征及體質量變化比較 造模前，各組大鼠活潑好動，皮毛光澤好、糞便呈球形。造模結束后，大鼠毛發變得干枯、胡須下搭、行動遲緩、精神倦怠、嗜臥、進食進水量減少、大便稀軟。各組大鼠在行去勢手術前體質量比較差異無統計學意義（P>0.05）。去勢后兩周即應激前1天，與假手術組相比，兩個去勢組的大鼠體質量均顯著增加，差異有統計學意義（P
2.2 三組對曠場行為的影響比較 手術前，各組大鼠在基線水平的水平得分和垂直得分差異均無統計學意義（P>0.05）；手術后兩周，即應激造模前1天，和假手術組比較，去勢空白組和去勢模型組大鼠的水平活動得分均有顯著下降（P
2.3 各組對糖水偏好的影響比較 手術前，各組大鼠在基線水平的糖水消耗率比較差異無統計學意義（P>0.05）；手術兩周后，即應激造模前，和假手術組比較，去勢空白組和去勢模型組的糖水消耗率均明顯下降，差異均有統計學意義（P
3 討論
課題組前期研究結果表明，肝郁是圍絕經期綜合征的重要病理因素[4]。圍絕經期女性常面臨家庭及事業等多種問題，精神壓力較大，多感所愿不遂、抑郁于內，易形成心理應激。因此，建立圍絕經期綜合征肝郁動物模型對于本病機理的深入研究具有一定的現實意義。本文通過手術摘除卵巢人為地造成雌激素突然下降模擬圍絕經期綜合征的狀態，該方法周期短、簡單易行，是常用的一種圍絕經期綜合征造模方法[8]。目前普遍認為，肝郁多表現為認知、人格等心境障礙，病理反應涉及植物神經功能紊亂，神經內分泌免疫等調節網絡的失衡[10]。多數學者認為，肝主疏泄的功能與心理―應激反應有關，從心理―應激反應來研究肝郁是近幾年的研究熱點[11-12]。慢性束縛應激使動物自由行動受限，情緒受抑，比較接近中醫“情志不遂”致郁的發病學說；孤養則模擬了人類遠離社會、家庭的生存狀態，運用束縛制動聯合孤養法建立肝郁大鼠模型，可以制造較為純粹的挫折應激和孤獨感受，是較好的負性心理應激動物模型[13-14]。另外，因其軀體應激因素較小，對機體無損傷性刺激，與人類身心性疾病的致病過程類似，近年來在肝郁相關研究中已被廣泛采用[15-16]。本研究表明，去勢模型組大鼠體重增加緩慢，探究行為減少，表現出情緒低落、興趣減退等癥狀，與圍絕經期綜合征肝郁證的形成過程相似。
圍絕經期女性由于卵巢萎縮，雌激素分泌下降，糖和脂肪代謝發生紊亂，體脂分布異常，特別是腹內脂肪積聚[14]。在本研究中大鼠在去勢手術后兩周體質量顯著增加，該現象與女性在圍絕經期的體質量變化相吻合。在束縛應激條件下，腎上腺皮質醇顯著升高，機體對胰島素的敏感性增加，皮質醇還可以促進蛋白質分解，抑制其合成，同時影響糖和脂類的代謝[17]。因此本研究中去勢模型組在應激開始后，體質量幾乎沒有增長，甚至有下降的趨勢。
在行為學研究中，曠場實驗可以用來檢測動物在新奇環境中的活動度、探究行為、恐懼緊張狀態及警覺性，其中水平活動反映動物的活動度，垂直活動反映動物對新鮮環境的好奇程度，糞便粒數是大鼠緊張程度的表現[18]。肝氣郁結證核心癥狀之一是“缺失”，糖水偏好實驗則是用來檢驗動物對幸福事件反應能力的變化，糖水消耗量及偏嗜度降低，表明動物對獎勵敏感度低，常作為一項反映動物愉悅體驗能力的指標[19-20]。本研究表明，大鼠在去勢后，水平運動得分及糖水消耗率明顯下降，在慢性束縛應激結合孤養的作用下，去勢模型組大鼠的行為活動進一步減少、糖水消耗率進一步降低，提示僅僅去勢即會使大鼠活動度、好奇程度及獎賞反應的敏感度下降，但是肝郁造模后大鼠的各癥狀加劇，缺乏，興趣喪失，可能是由于大鼠卵巢切除后，生殖內分泌功能開始衰退，對抗應激損傷的能力降低，腦內獎賞系統的一些神經元發生結構性損傷所致。
綜上所述，采用去勢及慢性束縛應激聯合孤養三步法復合制作圍絕經期綜合征肝郁大鼠模型，可以有效地模仿女性圍絕經期由于卵巢功能衰退引起的情感障礙、情緒低落的臨床表現。但是值得注意的是，在研究過程中發現，慢性應激誘導行為改變的易感性存在較大的個體差異，該方法并不能實現百分之百的成功率，因此研究過程中，必須適當增加樣本例數[21]。另外，圍絕經期綜合征肝郁的病理機制涉及神經內分泌免疫等調節網絡，運用現代分子生物學技術進一步闡明其發生發展機制，將為圍絕經期綜合征肝郁的臨床治療提供理論基礎。
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動物行為學研究方法范文6
【關鍵詞】 母嬰分離；開場實驗；生命早期應激
臨床研究表明，生命早期應激容易導致個體成年后患精神疾病的傾向。例如，幼年時有受虐待經歷成年后易出現心境障礙或者易患創傷后應激障礙(post-traumatic stress disorder,PTSD)［1］。Brewin 等［2］研究證明少年時期的精神創傷和受虐待是形成PTSD重要的的危險因素。母嬰分離被認為是研究人在幼年時期被忽視和受虐待有效的動物模型。大量相關動物實驗研究發現，母嬰分離能導致行為學和神經內分泌的異常而出現抑郁和焦慮樣反應［3］。這些研究結果表明生命早期應激可能對中樞神經系統發育產生深遠而持續的影響，這些影響會導致各種行為學異常和大腦內長時期的生物化學改變。本實驗應用母嬰分離的動物模型，旨在研究生命早期不良經歷對大鼠發育過程中神經行為學的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和分組
懷孕Wistar雌鼠8只(由中山大學中山醫學院實驗動物中心提供)。雌鼠生產后在光暗周期為12 h/12 h，光照時間8:00-20:00，溫度23±2℃，濕度(52±2)%的條件下飼養。22 d后斷奶后每籠4只飼養。22 d后將新生雄性大鼠分為母嬰分離組和正常對照組，每組8只。
1.2 主要材料
ZH-ZFT型自發活動實驗視頻分析系統(安徽省淮北正華生物儀器設備有限公司)。
1.3 動物模型的復制
母嬰分離組在新生鼠出生后的第2~15 d給予每天母嬰分離3 h的應激刺激。將新生大鼠小心移出，放進另外準備好的鼠籠里，移至另一臨近房間，保持溫度在25.0℃±0.5℃，母鼠留在原籠中，仔鼠被帶離母鼠3 h后放回母鼠籠中，對照組正常飼養。模型復制均在上午(8:00AM-13:00AM)進行。
1.4 自發活動檢測
于仔鼠生后22(PND22)d、60 (PND60)d和90 (PND90)d的相同時間，在安靜、四周由全封閉的遮光簾隔離開人及電腦干擾并杜絕參照物的環境條件下進行。觀察5 min內大鼠活動情況。
1.5 數據處理
測定值用均數±標準差(Mean±SD)表示，采用SPSS 16.0統計軟件分析，組間比較采用t檢驗。以P
2 結果
母嬰分離對大鼠自發活動的影響
22日齡大鼠：
仔鼠出生后第22日齡檢測其自發活動。結果顯示母嬰分離組大鼠自發活動總路程和周邊路程較對照組顯著增多(P
圖1
22日齡大鼠自發活動各路程
60日齡大鼠：
仔鼠出生后第60日齡進行第二次自發活動檢測。結果顯示，母嬰分離組中央路程較對照組明顯減少(P
90日齡大鼠：
仔鼠出生后第90日齡進行第三次自發活動檢測。結果顯示，母嬰分離組大鼠自發活動總路程、周邊路程、中央時間和周邊時間與對照組相比均存在顯著差異(P
圖2
60日齡大鼠自發活動各路程
3 討論
人類生命早期應激，是多種精神疾病的重要風險因素，可誘發重性抑郁癥、創傷后應激障礙、兒童注意缺陷癥及精神分裂癥等疾病。關于其致病機制的研究，目前主要采用動物模型是應用于嚙齒類動物的母嬰分離模型，因其符合人類生命早期母子分離的特征，得到廣泛應用。
自發活動(Animal Locomotion)試驗是觀察實驗動物在自然狀態下的活動情況，在神經精神藥理學、行為藥理學和毒理學等各個領域得到廣泛的應用。有些研究認為動物在自發活動實驗中出現自發活動的減少，尤其是中央區域探索活動的減少，提示動物表現為抑郁樣行為。也有研究表明，在自發活動實驗中動物活動的增加，尤其是周邊區域活動的增多，反映動物處于焦慮恐懼狀態。Platel等研究認為，動物若重復暴露在同一環境中，會出現對該環境的習慣化，從而表現在第二次重復試驗中表現為自發活動的減少，而且在第二次重復實驗中動物的活動路程越少，表明其記憶能力越好。本實驗結果顯示，22 d母嬰分離組大鼠在表現為自發活動總路程和周邊路程較對照組顯著增多，90 d剝奪組大鼠總路程、周邊路程和周邊時間明顯增加，中央時間明顯少于對照組。我們認為母嬰分離應激誘發了大鼠的焦慮樣和抑郁行為。
綜上所述，出生后經歷生命早期應激會影響個體的神經發育，導致發育過程中及成年后行為活動能力的受損。
參 考 文 獻
［1］ Wolfe, D.A. L. Sas, and C. Wekerle, Factors associated with the development of posttraumatic stress disorder among child victims of sexual abuse. Child Abuse Negl, 1994,18(1):37-50.
