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歲末感言范文1
[關鍵詞] 骨髓間充質干細胞 可塑性 視網膜
視網膜是由視網膜色素上皮層和神經感覺層組成的對光敏感且精細的膜樣結構，是視覺形成的基礎。任何原因引起的視網膜血管，神經感覺組織和色素上皮的病變均可導致視力損傷，甚至致盲。各種原因引起的視網膜疾病的最終結果都是視網膜神經細胞的壞死或凋亡，造成不可逆的損傷，如：視網膜色素變性(retinitis pigmentosa, RP)、年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration, AMD）等。雖然目前有多種治療方法，但療效均欠佳。隨著干細胞研究的深入，利用干細胞，尤其是MSCs，誘導分化為視網膜各種細胞，恢復視網膜的結構和功能可能有望成為新的治療途徑。
干細胞可分為胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞具有分化的全能性，可分化成為各種類型的細胞[1]。利用胚胎干細胞移植入受損部位可使組織再生恢復功能。已有報道指出胚胎干細胞可以向視網膜前體細胞誘導分化[2]。胚胎干細胞對于視網膜變性疾病的治療有很大潛力，但是由于胚胎干細胞的研究在倫理方面存在很大爭議。此外，胚胎干細胞的MHC-Ⅰ類分子隨細胞分化而不斷增加，使其排斥反應成為限制其應用的一個重要問題。成體干細胞是存在于個體組織中的具有多向或單向分化的潛能，廣泛存在于骨髓、肝臟、心肌、腦、及視網膜等組織中。在特定情況下，如組織損傷等，可增殖分化修復受損的組織。各種成體干細胞中，以MSCs具有多向分化潛能，可分化成為包括骨、軟骨、脂肪細胞、筋膜、肌肉及骨髓基質等[3]，而成為當前研究的熱點。此外，MSCs克服了胚胎干細胞的缺點，來源豐富，取材方便，易于分離純化，可塑性強且不存在倫理學問題。
1 MSCs概述
1867年Cohnheim在研究損傷修復時，利用可溶性苯胺染料經靜脈注射后發現染料出現在遠端受損修復部位的細胞中。并由此推測損傷部位的細胞是來自血液的，而且很可能來自骨髓。雖然這一推斷至今尚未得到證實，但是最近的研究證實骨髓中確實存在一種不同于造血干細胞且具有多向分化潛能的干細胞，即MSCs。
1.1 MSCs的細胞學特點
MSCs除具有細胞核漿比值大，細胞器少等干細胞的一般形態學特點外，還有細胞呈梭形，粘附能力強，每2~4個細胞可形成一個集落單元[4]。MSCs分裂周期在33h左右，具有較強的分裂能力。體外培養的MSCs經過20~30次的細胞倍增后，應用帶微孔的膠囊將其包繞并植入鼠的腹膜，可發現MSCs仍可分化成為纖維、骨、軟骨等組織[5]。
1.2 MSCs的免疫標志物
利用流式細胞儀分析顯示，MSCs大多數可表達SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124等。MSCs不表達造血干細胞的標志物，包括脂多糖受體CD14、CD34以及白細胞的一般標志物CD45[3]。所以目前認為可以把CD44、CD105、CD106等骨髓細胞標志物陽性等作為MSCs免疫學鑒定方法。
1.3 MSCs誘導分化的分子因素
作為間質來源的干細胞，MSCs具有多向分化潛能且分化的方向視誘導因素的不同而各異。MSCs分化過程中涉及多種細胞因子。各種細胞因子的作用方式和信號傳導過程也不同。其中，受體酪氨酸激酶（Receptor Tyrosine Kinase, RTK）可從細胞的增殖、生長、分化等方面調控細胞。過程包括配體―受體的結合，受體磷酸化并活化下游分子，通過級聯反應對細胞生長分化等發揮重要作用[6]。影響MSCs生長分化的蛋白質分子包括多種生長因子分子，如BMP,activin等，和多種類型的白介素。這些分子通過不同時相和濃度作用于MSCs，使其生長并向多種細胞類型分化。Irina Kratchmarova等[6]，在研究多種細胞因子對MSCs對分化的作用機制時，發現hMSCs分化成為骨樣細胞是表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）刺激產生的，而不是血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor, PDGF）。多數細胞內信號傳導蛋白可同時傳導兩種配體的刺激信號，但是磷酯酰肌醇激酶3（PI3K）途徑卻是單獨由PDGF激活的。利用PI3K的抑制劑可以使PDGF誘導分化的效應回退。這表明該途徑可能是一個細胞分化的控制點。此外，Runx2與PPARγ是調節MSCs分化的的兩個關鍵轉錄因子，通過以上兩個轉錄因子的活化分別驅動MSCs分化成為骨母細胞或脂肪細胞。同時，14-3-3結合蛋白TAZ對Rux2與PPARγ依賴性基因有分別共同激活和抑制的作用。MSCs的分化分子機制復雜，對其進行全面的研究有助于成功誘導MSCs分化成為目的細胞。
2 MSCs在視網膜疾病研究中的應用
多種試驗已證實MSCs可以分化成為包括視網膜的各種細胞在內的多種類型組織細胞或前體細胞。由于視網膜是由RPE、光感受器細胞和神經節細胞等組成。RPE和神經感覺層的細胞分別由胚胎發育時的神經外胚葉的外層和內層發育而來，各種細胞高度分化。因此，要實現將MSCs成功誘導分化成為視網膜細胞就需要不同的誘導條件。當前對于MSCs在視網膜疾病研究中的應用，大體是通過兩條途徑來實現的，即體外培養誘導和眼內移植。兩條途徑各有優缺點。利用體外誘導可以通過人工添加各種生長因子等，明確各種蛋白質分子對MSCs誘導的作用。培養液中成分明確便于分析，但是在尚未明確MSCs分化成為視網膜細胞的機制之前，體外培養無法準確誘導MSCs分成特定類型的細胞或前體細胞；成功誘導較為困難。與體外培養相反MSCs移植則可以應用體內適于MSCs分化的微環境誘導其分化成為特定類型的細胞或前體細胞。甚至某些分化的細胞可具有部分功能。但是眼內移植同樣存在缺點。如體內微環境復雜，存在多種促進或抑制分化的因素。此外，復雜的體內環境對于MSCs誘導因素的分析同樣是存在困難的。
2.1 細胞標志物的檢測
檢測MSCs是否被誘導成為目的細胞需要一定的檢測指標。而在細胞類型的檢測中，免疫標志物是較為可靠的指標，且在成為功能細胞前即可出現。幾種視網膜細胞具有各自的標志物，RPE，可表達角蛋白、RPE65等，光感受器細胞表達視紫紅質、視蛋白等。神經節前體細胞則可表達巢蛋白。神經膠質細胞可表達膠質酸性纖維蛋白等。所以當前對于MSCs誘導分化成為視網膜各細胞的研究也多采用這些標志物作為初步檢測指標。而在功能檢測方面，RPE常檢測其是否形成色素或類似色素的顆粒。神經細胞則應用到電生理，如膜片鉗等技術等；或是檢測是否存在突觸囊泡等。
2.2 MSCs誘導成為視網膜各細胞的關鍵
由于視網膜各種細胞高度分化，故利用MSCs誘導分化成為視網膜細胞需詳盡了解誘導過程的關鍵因素。當前多數研究是將MSCs與特定細胞共培養并適當添加生長因子或利用體內微環境誘導。這些方法尚不能把誘導過程的關鍵因子一一闡明，但眼的發育過程為我們提供了可能與誘導過程存在密切關系的某些因子。
RPE的形成與TGFβ的超家族成員BMP和activin存在密切關系[7]，其中BMP對RPE的正確發育有重要作用。因為Noggin的過渡表達可導致區域特異性的RPE完整性缺損[8]。神經視網膜可由視杯的神經上皮發育而來或由RPE轉分化形成，FGF家族成員的分子對分化的兩條途徑均有重要作用[9]。bFGF可使神經上皮向神經視網膜轉換[10]，而胚鼠RPE中FGF9的表達則可使RPE向神經視網膜轉變[11]。而在光感受器發育時兩個重要的轉錄因子，視網膜鏈氨基酸拉鏈（Nlz）和核受體（Nrze3）可以調節視桿細胞特異性的轉錄，同時抑制視錐細胞相關的基因轉錄表達[12]。二者的同時缺失則可使視網膜前體細胞向視錐細胞分化[13]。
2.3 體外培養誘導MSCs向視網膜細胞分化
Urs Vossmerbaeumer等[14]利用RPE條件培養液培養MSCs，通過研究添加血管活性腸肽（VIP）是否可以調節MSCs的分化進程時發現MSCs可以表達RPE的某些特異性標志物，如：bestrophin,角蛋白8,18以及RPE65等；而且在進一步檢測細胞功能時發現，利用促黑素（MSH）可以刺激已分化的MSCs表達色素顆粒，這些結果表明MSCs具有向神經外胚層分化的潛能，可以產生具有RPE特性的細胞表型且具有一定得功能。有學者利用鼠MSCs與不同發育時相的神經視網膜前體細胞（RPC）共培養時發現，與EB.5RPC共培養3d后的MSCs表現出神經元樣外觀，膜出現突起的結構。利用RT-PCR 和免疫熒光可檢測到Pax6,Brn36和巢蛋白表達，如果將培養時間延長到7d或14d則無法檢測到Pax6,Brn36的表達，而且在14d的培養后MSCs恢復原來的梭形外觀，由此認為MSCs自身可能存在著反饋調節，可以再一定程度抑制其分化，以維持干細胞的特性。
CD90¬¬¬¬+的MSCs的可塑性已被多種實驗證實,CD90+的MSCs可被包括?；撬?、actinvin A、和EGF在內的多種介質誘導分化成為視網膜神經細胞樣的細胞。被誘導的MSCs中30%可表達光感受器細胞的特異性標志物RHOS；同樣也有30%的細胞可表達無長突細胞的標志物CRABP1。另外尚有少數細胞可被這三種介質誘導表達巢蛋白。
2.4 MSCs移植誘導分化成為視網細胞
多數MSCs體外移植治療視網膜疾病研究的途徑是利用分離培養的MSCs經視網膜下腔注射。有學者用GFP或BrdU標記CD90+的MSCs后注射入成年RCS鼠視網膜下腔。2W后發現CD90+的MSCs與宿主視網膜整合形成類似光感細胞層的結構，并且細胞可出現Opsin、RHOS、突觸囊泡等，而分裂期細胞標志物PCNA并未測得。這表明細胞是進行了分化而不是分裂，這一結果證實MSCs可以分化成為視網膜細胞.該研究為視網膜變性病變的細胞療法的研究提供了良好的前景和研究途徑。
Wang.S等[15]利用RCS鼠的MSCs分別通過尾靜脈和視網膜下腔途徑對同基因鼠進行注射后，在不同時相進行光感細胞血管功能形態學方面的檢查，發現視網膜下腔注射后可以很大程度上挽救視網膜的形態和功能，而經尾靜脈注射則可對整個視網膜的光感細胞有挽救作用，兩條途徑結合則可以同時挽救光感細胞和視覺功能。
3 問題與展望
干細胞研究是當前的一個熱點和難點。利用MSCs誘導分化成為視網膜細胞，可以為多種視網膜變性疾病帶來希望，但是MSCs很難按預定方向分化，為此,需要從分子水平闡明MSCs分化過程的關鍵因子，并結合最新的組織工程技術從多方面研究MSCs的分化過程，實現其定向誘導分化成為視網膜各種細胞。在此過程中需要研究人員的不斷探索。
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歲末感言范文2
[關鍵詞] 干細胞 視網膜細胞 分化
視網膜是人體接受外來信息的重要部位。外傷、退行性病變及腫瘤等導致的視網膜損傷常引起嚴重的視力障礙甚至失明。目前隨著干細胞生物學的深入研究，應用不同來源的干細胞及其前體細胞參與視網膜組織修復和細胞再生成為研究的熱點。
1 眼源性干細胞分化修復視網膜損傷
1.1 來源于睫狀邊緣生長區和睫狀體的干細胞
睫狀體邊緣生長區（ciliary marginal growth zone，CMZ）位于視網膜的邊緣。視網膜大部分由CMZ產生的視網膜神經元組成，哺乳動物視網膜生成一旦完成，就不再繼續生成。此外也沒有發現類似CMZ。最近，Abdouh等[ 1 ]在成年鼠眼內注入生長因子，發現睫狀體上皮細胞能重新獲得胚胎期特征, 并能表達神經前體標記物nestin及視網膜祖細胞的同源轉錄因子Pax6和Chx10。這一結果提示成年哺乳動物的睫狀體可能是潛在的視網膜前體細胞來源，只是正常情況下這些具有干細胞特性的細胞處于靜止狀態，睫狀體內微環境不允許細胞的遷移和神經發生。
1.2 Müller細胞
Müller細胞為一種特殊的神經膠質細胞，在視網膜的發育和功能活動中起重要作用。最近Peter和Patrick等[ 2, 3 ]分別應用出生后的雞及魚為對象，研究視網膜神經毒性物質NMDA損傷后視網膜內神經元的再生情況。結果顯示：Müller細胞在視網膜受到急性損傷后可重新進入細胞循環，且增殖的Müller細胞具有向損傷區擴展的特性。說明在未損傷視網膜內同樣可能發生神經再生。Müller細胞可以為視網膜再生提供來源。許多研究還發現在視網膜急性損傷后，許多Müller細胞不僅經歷增殖反應，還失去其Müller細胞的形態，并開始短暫表達原僅表達于胚胎前體細胞中的轉錄因子， 如Pax6、Chx10、甚至Six3[ 3-5] 。這說明增殖的Müller細胞可分化表達視網膜祖細胞。
1.3 虹膜色素上皮細胞（iris pigment epithelium,IPE）
由于IPE細胞與視網膜色素上皮細胞（retinal pigment epithelium, RPE）的胚胎來源相似容易得到。且體外培養的IPE細胞又具有RPE細胞的某些功能，如吞噬感光細胞的外節膜盤，維持視網膜的代謝等。 所以可以將IPE細胞移植于視網膜下代替RPE細胞。動物實驗顯示將自體IPE細胞移植于視網膜下1～3個月，IPE 細胞形成單層或多層排列，移植區感光細胞保持良好；6個月時IPE細胞與RPE細胞形成連接，RPE細胞頂端色素顆粒增多，感光細胞外節變長，IPE 細胞與感光細胞外節接觸，視網膜增厚，熒光素造影時沒有發現滲漏[6]。近年來，許多臨床工作者將IPE進行自體移植治療視網膜變性疾病都取得了良好的臨床效果[ 7]
2 非眼源性干細胞與視網膜修復再生
2.1 腦源性神經干細胞
Dong等[ 8]從人胚胎大腦皮層分離獲得神經干細胞，在體外用轉化生長因子β3處理后再移植到鼠玻璃體腔內。結果發現這些細胞移行并與宿主視網膜整合，分化成視網膜細胞且有視蛋白陽性表達。這不僅表明人類神經干細胞能移行整合到宿主視網膜，而且更為重要的是這些細胞經過處理后能夠分化成視網膜細胞，特別是類感光細胞。 Nishida等將海馬來源的干細胞注入到機械刮傷視網膜的成年鼠玻璃體腔內，結果發現移植的海馬干細胞整合到宿主視網膜內，免疫組化顯示多數細胞能表達nestin，并表現出對微管相關蛋白2ab、MAP5及膠質纖維酸性蛋白的免疫活性，證明了移植干細胞向神經元和星形膠質細胞分化。
2.2 胚胎干細胞( human embryonic stem, hES)
胚胎干細胞具有發育全能性，理論上可以分化出任何細胞類型。Haruta等將鼠胚胎干細胞在體外誘導分化為色素上皮細胞，并移植到4周齡的遺傳性視網膜病變RCS鼠的視網膜下間隙。結果發現這些細胞具有正常視網膜色素上皮細胞的形態和生理特性。Meyer等將胚胎干細胞源的神經祖細胞注射到成年的遺傳性視網膜退變小鼠玻璃體腔，16周后發現移植細胞與宿主視網膜整合，具有與視網膜神經元類似的形態結構和分布特征，并表達特異性蛋白。Meyer等還發現宿主視網膜神經元，特別是感光細胞的存活明顯增加。最近，有學者將人胚胎干細胞進行體外培養，發現在合適的培養條件下大部分hES能夠定向成為視網膜前體細胞，并主要分化為視網膜神經元(神經節細胞和無長突細胞) 。而將這種hES來源的前體細胞與視網膜變性小鼠的視網膜共培養，結果發現這些細胞整合到了變性視網膜上，并能表達感光細胞特異性標記物。
上述不同來源的干細胞雖然可以誘導分化產生特化的細胞并表達各種組織的特異性蛋白抗原，但是目前未能真正實現細胞功能。如移植的干細胞是否能夠幫助修復受損的視網膜？受損的視網膜如果被修復是否伴隨著視功能的恢復？這些問題目前還沒有答案。尤其是胚胎干細胞的“成瘤性”問題和干細胞體內移植后如何獲取免疫防御功能等一直是干細胞領域亟待正視與解決的關鍵問題。
2.3 骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）
MSC是目前備受關注的一群具有多向分化潛能的成體干細胞。研究發現MSC 有跨胚層分化能力，體外可經誘導分化為神經元及神經膠質細胞。MSC 能在小鼠視網膜內存活并能與原視網膜結構發生融合，因而有可能成為視網膜移植治療中具有發育潛能的高純度視細胞供體，在治療視網膜變性疾病及視神經病變中有廣泛的應用前景。
2.3.1 MSC 體外誘導實驗
許多學者運用不同的方法進行了MSC 體外誘導的實驗研究，證實MSC 經誘導后可向神經元方向分化。常用的神經細胞誘導介質主要有和二甲基亞砜，神經營養因子及全反維甲酸（ATRA），3-異丁基-1-甲基黃嘌呤及雙丁酰環化腺苷酸（dbcAMP）等。
Woodbury等在MSC如何向神經元分化方面取得巨大成果。他們首次確定骨髓間充質干細胞能在體外分化為神經元。此實驗中將成年鼠的MSC在培養基中傳代20代次，顯示了非凡的增殖能力。將其先后用不同的誘導介質來誘導產生神經元表型。分化的細胞群致密表達神經元特異性烯醇化酶（NSE），正在分化的細胞表達神經元前體干細胞特有的nestin，且幾乎80%的細胞表達NSE和神經纖維絲蛋白（neurofilament, NF-M）。他們接著又對人類骨髓間充質干細胞的分化潛能進行了研究。證明了人類的間充質干細胞也具有向神經元分化的能力。最近Chiou等將人MSCs與RPE細胞共培養成功誘導分化出視蛋白表達陽性的感光細胞，其機制與RPE細胞釋放的色素上皮因子誘導分化有關。
2.3.2 MSC 體內移植實驗
國內外學者做了大量工作研究自體骨髓干細胞移植治療RP的實驗。2002年Tomita等報道，用PKH-67標記了富含干細胞的骨髓細胞，注射到用鉤針損傷的成年大鼠視網膜下，2周后觀察到在損傷部位來源于骨髓的干細胞形成了新的視網膜細胞，外源的干細胞主要存在于損傷部位周圍的外核層，并且表達膠質纖維酸性蛋白（GFAP），鈣結合蛋白（calbindin），視紫質和波形蛋白（vimentin），這一結果提供了骨髓來源的干細胞分化為視網膜神經細胞和修補受損視網膜的可能性。
Otani A等從小鼠骨髓中分離得到Lin譜系陰性的造血干細胞（Lin-HSC），移植入兩種視網膜退形性變小鼠模型rd1和rd10眼中，使原本發生退形性變的視網膜血管網的數量和長度有了一定增長。與對照組比較，視網膜外核層及內核層的厚度增加，且有核細胞數量增加，同時可以觀測到視網膜電圖（ERG）記錄的明顯改善。他們同時進行了視網膜微點陣分析，顯示多種抗凋亡基因（如熱休克蛋白和轉錄因子）出現顯著上調。
最近還有學者[18]將GFP轉基因鼠骨髓源性干細胞移植入經碘酸鈉定向誘導RPE受損鼠眼內，結果發現部分細胞能遷移整合到宿主受損RPE層內并擁有了RPE細胞表型，表現RPE細胞形態，表達色素顆粒，并且沒有發現細胞融合。由此表明MSC可以成為視網膜組織再生的來源。
MSC 在眼科的應用研究剛剛起步。主要研究重點集中于尋找治療視網膜色素變性可行的治療方法上。其作為一種成體干細胞，除具有干細胞的共性外，還具有如下優勢：取材方便且對機體無害；由間充質干細胞誘導來的組織在進行移植時不存在組織配型及免疫排斥問題；間充質干細胞在理論上可以向任何組織分化。
盡管近年來對MSC的研究取得了很大進展，但仍然存在以下問題尚待解決：(1)成體干細胞含量極微，每10萬個骨髓有核細胞中約含有1個MSC，并且隨著年齡的增加或體質的衰弱，細胞的數量逐漸減少；(2)目前尚未能建立鑒定MSC的統一標準，至今還未能篩選到MSC特異性的標記分子；(3)MSC具有多系分化潛能，但向多系分化的效率尚不太理想，尤其是在體外的分化是否會引起MSC遺傳特性的改變還有待進一步證實；(4)是何種信號誘導了骨髓MSC向多系分化，其誘導分化的分子機制尚不明了。
綜上所述，雖然理論上干細胞研究為眼科學者展示了美好的前景。然而，只有在具有巨大挑戰性的屏障問題獲得解決，人類疾病的治療才能邁入“干細胞”時代。
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歲末感言范文3
關鍵詞: GABA;甘氨酸;延髓;免疫電鏡;大鼠
摘 要:目的 觀察大鼠延髓背角（MDH，三叉神經脊束核尾側亞核）淺層（Ⅰ，Ⅱ層）內降鈣素基因相關肽（CGRP）陽性終末與γ-氨基丁酸（GABA）能和甘氨酸（Gly）能神經元的突觸聯系. 方法 包埋前GABA或Gly免疫組織化學染色方法結合包埋前CGRP免疫金標記電鏡技術. 結果 GABA或Gly陽性產物廣泛分布于神經元胞體、軸突和樹突內，CGRP陽性標記主要見于無髓和薄髓軸突內.約53%和51%的CGRP陽性軸突終末分別與GABA和Gly陽性神經元的胞體或樹突形成非對稱性突觸，其中的多數為軸-樹突觸，軸-體突觸較少. 結論 含CGRP的初級傳入纖維直接與MDH淺層內的GABA能及Gly能抑制性中間神經元形成突觸聯系.
Keywords:GABA;glycine;medulla oblongata;microscope，immunoelectron;rats
Abstract:AIM To investigate the synaptic connections be-tween calcitonin gene-related peptide-immunoreactive（CGRP-ir）terminals andγ-aminobutyric acid（GABA）-and glycine（Gly）-ir neurons in the superficial layers（laminae I and II）of rat medullary dorsal horn（MDH）.METHODS Pre-embedding immunohistochemical detection of GABA or Gly，combined with pre-embedding gold marking technique，was used to identify CGRP-immunoreactivity.RESULTS Densely stained GABA-and Gly-ir neuronal cell bodies as well as axonal and dendritic profiles were observed in laminaeⅠandⅡof the MDH，while CGRP-immunoreactivity was found distributed mainly within thin myelinated and unmyeli-nated axons and their terminals.About53%of CGRP-ir ter-minals made asymmetric synapses with GABA-ir cell bodies and dendrites and so did51%of CGRP-ir terminals with Gly-ir cell bodies and dendrites，the majority of which were axon-dendritic synapses and the minority were axo-somatic synapses.CONCLUSION CGRP-containing primary afferent fibers make direct synaptic connections with GABAergic and glycinergic inhibitory interneurons in laminaeⅠandⅡof the rat MDH.
0 引言
延髓背角（MDH，三叉神經脊束核尾側亞核）的淺層（Ⅰ，Ⅱ層）由投射神經元和中間神經元構成，主要接受傳遞面口部傷害性信息的初級傳入纖維［1，2］ .MDH淺層內有γ-氨基丁酸（GABA）和甘氨酸（Gly）能的抑制性中間神經元，它們在外周傷害性信息向中樞傳遞的過程中，發揮著重要的調控作用.P物質（SP）和降鈣素基因相關肽（CGRP）是三叉神經節發出的無髓或薄髓初級傳入纖維的神經活性物質，主要參與傷害性信息向MDH的傳遞［3，4］ .我們以往的研究觀察到含SP的初級傳入終末與GABA和Gly能神經元形成突觸聯系［5］ .本研究用包埋前GABA或Gly免疫組化染色方法結合包埋前CGRP免疫金標記的電鏡技術，對MDH淺層內CGRP陽性終末與GABA及Gly能抑制性中間神經元的突觸聯系進行了觀察.
1 材料和方法
1.1 材料 ①實驗動物SD大鼠8只，體質量200～250g，雌雄不拘，由第四軍醫大學實驗動物中心提供;②實驗儀器Philips CM100電子顯微鏡.
1.2 方法
1.2.1 取材 在ip戊巴比妥鈉（100mg?kg-1 ）的深麻醉狀態下開胸，經左心室插管至升主動脈，先用100mL生理鹽水沖洗血液，再灌注500mL含40g?L-1 多聚甲醛、2g?L-1 苦味酸和0.5g?L-1 戊二醛的0.1mol?L-1 磷酸緩沖液（PB;pH7.3），持續1.5～2.0h.灌注完畢立即取腦并置于上述新鮮固定液中后固定4～6h.振動切片機冠狀切腦干，片厚40μm，切片分2組收集.經冷凍保護后，用液氮對切片進行凍融，以增強抗體穿透細胞膜的能力.再將切片置入含0.2L?L-1 正常羊血清的0.05mol?L-1 Tris鹽酸緩沖鹽（TBS）溶液中孵育0.5h，以阻斷非特異性免疫反應.
1.2.2 免疫細胞化學染色 切片經0.05mol?L-1 磷酸緩沖鹽溶液（PBS;pH7.4）漂洗后，用ABC法對第1組切片在室溫下進行GABA/CGRP的免疫細胞化學染色，步驟如下:將切片在豚鼠抗GABA血清（1∶1000;Chemicon）和兔抗CGRP血清（1∶1000;Incstar）的混合液中孵育24h;用結合有生物素的驢抗豚鼠IgG（Jackson）和結合有1.4nm免疫金顆粒（1∶100;Nanoprobes）的羊抗兔IgG的混合液孵育16～18h.對第2組切片進行Gly/CGRP的免疫細胞化學染色，步驟如下:將切片在兔抗Gly血清（1∶1000;Chemicon）和小鼠抗CGRP單克隆抗體（1∶200;Chemicon）的混合液中孵育24h;用結合有生物素的驢抗兔IgG（1∶100，Jackson）和結合有1.0nm的免疫金顆粒（1∶100;Aurion）的羊抗小鼠IgG的混合液孵育16～18h.在上述各步驟之間，均用0.05mol?L-1 的TBS清洗.對抗體和復合物稀釋時都用含0.2L?L-1 正常驢血清的0.05mol?L-1 的TBS.此后，對切片進行下列處理:①10g?L-1 戊二醛后固定10min;②HQ Silver Kit（Nanoprobes）進行銀加強8～14min;③ABC Kit（Vector）孵育2h.切片在含0.2g?L-1 二氨基聯苯胺和0.03mL?L-1 雙氧水的0.05mol?L-1 Tris-HCl緩沖液（pH7.6）內呈色10～20min.上述各步驟之間均用PBS洗片3次，每次10min.將免疫組化染色后的切片置入10g?L-1 鋨酸溶液固定1h，在含700mL?L-1 乙醇的飽和醋酸鈾溶液中過夜，梯度乙醇及環氧丙烷脫水，Durcupan（Fluca）平板包埋、聚合.在解剖顯微鏡下取出延髓背角淺層，粘接在環 氧樹脂柱上，超薄切片，將切片裱于銅網.枸櫞酸鉛染色，電鏡觀察、攝片.
1.2.3 對照實驗 在省略一抗的條件下，其余染色步驟同上，進行了對照實驗，電鏡下未見GABA或Gly陽性反應產物及CGRP免疫金標記.
2 結果
在電鏡下，GABA和Gly陽性反應產物廣泛分布于MDH淺層神經元的胞體、樹突、軸突及其終末內（Fig1，2）.在陽性神經元胞體內，GABA和Gly陽性反應產物見于胞膜下以及胞內的線粒體、內質網等膜性結構的表面;在樹突內，陽性反應產物則見于樹突膜下和樹突內的細胞器表面及其內部;在軸突內，陽性反應產物主要分布于突觸小泡膜下.CGRP免疫金標記顆粒分布于薄髓和無髓的軸突終末內，主要見于顆粒小泡中（Fig1，2）.CGRP陽性終末與GABA或Gly陽性神經元的胞體及樹突形成非對稱性突觸聯系.在GABA和CGRP染色的標本上觀察到的95個CGRP陽性終末中，有53%（50個）與GABA能神經元形成突觸，其中42個（84%）為軸-樹突觸（Fig1），8個（16%）為軸-體突觸;在Gly和CGRP染色的標本中，觀察到69個CGRP陽性終末，有51%（35個）與Gly能神經元形成突觸，其中30個（86%）為軸-樹突觸（Fig2），5個（14%）為軸-體突觸.在CGRP陽性軸突終末內，有大量的多形性突觸小泡.其中，圓形清亮小泡最多，顆粒小泡次之，偶見扁平小泡（Fig1，2）.
此外，在電鏡下尚可見含大量扁平小泡的GA-BA能軸突終末與GABA能樹突形成對稱性突觸聯系（Fig1）.
3 討論
GABA和Gly是重要的抑制性神經遞質，在MDH內，主要存在于抑制性中間神經元.在中樞內源性鎮痛系統中，GABA可能通過激活GABAB 受體，參與對傷害性信息的調控［6，7］ .在MDH淺層，GABA能和Gly能抑制性中間神經元通過對初級傳入纖維、興奮性中間神經元和投射神經元的抑制效應，對外周傷害性信息向中樞的傳遞進行調制.MDH淺層內分布著大量的GABA和Gly能神經元的胞體和突起，在GABA陽性神經元中，約有一半也呈Gly陽性，而Gly陽性神經元中，大多數都同時呈GABA陽性［5］ .在MDH淺層內，GABA能和Gly能神經元的胞體和樹突直接與含SP的初級傳入纖維的終末形成突觸聯系，提示它們直接接受外周傷害性傳入信息［5］ ;而GABA能和Gly能的軸突則與投射神經元形成對稱性（抑制性）突觸，可能抑制面口部傷害性信息向上位中樞的傳遞［8］ .此外，我們以往的研究表明，內源性鎮痛系統的下行投射纖維終末在MDH淺層內密集分布［9-11］ ，也參與了對傷害性信息傳遞的抑制［12］ .
圖1 － 圖2 略
因為MDH既不接受來自中樞的CGRP能投射，也沒有CGRP陽性神經元，所以，MDH內的CGRP陽性終末均來自于初級傳入纖維.在MDH內，CGRP既能增強興奮性神經遞質谷氨酸和SP的釋放，也能直接興奮部分延髓背角Ⅱ層的神經元［3］ .此外，尚有研究表明鞘內注射CGRP抗血清后，大鼠足底注射弗氏佐劑或角叉菜膠引起的熱痛敏、機械性痛敏現象消失［13］ .上述結果表明，CGRP在MDH的Ⅰ，Ⅱ層內發揮興奮性作用，促進傷害性信息向中樞的傳遞.我們對MDHⅠ，Ⅱ層內GABA陽性及Gly陽性神經元與CGRP陽性終末的突觸聯系進行了觀察，見到GABA陽性及Gly陽性神經元的胞體和樹突位于CGRP陽性終末的突觸后，兩者之間主要形成非對稱性（興奮性）突觸，但未見到GABA或Gly陽性終末與CGRP陽性初級傳入纖維之間的突觸聯系.上述結果提示外周傷害性刺激可能促進CGRP的釋放，經由興奮性突觸將傷害性信息傳遞給GA-BA能及Gly能神經元，激活MDH淺層中的抑制性環路，對傷害性刺激進行調制.此外，我們在電鏡下還觀察到突觸前和突觸后均為GABA陽性的軸-樹突觸（Fig1）.此類突觸可能通過抑制GABA能中間神經元，對投射神經元發揮脫抑制（disinhibitior）作用，使投射神經元的興奮性增強，進而促進傷害性信息的傳遞.
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歲末感言范文4
12月17日，《私人訂制》在北京舉行首映紅毯典禮，導演馮小剛攜四位主演一并出席，眾多大咖強勢助陣。有記者觀影后發現，這就是部“夠二”的《甲方乙方》，面對炒冷飯的質疑，馮小剛坦言：“我喜歡吃剩飯，入味兒，香！”如此拿著不是當理說，正如一男性嘉賓手持的“趣味”春聯上精光閃閃的四個大字——“倍兒牛逼”，據說這也成為紅毯的一大亮點?？蔁o論怎樣，也沒有戲中扮演夜總會媽咪的85后女星邱曄引人注目：性感半球，整片脊背，臀溝股骨——如此無節操，真心無下限??！由此我們也就對《私人訂制》未映遭噓、華誼兄弟股價觸及跌停便不再驚呆了。
話說回來，普通的受眾真的很寬容，他們從來不乏善良的愿望，“在一起”從春晚喊到了中秋，直至加上了“上頭條”，只是點兒背真的怨不得這寬松的社會，有心細的網絡小編為“峰怡戀”的艱難頭條路做了如下記錄：
9月13日王菲、李亞鵬事件：汪峰在微博上宣布自己離婚之后幾小時，王李曝出離婚消息，瞬間就把汪峰深情并茂上千字的離婚感言秒成了渣；11月9日恒大事件：汪峰在演唱會上向章子怡深情表白，卻萬萬沒想到板上釘釘的頭條卻被恒大奪得亞冠冠軍的巨大喜訊沖到不知何處；11月13日劉詩詩吳奇隆、楊冪劉愷威等事件：作為最近的話題人物，汪峰發新歌本來也有頭條相，但是劉吳、楊劉等5對娛樂圈的情侶組團公開戀情，再一次讓汪峰感受到了這個世界的滿滿惡意；只是近日，憑借著章子怡7億陪睡案的收官鳴金，汪峰終于有望上頭條了。好在此前汪峰在承受了一系列巨大的沖擊挫敗后，身為女一號的國際章在微博里轉發男友的新歌，并且高呼汪峰是她的音樂國王，讓男主人公深刻體味了挺的力度。
遺憾的是，到了年終歲末，被評論人徐鵬遠認定存活在假想敵中的郭德綱，憑借“郭·吉訶德”般的大無畏精神，再一次攪動了演藝圈這潭渾不見底的淺水。徐文認為：“郭德綱的‘不入流’與自身性格、親身經歷和生存模式相關，他并不反體制，相反聰明地利用了這種矛盾贏得了一種類英雄的利益。郭德綱大有問題，但更有問題的是相聲界只有一個郭德綱，整體不進步，‘有藝少德’的郭德綱恐怕還會繼續流行下去?！彼灾锌希档藐P注。
歲末感言范文5
時光如水，一路向前，轉眼2020年已經走到盡頭，再見2020年，你好2021年。這里給大家分享一些關于再見2020你好2021的語錄適合發到空間或朋友圈里，供大家參考。
再見2020適用于朋友圈的語錄1.窗外沒有太陽?不要緊，只要心里有光，怎樣都會溫暖，2020年的最后一天，愿我們都能溫暖如初幸福依舊。
2.如果你有夢想，就默默去實現它，沒必要讓所有人知道。
2020年最后一天了，明年更加要加油哦!
3.你有你的背景，我有我的故事。
沒有讀懂我的故事，別給我多余的評價。別用昨日的眼光，看今日的我。2021加油。
4.任何事，任何人，都會成為過去，不要跟它過不去，無論多難，我們都要學會抽身而退。
5.關上2020的窗戶，忘記憂愁，拋開煩惱，丟棄哀傷，扔掉失望，擺脫病痛;打開2021的大門，迎接希望，堆積收獲，擁抱健康，感受歡樂，收集幸福!
6.生命的完整，在于容忍等待與愛，如果沒有這一切，你擁有了所有，也是虛無。
7.望過去的一年，付出了汗水，付出了努力，收獲了喜悅，收獲了成功，在五彩斑斕的人生涂上了重重一筆;
新的一年到來，愿你執起勤奮的筆，加油，在事業的大道上留下濃濃的一筆。
8.辛苦一天，成就一天，奔波一月，豐收一月，付出一年，收獲一年，2020回頭遙望，人生麥田，黃金閃閃，2021舉頭展望，未來大道，幸福光芒!祝前程無量，喜悅豐收。
9.快樂和痛苦其實都是人生的財富，與其消極逃避，不如勇敢去面對，有時候，能夠回憶也是一種幸福。
過去的事情可以不忘記，但一定要會放一放;今后的事情可能再失敗，但一定要去搏一搏。2020再見，2021你好。
10.收起遺憾的感嘆，收回后悔的心情，平靜瘋狂的回憶，穩重成功的感動，放開糾結的感情，重啟奮斗的夢，幸福和成長的心，伴你2021繼續遠行，愿成功成就常在，新年幸福輕松。
11.只要還有明天，今天就永遠是起跑線。
致即將逝去的2020!
12.我從來不信什么一夜成名，一夜暴富，只信一分耕耘一分收獲。
2020再見!
13.你好，新的2021年!我們渴望成功，首先要志在成功。
14.一個勝利者不會放棄，而一個放棄者永遠不會勝利。
再見2020，你好2021!
15.也許你的2020是苦澀的，或者是難忘的一年。
但你的2020也是快樂的充滿收獲的一年，2020年的最后一天，跟2020年好好的說一聲“再見”，2021繼續向前看!
16.總有無悔和后悔，總會無奈和不舍，總有簡單和復雜，總有感慨和冷淡，總有難忘和想忘，生活卻仍要向上，夢想依舊要奔忙，愿2021幸福相伴，快樂更長。
17.感嘆過無奈年華，花開花落留不住，感慨過如水生命，月缺月圓控不住，感謝過感情友誼，情真情深止不住，感動著拼搏努力，激情向前停不住，2021的目標更遠，2021的快樂更長，2021的未來愿你無限瘋狂。
18.人生難免有低谷，就看你是否能給自己搭一個跳板;
事業難免有不順，就看你是否能給自己一束陽光;不管過去有多失敗，將來都是未知的，只有努力者才能獲得新一輪的成功，加油!我看好你喲。
19.在煙花綻放的瞬間，趁著震耳的煙花聲輕輕地對你說“我喜歡你”。
20.告別過去，迎接未來。
勇敢改變，勇敢接受，新人新物新景象!
再見2020你好2021經典短句1.時間，是最公平的，不管你是誰，它都平等對待。
珍惜時間就是珍惜生命，對于每個人的付出它會有不同的回報。再見2020，你好2021!
2.不管這一年，你過得快樂或是傷心收獲還是迷茫，都得和那些開心的日子，那些孤獨的夜晚，和那些破碎的承諾，還有那混亂的麻煩說再見了。
3.愿你放下執著，放下不甘心，從今以后，只負責精彩自己的人生。
往事不回頭，未來不將就，你若盛開，清風自來。再見，2020!你好，2021!
4.生活，總是一半煙火，一半禪意。
2021，不再患得患失，帶著一顆通透的心，去發現生活中的美好，感悟生命的真諦，不再把時間用來追憶和憂思。早安。
5.不要為失敗找借口，只為成功找方法。
6.艱辛多彩的2020即將過去，嶄新期盼的2021馬上到來，祈愿家人在新的一年里平安健康!朋友們幸?？鞓?世界和平吉祥!地球永遠蔚藍美麗!
7.當漸行漸遠的今天即將成為2020年的封底，當漸行漸近的明天即將成為2021年的封面，奉上最衷心的祝愿：新年快樂，新年進步!
8.拼搏與努力，奠定了卓越的業績;奮斗與汗水，成就了事業的輝煌;2021，編織偉大的夢想;2021，唱響幸福的篇章;新的一年，愿你繼往開來，直掛云帆，想著理想盡情翱翔!
9.遺憾留給2020，好好愛自己，遇到珍惜自己的人。
10.風霜雪雨，2020已不再，悲歡離合往事散，酸甜苦辣也忘懷，成敗彈指一揮間，望過去，展未來，2021新起點，新的輝煌新舞臺，拼搏進取在未來，愿新的一年譜寫新的篇章繼往開來。
11.人生總會有不期而遇的溫暖，還有生生不息的希望。
2020年最后一天了，再見了2020，2021也要加油哦!
12.回顧2020年，在工作上我們互相幫助，在生活上我們互相照顧，快把這些收起來吧;
我要在2021年里繼續我們的快樂，繼續我們的和諧。愿我們在新的一年里合作愉快，事業更上一層樓!
13.把2020年的失意化為勇氣，痛苦轉為力量，哀傷變成勇闖，困擾融成決心，阻難引為方向;在2021年里，堅持向前，努力去闖，追求不止;祝你早日成功，輝煌永享!
14.鮮花繽紛美酒醇，舉杯同慶業績高。
掌聲不息淚花閃，你的辛勞我知道。成功之路汗水鋪，拼搏換來事業傲。愿你再接再厲不驕傲，新年再把新功建!
15.請你好好努力，變得自律，變得優秀!
16.如果你要選擇前方，那就不要再留戀過去的溫暖，帶上你的倔強與驕傲，就像向日葵迎著太陽，你也要迎著遠方。
2021你好。
17.掃去一年的疲憊和風塵，其實我們還很年輕。
18.總結：辛苦一天，成就一天，奔波一月，豐收一月，付出一年，收獲一年，2020回頭遙望，人生麥田，黃金閃閃，2021舉頭展望，未來大道，幸福光芒!祝前程無量，喜悅豐收!
19.生命太短未來看似很長也不太長，我可以對2020情深義重但眼里心里還得是有無限可能的2021才行!
20.今天是2020的最后一天，每個人都是獨立的個體，真的沒有誰離開誰就活不下去的情況。
再見2020你好2021創意的說說1.我的征途是星辰大海，拜拜2020我不會回來了。
2.只管努力就好了，答案在2021年。
3.生活豐富又精彩，快樂辛勞緊相隨。
一年汗水一年累，換來碩果一大堆。優秀先進全是你，獎金分紅也不虧。愿你2021再努力，公司興旺你最美!
4.在新春即將到來之際，愿我的祝福如冬日暖陽，春日清風，夏日陽傘，為你擋風阻沙，送去溫暖，捎去清涼，陪伴你共渡今生!
5.辛苦一年不容易，今天大家聚在一起，為我們2020的成功舉杯，心情無比激動，愿2021年的大家身體健康，萬事如意，工作開心，再創佳績，公司來年再創輝煌，龍年騰飛創造奇跡。
6.有一種結局叫命中注定，有一種心痛叫綿綿無期。
7.人類往往少年老成，青年迷茫，中年喜歡將別人的成就與自己相比較，因而覺得受挫，好不容易活到老年仍是一個沒有成長的笨孩子。
我們一直粗糙的活著，而人的一生，便也這樣過去了。
8.此時此刻，感慨萬千，舊的一年已經過去，新的一年已經到來，展望未來，美好的日子正等著我們去奮斗，愿在新的一年里，我們能夠繼續經受住考驗，克服困難，讓公司的事業再度輝煌!
9.一個勝利者不會放棄，而一個放棄者永遠不會勝利。
2020，再見;2021，你好!
10.留住快樂，記住經驗，攢下運氣，帶上福氣，拼出積極，搏出努力，告別2020年，迎接新喜，好運伴隨，幸福跟隨，成就自己，成功公司，萬事如意，新年快樂。
11.今天是2020年最后一天，我們即將和2020說再見。
匆匆歲月，我們奮斗不息，我們用心生活。
12.一無所有就是拼搏的理由。
再見了，2020年!你好，2021年!
13.花開花落，此消彼長，云卷云舒，又是一年。
愿時間更替帶給你漂亮心情，飄送著我的祝福，縈繞在您的身邊。祝你新年快樂!快樂每一天!
14.用真誠品味回憶，用真情品味朋友，用真心品味工作，用勤奮品味學習，用感恩品味幸福，用寬容品味年輪!
15.新的一天用運動投資健康，用讀書和旅行提升眼界，這些自我提升的好習慣，值得每一個人努力去養成。
早安!2020的最后一天!
16.悲觀主義是一種態度，一個勇敢的人的態度。
2020，再見;2021，你好!
17.醒來打開窗一陣哆嗦2020的最后一天，有時候就覺得整個人空蕩蕩的，或是說有種所有喜怒哀樂都平靜下來以后的無力感。
18.不知不覺，時間就走到了2020年的最后一天了，還是很忙，不過還好有青梅酒。
感謝朋友，知道我喜歡喝青梅酒，找了朋友各種打聽幫我買來，謝謝!
19.新的一年總會有新的挑戰，愿自己還能夠保持一個好的心態。
再見2020，你好2021!
20.經驗是過去一年坎坎坷坷練出來的，成功是過去一年碰碰撞撞闖出來的。
你好2021的人生感言文案1.過去的一年，努力是你的佐佑銘，勤奮是你的宗旨，拼搏是你的后盾，終于握住成功的手;新的一年來到，愿你堅持去年的方針，加油鼓勁，獲得事業大豐收!
2.揮揮手，辭舊日，2020隨風逝;
想過去，忙碌多，2021奮力博;有歡笑，有悲傷，2020有成長。汗水與淚水交織，2021將圓滿結局。愿2021的你更加努力，大業興起。
3.或許我應該高冷一輩子，再也不想辜負別人的熱情，2020再見。
4.有時候，這個世界很大很大，大到我們一輩子都沒有機會遇見。
5.親愛的，公司過去的一年，是艱苦的一年，是開創的一年，更是豐收的一年，因為有了您的不懈努力，我們才會把公司做的如此順利。
6.在這歡喜的時刻，在這總結的時間，愿大家犒勞自己的身體，解放自己的心情，總結自己的經歷，成長自己的2020，喝酒喝出情誼，談心談出歡喜，愿2021的大家多多努力，再創輝煌。
7.風塵仆仆隨著新年的鐘聲消散在2020，快樂幸福尾隨著辭舊的歡笑迎面在2021，祝你掃走寒風，迎接暖暖的春風，生活甜蜜如花，家庭和諧如畫!
8.今天是2020年最后一天，我們即將和2020說再見。
匆匆歲月，我們奮斗不息，我們用心生活。
9.辛苦一年不容易，大家都很努力，工作有了新成績，歡喜我們都如意，2020總結走過去，2021重新再崛起，把激情留下，把斗志守住，把目標牢記，把奮斗拼起，愿你2021再創輝煌，成就奇跡。
10.為了不讓生活留下遺憾和后悔，我們應該盡可能抓住一切改變生活的機會。
11.你好，新的2021年!腦袋口袋，心態決定成敗。
12.人要為自己活，錢要為自己賺，公司是你和錢的天，有公司的效益，就有大家的晴天，2021年我們成功，今天大家要盡情歡，喝酒吃菜訴情誼，多分財氣和人氣，愿你萬事如意。
13.對自己狠一點，逼自己努力，再過幾年你將會感謝今天發狠的自己。
努力過后，才知道許多事情，堅持堅持，就過來了，再見2020，你好2021。
14.歲末，又到歲末。
感謝您一年的付出與拼搏，感謝您與公司一起快樂的成長。展望，就有希望。希望明年您一如既往的工作，收獲加倍的快樂，充實幸福的生活。祝你健康，幸福吉祥!
15.過去輝煌不容忘記，美好明天需要奮斗，新一年已經到來，在激烈市場競爭環境中，我們依然面臨很多挑戰。
愿同志們再接再厲，努力向前，再創新輝煌。
16.舊的一年已經過去，新的一年已經到來，展望未來，美好的日子正等著我們去奮斗，愿在新的一年里，我們能夠繼續經受住考驗，克服困難，打造一份不一樣的天空!
17.一心一意的努力不會白費。
認認真真的生活，總能闖出自己的一片天。
18.時間就是這樣：夜里想著心事，第二天的鬧鈴就響了;
下幾次雨，夏天也結束了;等反應過來的時候，一年已經快要過去了。
19.生命就是一個逐漸支出和利用時間的過程。
一旦喪失了時間，生命也就走到了盡頭。
歲末感言范文6
打造娛樂籃球
2005年12月17日，361°與中央電視臺體育頻道聯合了一條重磅消息：361°運動武裝與CCTV-5聯手重塑“籃球公園”，打造全民娛樂的籃球運動與最受矚目的籃球賽事。據悉此次361°與央視合作，三年的累計投入將超過6000萬元現金，包括節目冠名權，15個單項擂臺賽冠名權，惟一裝備提供，場地以及活動費用等。不少人都笑稱361°是在“玩命”。
當時，籃球公園還只是個想法，具體就是模仿美國NBA花式籃球，并融合街球、街舞、拉拉隊表演等時尚元素，吸引球迷參與。而這種娛樂+營銷的做法已并不是什么新鮮事了，在體育營銷與娛樂相結合方面，早在幾年前，百事可樂和肯德基就在中國推出了針對青少年的足球和三人籃球比賽。作為一個全新探索的節目，對電視臺和贊助商來說都存在著風險。所以當籃球公園制片人向企業推銷娛樂籃球節目的想法時，對此感興趣的企業寥寥無幾。
2005年10月，當籃球公園制片人找361°商談時，361°表現出了敢為天下先的勇氣。沒有過多猶豫，一出手就是每年2000萬元，這也一舉創下了CCTV-5最高的單筆贊助。
當然，361°的果斷之舉有著自己的考慮，公司營銷總監夏友群稱:“商業投資不可能沒有風險，但投資籃球公園有巨大商機，所以沒有猶豫。”實際上，361°果斷出手原因有三點。第一點看中的是CCTV-5的品牌，CCTV-5在國內良好的頻道覆蓋率、欄目收視率、強大的賽事與媒體資源等，是國內其他電視頻道所難以匹敵的。第二點是籃球所擁有的群眾基礎，據一份調查報告顯示，中國大概有三億人打籃球，40%的中國兒童說籃球是他們最喜歡的項目，75%的15至24歲的年輕人說他們是籃球的熱愛者，在北京、上海、廣州這樣的大城市，這個比例高達97%?！皧蕵坊@球”項目是針對15至24歲的年輕人，將在全國20個城市的賽場舉行600多場包括“三對三”、“3分遠投”、“扣籃”、“趣味投籃”、“花式籃球自選”等15項擂臺賽的公開比賽。作為一個運動品牌，361°最大的消費群體是追求時尚、個性張揚的青少年，而娛樂籃球大賽的主要參與者也正是這個群體，二者將得到完美的結合。第三點是2005年席卷大江南北的超級女聲，讓業界看到娛樂和營銷在加入媒體后的強大功效。娛樂籃球顯然和超級女聲有異曲同工之妙，同樣采用選秀的方式、同樣借助媒體平臺。361°希望通過央視這個平臺，搭起一座與消費者進行感情交流的橋梁。
事實證明，此次361°與CCTV-5的合作意義已完全超越了合作本身，更為重要的是打破邊際效益遞減的明星代言等舊模式，展示了一種體育營銷的新模式，這不只是簡單的促銷和接觸點的拓展，而是體育用品品牌建設思路的飛躍:由單打獨斗向建設具有共同精神和共同主張的品牌陣營的轉變。
在雙方合作的過程中，央視給予了361°極大的品牌宣傳空間，在每期90分鐘的節目中，每一處細節都對361°完全開放。在比賽中，所有的選手也都必須使用由361°提供的全套籃球運動裝備。在娛樂籃球從海選、路演、分賽區到全國總決賽的半年歷程中，361°的4000多家店鋪和銷售網點都成了節目的報名點和宣傳陣地；企業的公關、廣告、路牌、海報等多種市場推廣手段和媒介平臺也都成為節目的宣傳手段。對于361°的借力打力之舉，不能不說是企業的大智慧。
361°重金投入來搶占稀缺資源，表明其扎根體育、打造專業體育運動品牌的戰略思想更加清晰，而融入了娛樂籃球這一獨特的大眾籃球文化之后，其品牌比較優勢更為明顯。正如有媒體評價說，361°即將引領一場“籃球”，不僅為年輕一族帶來一種全新的時尚文化，也為體育營銷開創了“營銷+娛樂+媒體”的新模式。
詮釋品牌個性
國際著名廣告人凱文.羅伯茨認為，一個好的品牌，關鍵是讓消費者覺得這種商品有個性，在個性的紐帶下讓人與品牌之間產生一種愛，從而在情感上產生長期的認同與依賴。現在的消費心理，購買的不僅是實物，更是一種個人情感的表現物，哪個品牌能夠與消費者的情感產生共鳴，哪個品牌才能在競爭中立于不敗之地。
所以不管是耐克的“JUST DO IT”，還是阿迪達斯的“沒有什么不可能”，都是通過勵志式的品牌理念直擊消費者的情感動脈，尤其是年輕一代的消費者。本土品牌已經意識到，必須要打情感牌才能提升品牌的競爭力。但如何擺脫品牌理念的同源尷尬，又如何將這種差異的品牌情感深入人心呢？
相較于耐克和阿迪達斯的品牌主張，361°并沒有用一種教條理念鎖住消費者的情感，而是創造性地提出了“勇敢做自己”。除了宣揚勇敢和堅韌的體育精神外，更多的鼓勵消費者勇敢張揚個人情感，用自己的方式來詮釋體育精神。這與當代青年注重個性，喜歡用自己的方式和理解事物的特點不謀而合，使361°品牌的情感價值得到了巨大的提升。也正是基于對品牌內涵與消費者心理的深刻理解，才留下了品牌情感營銷的精彩一筆。
經過細心調研、精心策劃。2006年歲末，在圣誕節與元旦到來之際，361°在北京、上海、廣州等全國11個大中城市共同發起了“361°成年禮”活動。不僅為青年人送出了恭賀成年的特別禮物，而且發起“做件公益事，得份成年禮”的倡議，號召青年人勇于承擔社會責任，以做公益事的方式讓自己的成年禮更有意義。
“361°成年禮”系列活動一出爐，就吸引了眾多青少年的參與。盛大的“成年禮”網絡活動――征文和視頻大賽也隨機拉開大幕。網絡活動從簡單的宣誓、感言發展到動畫、文章的征集，博得了時尚年輕一族響亮的喝彩。大多數青少年認為這次主題活動為他們講出了心聲。隨后，贈送“成年禮”的活動更將活動推向，不少青年人都通過參與活動，得到了一份慶賀自己成年的禮物。在“做件公益事、得份成年禮”的主題下，青少年踴躍參與各種社會公益活動，讓回報社會成為自己的“成年宣言”。
這一系列活動的成功舉行，不僅點燃了眾多青年的熱情，為青少年搭建了一個表達自己心聲的平臺，也進一步拉近了361°與青年人心靈之間的距離。讓361°名符其實成為青年人的好朋友、代言人，“勇敢做自己”的理念更是深入人心?！俺赡甓Y”話題經互聯網熱傳，還引發了社會各階層的討論，361°品牌也因此廣受追捧。
事實上，“成年禮”可以說是361°情感營銷的一個縮影。在擴大專業賽事、專業媒體與品牌的融合的前提下，將情感營銷縱深化，圍繞“勇敢做自己”的品牌主張，通過張揚獨特的品牌文化使其進一步走進消費者的心里，并獲得消費者的情感共鳴。361°這種創新的品牌理念，不僅使其在品牌林立的運動裝備市場上獨樹一幟，而且也為中國體育用品企業開辟了一條個性化的道路。
挖掘傳播差異
有人說，北京奧運會是一次讓中國品牌走向世界的歷史性契機，也有人說奧運會將是中國運動品牌的大限。姑且不論奧運會是機遇還是挑戰，一個不爭的事實是，幾乎每個行業都在想盡辦法與奧運拉上關系，借助體育營銷來推廣自己。在這種情況下，簡單的營銷規劃已無法適應奧運年的發展需求。如何適應奧運年的發展需求，如何更有效選擇、利用各類媒體優勢，抓住機遇并最終帶動終端銷售，對企業而言顯然是道難題。
網絡，無疑是企業必爭的宣傳陣地。雖然在體育營銷領域，網絡的力量早已得到認同，但由于起步較晚，網絡技術和工具的更新又非常迅速，網絡的價值和模式并沒有充分被挖掘。因此無論是企業還是網絡媒體，都在繼續充分挖掘網絡營銷的特質和價值。具有敏銳市場意識的361°，早在2006年就攜手騰訊網，對網絡互動進行了初步嘗試。從對體育頻道冠名，到對客戶端和進行廣告投放，再到游戲平臺的互動，并結合線下精彩的賽事等。通過與騰訊的合作，全方位地提升了361°品牌的曝光率與知名度。
當然，選擇與騰訊合作顯然是經過深思熟慮的。騰訊作為中國最大的互聯網服務商，不僅擁有中國第一的即時通訊軟件QQ，而且騰訊網的平臺上還具有多元化營銷的突出優勢。更為重要的是，361°產品的消費群體與年輕的騰訊網用戶群體相吻合，他們年輕、時尚，有一定的消費能力，喜歡嘗試新鮮的事物，追逐潮流和品質，成為了這些行業最具價值的人群，這將直接加大361°品牌營銷的命中率。