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遺傳學重疊效應范文1
關鍵詞：油菜；三隱性核全不育系；臨保系；優勢
中圖分類號 S565.4 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）05-0066-03
國內報道的油菜細胞核不育類型主要有雙基因隱性核不育[1-3]，該不育系應用的一個最大障礙就是制種時要在其開花期拔除50%的可育株，不但影響制種產量和種子純度，還增加了制種成本。如何解決這一問題已成為多年來油菜育種界研究的熱點。
陳鳳祥等[7]報道了甘藍型油菜隱性核不育系9012A的不育性受2對隱性重疊基因和1對隱性上位抑制基因互作控制[5]，并找到了能100%保持其不育性的臨時保持系[6]，初步實行“三系”配套，克服了傳統“二系法”制種時需拔除50%可育株的難題，為隱性核不育雜種優勢利用開辟了一條新途徑。陳鳳祥等[7]提出的隱性上位互作遺傳假說，可以從存在隱性互作的雜交組合后代群體中分離出純合三隱性完全保持系。這種保持系自交后代不分離，與純合不育株測交后代植株100%表現不育，但與全不育系回交后代則只出現50%不育株，把這種保持系稱作臨保系（TAM）。根據遺傳分離規律，在存隱性互作的雜交組合F2代中可育株和不育株的分離比例有3∶1，15∶1，13∶3和61∶3等情況，在13∶3和61∶3分離的小區中可育株套袋自交并且分別與不育株一對一測交，可從中找到臨時保持系；在3∶1和15∶1分離的小區中進行兄妹交，能找到純合兩型系，從而完成三系配套。
1 材料與方法
1.1 材料 2004年漢中農科所引進三隱性細胞核不育三系雜交種向農03（上海市農科院周熙榮先生惠贈）作為分離對象。
1.2 方法 2005年春季在F1群體中選擇200個優良單株套袋自交，收獲后進行品質分析。2006年春季在F2代株系中調查育性分離情況，篩選出4個育性分離為13∶3的株系，在這4個株系中選擇可育株大量套袋自交，并且與株系中的不育株成對測交。
2 結果與分析
2.1 選育純合兩型系13AB 圖1顯示：2007年觀察了165份可育株自交后代及其成對測交（兄妹交）組合的育性表現，發現2個全不育組合，對應父本自交不分離。據此鑒定并分離出了2個臨時保持系，記為TAM-1、TAM-2。在組合分離中同時發現了5個育性分離比例1∶1的株系，對應父本自交育性分離比例3∶1，由于在1∶1系中不能確定其純合或雜合，因此，繼續在1∶1的組合內選不育株與可育株成對兄妹交，相應可育株套袋自交，不育株同時與臨時保持系測交；在2個臨時保持系中繼續套袋自交。2008年春，結合上年兄妹交與測交組合以及相應可育株自交的鑒定結果，篩選出2個兄妹交育性分離1∶1，與臨保系測交全不育，可育株自交分離3∶1的組合即純合兩型系，隨后繼續在組合內兄妹交―自交―兄妹交，嚴格進行品質改良，穩定純合兩用系的雙低品質。至2010年育成穩定純合兩型系13AB。
2.2 臨時保持系4081-1的選育 圖2顯示：與純合兩型系13AB配套的臨時保持系4081-1的選育，觀察了165份可育株自交后代及其成對測交（兄妹交）組合的育性表現，發現2個全不育組合，對應父本自交不分離。據此鑒定并分離出了2個臨時保持系。以純合兩型系中的不育株與配套臨時保持系雜交得到全不育系SY13A。之后擴大群體對其品質和農藝性狀進行連續4代選擇，使雙低品質和農藝性狀達到穩定一致。
2.3 隱型上位基因互作核不育三系繁殖、制種模式 圖3顯示：甘藍型半冬性上位互作細胞核全不育系油菜SY13A的不育性受2對重疊基因和1對上位基因共同抑制。當2對基因為隱性純合體（m1m1m2m2），另1對互作基因為顯性純合體（RR）和雜合體（Rr）時，植株表現不育（m1m1m2m2RR或m1m1m2m2Rr），其不育純合體相應的臨保系基因型為3對隱性純合體（m1m1m2m2rr）。利用純合兩型系中的不育株（m1m1m2m2RR）和可育株（M1m1m2m2RR或m1m1M2m2RR）成對兄妹交可產生純合兩型系（M1m1m2m2RR或m1m1M2m2RR）和純合不育系（m1m1m2m2RR），利用純合兩型系中的不育系（m1m1m2m2RR）和臨保系（m1m1m2m2rr）雜交可獲得全不育系（m1m1m2m2Rr），全不育系與恢復系（M1M1_ _或M2M2_ _）雜交可獲得全可育雜交種，從而將隱型核不育系SY13A的三系雜交種應用于生產。
3 討論
甘藍型油菜隱性上位互作核不育系具有恢復源廣，配組自由，易于選配強優勢組合，易于轉育，育性穩定，可避免不育胞質可能存在的負效應和細胞質單一化的潛在危險等優點[8]，更為重要的是解決了隱性核不育兩型系制種時拔除不育系中50%可育株的難題，提高了制種產量，降低了制種成本，保證了制種純度，在雜交油菜育種方面具有顯著的優越性。此外，還有學者做了相關研究，如陳大倫等[9]對甘藍型油菜隱性上位細胞核雄性不育純合兩型系、臨保系和全不育系的轉育方法進行了介紹.其要點是先轉育隱性上位細胞核雄性不育純合兩型系，然后再通過回交轉育主要農藝性狀與純合兩型系相近或完全一致的相應的全不育臨保系；陳芝能等[10]甘藍型油菜雙隱性基因細胞核+廣恢型細胞質雄性不育（RRGCMS）三系綜合了RM 5637A細胞質雄性不育和雙隱性基因細胞核不育的優點；董發明等[11]通過對甘藍型油菜隱性細胞核雄性不育系9012AB及其臨保系T45與來源不同的幾個自交系和常規品種雜交和測交后代的遺傳分析，提出了隱性細胞核雄性不育系9012AB的新遺傳模式；李婧婧等提出[12]9012AB是甘藍型油菜隱性上位細胞核雄性不育兩型系，其育性受2對隱性重疊不育基因（ms3ms3ms4ms4）和1對隱性上位抑制基因（espesp）互作控制。
參考文獻
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遺傳學重疊效應范文2
>> 基于單片段代換系的水稻抽穗期QTL定位及上位性分析 水稻抽穗期管理注意事項 水稻抽穗期基因qHY—8對植株干物質積累及產量性狀的影響 水稻抽穗期QTL鑒定及重疊群作圖 水稻抽穗期分子生物學研究進展 水稻抽穗期QTL的聚合及其互作分析 普通小麥抽穗期控制基因TaHd1研究進展與展望 馬鈴薯連作栽培對土壤微生物多樣性的影響 多樣性間套種栽培技術 多效唑與氮磷鉀肥配合運用減輕小麥抽穗期漬澇研究 環形RNAs形成機制的多樣性 團隊多樣性對員工創新的影響機制研究：一個跨層次研究 城市化影響下植物多樣性研究 氣候變化對生物多樣性的影響 森林對生物多樣性的影響及保護 云南旱災對生物多樣性的影響 氮磷污染對生物多樣性的影響 植物多樣性及其對景觀的影響 多樣性對企業績效的影響綜述 外來入侵植物對生物多樣性的影響 常見問題解答 當前所在位置：l）?；蛐治霾捎脝我蛩胤讲罘治觯瑔我蛩兀ㄈ鏗d1等位基因變異）對總表型變異的貢獻率R2=SSintergroup/SSoverall，其中SSintergroup為組間方差，SSoverall為總方差；F1雜種播始期超親天數占親本播始期比例MP1=[（F1-P1）/P1]×100%，其中F1為F1雜種播始期，P1為早抽穗親本的播始期（計算超親早抽穗時間）或晚抽穗親本的播始期（計算超親晚抽穗時間）。
2 結果與分析
2.1 親本材料及其F1雜種的播始期
表1的結果表明，親本材料和F1組合的播始期表現廣泛變異，親本材料播始期59～101 d，F1材料播始期60～120 d；通過計算F1雜種與兩親本播始期的相關系數，表明F1播始期與不育系的播始期沒有顯著的相關性，但是和恢復系播始期呈極顯著正相關，相關系數為r=0.77（P
與雙親相比，少數F1雜種播始期表現出超親現象，6份F1雜種表現出較強的超親晚抽穗，除雜交組合HD9802S/HR015的超親晚抽穗天數占遲抽穗親本播始期比例的8.4%外，其余5份雜交組合為18.8%～20.2%。7份材料表現出超親早抽穗，超親早抽穗天數占早抽穗親本播始期比例的5.6%～13.0%；相同的恢復系與不同的不育系會產生超親F1，相同的不育系與不同的恢復系也會產生超親F1，因此F1的生育期超親表現與雙親的組配有關。
2.2 不同材料抽穗期控制基因的序列比對
選取了16份具有不同抽穗期的水稻材料（表3），對其抽穗期控制基因Hd1、Ehd1、Hd3a、RFT1以及Hd3a啟動子序列進行PCR擴增測序分析。除Hd1基因存在4種不同的等位基因外，其余基因均無差異。與日本晴Hd1編碼區相比，4個等位基因的編碼區分別表現出單核苷酸的替換、片段插入與缺失、無義突變等不同的SNP類型（圖2）。利用軟件預測分析，這4個等位基因分別編碼4種不同的蛋白質（圖3）。通過與Takahashi等[2]對水稻Hd1序列及功能分析結果的比對確定本研究中的Hd1-1和Hd1-4為有功能的等位基因，Hd1-2和Hd1-3則因為出現了大片段的缺失，表現為功能缺失型等位基因。通過計算有功能等位基因材料的播始期的平均值和功能缺失型等位基因材料的播始期的平均值可知，前者為86 d， 后者為83 d（表3），并且兩者呈顯著差異（P
通過分析F1雜種播始期與Hd1等位基因的關系，結果表明有功能Hd1純合型F1（HD1/HD1）的播始期平均值為89 d，雜合型（HD1/hd1）為94 d，功能缺失型Hd1的純合型F1（hd1/hd1）的播始期平均值為83 d，并且HD1/HD1和 HD1/hd1基因型與hd1/hd1基因型的播始期均表現出顯著差異（P
3 討論
3.1 Hd1等位基因變異是長江流域雜交秈稻骨干親本抽穗期變異的遺傳基礎之一
本研究選取的雜交稻骨干親本材料中，Ehd1、Hd3a、RFT1的編碼區以及Hd3a的啟動子序列非常保守，沒有表現出差異，Hd1的編碼區表現出了4種不同等位基因類型，并且不同類型Hd1等位基因解釋了自然日照條件下抽穗期19.75%的表型變異；因此，本研究結果表明Hd1等位基因多態性是我國長江流域雜交秈稻骨干親本抽穗期變異的遺傳基礎之一。
3.2 關于F1雜種抽穗期的超親現象
親本間感光性和基本營養生長性組合的多樣性及強弱的不同使得F1雜種抽穗期呈現多種多樣的變化。在雜種優勢利用，特別是秈粳亞種間雜種優勢的利用中，常遇到超親晚熟現象，而許多研究表明，F1雜種抽穗期是否嚴重超親主要取決于雙親是否帶有不同位點的互補的顯性感光基因[3-5]，如果帶有一對互補基因，那么F1將會表現超親晚抽穗；徐俊鋒[6]的研究結果表明F1超親晚抽穗主要受兩對顯性互補感光基因E1（Hd4）和Se-1（Hd1）控制，雜種超親晚抽穗主要由感光性引起。本研究材料中也出現了抽穗期超親的雜交組合，其中不育系親本814A和HD9802S與恢復系親本HR020和HR935配組的F1超親晚抽穗天數與晚抽穗親本播始期的比例為18.8%～20.2%，而且不育系親本含有有功能的Hd1等位基因，而恢復系親本含有功能缺失型等位基因，因此存在潛在的互補基因的可能。
Chang等[7]對感光品種的感光性（PSP）和基本營養生長性（BVP）同時進行研究，認為PSP受單一顯性基因或2個顯性基因（Se）控制，BVP則受2個或2個以上基因（Ef）控制，這些基因具有累加效應，短的BVP相對于長的BVP為顯性，因此不同Ef基因在F1材料中的互補可能會導致營養生長期比雙親的縮短，從而導致提前抽穗[8]，因此還需要進一步的試驗去驗證本研究中的超親早抽穗是否也是由Ef基因導致的。
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遺傳學重疊效應范文3
關鍵詞：RQ-PCR；熒光探針；分子生物；熒光共振能量轉移
中圖分類號：O657 文獻標識碼：A 文章編號：1009-2374（2013）13-0044-02
1 RQ-PCR技術概述
RQ-PCR是FPET（熒光共振能量轉移）技術在PCR定量上的應用。其指在PCR反應體系中加入熒光基團，在指數擴增期間通過連續監測熒光信號出現的先后順序及強弱變化實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。RQ-PCR同步進行定量和擴增，這樣就克服了傳統PCR的平臺效應，減少了終點檢測帶來交叉污染的機會，也克服了終點法定量的不準確性。另外，RQ-PCR無需再處理，節約了時間和精力，更避免了放射性同位素可能給實驗人員造成的傷害。目前，RQ-PCR在分子生物學研究中應用越來越多。
1.1 熒光共振能量轉移
當一個熒光基團的熒光光譜與另一個熒光基團的激發光譜重疊，并且兩個基團距離足夠近時，供體熒光基團的激發能誘發受體基團發出熒光，同時供體熒光基團自身的熒光強度衰減，即能量從短波長的熒光基團傳遞到長波長的熒光基團，相當于短波長熒光基團釋放的熒光被屏蔽，這個過程稱為FRET。
1.2 參照物
參照物有外參照和內參照兩種。外參照不與目的基因在同一反應體系中擴增。以已知濃度的目的基因為模板按一定比例稀釋，制備標準曲線。而未知標本則根據該標準曲線得出相對的拷貝數和Ct值。其優點是可以和目的基因保持較高的同源性，保證了二者的擴增效率近似。缺點是不能克服也無法檢測可能出現在樣本反應體系中的影響因素。內參照是在各標本中加入已知濃度的內參照基因，與樣本一起抽提、擴增。內參照基因的DN段與目的基因相似。為保證目的基因只能與內參照探針結合，運用定點突變的方法改變與探針結合的中間部位的序列。內參照系統的結果重復性更好，可以避免不同抽提效率導致的樣本間差異。
1.3 RQ-PCR幾個重要參數
（1）熒光域值3～15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍設置為熒光域值的缺省，熒光本底信號為PCR反應的前15個循環的熒光信號；（2）Ct值中C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數；（3）Ct值與起始模板的關系研究表明，每個模板的Ct值與該模板起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小，利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，當獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
2 RQ-PCR技術的關鍵
RQ-PCR技術在常規PCR基礎上添加了熒光染料或探針。特異的將雙鏈DNA摻入熒光染料中，保證其信號與PCR產物完全同步遞增。在探針的3’端和5’端分別標記淬滅基團（Q）和報告基團（R），進行能量的傳遞。R基團所發出的熒光可被Q基團吸收或抑制；抑制作用隨著兩者距離變遠而消失，R基團增強后的熒光信號可以被熒光監測系統接收到。當熒光信號增強到某一閾值時，Ct值被記錄下來。這樣，通過未知樣品的Ct值和標準曲線就可以將該樣品的起始拷貝數確定。因此，在RQ-PCR中，熒光染料或探針就成為了技術關鍵。目前已經開發出的熒光染料和探針按照能量轉移和基團標記的方式，大體可以分為水解類探針和雜交類探針兩類。
2.1 Taq Man探針法
在該探針的3’末端和5’末端分別標記Q基團和R基團，使其與兩引物所包含的一段序列內DNA模板完全互補。當探針完整時，利用Taq酶5’3’外切酶的活性，Q基團吸收R基團的熒光，熒光信號也就不能被檢測到；相反如果正確的底物被擴增出來后，即有特異的PCR發生時，探針就會在復性階段與其雜交，當聚合酶延伸到探針時，它就會將與模板雜交上的探針切碎，使得R基團和Q基團分開，解除淬滅作用，從而釋放出熒光信號，可通過檢測系統觀察到信號的變化。每擴增一條DNA鏈，就會有一個游離的熒光分子形成，實現了熒光信號累積與PCR產物形成完全同步，進而計算出Rn值、Rn值、Ct值和閾值。通過計算就可以獲得起初模板量。常用的熒光基團是VIC、TET、FAM、HEX。
2.2 非特異性雙鏈DNA嵌入染料
SYBR Green 1是一種與雙鏈DNA結合的染料。當它游離在溶液中時，不發出熒光；但當其摻入DNA雙鏈后，會發出強烈熒光。該染料最大的優點是可以作用于任何模板的任何引物。但由于其對DNA模板沒有選擇性，可能會造成定量不準確。若想解決這個問題，可以使用比較由于融解曲線法，還可以通過反應條件的優化及嚴格設計高特異性引物，降低引物二聚體形成的可能性。
2.3 分子信標
分子信標由Tyagi和Krammertm建立，適用于鑒定點突變。該探針是單鏈DNA所形成的呈發卡結構的莖環雙標記寡核苷酸，環部部分堿基同靶DNA序列互補，長度為15～35個核苷酸；莖部有互補配對的堿基組成，同靶DNA無序列同源性，約5～7個核苷酸長。在探針的5’端標記R基團，3’端標記Q基團。當分子信標游離時，由于R、Q兩個基團緊密相鄰，熒光被淬滅。而在PCR變性后的復性階段，分子信標與溶液中的特異模板雜交，靶DNA序列與分子信標環部的核苷酸序列互補結合，使發卡結構破壞，釋放出熒光信號，淬滅作用被解除。由于熒光強度會隨著分子信標量的增加而增加，從而達到定量檢測的目的。在PCR的延伸階段，分子信標與模板解離，再次形成發卡結構，熒光消失。每次擴增后產物的積累量可以通過當時的熒光強度的增加來反映。該方法的優點是探針可循環利用，缺點是標記相對復雜。同時，莖部結構的高熱力學溫度會影響探針和靶序列的雜交。
2.4 雜交探針
雙雜交探針也是以FRET為原理進行的。該方法使用四個寡聚核苷酸分子、兩個引物和兩個探針。發光探針的5’端標記一個R基團，淬滅探針的3’端標記Q基團，雜交時R基團緊密相鄰Q基團，以首尾相接的方式退火靶擴增子，當循環儀的光源激發3’端的Q基團后，產生從供體到毗鄰探針R基團的FRET使熒光淬滅。起始模板的量越高，熒光淬滅的程度越低，以此可以進行PCR的定量分析。該方法的優點是淬滅效率高，缺點是擴增效率不穩定，合成成本相對較高。
3 RQ-PCR技術的應用
3.1 基因工程研究領域
RQ-PCR技術的出現加強了對基因的量和質變化的研究。它目前已經在遺傳分析中廣泛應用以檢測基因突變及基因組的不穩定性。
（1）基因表達研究由于探針雜交的效率和其后的切除與雜交有關，可以將由不同熒光報告基團標記的探針與野生型和突變基因雜交，2005年劉敬忠等使用RQ-PCR技術對β地中海貧血純、雜合子作出診斷。目前對遺傳性物質改變引起的疾病還無法根治，而應用RQ-PCR技術可以通過產前監測和產前基因診斷來減少病嬰出生。
（2）轉基因研究Tesson等確定了分析轉基因鼠接合性的RQ-PCR技術使用條件，利用合適的循環域值及發光探針，擴增一個轉移后的基因和一個對照基因。通過RQ-PCR檢測，同型結合的和異質接合的動物后其子代中轉基因的傳遞情況與孟德爾遺傳規律相符。這項技術可以廣泛地應用于基因劑量功效實驗和轉基因動物的繁育中。
（3）單核苷酸多態性與突變的分析RQ-PCR可以用來檢測基因突變和基因組的不穩定性。一條橫跨突變位點的探針和一條錨定探針是檢測基因突變的基礎。兩條探針用兩種不同的發光基團標記。如果靶序列中無突變，探針雜交便完全配對；如果靶序列和探針不完全配對，會降低雜交體的穩定性和熔解溫度。這樣便可對突變和多態性進行分析。
3.2 醫學研究領域
（1）病原體檢測2000年蘇學飛等利用該技術對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類瘤病毒、單純皰疹病毒五個項目進行了定量測定。2004年針對SARS流行性病的檢測和診斷使得RQ-PCR技術得以應用和發展。近年來，TaKaRa公司推出的試劑盒可以一步完成對H5N1、H7N9等禽流感病毒的檢測。
（2）腫瘤診斷基因發生了變異是腫瘤產生的根本，RQ-PCR方法可以將這些異常變化都檢測出來。許多癌基因的突變和表達增加，在腫瘤早期就出現。除了能夠有效地檢測基因突變，RQ-PCR還能夠準確地檢測到癌變基因的表達量。隨著與腫瘤相關的新基因被不斷地發現，會使RQ-PCR技術在腫瘤的研究中發揮越來越大的作用。
（3）抗藥性考核日本Funato等使用RQ-PCR技術對臨床樣品中如MRP、MDR21等與抗藥性相關的基因表達進行了檢測。結果表明，RQ-PCR技術可以可靠地定量檢測抗藥基因的表達，運用該技術可以對化療可能引起的反應進行預測。
4 結語
現在，RQ-PCR技術不僅快速、靈敏、準確，而且己經發展為一項高度自動化的核酸定量技術，大大降低了假陽性率，提高了工作效率，且不必使用對人體有害的染色劑。因此該技術被廣泛地應用在基因表達研究、基因單核苷酸多態性和遺傳性疾病診斷、病原微生物診斷等諸多科研領域。但與傳統的PCR技術相比，RQ-PCR也存在不足之處：（1）RQ-PCR在復合式檢測方面的應用能力會因檢測光源和熒光素種類的局限所限制；（2）由于檢測環境相對封閉，減少了擴增后電泳的檢測步驟，也就無法對擴增產物的大小進行監測；（3）RQ-PCR實驗的高成本也限制了其廣泛的應用。
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遺傳學重疊效應范文4
關鍵詞分子標記;概念;基本原理;特點
中圖分類號Q78文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2009)11-0264-07
隨著人們對生命認識的不斷加深以及遺傳學的不斷深入發展,越來越多的遺傳標記被發現,遺傳標記的種類和數量越來越多。主要分為4種類型,即形態標記、細胞學標記、生化標記和DNA分子標記。顯然,前3種標記都是以基因表達的結果(表現型)為基礎,是對基因的間接反映;而DNA分子標記則是DNA水平遺傳變異的直接反映。與表型標記相比,DNA分子標記具有能對各發育時期的個體、各個組織、器官甚至細胞作檢測,既不受環境的影響,也不受基因表達與否的限制,數量豐富,遺傳穩定,對生物體的影響表現“中性”以及操作簡便等特點。分子標記的所有這些特性,奠定了它具有廣泛應用性的基礎[1-2]。
1分子標記的來源及定義
1.1分子標記的來源
“標記”一詞,根據漢語大詞典的解釋,是“便于識別的標識或者記號”。隨著人們對生命本質認識的一步步加深,在人們研究DNA序列時發現了大量的非編碼序列,甚至占到了全序列的90%以上。這些非編碼序列具有特殊的一級結構,如串聯重復、回文結構、Alu序列(反向重復序列)、CpG島等,并且全基因組分布[3]。隨著人類基因組計劃的人類基因組框架草圖的完成和一個個模式生物的全基因組測序,一個個新的DNA特異序列被發現并且在染色體上定位,整個基因組內的標記密度越來越高,并且大量的特異序列與不同的基因片段有著不同程度的連鎖,所有這些標記構成了人類研究探索各種生物基因組DNA的地圖與路標。
1.2分子標記的定義
廣義的分子標記指可遺傳并可檢測的DNA序列或者蛋白質。蛋白質標記包括種子貯藏蛋白和同工酶(不同基因位點編碼的酶的不同分子形式)及等位酶(同一基因位點上不同的等位基因編碼的酶的不同形式)。狹義的分子標記僅僅指DNA標記,一般所稱的分子標記即被界定在此范圍之內[4]。這是因為在應用上DNA標記比蛋白質標記廣泛的多。蛋白質的結構比DNA的結構復雜的多。構成蛋白質的氨基酸有幾十種,而構成DNA的堿基只有4種,通過指數級的排列方式僅是其一級結構的可能性就有數量級上的差異,且不計蛋白質更加復雜的二級、三級、四級結構及其結構域。并且到目前為止,蛋白質的復制與合成遠不及DNA復制技術成熟,可控性也不高。因此,蛋白質標記應用遠不如DNA標記方便和廣泛。但從更嚴格的意義上講,蛋白質標記是研究生命現象更為精確的標記,因為其更穩定、多態性更高,每種蛋白質都是唯一的(序列唯一、構象唯一)。
1.3理想的分子標記
理想的分子標記必須達到以下要求:①具有高多態性;②共顯性遺傳,即利用分子標記可鑒別二倍體中雜合和純合基因型;③能明確辨別等位基因;④遍布整個基因組;⑤除特殊位點的標記外,要求分子標記均勻分布于整個基因組;⑥選擇中性(即無基因多效性);⑦檢測手段簡單、快速(如實驗程序易自動化);⑧開發成本和使用成本盡量低廉;⑨在實驗室內和實驗空間重復性好(便于數據交換)[5]。
特別需要提出的是,所有的分子標記都必須滿足和某個基因或者已知標記緊密連鎖(連鎖程度越高越好)甚至共分離。
但是,目前發現的任何一種分子標記均無法同時滿足以上所有要求。使用者可以根據自己的實驗目的和要求具體選用某種標記技術。
2目前常用分子標記的基本原理
2.1限制性片斷長度多態性(RFLP)
限制性片斷長度多態性(Restriction Fragment Length Pol-ymorphism)是指用限制性內切酶處理不同生物個體的DNA所產生的分子片斷大小的差異。此技術基于生物個體的基因組的變異,是研究不同基因組間的差異的技術,由Grod-zicker于1974年首先提出。其基本原理是:物種經過長期的進化,各個種屬甚至品種之間的同源DNA序列上的限制性內切酶識別位點不同,或者由于突變、重組等原因引起限制性內切酶位點上的核苷酸的變化。若引起DNA分子某一特定內切酶識別位點序列內發生變化,這樣該位點就不能被切開,使得DN段比親本長;若突變后形成新的酶切位點,則酶切后的片斷變短。這樣,通過電泳可以將大小不同的片斷區分開來。對于分子量較小的質粒DNA就可直接觀察到DNA長度的差異,但對于核DNA而言,DN斷呈連續分布,無法辨別差異,需通過Southern雜交轉移至支持膜上,用單拷貝或低拷貝的DNA克隆作為探針與膜上的酶切片斷雜交,通過放射自顯影或非同位素顯色技術,發生變異的材料顯示的帶就可能與親本的帶處于不同位置。檢測出與此標記DNA相關的片段構建出多態性圖譜,即為RFLP[5,6]。這種特定的限制性片斷與DNA探針的組合,便可以作為遺傳標記。由于RFLP起源于DNA的變異,不受顯隱性關系、環境條件和發育階段的影響,具有遺傳的專一性和穩定性的特點,在數量上不受限制,可隨機選取足夠數量能代表整個基因組的RFLP標記,而且每個標記變異大,檢測方便。用于檢測RFLP的克隆探針可隨機選取,可以是使核糖體DNA、葉綠體DNA,也可以是總DNA。這樣就可以獲得能夠反映遺傳差異的大量多態性,為進行資源分析、品種鑒定、物種進化、基因定位、親緣關系和遺傳距離的分析,遺傳圖譜的構建提供了有力的工具。并且RFLP是共顯性標記,能夠區別出雜合體與純合體[7]。雖然RFLP具有結果穩定可靠,重復性好,特別適合建立連鎖圖等優點,但也具有檢驗步驟多、周期長、成本高等缺點。并且RFLP對DNA多態性檢出的靈敏性不高,RFLP連鎖圖譜上還有很大的空間區(gap),甚至在使用同位素時可能對人有一定的傷害等等,這些都是需要進一步完善的地方。
2.2隨機擴增多態性DNA(RAPD)
隨機擴增多態性DNA(Random Amplified Polymorphi-sms DNA)是美國杜邦公司的Williams和加利福尼亞生物研究所的Welsh等領導的2個小組于20世紀90年代同時開發出來的一種新的DNA指紋技術。此技術是應用一系列隨機引物擴增并尋找多態性DN段的遺傳標記技術。這一技術建立于PCR反應基礎之上,以隨機的短脫氧核苷酸(通常為10個堿基)作為PCR引物,對基因組DNA進行擴增而產生多態的DNA圖譜。擴增產生的片段可通過瓊脂糖電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳分開,經溴化乙錠染色或銀染色得到多態性的DNA圖譜后進行多態性觀察。在基因組上,每個引物可以連續直接擴增特定的DN段,對一個特定的基因型來講,這些擴增的片段或片段的類型是唯一的。它的應用是基于這樣的一個理論:對于同一模板DNA,用同一引物擴增既可能得到相同的帶譜(模板基因組間可能具有同源性),也可能得到不同的帶譜。僅在某一特定模板中出現的條帶即可作為該模板的分子標記[8,9]。事實上,不同基因組DNA總是有一定差異的,所以用RAPD即可進行分子標記研究。理論上講,在一定的擴增條件下,擴增的條帶數取決于基因組的復雜性。對特定的引物,復雜性越高的基因組所產生的擴增條帶數也越多。
RAPD所用的一系列引物的DNA序列雖然各不相同,但對于某一特定引物來說,它同基因組DNA序列有特定的互補區域。這些特定區域在基因組的分布如果符合PCR擴增的反應條件的話,即引物在模板上的2條鏈如果有互補位置并且與引物的3′端在200bp以內,就可以擴增出這一片段。如果基因組在這些區域內發生插入、缺失或者替換即可導致這些特定的結合位置分布發生變化而使PCR產物發生增加、缺失或者分子量發生改變,通過對PCR產物的檢測,即可找出基因組DNA在這些區域內的多態性[10]。由于RAPD分析時所用的引物數量極大,并且引物序列隨機,雖然對某一引物而言檢測的區域有限,但是利用一系列引物可以檢測的區域幾乎可以覆蓋整個基因組。與RFLP是從一系列酶切片段中尋找多態性片段不同,RAPD是利用PCR隨機合成多態性DN段,檢測被擴增區域內的遺傳特征變化。其具體優點體現在:①極大的豐富性,能反映整個基因組的變化;②強大的可探測性,無需合成特定的引物;③高效性與靈敏性。短期內可以得到大量的擴增片段,只要是遺傳特異性的發生變化,即使親緣關系很近的個體也可以識別出[11]。
RAPD最大的特點是引物的堿基序列是隨機的,所用引物通常多達幾百種,并且1套引物可以用作多個物種或者群體,所以RAPD技術在用于遺傳多樣性和品種鑒定的研究中具有極大的優越性。因此,用來鑒定品種純度是很有用的。據報道[9],從玉米、大豆、小麥及紅三葉草干種子中提取DNA并成功地利用RAPD技術擴增DN段;中國科學院遺傳所陳洪等利用OPP-18引物成功地鑒定了雜交水稻汕優63雜種純度,鑒定結果與田間小區種植鑒定完全一致。RAPD技術反應靈敏、多態性強,操作簡便,速度快,費用低,既有大量的隨機引物可供篩選之用,又不受種屬的限制,被廣泛用于多種作物的種子鑒定[9,11,12]。
由于是隨機引物對整個基因組進行多態性檢測,在技術上簡單易行不需要克隆制備、同位素標記、Southern印記等預備性工作,所需DNA樣品量少,安全性好,價格便宜,是繼RFLP之后應用最廣的分子標記。由于引物沒有特異性,1套引物可用于不同生物基因組的的分析,分析速度快,短期內可得到大量的遺傳標記,并克服了同工酶位點少和RFLP操作技術復雜的弊端,已經廣泛應用于遺傳作圖、基因定位和克隆、物種進化及鑒定特殊染色體區段的鑒別和分離以及動植物育種等方面,特別是在尋找與目的基因連鎖的分子標記方面,近年來報道了大量的與各種目的基因連鎖的RAPD標記。水稻的Xa-21 基因和西紅柿的pto基因的成功分離就是首先找到了與目的基因緊密連鎖的RAPD標記,然后通過定位克隆的方法克隆了目的基因[13]。
與PCR相比,RAPD具有以下特點:①RAPD使用的是隨機引物,不需要預先了解目的基因和相應的序列;②操作簡便,實驗周期短,能在較短的時間篩選大量樣品;③引物具有普遍適應性,適用于自動化操作分析。
與RFLP相比,RAPD具有以下特點:①RAPD分析只需要少量模板,1次擴增僅需20~100ng,這對于DNA量很少的材料進行基因組分析有利。比如對花粉粒、原生質體、種子等的DNA分析是切實可行的。②RAPD標記具有更大的隨機性,亦有利于圖譜的構建。對于DNA含量大的和多倍體物種,RFLP探針會與多倍體的多個片段雜交,所得到的混合指紋會對其他等位基因的闡明帶來困難。而且由于DNA量較大,進行單拷貝的Southern雜交不很實際,至少需要很長的曝光時間,并且已知的探針數量有限。RAPD大大增加了可構建遺傳圖譜物種的數量。③無需借助于有傷害性的同位素,耗費的人力物力少。④靈敏度高。引物中的個別堿基的變化會引起擴增條帶和強度的劇烈變化,這是RFLP所無法比擬的。短期內可以得到大量的擴增片段,只要是遺傳特異性發生變化,即使親緣關系很近的個體也可以識別出。⑤RAPD標記可以覆蓋整個基因組,包括編碼和非編碼區,可以反映整個基因組的變化。但是,由于引物的競爭性等,基因組的RAPD位點有時不能全部檢出,造成假象上的差異,這在種屬親緣關系的研究上尤其明顯。⑥RAPD產物有大于50%的條帶擴增于單拷貝區,經過克隆和序列分析后,可作為RFLP和原位雜交的探針,在基因定位、克隆及輔助選擇育種中可以廣泛應用。
隨著RAPD日益廣泛的使用,其不足之處也逐漸顯現,比如標記的顯隱性位點性,致使其不能在后代中區分雜合體和純合體;穩定性差,由于是單鏈引物隨機的結合,在眾多的反向重復序列上,每次的實驗結果可能不一致。解決辦法是對單鏈引物進行篩選,優化PCR條件;高度的變異性,即使在親緣關系很近的物種間,結果也可能差異極大;Tm值低的隨機引物易受外界環境影響,如Mg2+濃度等[8,9,14]。
由于RAPD技術是由多種成分參加的生化反應,反應中各種成分均為微量,盡管其反應靈敏度高,但是影響因素較多,故而RAPD受環境影響很大,穩定性差,重復性也不好,因此對實驗的設備、條件及其操作的一致性很嚴格,這又大大限制了它的使用。為了得到較穩定的結果,各種反應參數必須事先優化選擇,操作中每一步都必須小心謹慎,以防止出現差錯。
2.3特征序列擴增區域(Sequence-characterized amplified regions,SCAR)
RAPD標記一般表現顯性遺傳,但若某RAPD片段不是重復序列,也可將其轉化為RFLP標記。另外,為了提高某一理想RAPD標記的穩定性,可首先將其克隆并對其末端測序,之后,在原來RAPD所用的10bp引物上增加合成上述末端序列的14bp的核苷酸,以此為引物對基因組DNA再行擴增分析,此即SCARs(Sequenced Characterized Amplified Regions)標記[15]。
SCAR首先由Parar和Michlmore(1993)提出并應用。SCAR標記是在RAPD技術的基礎上發展起來的。其基本步驟是:先作RAPD分析,然后把目標RAPD片段(如與某目的基因連鎖的RAPD片段)進行克隆和測序,根據原RAPD片段兩末端的序列設計特定引物(一般比RAPD引物長,通常24個堿基,是在原RAPD引物的3′與5′端延長14個堿基),利用兩端各24個堿基的引物再進行PCR特異擴增,這樣就可把與原RAPD片段相對應的單一位點鑒定出來。這樣的位點就稱為SCAR?？偟膩碚f,SCAR比RAPD和其他利用隨機引物的方法在基因定位和作圖中的應用更好,因為它有更高的可重復性(原因是使用的引物長),標記是共顯性遺傳的[16]。
該方法與RAPD相比,具體有如下優點:①由于有較長的引物,退火溫度較高,因此具有更高的檢測穩定性;②有將顯性RAPD標記轉化為共顯性的SCAR標記的可能性;③如果是顯性標記,則在檢測中可以直接染色而不需電泳檢測。另外,用RAPD找到擴增片段后不再設計引物,而是直接測序后通過電腦軟件分析(如用ClustalX軟件進行對位,MEGA軟件計算DNA序列間的差異百分率和轉換/顛換數,UPGMA軟件建親緣關系樹狀圖等),找出特異性的堿基作為鑒定的特異性標記[17]。
2.4與RAPD技術相近的分子標記種類
下面提到的所有技術都是利用1個或2個短的富含GC堿基的隨機引物。
(1)DNA擴增指紋圖譜(DNA amplification fingerprint-ing,DAF)[18]。與RAPD技術不同的是,在DAF分析中,引物濃度更高,引物長度更短(一般5~8個堿基),只有2個溫度循環(在RAPD中是3個溫度循環),并且往往用聚丙烯酰胺凝膠電泳,DAF通常會產生非常復雜的帶型。
(2)任意引物PCR(arbitrarily primed polymerase chain reaction, AP-PCR)。AP-PCR使用的引物較長(10~50個堿基),但PCR反應前2個循環的嚴謹條件較低,最終的反應結果與RAPD類似[19]。在AP-PCR分析中,擴增分為3個部分,每個部分要求的條件和組分的濃度存在差異;在第1個PCR循環中,引物濃度較高;引物長度不定,并且常常來自為其他目的而設計的引物(如M13通用測序引物)。
2.5擴增片段長度多態性(AFLP)
擴增片段長度多態性(Amplified Fragment Length Poly-morphism),亦稱選擇性限制片段擴增(SRFA, Selective Res-triction Fragment Amplification),是荷蘭Keygene公司的Za-beau Marc和Vos Pieter于1993年創建的一種新型的分子標記,并于當年獲得了歐洲專利局專利[20]。
它是RFLP和PCR相結合的分子標記技術,既有RFLP的可靠性,又有PCR(如RAPD)的靈敏性,多態性高。其基本原理是利用PCR技術選擇性擴增基因組DNA雙酶切后產生的限制性片斷?；蚪M經2種限制性內切酶消化以后將一雙鏈DNA人工接頭(artificial adapter)連接于限制性片斷兩端。然后根據接頭序列和限制性位點附近的區域的堿基序列,設計一系列3′端含數個隨機變化的選擇性堿基的PCR引物進行特異性條件擴增,只有那些限制性位點的側翼序列與引物3′端選擇堿基相匹配的限制性片段才能得以擴增。這些選擇性堿基數目的多少主要是由待測樣品的基因組大小決定,選擇性堿基數目多,選擇性就強,擴增產物就少;反之,其數目就少,選擇性弱,擴增產物就多。擴增產物經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離顯示其多態性。當不同基因組DNA中因為突變引起限制性位點的數量發生改變或2個限制性位點之間的區域內發生堿基插入、片段消失或順序重排時,電泳譜帶顯示多態性,多態性以擴增片段的長短不同和數量多寡顯示出來[21]。
AFLP的技術特點包括以下幾個方面:①使用2種內切酶消化模板DNA。一些酶的切割位點較多,如MseI、TaqI、XbaI等,另一些酶切位點較少,如PstI等等。采用雙酶切割的原因是:多切點酶產生小片段,便于凝膠分析切點數少的酶減少擴增片段,由于AFLP反應中擴增片段是2個酶共同酶切的片段,這樣減少了選擇擴增時所需的選擇堿基數。雙酶可以進行單鏈標記,從而防止電泳中因為雙鏈泳動不均而產生的雙帶假象。并且可使少量引物產生許多不同的引物組合,從而產生大量的不同的AFLP指紋圖譜[22]。另外,不同物種基因組的AFLP過程中使用的限制性內切酶也不盡相同。EcoRI可靠廉價,是6堿基內切酶的首選。分析真核生物基因組時大多使用MseI(4堿基),因為MseI的識別序列是TTAA,而真核生物基因組富含AT序列,與TaqI相比(其識別序列為TCGA),可以獲得更多的便于PCR擴增和電泳分離的小片段DNA[23]。②AFLP的接頭為雙鏈寡核苷酸。人工合成時接頭未進行磷酸化處理,所以只有1條單鏈連接于酶切片段的末端。③與常規的PCR相比,AFLP的引物有其獨特性。其引物有3部分構成:與接頭互補的核心序列、內切酶識別序列以及3′末端的選擇性堿基。該類引物的一個重要特征是通常以鳥苷酸G開頭,這樣可以有效的形成雙鏈,不過當dNTP濃度過低時容易形成雙鏈結構。此外,選擇性堿基的數目影響著AFLP反應的特異性。研究表明,引物帶有1~3個選擇性堿基時擴增的選擇性較好。當選擇性堿基超過4個時,擴增的錯配程度超過了允許程度,故而AFLP的選擇性堿基數目一般不超過3個,具體數目取決于基因組的大小。研究表明,分析500Mbp以下的植物基因組時用EcoRI+2(2個選擇性堿基)/MseI+3引物組,500~6 000 Mbp的基因組應采取EcoRI+3/MseI+3較為嚴謹的引物組。微生物通常采用1個選擇性堿基的引物組[24]。④AFLP的PCR擴增分兩步進行。首先預擴增,其擴增產物經過一定比例稀釋后,以此為模板再進行選擇性擴增。兩步擴增可以減少擴增產物中的非特異性帶,降低了不清晰電泳造成的指紋圖譜的背景,提高了指紋圖譜的清晰度,還可以增加擴增片段數,為AFLP分析提供充足的模板。
AFLP技術不僅具有其他分子標記的優點,即位點數量無限,呈典型的孟德爾遺傳,無表型、復等位效應,不受環境影響等,還具有一些獨特的優越性,如標記異常豐富,典型的AFLP反應中,1次電泳可得到100~150個擴增產物,其他標記技術難以達到。穩定性、重復性好,應用非常廣泛,可用于任何生物基因組的遺傳分析。與PCR技術結合,可在短時間內得到大量多態性標記。同時對模板濃度不敏感,模板需求量也小。Vos Pieter在對番茄基因組AFLP分析時,證實了模板濃度在相差1 000倍以內(0.000 5~25ng)獲得的指紋圖譜基本一致。另外,在AFLP中標記的引物會全部耗盡,引物耗盡后,擴增的帶型不受循環數的影響。這樣模板濃度即使不一致也可以通過增減循環次數的方法獲得強度一致的帶型。目前,AFLP是構建基因組特定區段高密度連鎖圖譜的最有效的方法。此外,AFLP全基因組分布非常適合構建遺傳連鎖圖譜。AFLP也可以用于檢測DNA庫(DNA pool)克隆的DNA大片段的多態性,而且其多態性的標記大多對應于基因組的某一位置,這樣就可以和STS一樣,成為遺傳圖譜(genetic map)和物理圖譜(physical map)之間的橋梁[25,26]。
實際操作中,影響AFLP指紋圖譜結果的因素很多。因此,應采取質量高、純度好、分子量大的的基因組DNA作為模板。如果模板中含有其他雜質或者DNA降解很嚴重,導致酶切不完全,許多未經酶切的模板片段經電泳后產生表現為高分子量的條帶(假帶),導致不能真實地反映被測物種的多態性。為了避免電泳的條帶過多或者過少,應對PCR反應體系進行優化,篩選出最佳的引物組合。PCR擴增時,應在模板變性之前加入Tag酶和dNTP,否則會導致擴增失敗。反應體系中的dNTP濃度不能過低,否則擴增產物容易形成雙鏈結構[21,27]。
2.6序列標簽位點(STS)
序列標簽位點(Sequence -Tagged Site,STS)指的是一段序列已知并且能夠在基因組中作為“路標”使用的DNA序列,是對由特定引物序列所界定的一類DNA標記的統稱。其最大特點就是利用特異PCR,因此結果非?？煽俊ｏ@然,成為STS必須滿足2個條件:①序列已知;②位置確定并唯一。從理論上講,任何一段DNA都可以成為STS。但是,由于需要的是與某一個目標性狀基因或已知的標記緊密連鎖的DN段,因此能夠利用的STS數量則非常有限。根據單拷貝的DN段兩端的序列設計1對特異引物擴增基因組DNA,產生的一段長度為幾百bp的特異序列在基因組中往往只出現1次,從而能夠界定基因組的特異位點。在人類基因組作圖中已用其作為將遺傳圖譜與物理圖譜整合的共同位標,這在基因組作圖上具有非常重要的作用。隨著大量的模式生物的全基因組測序,會有越來越多的可利用的STS被發現。
2.6.1表達序列標簽標記(Expressed Sequence Tags,EST)。EST是指一小段(通常長度300~500bp)單次重復的mRNA序列或cDNA序列。它們在特定的組織或者特定的時期內特異的表達,可以看作是特定的cDNA文庫中的標記。EST計劃由美國科學家Venter于1989年提出,并首先應用于人類基因組研究,之后被廣泛用于植物基因組研究,它是通過大規模的cDNA隨機測序,從而獲得對基因組認識的一種研究策略。目前,許多國家和組織正在開展某些作物基因組EST計劃的研究,如成立于1998年的國際小麥族EST協作網(International Triteace EST corperation,ITEC),就是致力于麥類EST研究和開發的[28]。近幾年來,國際公共數據庫中的EST序列呈指數增長,截止到2006年8月,美國生物信息中心(NCBI)數據庫Genbank已公布涉及205 000種生物的61 132 599條EST序列,總長度共65 369 091 950bp。
快速增長的ESTs數據為SSR標記的開發提供了一個巨大的有價值的來源。首先,避免了傳統SSR標記開發需要構建基因組DNA文庫等煩瑣步驟,而且從ESTs中發掘出的SSR只是ESTs測序計劃的副產品,從而節省了大量人力物力[29];其次,其本身是功能基因的一部分序列,所以它將為功能基因提供“絕對”的標記[30]。同時,由于不同物種間基因共線性和保守性,從一種作物中開發的EST-SSR可同時用于其他作物研究,從而能夠為比較基因組學和同源基因克隆提供新的途徑[31]。現在EST-SSR已被用于構建遺傳圖譜、分離與鑒定新基因、基因表達差異研究、比較基因組研究和制備DNA芯片等方面。
另外,還有一種被稱為GSS序列的標記。GSS序列本質上和EST序列是一樣的,不同之處是它的序列直接來源于基因組而不是mRNA或cDNA。它通常有以下幾種來源:①全基因組檢測得到的特異/單次重復序列;②來自質粒/BAC/YAC克隆所得到的單次重復序列;③基因組外顯子捕獲;④通過Alu―PCR得到的序列。
2.6.2微衛星(SSR)。微衛星(microsatellite)又叫做簡單重復序列(Simple Sequence Repeat)或者短串聯重復序列(Short trandem repeat,STR)、簡單序列長度多態性(Simple Seque-nce Length Polymorphism,SSLP)。簡單序列重復多態性(Si-mple Sequence Repeat Polymorphisms,SSRP)微衛星指的是真核生物普遍存在的遍布整個基因組的排列為2~5個核苷酸的短串聯重復序列,如(CA)n、(GT)n、(CAG)n等,尤以(CA)n重復序列最為常見,其長度由重復單位的拷貝數決定。在真核生物基因組中微衛星很豐富,通常長度能夠達到150bp,是一類呈高度多態的遺傳標記,不僅可用于基因組遺傳連鎖圖的構建以及基因的定位與克隆,而且可用于遺傳性疾病的連鎖分析和基因診斷。其重復單位數目的改變可以引起相當高的多態性,但突變率僅為0.5×10-4~5.0×10-4,在家系中可以穩定地遺傳,是一種很好的遺傳標志[32]。
微衛星約占真核基因組的5%,其基本構成單位一般為1~8bp,多位于編碼區附近,也可位于內含子、啟動子及Alu序列(反向重復序列)中。人類基因組約有5~10萬個(CA)n重復序列。通常認為重復序列的產生是由于在遺傳物質復制過程中DNA滑動或在有絲分裂、減數分裂期染色體不對等交換所致,因此該重復序列多存在于不經嚴格選擇的基因組區域。目前普遍認為微衛星充當基因重組的熱點是基因重排和變異的來源[33]。微衛星不穩定性(microsatellite instabi-lity,MSI)是指由于復制錯誤(replication error,RER)引起的簡單重復序列的增加或丟失,也稱RER陽性或RER表型。MSI首先在結直腸癌中觀察到。微衛星通過改變DNA結構或通過與特異性蛋白質結合而發揮其基因調控作用。
由于微衛星的寡核苷酸在同一物種的不同基因型之間差異很大,可以利用特異引物進行PCR擴增。引物根據與微衛星重復序列兩翼的特定保守序列設計,用來擴增重復序列本身。由于重復的長度變化極大,所以這是檢測多態性的1種有效方法[34]。其特點包括:一般檢測到的是1個單一的多等位基因位點;共顯性遺傳,故可鑒別雜合子和純合子;得到的結果復性很高。為了提高分辨力,通常使用聚丙烯酰胺凝膠電泳,它可檢測出單拷貝差異。也可以在同1個反應試管中把PCR反應與不同的SSR引物結合起來(稱為multiplexing),這可節省時間,但是,這只能在不同引物的產物在大小上下不重疊的情況下才能使用[35,36]。很顯然,使用SSR技術的前提是需要知道重復序列兩翼的DNA序列的信息,這一方面可以在其他種的DNA數據庫中查詢,否則就必須先建立含有微衛星的基因組文庫,再從中篩選可用的克隆,進行測序,然后設計合適的引物。同時,這種由保守序定的微衛星序列也具有染色點的特異性,因此1981年Miesfeld等首次發現微衛星后,很快成為1種常用高效的分子標記。統計分析表明,不同的物種其微衛星的突變頻率也是穩定的。SSR的PCR引物也是對某一高變重復位點高度專一的。用特定引物擴增出相應的微衛星片段后,再通過電泳分離,差異可經過EB或者銀染后觀察。一般種群可顯示出超過10種類型的等位基因。微衛星不僅重復單位變異數大,而且其重復區域總長度又在PCR易于擴增的區域,快速簡便,所需的DNA用量小。與等位酶相似,微衛星是具有獨立的共顯性基因。由于微衛星的遺傳中性并且比等位酶法有更多的可供檢測的等位基因,這樣就可以提供更加精細的基因變化的范圍,因此在種群研究上有著更大的應用[3,34,37-39]。
簡而言之,微衛星的最大優點在于通過簡單的PCR擴增即可直接檢測到已知的特定的染色點,不僅具有一般PCR操作簡單、快速、成本低的特點,還具有RFLP的穩定可靠、特異性、共顯性等特點,不足之處是其引物開發難度較大,技術復雜,周期長,成本也高。不過隨著眾多模式生物的全基因組測序的飛速進展,對全基因組了解的日益全面,各個大型數據庫的逐步完善,并且借助越來越發達的計算機計算和預測技術,使得開發成本有所降低。
2.6.3其他具有特定引物的分子標記種類。
(1)加錨微衛星寡核苷酸(Anchored microsatellite oli-gonucleotides)。Zietki-ewicz et al(1994)對SSR技術進行了發展[40],他們用加錨微衛星寡核苷酸作引物,對基因組節段而不是重復序列本身進行擴增。在SSR的5′端或3′端加上2~4個隨機選擇的核苷酸,這可引起特定位點退火。這樣就能導致位于反向排列的間隔不太大的重復序列間的基因組節段進行PCR擴增。這類標記又被稱為ISSR(inter-simple sequence repeat)、ASSR(anchored simple sequence repeats)或AMP-PCR。這類標記往往是顯性遺傳的。在所用的兩翼引物中,可以1個是ASSR引物,另1個是隨機引物。如果1個是5′端加錨的ASSR引物,另1個是隨機引物,則被稱為RAMP技術。
(2)CAPS(Clea-ved amplified polymorphic sequence)。CAPS技術又可稱為PCR-RFLP。所用的PCR引物是針對特定的位點而設計的。其基本步驟是:先進行PCR擴增,然后將PCR擴增產物用限制性內切酶酶切,再用瓊脂糖凝膠電泳將DN段分開,用EB染色,觀察。與RFLP技術一樣,CAPS技術檢測的多態性其實是酶切片段大小的差異。在酶切前進行RCR產物檢測,其多態性稱為ALP。Neff et al.(1998)在此基礎上又發展出dCAPS技術(derived CAPS),這是檢測單核苷酸多態性的一種良好方法。
(3)單引物擴增反應(single primer amplification reaction,SPAR)。SPAR技術與RAPD技術相似的是也只用1個引物,但SPAR分析中所用的引物不是隨機的,而是在SSR的基礎上設計的,例如可能的序列是(TA)10或(CGA)6。擴增的是SSR之間的DNA序列。又稱為MP-PCR(microsate-llite-primed PCR)。
(4)小衛星區域DNA直接擴增(directed amplification of minisatellite region DNA,DAMD)。直接用小衛星的核心序列作引物進行擴增。
(5)Inter-Alu PCR like genomic profiling。與SPAR技術相近,也只用1個引物,但所用的引物是在Alu序列(反向重復序列)的基礎上設計的,擴增的是copia(另一種反向重復序列)序列之間的DNA序列。
(6)ISTR(inverse sequence-tagged repeat)。這種技術與SPAR技術也相近,所用的引物是在copia序列的基礎上設計的,擴增的是copia序列之間的DNA序列。
(7)IFLP(intron fragment length polymorphism)。檢測的對象是內含子的長度差異。根據內含子兩端的特征序列設計引物,擴增出長度不同的內含子片段。
(8)RAMPO(random amplified microsatellite polymorph-ism)。RAMPO的英文全名與RAMP的英文全名相近,但實驗方法卻不同。RAMPO的基本步驟是:先用1個單一的隨機引物(即RAPD引物)對基因組DNA擴增,用電泳將擴增片段分開,然后,把凝膠轉移到尼龍膜上,使之與一個帶有放射性標記(或其他標記)的與SSR互補的寡核苷酸探針如(CA)8和(GA)8雜交,放射自顯影后可得到新的多態性類型。
先找到RFLP標記后,對RFLP探針進行測序,再合成適當的PCR引物,這樣可發現新的STS標記。這也可稱為RFLP-PCR。
3抗性基因同源序列(RGA)
近年來,在各種農作物抗性育種的進程和模式生物的抗性研究中,在水稻、玉米、番茄、馬鈴薯、煙草、擬南芥等植物中克隆了若干抗性基因,包括植物對病毒、細菌、線蟲的抗性基因。例如煙草抗花葉病毒基因、水稻抗白葉枯病基因Xa-21、擬南芥抗丁香假單胞桿菌基因RPS2、亞麻抗銹病基因L6以及甘蔗抗胞囊線蟲基因HS1等。
Leister等通過分析研究已克隆的植物抗病基因的結構特征,發現很大一部分的抗病基因都含有NBS保守序列。同年,《美國科學院院刊》在同一期發表了2篇應用同源序列從大豆中克隆R基因同源序列的報道,從而引發了同源序列法在植物抗病基因研究中的應用。隨后的大量研究表明,植物抗病基因中存在多種類型的保守結構域。Hammond Kosack和Parker通過分析已克隆的植物抗病基因結構,將植物抗病基因分為8 類,其中,含有NBS-LRR(富亮氨酸重復子Leucine-rich Repeats,LRR)結構域的抗病基因是最主要的類型。
這些結構可能是參與蛋白質之間的相互作用或者細胞信號的傳導以及識別。根據抗性基因的這一共性,以其保守結構的序列為基礎設計引物,在任何作物中,用PCR技術擴增和分離具有相似序列的DN段,即抗性基因同源序列。
RGA提供了一種快速鑒定候選抗性基因的便捷途徑。目前已經利用此技術在小麥、大豆、馬鈴薯中鑒定了候選抗性基因,它們在基因組的位置基本上就在已知的抗病基因區域。已知基因包括抗病毒、細菌、真菌和線蟲的基因。而且部分與抗性基因緊密連鎖的標記本身就是抗性基因或者抗性基因的一部分。因此,應用RGA進行基因定位可以較快地檢測到與抗性基因緊密連鎖的分子標記?？梢灶A見,RGA將成為抗性基因定位的重要手段,并且在分子作圖的領域將發揮更加巨大的作用[41,42]。
4單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)
單核苷酸多態性是指2套基因組的DNA序列兩兩進行位置比對時, 單個核苷酸的的不同而顯示出的差異(多態性)。因此,SNP反映了過去多數突變事件的特點,2個個體在同一位點攜帶的不同等位基因被認為是進化的遺傳標志。顯而易見,SNP是目前已知的多態性最高的分子標記。據Genbank估計,如果比較2套人類基因組的DNA序列,出現SNP的頻率可達1/2 000~1/1 000,看起來這個頻率并不高,但是考慮到人類基因組共有3.2×109bp時,即可能出現3.2×1012個SNP位點時,這個數量已經相當可觀了。并且這只是2套基因組之間的比較,所有的SNP位點肯定比這個數字大得多。水稻中SNP分布頻率也很高,平均1 000bp就有1個SNP,這些標記隨著水稻基因組的實施而被發現和利用。由于SNP具有同一個位點多態性低而全基因組多態性又極其豐富的特點,并且分析時只需要進行陰/陽性分析而不需進行片段的長度分析,特別適合用DNA芯片技術進行大規模的掃描分析,是繼微衛星后最為高效的標記。不過其昂貴的成本(開發和使用的成本都很高)使其應用受到一定的限制。建立可供利用的SNP標記需經過以下幾步:①全基因組測序;②根據測序結果確定特定的序列標記位點;③對STS進行掃描,尋找SNP位點;④確定SNP;⑤將SNP定位到染色體上。
5單鏈構象多態性(Single Strand Conformational Poly-morphism,SSCP)
SSCP是指DNA單鏈構象的多態性,是基于PCR擴增而新發展起來的一項檢測DNA多態性的分析技術。在進行SSCP分析時,利用PCR特異的擴增出基因組目的DN段,然后將這些擴增出來的DN段進行變性處理,使雙鏈DNA分開成單鏈,再用非變性凝膠電泳分離。由于在自然狀態下,單鏈DNA會折疊卷曲,形成一定點空間構象,這種空間構象是由DNA鏈的堿基序列決定。如果擴增的目的DN段序列的堿基發生了變異,就可能造成其單鏈的空間構象發生改變,從而影響其單鏈電泳時的遷移速率,導致其在電泳圖譜上的帶紋位置不同,顯示出不同生物個體DNA的特異性。
6新型分子標記的開發及其應用前景
自從20世紀70年代第1代分子(RFLP)標記出現以來,分子標記家族迅速發展繁榮起來,并且準確性和靈敏性也一步步提高。目前的SNP技術已經可以在單個核苷酸的水平上找出不同樣本之間的差異,即使它們之間的親緣關系非常接近。
縱觀分子標記的發展,是伴隨著人們對生命本質的認識一步步加深,認識范圍從宏觀表型一步步逼近微觀世界的進程同步發展的。任何一個特殊生命現象的發現,都可能導致革命性的理論或技術的產生,DNA雙螺旋理論的提出導致了DNA的自我復制理論,又進而導致了PCR技術以至于后來的全自動PCR儀的問世(當然也少不了其間Taq聚合酶的發現)。比如各種類型的外切酶和內切酶的發現導致了RFLP技術的產生。
重大的技術突破來源于理論的突破性進展,重大理論的提出來源于無數細微現象的總結?；仡?0世紀生命科學的重大突破:1900年孟德爾的遺傳理論被重新認識;1920年,摩爾根的基因理論和連鎖遺傳的提出;1953年,DNA雙螺旋結構理論的提出;直到90年代,自動PCR儀的出現。從此,人們又進入了一個眾多實驗現象的重復和積累的階段。已經有很多不能解釋甚至是矛盾的試驗現象在陸續出現?？梢灶A言,下一次的理論突破將導致更加革命性的發現,也必將使得分子標記技術能夠從更加深的層面上解釋生命現象本身,人們對分子標記的認識和利用也更加深刻和簡便。并且隨著計算機技術的迅速發展,使得人們不僅能從浩如煙海的數據和現象中發現總結規律,還能夠根據現有的現象和規律來預測可能的現象乃至規律。根據目前的發展來看,分子標記的用途不會再局限在傳統的生物、醫學、農業等領域,還會擴大到諸如數據加密傳輸、計算技術等領域。
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遺傳學重疊效應范文5
關鍵詞：抑郁癥；神經成像；轉化研究；臨床
分類號：B845
1.前言
抑郁癥（Maior Depressive Disorder）是最常見的精神障礙之一，其在臨床上最為顯著的表現為情緒低落、精力減退、活動降低、缺乏以及相關的軀體癥狀（如體重增加或減輕、睡眠障礙和疲勞等），重度抑郁甚至導致心理遲滯與思維困難（Seminowiez et al.，2004）。世界衛生組織的統計結果表明，抑郁癥目前已經成為全球第四大疾患，并且預計到2020年可能成為僅次于心臟病的人類第二大疾患（WHO，2008）。相關數據表明，高達20%的人群在其人生歷程中至少經歷過一次抑郁，而且其復發率超過80%（Gotlib&Hamilton，2008）。抑郁癥不但增加了病人及其家屬的經濟負擔，損害了病人的生理、認知和社會功能，還導致了更高的死亡風險（Bortolotti，Menchetti，Bellini，Montaguti，&Berardi，2008）。由于它的高發生率和破壞性后果，抑郁癥已經成為一種重要的公共健康問題。
雖然許多元分析的結果表明，心理治療（如認知行為療法、心理動力學療法與人際關系療法等）和藥物治療能夠減輕抑郁癥狀，有一定治療效果（cuijpers，van Straten，Andersson，&Varl Oppen，2008；Cuijpers，Van Straten，van Oppen，&Andersson，2008；Pinquart，Duberstein，&Lyness，2008）。但在臨床隋境中，還存在以下問題：（1）抑郁癥的病因和發病機制不甚清楚。（2）現有的診斷采用疾病分類學的方法，過于簡單和主觀，容易導致較低的抑郁癥識別率。（3）抑郁癥具有很大的異質性，不同階段和不同的人表現出來的癥狀類型和嚴重程度存在很大差異，容易導致較高的誤診率。（4）抑郁癥治愈率低且藥物治療存在一定副作用，尤其是針對難治型抑郁癥（treatment-resistant refractory maior depression），大約20%的人治療不起作用（Fava，2003；Keller et al.，1992）。（5）抑郁癥治療的長期效果差，復發率高?；谝陨弦蛩?，探討新的途徑，用于提高抑郁癥的預防、診斷和治療效果具有重要的現實價值。而神經成像技術的轉化研究為這一目標的實現提供了巨大的可能性。
2.轉化研究的發展概況、定義及其主要步驟
轉化研究（translational research）是指系統性地嘗試整合基礎研究者和臨床研究者的兩個不同的研究視角（Rosenthal，Gratz，Kosson，Cheavens，Lejuez，&Lynch，2008）。其中基礎研究經常采用控制精良的實驗室方法來闡述潛在的過程，在該過程中不需要思考實際應用目標，其產出是一般知識以及對自然法則和規律的理解（Rubio et al.，2010）；而臨床研究者聚焦于將研究結果更加直接地運用到真實世界中，包括患者導向研究（Patient-oriented research）、流行病學和行為研究以及成果研究和健康服務研究（NIH，2001）。轉化研究這一術語最早出現在1993年Medline搜索中，但是上世紀90年代的醫學文獻中只有很少的文章與該術語相關聯，而且相關的文章也大都是關于癌癥研究的。那時，關于癌癥的文獻傾向使用“轉化研究”來指代包含不同類型研究的工作（例如，覆蓋基礎和臨床研究兩方面的免疫學研究）或者在某一特殊研究類型中包含不同學科的工作（例如，涉及分子遺傳學和免疫學兩種學科的基礎研究）（Rubio et al.，2010）。時至今日，不同領域的研究者在此定義上進行了大量嘗試和工作。大體上說，目前轉化研究主要有兩種路徑：一種是將基礎研究的發現轉化到臨床運用（from bench to bedside）；另一種是將臨床問題轉化為基礎研究（fTom bedside to bench）（Rubio et al.，2010）。
Wang，Heinssen，Oliveri，Wagner和Goodman（2009）提出轉化研究包含兩個步驟：第一步是將實驗室和前臨床研究階段所得的研究結果應用于人類的臨床試驗或研究；第二步著眼于將臨床試驗或研究的結果遷移到日常生活中去，以提高人類健康水平。在此過程中預防和治療策略的成本效益在轉化科學中也是非常重要的部分。不過上述只是一個單向的轉化研究路徑。Rubio等（2010）以提高公共健康為長期目標，將基礎研究、患者導向研究和以人群為基礎的研究fPopulafion-based research）相整合，提出了更加詳細和更為成熟的轉化研究多向模式。該模式分為3個步驟：第一步探索基礎研究和患者導向研究之間的作用，以促進對疾病科學性的新理解或改善護理標準；第二步加強患者導向研究和以人群為基礎的研究兩者之間的作用，以改善患者的治療效果，實施更好方法促進人群的健康狀況；第三步提高基于實驗室的基礎研究和以人群為基礎的研究之間的作用，促進對人類健康和疾病更加深入的科學性理解。在基礎研究、患者導向研究和以人群為基礎的研究中，兩兩之間是雙向的關系并且三者之間彼此動態地交互作用。廣義上說，患者導向研究和以人群為基礎的研究實際上落入到更廣泛的臨床研究范圍內。患者導向研究包括患者和健康個體的研究，用于理解疾病和健康的機制，決定治療效果或者提供患者護理軌跡的決策分析；而以人群為基礎的研究則涉及流行病學、社會和行為科學、公共衛生、質量評估以及成本效益等方面。
總之，轉化研究作為一種新的視角，為實驗室的基礎研究成果轉化到臨床運用提供了一個有前景的框架。本文就以抑郁癥為例，沿著從基礎研究到其預防、臨床診斷和治療的這一轉化研究路徑，詳細探討抑郁癥神經成像轉化研究的進展。
3.抑郁癥的神經成像基礎研究
神經成像作為認知神經科學研究最為主要的技術手段之一，使人類有史以來第一次能直接觀察到大腦的心理過程和認知活動，成為近年來國際上該領域研究的趨勢。同樣，這一技術在抑郁癥領域的研究中也發揮著越來越重要的作用。借助神經成像技術，研究者能夠探討到抑郁癥患者的異常腦區，這些腦區可能在結構或功能上異于正常人。如抑郁癥患者的顳葉（temporal lobes）、海馬、杏仁核、額葉（fontal lobes）、扣帶前回（anterior cingulate cortex）、基底神經節（basal ganglia）和丘腦結構異于正常人。具體表現為，抑郁癥患者具有更小的左側顳葉容量和海馬容量；與慢性抑郁癥病人和正常人相比，首發抑郁癥患者的杏仁核灰質容量減少；在嚴重的抑郁癥患者中，整個的前額葉容量和/或眶額葉皮層（orbitofrontal codex，OFC）容量減少；抑郁癥患者的吻側扣帶皮層（rostral cingulate codex）的灰質容量減少，并且這和疾病時程有顯著正相關；雖然基底神經節的結構和抑郁癥的關系還不確定，但是在難治型抑郁癥患者中，尾狀核（the caudate nuclea）的灰質容量減少，這異于康復的抑郁癥患者和正常人；抑郁癥患者的丘腦灰質容量也減少（Bora，Fomito，Pantelis，&Yucel，2012；Hastings，Parsey，Oquendo，Arango，&Mann，2004；Neumeister et al.，2005；Vasic，Waiter，HOse，&Wole 2008；vythilingam et al.，2004）。雖然病人的人口學特征、所采用的成像技術、分析方法和臨床因素等可能導致結果存在變異，但是在抑郁癥患者中存在顯著的杏仁核、基底神經節、海馬、眶額皮層、膝下扣帶皮層（subgenual cingulated cortex，sgACC）和丘腦容量改變。
抑郁癥是一種認知和情緒障礙，大量的行為和認知任務表明，抑郁癥和負性認知偏差、學習和記憶能力受損、對獎賞的鈍化反應、對懲罰的高度敏感以及受損的社會認知密切相關（Mathews&MacLeod，2005；Whitmer，Frank，&Gotlib，2012）。與此相對應，抑郁癥患者在加工這些認知或社會性任務時，其大腦的激活模式也往往異于正常人。如Davidson，Pizzagalli，Nitschke和Putnam（2002）認為抑郁癥是一種情緒表征和調節障礙，與這些功能異常相關的腦區包括額葉皮層（prefrontal Cortex）、扣帶前回、海馬和杏仁核。Gotlib和Hamilton（2008）認為抑郁癥患者的情緒體驗、表達和調節異常與杏仁核、膝下扣帶前回的過度激活以及背外側前額葉皮層（dorsolateral prefrontal cortex，DLPFC）激活不足密切相關。Clark，Chamberlain和Sahakian（2009）列舉了抑郁癥患者常見的四種認知異常：執行控制、記憶、情感加工和反饋敏感性。這些功能改變所涉及的神經回路包括額葉多個區域、皮層下區域（紋狀體、丘腦）和顳葉結構（杏仁核、海馬）的交互作用。
總之，抑郁癥的神經成像基礎研究表明，抑郁癥患者的一些特定腦區的結構和功能都不同于正常人，這尤其表現在杏仁核、丘腦、海馬和額葉皮層等部位。這為理解抑郁癥的病因及其發病機制提供了新的證據?；谶@些研究成果，可以為抑郁癥的預防、診斷和治療的轉化研究提供新的視角。
4.神經成像研究與抑郁癥預防
鑒于抑郁癥治療的復雜性，為了減少抑郁癥的巨大疾病負擔，越來越多的研究者認為抑郁癥的早期識別和預防能起到更好的效果（Hetrick et al.，2008）。首先因為即使在理想的條件下，現有的藥物和心理治療所減少抑郁癥的疾病負擔不超過35%（Andrews&Wilkinson，2002；Andrews，Issakidis，Sanderson，Corry，&Lapsley，2004）。其次因為抑郁癥首發階段的早期有效干預能夠減少其復發的可能性，后者隨著病程的進展，將變得更為頻繁。Harrington和Clarke（1998）研究表明，假如抑郁癥患者能夠早在13歲時被成功治愈，那么其在16歲時患復發抑郁癥的風險將減少大約10%。
流行病學的調查研究發現，青少年早期是抑郁癥的高發期，且女性得抑郁癥的概率要顯著高于男性，如美國青少年中15%-20%患有重度抑郁（Lewinsohn&Essau，2002）；而在我國約有42.3%的中學生存在輕度抑郁（馮正直，張大均，2005）。此外，抑郁癥父母的子代在青少年期患抑郁癥的風險是健康父母的子代的3-5倍（Hammen，2009）。尤其是母親抑郁與其女性子代的早發和更嚴重的抑郁相關（Lieb，Isensee，Hoefler，Pfister，&Wittchen，2002）。因此，抑郁癥父母的子代，尤其是抑郁癥母親的女性子代，是抑郁癥的高發群體，對其大腦結構和功能的神經成像研究可以探究抑郁癥的風險因素。如Chen，Hamilton和Gotlib（2010）的研究表明抑郁癥患者的女兒比正常人的女兒有更少的雙側海馬灰質密度，并且前者的左側海馬容量減低。Joormann。Cooney，Henry和Gotlib（2012）通過負性情緒誘發和自動情緒調節任務，比較了抑郁癥母親的女兒和正常母親的女兒，發現前者出現更多的杏仁核和腹外側前額葉皮層（ventrolateral prefrontal codex）激活；而在自動情緒調節過程中，后者出現更大的背外側前額葉皮層（dorsolateral prefrontal cortex）和背側前扣帶回皮層（dorsal anterior eingulated codex）激活。Mannie，Harmer，Cowen和Norbury（2010）采用不同認知負荷的口頭工作記憶任務（1-2-3-back vso-back），對父母患有抑郁癥但其本人沒有抑郁癥病史的年輕人和父母及其本人都沒有抑郁癥的年輕人的比較發現，雖然兩組的總體認知能力是相似的（操作準確性和反應潛伏期沒有顯著差異），但是前者比后者在外側枕葉皮層（lateral occipital cortex）、顳上皮層（superior temporal cortex）和頂上皮層（superior parietal codex）有更大的激活水平。
抑郁的認知理論認為負性的認知偏差（如注意偏差、記憶偏差和解釋偏差等）是抑郁癥的認知易感性因素（Mathews&MacLeod，2005）。在壓力情境下，認知易感性高的個體更容易產生抑郁癥。因此，高認知易感性也是抑郁癥的風險因素，對其相關腦機制的探討可以為抑郁癥的早期預防提供新的參考。如Zhong等（2011）采用情緒匹配任務，使用fMRI檢驗未服藥的抑郁癥患者、具有認知易感性的非抑郁癥被試和沒有抑郁癥的正常被試，發現與正常被試相比，抑郁癥患者有更強的左側杏仁核激活和更弱的左側背外側前額葉皮層激活水平。相似地，與正常被試相比，高認知易感性被試有更高的雙側杏仁核激活和更低的雙側背外側前額葉皮層激活水平。高認知易感性被試在腦機制上可能表現為對情緒刺激的前額葉的減弱反應和杏仁核的增強反應。
總之，最近對抑郁癥高風險人群的神經成像研究表明，與健康對照組相比，該群體特定腦區的結構和功能都存在異常。這些異常出現在抑郁癥發作之前，可能影響抑郁癥的發展進程。因此，借助這些腦成像的證據，有助于超越以往的問卷調查和行為學指標，更加敏感地甄別抑郁癥的高風險人群，從而對其進行早期有效預防和干預，有助于減少其抑郁癥發作風險，將損失降低到最低程度。
5.神經成像研究與抑郁癥診斷
當前抑郁癥的臨床評估主要采用疾病分類學的方法，根據臨床訪談診斷體系（如精神障礙診斷原則和統計手冊第四版DSM-IV、國際疾病分類第十版ICD-10和中國精神障礙分類與診斷標準第3版CCMD-3），通過病人或其家屬的口頭報告和臨床醫生的直接觀察來判斷病人是否具有癥狀以及具有何種癥狀，最終做出是否有抑郁癥的診斷結果。如根據DSM-IV，抑郁癥的診斷標準是在連續兩周的時間里，病人表現出九個癥狀（抑郁心境、興趣或缺乏、體重減輕、失眠、精神運動興奮或遲緩、疲勞無精力、無價值或負罪感、無法思維或集中注意力、反復出現死或自殺念頭、自殺的企圖或計劃）中的五個以上。這些癥狀必須是病人以前沒有的或者極輕的。并且抑郁癥的診斷至少包括抑郁心境、興趣或缺乏這兩個癥狀中的一個。根據這些規范化的評估體系，可以改善我們對患者的認識，對抑郁癥做出相對比較準確的判斷。但是，由于抑郁癥的癥狀診斷采用全或否的方式、自我報告和臨床觀察的方法具有較強的主觀性，尤其是抑郁癥作為一種復雜的精神障礙，在不同人中甚至在同一個人不同時期中都會表現出許多異質性的情緒、認知和運動癥狀，這些因素可能使抑郁癥的診斷出現誤差，需要進一步完善。
神經成像技術的發展，尤其是抑郁癥神經成像的基礎研究，為抑郁癥的診斷和鑒別提供了一條非常有價值的發展路徑。其中，抑郁癥的生物標記研究是近年來精神障礙領域的一個研究熱點。當前抑郁癥的診斷主要依靠于可操作化的診斷系統，但是抑郁癥具有不同的生理機制，不同生理因素導致的抑郁癥在臨床癥狀上的表現可能是重疊的，生物標記就能很好地應對這一難題。因此，借助基礎研究所發現的抑郁癥的生物標記，可能是改善抑郁癥患者準確識別和識別速度的非常重要的一環。
5.1抑郁癥診斷的生物標記
生物標記（biomarker）是一種可以客觀測量和評估的特征，可作為正常生理過程、病理過程或者治療干預的藥物反映的指標（Masdeu，2011）。NIH生物標記和替代終點（surrogate endpoint）的工作組認為存在3種水平的生物標記：0型生物標記用于追蹤疾病的自然進程；1型生物標記用于檢驗干預的效果，連同試驗化合物所熟知的作用機理，但和臨床結果沒有精確的關系；替代終點2型生物標記用于預測臨床結果（Wong，TauscheL&Grtmder，2009）。生物標記在疾病診斷上產生價值，需要具備以下幾個條件：第一，在甄別和區分不同的障礙方面有非常高的敏感性和特異性（>80%）（Ritsner&Gottesman，2009）；第二，為了確保它們可用于日常臨床實踐，生物標記是可再生的、可信的、便宜的、非入侵的和容易獲得的（Ritsner&Gottesman，2009）。由于識別生物標記并調查它們之間的相互作用有助于揭示疾病的病理生理原因，長久來看有助于發展基于生理而不是行為癥狀導向的疾病分類體系，這可能有助于改善抑郁癥的診斷。
Marquand，Mourao-Miranda，Brammer，Cleare和Fu（2008）對完成口頭工作記憶任務的被試進行fMRI掃描，來探究抑郁癥診斷的生物標記。他們發現，2-back任務具有最高的準確率，為68%。由于抑郁癥患者在表情加工上存在問題，Fu等（2008）采用對悲傷表情和中性表情的神經反應來鑒別抑郁癥，其中中等強度悲傷表情的準確率為74%，高強度悲傷表情的準確率為76%，中性表情的準確率為87%。鑒于抑郁癥和早期不良依戀之間的關系，Zhang，Yaseen，Galynker，Hirsch和winston（2011）采用fMRI，比較抑郁癥患者和正常被試在觀看母親照片、朋友照片和陌生人照片時的腦激活模式，采用主成分回歸方法（a principal component regression method，PCR），發現BA-32的活動模式能夠識別抑郁癥患者。該方法與BDI-II和臨床精神病訪談的診斷一致性為89%，敏感性為85.7%，特異性為92.8%。一些研究者（Hahn et al.，2011）認為由于抑郁癥具有多個癥狀，不同癥狀可能涉及到多種神經過程，從而單個生物標記（如與單個病理異常過程或癥狀相關的神經反應）在預測復雜癥狀模式的疾病上是有難度的。因此，他們主張采用合成的生物標記來診斷抑郁癥。Hahn等（2011）基于3個任務（對中性表情、大獎賞和安全線索的反應）的全腦神經反應模式，采用模式再認算法（pattern-recognition algorithms），發現綜合多個生物標記的決策樹算法（decision tree algorithm）對抑郁癥的診斷正確率為83%（敏感性為80%，特異性為87%），比僅用單個生物標記的準確率提高了11%。
5.2難治型抑郁癥與非難治型抑郁癥的區別
盡管抑郁癥治療方法在不斷更新，但是大概15%-30%的抑郁癥病人對治療方法存在排斥，導致巨大的個人、社會和經濟負擔（Bedim&Turecki，2007）。其中，當至少2種來自不同藥理類別的規范化抗抑郁藥物對抑郁癥癥狀不能產生顯著的改善時，這種抑郁癥就可以稱為難治型抑郁癥（Berlim&Turecki，2007；Stimpson，Agrawal，&Lewis，2002）。因此，發展針對這一群體的更有效治療方法需要對其神經生物基礎有更深刻的認識。
Wu等（2011）采用靜息態功能成像，根據區域同步分析（Regional homogeneity analysis），發現與正常人和非難治型抑郁癥患者相比，難治型抑郁癥患者有更多腦區改變的區域同步。Guo等（2012）也采用了靜息態功能成像，基于一致性的ReHo（Cohe-ReHo）方法，對比了難治型抑郁癥患者和治療敏感（treatment-sensitive）的抑郁癥患者的大腦結構，發現小腦部位的更低的ReHo值可以作為區分前者與后者的標記，它具有83%的敏感性和86%的特異性。
5.3雙相障礙與單相抑郁癥的區別
由于在雙相障礙（Bipolar disorder）中，抑郁癥狀比躁狂癥狀更為普遍，且在雙相障礙和單相抑郁癥中都存在較高的亞臨床躁狂癥狀，從而導致在臨床領域中將60%的雙相障礙診斷為抑郁癥或復發性單相障礙，從而耽誤合適的治療，導致許多雙相障礙患者的病情惡化（de Almeida&Phillips，2013）。因此，區分雙相障礙和單相抑郁癥是一個重要的臨床挑戰。識別雙相障礙的生物標記可能有助于區分雙相障礙和單相抑郁癥，并最終優化所有抑郁癥患者的臨床和功能結果。
Konarski等（2008）綜合比較了單相抑郁癥和雙相障礙的神經結構成像，發現皮層下結構，尤其是紋狀體、杏仁核和海馬可以用來區分單相抑郁癥和雙相障礙。神經成像的研究發現雙相障礙比單相抑郁癥有更大范圍的白質連接異常和白質高度濃縮（hyperintensities），韁核容量（habenula volume）減少以及在情緒調節和注意控制神經環路上有不同的功能異常模式。從不同的病理生理過程，尤其是情緒調節、獎賞和注意的神經環路可以區分雙相障礙和單相抑郁癥（de Almeida&Phillips，2013）。
Lawrence等（2004）對比了雙相障礙和單相抑郁癥對輕度到重度恐懼、快樂和悲傷表情的功能性成像的神經反應，發現與單相抑郁癥患者相比，雙相障礙患者對快樂和悲傷表情有更強的皮層下和腹側前額葉皮層（ventral prefrontal cortical）激活。De Almeida等（2009）采用兩個事件相關的范式——分別評定快樂和悲傷表情的情緒強度，通過動態因果模型檢驗雙相障礙和單相抑郁癥在支持情緒調節左右腦區中的杏仁核與眶內側前額葉皮層（orbitomedial prefrontal cortex，OMPFC）的有效連接，發現在快樂評定任務中異常的、左側自上而下眶內側前額葉皮層，杏仁核以及右側的、自下而上的杏仁核-眶內側前額葉皮層有效連接能夠區分單相抑郁癥和雙相障礙。
Bertocci等（2012）采用面部表情的n-back任務，通過高記憶負荷（2-backl和低記憶負荷（O-back）條件，檢驗她們對情緒性分心物的情緒調節的執行控制的腦機制，發現單相抑郁癥女性組比雙相障礙女性組和正常女性組在高記憶負荷條件下，中性表情分心物誘發了更大的雙側和左側背側前中扣帶皮層（dorsal anterior midcingulate cortex，dAMCC）激活水平，且兩個抑郁癥組的雙側殼核（bilateral putamen）激活水平大于正常組。在快樂表情分心物的高記憶條件下，單相抑郁癥的女性比正常女性誘發了更大的左側殼核激活水平。因此，在情緒調節的注意控制的神經環路上功能異常，尤其是背側前中扣帶皮層上的差異，是區分單相抑郁癥和雙相障礙女性的一個潛在神經成像測量指標。
6.神經成像研究與抑郁癥治療
目前抑郁癥治療主要采用心理和藥物兩方面的治療。在心理治療方面，臨床上更多地使用認知行為療法和人際關系療法。這兩種療法共有3個目標：（1）旨在改善抑郁癥患者處理壓力事件的方式和有問題的人際關系，以此來提高他們問題解決的能力；（2）修正患者關于他們自己和關系的角度；（3）嘗試幫助個體調節壓力情緒狀態（Frewen，Dozois，&Lanius，2008）。特別是在心理干預和神經成像技術相結合來短期治療重度抑郁癥上已取得令人欣喜的結果，有研究者利用PET、SPECT技術發現進行人際關系療法且從未參與過藥物治療的抑郁癥個體，與治療前相比，其大腦的右側前額葉、左側前扣帶回皮層、左側腦島和左側顳葉皮層的葡萄糖代謝率降低（Brody et al.，2001），整個治療過程右側后扣帶回的腦血流量明顯增加（Martin，Martin，Rai，Richardson，&Royall，2001）。同樣，利用認知行為療法也發現治療后抑郁個體大腦代謝活動的變化并且得到明顯改善（Goldapple et al.，2004；Siegle，Carter，&Thase，2006）。此外，最近的一項研究還表明心理動力學療法對抑郁癥患者進行長期干預取得一定的進展，他們發現患者的前額葉一邊緣系統功能（包括左前海馬、杏仁核、膝下扣帶回和內側前額葉皮層）在治療前有較高程度的激活，而在歷時15個月的治療后激活程度明顯降低，這意味著抑郁癥狀的減輕（Buchheim et al.，2012）。
當前的藥物治療主要針對一元胺系統，但是將近1/3的病人在第一次開藥后復發，抗抑郁癥藥物見效慢，藥物治療需要至少4到6周時間來甄別藥物治療有效者和無效者。Lisiecka等（2011）基于fMRI技術并采用兩種常見的抗抑郁癥藥物，即文法拉辛或米爾塔扎平fvenlafaxine或者mirtazapine），對抑郁癥患者進行四周的隨機臨床治療，采用表情匹配任務，考察在治療前和治療后的眶額葉皮層功能連接，發現在治療前左側運動區和眶額葉皮層區更高的功能連接是治療有效者的特征。而治療無效者的特征是更高的眶額葉皮層和小腦的連接。反應的強度與左側眶額葉皮層、尾狀核、丘腦的功能連接正相關。文法拉辛和米爾塔扎平治療縱向改變的差異體現在運動區、小腦、扣帶回（cingulate gyms）和角回（angular gyrus）。此外，藥物治療對許多病人會產生很多的副作用并且在長期可能復發。因此，對于新的抗抑郁藥物的評估和開發也是非常重要的。例如，選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑（SSRI）治療方法的有效性已遭到質疑，McCabe，Mishor，Cowen和Harmer（2010）利用西酞普蘭（citalopram）對患者進行短期治療時發現這種抗抑郁藥能同時降低獎賞或厭惡刺激的神經加工，造成抑郁所呈現的動機降低和缺乏狀態，也可用來解釋SSRI治療期間患者所表現出的情感遲鈍體驗。相反地，去甲腎上腺素再攝取抑制劑瑞波西?。≧eboxetine）的使用能促進對獎賞刺激在內側眶額葉皮層（medial orbitofrontal cortex）的激活反應。近期的一項研究使用抗抑郁藥依他普倫（Escitalopram）對重抑郁患者進行治療，同時利用fMRI考察患者在負性情緒圖片呈現和預期過程中的神經激活，發現在治療前當患者對負性圖片有所預期時，杏仁核有更大的激活，即使沒有預期線索，當患者看到負性圖片時，前額葉也有明顯的激活；而在治療之后杏仁核和前額葉的激活程度都明顯降低（Rosenblau et al.，2012），說明該藥物能夠改變抑郁癥患者異常的情緒加工的神經機制并使其趨于正常化。當然，在迫切需要開發治療抑郁癥的新藥物的同時也面臨著問題，新的開發方法的出現很大程度上受前臨床方法的不良預測效度的影響。缺乏前臨床和臨床方法之間的共同靶點（endpoints）也是開發新藥物的一個不足。
除此之外，伴隨著神經成像技術的發展，抑郁癥在神經生物標記上的發現有助于深入了解其病因、機制及制定更合理的治療方法。經過抗抑郁治療后，嚴重的抑郁癥患者在觀看悲傷的情緒圖片時，與治療之前相比，個體表現出在大腦的右側膝下扣帶回和視覺皮層的反應的效應值下降，這說明對負性面孔的反應與臨床治療的改善有關，特別表現在膝下扣帶回這一生物標記上（Keedwell et al.，2009）。Pizzagalli（2011）通過元分析發現吻側前扣帶皮層（rostral anterior cingulate codex，rACC）在靜息狀態下活動的增強是非常具有前景的，有助于抑郁癥取得更好療效的預測指標。
7.研究展望
雖然抑郁癥的神經成像轉化研究有助于早期識別抑郁癥的高危人群（如抑郁父母的青少年子代尤其是抑郁母親的女性子代和高認知易感性的群體），提供抑郁癥診斷的有效生物標記，進一步區分難治型抑郁癥和非難治型抑郁癥、雙相障礙和單相抑郁癥；并有助于進一步評估心理治療和藥物治療的干預效果和開發新藥物。但是，還有以下問題有待進一步的解決。
第一，轉化研究是個雙向自由流通過程，一方面是從基礎到臨床，將基礎研究的成果快速轉化到臨床應用領域，為疾病的預防、診斷和治療提供更先進的理念、手段、工具和方法；另一方面從臨床到基礎，將臨床問題進一步轉入相應的基礎領域進行深入研究。但是在現實情境中，基礎研究和臨床研究（或科學與實踐）之間一直存在很大的鴻溝。一方面，國家投入大量的科研經費從事基礎研究，并產生眾多的科研成果，但是這些成果卻鮮為臨床工作者所知和應用；另一方面，臨床工作者對治療為什么會起作用以及用于解釋病人改變的具體何種因果機制還知之甚少。如Johnson（2004）將心理治療人員的現狀概括為“當治療者想明確地敘述問題、描繪治療目標或者關注治療階段中的歷時變化過程時，往往沒有一致的、綜合的和研究所支撐的圖景?！币虼耍瑸榱诉M一步促進轉化研究的成果，基礎研究者和臨床運用者的有效溝通非常重要。這方面可以借鑒精神分裂癥領域的成功經驗。為了更好地運用認知神經科學的轉化研究，開發針對精神分裂癥認知損傷的新干預方法，這一領域的研究者組織了3次國際性會議，召集了這一領域眾多知名學者，分階段討論了用于精神分裂癥治療方法開發的認知機制、用于認知神經科學臨床轉化研究的認知范式（涉及工作記憶、執行控制、注意、長時記憶、知覺和社會認知）選擇和相應的神經成像生物標記（Barch et al.，2009；Carter et al.，2008，2011）。同樣，抑郁癥是種認知和情緒障礙，相關的基礎研究積累了大量的抑郁癥的認知機制、實驗范式和神經成像生物標記的研究成果，有待這一領域的學者針對抑郁癥臨床運用問題，進行更有效的整理、歸納并提出主要的解決方法。
第二，從基礎研究到臨床運用是個多階段過程。第一階段是利用神經成像基礎研究的成果并將它們轉化為更有效的預防、診斷和治療干預手段。第二階段是將新的方法轉化到日常的臨床實踐和健康決策上去（Wang，Heinssen，Oliveri，Wagner，&Goodman，2009）。雖然當前抑郁癥的神經成像轉化研究在第一階段取得了較大的成績，但是第二階段的進展還非常緩慢。這主要有以下幾個原因：首先，相關研究的數量、變異的結果和較少獨立的效度驗證試驗表明這方面的研究還處在嬰兒期（Schleim&Roiser，2009）?，F有研究所采用的被試數量較少，這導致了實驗的外部效度較低，已有的研究結果是否能夠推廣運用到臨床情境中更多的病人身上還需要更加深入的研究。而且，研究結果的穩定性和高效性有待進一步驗證，因為抑郁癥病人組與正常組所得到的差異顯著性結果并不一定適用于某個特定的抑郁癥患者。此外，臨床情境中的干預方法運用強調其成本收益，神經成像轉化研究的運用缺乏這方面證據的支撐。其次，由于設備昂貴的費用，對于大多數的臨床心理學家和門診部來說，神經成像不容易獲得。
