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反向遺傳學研究方法范文1
關鍵詞：牛輪狀病毒；反向遺傳技術；應用；展望
中圖分類號：R392 文獻標識碼：A 文章編號：1674-0432（2012）-01-0170-1
牛輪狀病毒(Bovine rotavirus，BRV)屬于呼腸孤病毒科，輪狀病毒屬，是引起犢牛急性腹瀉的主要病毒之一[1]。發生BRV感染之后多容易繼發引起細菌性感染，對犢牛的生命安全和生命質量構成很大的威脅，同時也給養牛業帶來巨大的經濟損失，對我國養牛業的健康持續發展造成嚴重的影響。近年來，隨著科學技術的不斷發展和完善，對牛輪狀病毒的生物學研究也越來越完善，反向遺傳技術的發展更是準確的提供了獲得重組毒株制備疫苗的方法，從而為防治牛輪狀病毒提供了更有效的措施。本文通過對牛輪狀病毒的生物學、流行病學和其分離培養鑒定等內容的研究，分析反向遺傳技術在牛輪狀病毒中的應用情況，并展望其未來的發展狀態，現將分析報告如下。
1 牛輪狀病毒的簡介
1.1 牛輪狀病毒的生物學特性
輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科(Reoviridase)輪狀病毒屬，是引起人和動物急性胄腸炎的主要病原體之一[2]。其中A組RV感染是世界范圍內導致嬰幼兒發生嚴重腹瀉的最主要因素，是發展中國家嬰幼兒發生致命性腹瀉的首要病因[2]。目前，臨床中尚沒有治療輪狀病毒感染的特效藥物，因此，對其疫苗的研究就成了一直備受關注的課題。BRV是引起犢牛嚴重腹瀉的主要因素，且其致死率較高，有報道表明，英國犢牛因牛輪狀病毒而引起腹瀉的發生率為60-80%[3]，給養牛業造成嚴重的經濟損失。
BRV呈球形，在透射電子顯微鏡下呈現出車輪樣形狀，結構穩定，耐熱耐酸耐堿，于20℃左右最為活躍，具有較強的季節性。直徑為65～75mm，無囊膜，有3層衣殼，具有雙層蛋白殼體。牛輪狀病毒為二十面體結構，基因組由雙鏈RNA組成，有11個分節段，一個鏈編碼病毒的6個結構蛋白，另一個鏈編碼6個非結構蛋白，決定了病毒的結構和功能[3]，其中至少會有6個蛋白質要與核糖核酸結合。
1.2 牛輪狀病毒的流行情況
全球的科研工作者陸續在猴、豬、狗、禽等多種幼齡動物中發現輪狀病毒，逐漸認識到輪狀病毒是引起幼齡動物病毒性腹瀉的主要病原。隨著研究的深入，結合電泳圖差異，顯示可感染牛的是A、B和C群輪狀病毒，其中以A群的感染最為嚴重[3]。牛群中輪狀病毒的感染源主要為糞便，在牛感染病毒后1天便可以在其糞便中檢測到病毒的存在。感染病毒主要通過接觸、呼吸系統、消化系統途徑傳播，感染的牛群發生持續性腹瀉，進而脫水，短時間內繼發大腸桿菌和沙門氏桿菌感染，14-21d后引發肺炎，最終死亡。目前，科學研究者多認為接種疫苗是防御此病的最有效方法，另外，也有些報道表示使用適量的抗生素也可以起到一定緩解細菌性腹瀉的作用。
1.3 牛輪狀病毒的分離培養和鑒定
輪狀病毒分離培養比較困難，應用易感細胞和胰蛋白酶處理是細胞培養分離輪狀病毒的關鍵，最初多采用原代細胞，后來易感細胞系恒河猴腎傳代細胞MA-104的引進，成功的分離到適應于細胞培養的多種動物輪狀病毒細胞株[4]。牛輪狀病毒培養時需要加蛋白水解酶如胰蛋白酶或胰凝乳酶，消化后才能適應細胞，且不需血清。通過VP6高價免疫血清或單克隆抗體建立酶聯免疫吸附試驗、乳膠凝集試驗，檢測牛糞便以確定有無感染。VP7或VP4的單克隆抗體可以通過血清學檢測確定。
2 反向遺傳技術
反向遺傳學是指直接從生物的遺傳物質來對其生命的本質現象進行闡述。在得到生物體的全部基因序列后人工處理，之后再組成有生命活性的個體。這一技術有利于對生物體功能結構的進一步研究，從而研發新疫苗。反向遺傳包括RNA干擾技術、基因沉默技術、基因體外轉錄技術等。通過使用反向遺傳技術對輪狀病毒中的某些重要的蛋白質功能進行鑒定，可以加深對輪狀病毒復制和發病機理的研究，從而獲得理想的弱毒株。反向遺傳技術推動了研究病毒基因組的人工操作和病毒基因功能的進程，具有準確率高、毒力返毒率低等優點，同時其也存在有一定的局限性。然而，目前對輪狀病毒疫苗的研究主要集中在實驗室VP4、VP6、VP7三個基因階段，對于安全可靠的應用在臨床中還需要得到更有效的發展。
3 展望
牛輪狀病毒是引起犢牛急性腹瀉的主要病毒之一，也是引起犢牛急性腹瀉的最主要病因，感染后容易繼發引起細菌性感染，從而引起犢牛死亡。牛輪狀病毒主要是通過消化道、呼吸道和接觸的方式進行傳播，口服或經腸道后，減毒疫苗可激發腸道黏膜免疫，防止腸道黏膜上皮細胞發生感染，因此研制減毒疫苗對于預防BRV感染有著非常重要的意義。目前，國內尚沒有成功研制出BRV口服減毒疫苗，傳統的篩選毒株效率低，反向遺傳技術于基因組水平改良重組，所以將成為獲得弱毒株的有效方法。
參考文獻
[1] ,宋玲玲,王洪梅.反向遺傳技術在牛輪狀病毒研究中的應用[J].安徽農業科學,2011,39(12):7255-7257.
[2] 趙雅靜,高雪軍,劉晨鳴.輪狀病毒LLR疫苗株VP7基因的遺傳變異研究[J].中國生物制品學雜志,2008,21(12):1074-1079.
[3] 陳軍,楊彪,謝金鑫.牛輪狀病毒的流行情況及預防措施[J].養殖技術顧問,2011,2:195.
反向遺傳學研究方法范文2
關鍵詞：虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.）；III型聚酮合酶；查爾酮合酶；RNA干擾；轉基因
中圖分類號：R282 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）09-2255-05
虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.）為蓼科蓼屬多年生草本植物，也是富含芳香族聚酮化合物的藥用植物[1]。聚酮化合物是一大類抗菌、抗腫瘤、抗寄生蟲并具免疫抑制劑活性的天然產物。聚酮化合物通常在聚酮合酶（Polyketide synthase，PKS）的作用下生成。聚酮合酶可以分為3類：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型PKS[2]，其中III型PKS即查爾酮合酶（Chalcone synthase，CHS）超家族主要分布于植物界。自從1983年第一個植物Ⅲ型聚酮合酶基因家族成員查爾酮合酶基因被克隆以來，植物III型PKS不斷被克隆和鑒定，序列分析表明他們之間氨基酸序列相似性在60%以上，編碼約400個氨基酸的蛋白質[3]。Ma等[4]從虎杖中克隆得到一個III型PKS基因PcPKS1，該基因含有3個內含子，BLAST分析發現，PcPKS1與其他植物來源的PKS基因具有80%～99%核苷酸序列的相似性[5，6]。體外酶活試驗研究表明，PcPKS1是一個具有查爾酮合酶（CHS）和苯亞甲基丙酮合酶（BAS）活性的雙功能酶[5]，但PcPKS1在植物體內的生物學功能研究鮮有報道。
RNA干擾（RNA interference，RNAi）是由靶基因同源雙鏈RNA引發，在動植物和真菌中普遍存在序列特異的轉錄后基因沉默現象。按雙鏈RNA（dsRNA）產生途徑將RNAi技術分為多種，其中以具有反向重復序列的hpRNA載體結構在轉錄過程中形成穩定的dsRNA抑制基因表達的效率較高[7]。RNAi技術已成為功能基因組學研究、動植物性狀改良和疾病基因治療的強有力工具[8，9]。
虎杖富含芳香族聚酮化合物，存在多種Ⅲ型PKS基因來合成這些復雜多樣的化合物，深入研究虎杖中聚酮類化合物的生物合成與代謝途徑將為人們更合理地利用虎杖的藥物資源和基因資源提供參考。本研究從反向遺傳學入手，選取位于PcPKS1基因的編碼區保守序列（574 bp）和3′端非編碼區特異序列（209 bp）為目標序列，以載體pYLRNAi作為骨架載體，分別構建能形成hpRNA結構的RNAi表達載體，為進一步鑒定PcPKS1基因的生物學功能和虎杖功能基因組學研究奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 材料 野生虎杖植株由廣州中醫藥大學中藥資源科學與工程研究中心提供。
1.1.2 菌株和載體 根癌農桿菌LBA4404和潮霉素抗性的雙元表達載體pYLRNAi由華南農業大學植物基因組學與生物技術重點實驗室提供。
1.1.3 試劑 引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。限制性內切酶、Taq DNA聚合酶、pMD18-T載體購自TaRaKa公司?？俁NA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒和凝膠回收試劑盒購自Tiangen公司。
1.2 方法
1.2.1 虎杖葉片總RNA的提取及反轉錄 以野生虎杖葉片為材料，采用Trizol法提取總RNA，用cDNA第一鏈合成試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA備用，按試劑盒說明書進行操作。
1.2.2 干擾片段的選擇 根據PcPKS1基因的保守區和特異區序列分別設計2個干擾片段（圖1），用于后續2個RNAi載體的構建。將NCBI中PcPKS1基因（登錄號：EF090266）的序列進行Blast比對，查找PcPKS1基因的保守區域，選擇編碼區605～1179 間長574 bp的序列作為第一個干擾片段，簡寫為CDS。在3′端非編碼區選取長209 bp的特異序列作為第二個干擾片段，簡寫為UTR。
1.2.3 引物設計 以表達載體pYLRNAi為基礎載體（圖2），該載體攜帶強組成型35S啟動子和GUS基因內含子（250 bp），具有2個多克隆位點MCS1和MCS2，可用于干擾片段的正反向插入。在正向片段引物兩端分別加上BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點，反向片段引物兩端分別加上Mlu Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位點。共設計4對引物，引物序列如表1所示。針對PcPKS1基因編碼區，設計引物CDS-1和CDS-2擴增正向干擾片段CDSf，設計引物CDS-3和CDS-4擴增反向干擾片段CDSr。針對PcPKS1基因3′端非編碼區，設計引物UTR-1和UTR-2擴增正向干擾片段UTRf，設計引物UTR-3和UTR-4擴增反向干擾片段UTRr。
1.2.4 干擾片段的克隆與測序 采用25 μL反應體系，PCR擴增條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環35次；72 ℃延伸5 min。將正向、反向片段的PCR產物純化后分別連接pMD18-T載體，將PCR驗證正確的陽性重組子進行酶切驗證并測序。分別將測序正確的重組子命名為pMD18-CDSf、 pMD18-CDSr、 pMD18-UTRf、pMD18-UTRr。
1.2.5 RNAi載體pYLRNAi-CDS和pYLRNAi-UTR的構建
1）RNAi載體pYLRNAi-CDS的構建。利用BamHⅠ和Hind Ⅲ分別對測序正確的重組克隆質粒pMD18-CDSf和pYLRNAi進行雙酶切，用回收的片段作正向連接，16 ℃連接過夜，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，選取長出的單菌落進行PCR檢測。檢測出的陽性克隆搖菌提取質粒，將提取出的質粒和測序正確的pMD18-CDSr進行MluⅠ和Pst Ⅰ雙酶切，用回收的片段進行反向連接，獲得RNAi載體pYLRNAi-CDS（圖3A），將其轉化大腸桿菌。將已轉化大腸桿菌的載體pYLRNAi-CDS進行菌落PCR擴增鑒定和酶切鑒定。
2）RNAi載體pYLRNAi-UTR的構建。方法同上，最終獲得RNAi載體pYLRNAi-UTR（圖3B）。用CaCl2凍融法將RNA干擾載體pYLRNAi-CDS和 pYLRNAi-UTR分別導入農桿菌EHA105中，用于后期植物轉化。
2 結果與分析
2.1 CDS序列的正向片段和反向片段的克隆
以cDNA為模板，用引物CDS-1和CDS-2對正向片段CDSf進行PCR擴增，用CDS-3和CDS-4對反向片段CDSr進行PCR擴增，擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明擴增條帶與預期574 bp的片段大小一致，初步表明已獲得了CDS序列的正向片段和反向片段（圖4）。正向片段CDSf和反向片段CDSr回收純化后分別連接到pMD18-T載體，對得到的重組質粒pMD18-CDSf和pMD18-CDSr進行雙酶切鑒定（圖5），均能酶切得到大小約574 bp的片段。測序結果表明，獲得的CDS序列的正向片段和反向片段是正確的。
2.2 RNAi載體pYLRNAi-CDS的酶切鑒定
分別用BamH Ⅰ+Hind Ⅲ和MluⅠ+Pst Ⅰ將正向片段和反向片段從重組質粒pMD18-CDSf和pMD18-CDSr上切下來，先后插入到pYLRNAi載體的內含子兩側，得到RNAi載體pYLRNAi-CDS。首先對重組質粒pYLRNAi-CDS 進行菌落PCR鑒定，將鑒定正確的菌液提取質粒DNA。將陽性重組質粒pYLRNAi-CDS用BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切，切出大小574 bp的正義片段；用MluⅠ和Pst Ⅰ酶切則切出大小574 bp的反義片段（圖6A）。將重組質粒pYLRNAi-CDS用BamHⅠ和MluⅠ酶切，切出大小約1.4 kb的片段，符合內含子（250 bp）加上正義片段和反義片段長度（圖6B）。以上結果表明，RNAi載體pYLRNAi-CDS構建成功。
2.3 UTR序列的正向片段和反向片段的克隆
以cDNA為模板，用引物UTR-1和UTR-2對正向片段UTRf進行PCR擴增，用UTR-3和UTR-4對反向片段UTRr進行PCR擴增，擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明擴增條帶與預期209 bp的片段大小一致，初步表明已獲得UTR序列的正向片段和反向片段（圖7）。正向片段UTRf和反向片段UTRr回收純化后分別連接到pMD18-T載體上，對得到的重組質粒pMD18-UTRf和pMD18-UTRr進行雙酶切鑒定（圖8），均能酶切得到大小約209 bp的片段。測序結果表明，獲得的UTR序列的正向片段和反向片段是正確的。
2.4 RNAi載體pYLRNAi-UTR的酶切鑒定
分別用BamHⅠ+Hind Ⅲ和Mlu Ⅰ+Pst Ⅰ將正向片段和反向片段從重組質粒pMD18-UTRf和pMD18-UTRr上切下來，先后插入到pYLRNAi載體的內含子兩側，得到RNAi載體pYLRNAi-UTR。首先對重組質粒pYLRNAi-UTR進行菌落PCR鑒定，將鑒定正確的菌液提取質粒DNA。將陽性重組質粒pYLRNAi-UTR用BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切，切出大小209 bp的正義片段；用MluⅠ和PstⅠ酶切則切出大小209 bp的反義片段（圖9A）。將重組質粒pYLRNAi-UTR用BamHⅠ和MluⅠ酶切，切出大小約660 bp的片段（圖9B），符合內含子（250 bp）加上正義片段和反義片段長度。以上結果表明，RNAi載體pYLRNAi-UTR構建成功。
3 討論
RNAi載體構建過程中，正、反向重復序列間加一段間隔序列（如內含子），在轉錄后能形成更加穩定的hpRNA結構，顯著提高RNA沉默的效率和強度[10]。在本研究中，選擇了pYLRNAi載體中的GUS基因內含子序列作為間隔序列，以利于轉錄后的反向重復序列形成hpRNA。干擾片段的長度影響RNAi的效率，在哺乳動物中，表達的hpRNA雙鏈長度在21～25 nt時，既能引發干擾效應，又不會導致細胞死亡[10]。Wesley等[11]研究發現，植物雙鏈hpRNA長度為98～853 bp的靶基因反向重復片段均能高效地導致基因沉默。
靶基因的位置也影響RNAi構建的效果[12]。一方面，若將靶基因保守區域包含在干擾片段內，就有可能同時沉默一簇基因，這種同時沉默多基因家族的特點，使RNAi在植物功能基因組學研究成為可能[13]；另一方面，選擇非保守區域作為干擾片段，則會提高沉默單個基因的效率和特異性[10]。Fukusaki等[14]以矮牽牛查爾酮合酶ThCHS1為靶基因，分別選擇610 bp的編碼區保守序列和132 bp的3′端非編碼區為干擾片段，構建了2個RNA干擾載體CDSi和UTRi，遺傳轉化結果顯示，CDSi轉化株系的紫色花色幾乎完全消失，花瓣呈純白色，而UTRi株系的紫色花色只是部分消退，花瓣呈淡紫色，其原因可能是花色由多個查爾酮合酶基因共同調控的，3′端非編碼區與同家族基因的同源性較低，針對3′端非編碼區設計的RNAi載體UTRi，往往不會干擾其他基因而是特定干擾ThCHS1基因表達，因而導致花色只是部分改變。
在本研究中，經過序列比對分析，選取PcPKS1 基因3′端的非編碼區長為209 bp的特異序列作為干擾區段，構建了載體pYLRNAi-UTR，這樣保證提高了沉默PcPKS1基因的效率和特異性，為研究PcPKS1基因的功能奠定基礎。同時，選取PcPKS1基因編碼區長為574 bp的保守序列作為干擾區段，構建了載體pYLRNAi-CDS，期望沉默虎杖Ⅲ型聚酮合酶基因家族或查爾酮合酶基因家族，為虎杖功能基因組學研究奠定基礎。
查爾酮合酶是Ⅲ型聚酮合酶家族的重要成員。查爾酮合酶基因是個多功效基因，可以用于花色修飾[15]和種皮色澤調節[16]，甚至影響植株的育性[17]或激素運輸[18]。雖然體外試驗表明虎杖PcPKS1具有查爾酮合酶活性[5]，但目前對虎杖中查爾酮合酶基因CHS的功能以及該基因在生物合成途徑中的作用了解較少。
4 小結
本研究基于反向調控策略，分別以PcPKS1基因的編碼區保守序列和3′端非編碼區特異序列為目標序列，成功構建了以組成型CaMV35S為啟動子，以潮霉素抗性為篩選標記的RNA干擾表達載體pYLRNAi-CDS和pYLRNAi-UTR。
參考文獻：
[1] 張文根，楊賽剛，李 波，等.中國蓼科植物化學成分研究進展[J].現代生物醫學進展，2008（8）：393-396.
[2] SHEN B.Polyketide biosynthesis beyond the type II，II and III polyketide synthase paradigms[J]. Current Opinion in Chemical Biology，2003，7（2）：285-295.
[3] ABE I， MORITA H.Structure and function of the chalcone synthase superfamily of plant type III polyketide synthases[J]. Natural Product Reports，2010，27（6）：809-838.
[4] MA L Q，GUO Y W，GAO D Y，et al.Identification of a Polygonum cuspidatum three-intron gene encoding a type III polyketide synthase producing both naringenin and p-hydroxybenzalacetone[J]. Planta， 2009， 229（5）： 1077-1086.
[5] MA L， PANG X， SHEN H， et al. A novel type III polyketide synthase encoded by a three-intron gene from Polygonum cuspidatum[J].Planta，2009，229（3）：457-469.
[6] 李 星，王 紅.虎杖查爾酮合酶PcCHS1基因的克隆與功能分析[J].中國科學院研究生院學報， 2013，30（2）：206-212.
[7] SIOMI H，SIOMI M C.On the road to reading the RNA-interference code[J]. Nature，2009，457（22）：396-404.
[8] WANG M B，ABBOTT D C，WATERHOUSE P M.A single copy of a virus-derived transgene encoding hairpin RNA gives immunity to barley yellow dwarf virus[J]. Mol Plant Pathol，2000，1（6）：347-356.
[9] REGINA A， BIRD A，TOPPING D，et al.High-amylose wheat generated by RNA interference improves indices oflarge-bowel health in rats[J].PNAS，2006，103：3546-3551.
[10] WIANNY F，ZERNICKA-GOETZ M.Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development[J].Nat Cell Biol，2000，2：70-75.
[11] WESLEY S V，HELLIWELL C，SMITH N A，et al.Constructs for efficient，effective and high throughput gene silencing in plants[J].Plant J， 2001， 27： 581-590.
[12] 曾曉珊，戴良英，劉雄倫，等.dsRNA介導植物基因沉默及其應用[J].生命科學，2007，19（2）：132-138.
[13] 柳 覲，相微微，張懷剛.RNA干擾技術在小麥中的應用研究進展[J].麥類作物學報，2009，29（4）：725-729.
[14] FUKUSAKI E，KAWASAKI K， KAJIYAMA S，et al.Flower color modulations of Torenia hybrida by downregulation of chalcone synthase genes with RNA interference[J]. J Biotechnology， 2004，111：229-240.
[15] NAKATSUKA T，PITAKSUTHEEPONG C，YAMAMURA S， et al.Induction of differential flower pigmentation patterns by RNAi using promoters with distinct tissue-specific activity[J].Plant Biotechnol Rep，2007，1：251-257.
[16] 狄曙玲，劉列釗，柴友榮，等.類黃酮物質及查爾酮合酶在油菜性狀改良中的作用[J].安徽農學通報，2007，13（18）：21-24.
反向遺傳學研究方法范文3
關鍵詞：RNA干擾；腦膠質瘤細胞U251；X連鎖凋亡抑制蛋白
中圖分類號：R739.4 R255.2 文獻標識碼：A 文章編號：1672-1349（2011）06-0720-03腦膠質瘤是神經系統最常見的惡性疾病，起源于神經上皮的原發腫瘤，約占顱內腫瘤的35%～60%，具有血供豐富，浸潤性生長等惡性腫瘤的生物學特點。外科手術要完全切除腦膠質瘤很難，化學治療、放療的治療效果不容樂觀，且易發生一些毒副反應，腫瘤復發率高，預后差，病死率高。近幾年來，在臨床上對腦膠質瘤的綜合治療措施不斷的改進和提高，但其死亡率仍未下降，其中位生存期僅13個月。腦膠質瘤的惡性進展及其復發是一個涉及多基因、多階段、多步驟的復雜過程，現階段腦膠質瘤基因治療表現出了它的優越性，X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP） 是凋亡抑制蛋白家族（inhibitor apoptosis proteins，IAPs）中的成分之一，且是IAPs中抗凋亡作用最強的，研究顯示XIAP在多種正常細胞中呈現低表達狀態，但在惡性腫瘤中表達則呈高表達狀態【sup】［1］【/sup】 。IAPs編碼一組結構相關的蛋白質，它的主要功能是抑制細胞凋亡，在凋亡調控中發揮著關鍵作用，從現在的研究發現IAPs有八個主要成員，研究比較多的是其中的XIAP和survivin。目前，國內外尚未見以XIAP為靶點治療腦膠質瘤的類似報道。本實驗選擇RNA干擾技術，設計特異性針對XIAP的siRNA，將siRNA轉染人腦膠質瘤細胞U251細胞，檢測XIAP的表達及其細胞周期和凋亡率的改變。為臨床診斷和治療腦膠質瘤奠定理論基礎。
1 材料與方法
1.1 材料 腦膠質瘤細胞（山西醫科大學）， RNA提取試劑盒（北京飛捷生物公司），lipofectamin 2000（Invitrogen 公司），RT-PCR一步法試劑盒（Promega公司），DNAmark（Takara公司），Protein Markers（Hong KongTech.Co.Ltd），β-actin小鼠單抗（晶美生物公司），辣根過氧化酶標記山羊IgG（H+L）（中杉金橋公司），XIAP（3F3）小鼠單抗（sc58470）（Santa Cruz Biotechnology.Inc），SiRNA1-3（北京三博遠志生物技術有限責任公司）。
1.2 方法
1.2.1 腦膠質瘤細U2451細胞siRNA轉染效率檢測 在37 ℃，5% CO【sub】2【/sub】溫箱以10%的RPM1640培養液培養人腦膠質瘤U251細胞，胰酶消化傳代。當細胞達到對數期以 2×10【sup】5【/sup】的密度接種6孔板，24 h后用帶熒光的siRNA轉染細胞，在轉染前1 h用無血清無抗生素的空白1640換液2次，細胞呈饑餓狀態。按照銳博公司siRNA轉染說明將配好的siRNA和脂質體2000在室溫下混合20 min，逐滴加入6孔板，在37 ℃，5% CO【sub】2【/sub】溫箱孵育24 h后觀察其轉染效率。轉染效率（發出綠色熒光的細胞數/總細胞數）×100%。
1.2.2 實驗分組 根據實驗需要分為5組：篩選有效siRNA后，將有效siRNA按濃度分為20 nmol/L組、30 nmol/L組、50 nmol/L組，并且有陰性對照組和陽性對照組。
1.2.3 RT-PCR檢測特異性的siRNA 登陸NCBI網站，從GeneBank上查詢XIAP的mRNA序列，根據XIAP的mRNA序列，用Primer5軟件設計RT-PCR引物，并用BLAST比對，內參為GAPDH，參照GeneBank資料設計。取對數生長期細胞，用20 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L濃度siRNA轉染后培養24 h為實驗組，正常培養未加干預細胞為對照組，提取RNA步驟按照RNAfast200-總RNA極速抽提試劑盒進行。建立50 μL的反應體系，將無核酸酶水，AMV/Tfi 5×反應緩沖液，dNTP混合物，特異上下游引物及25 mmol/L MgSO【sub】4【/sub】加入倒置于冰上的0.5 mL薄壁反應管中，配制成反應混合物。然后向反應體系中加入AMV反轉錄酶和Tfi DNA聚合酶。將反應管輕柔振蕩10 s以使該混合物混勻。反應條件如下48 ℃ 45 min， 94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 1 min， 68 ℃ 2 min，68 ℃ 7 min，4 ℃∞。共44個循環，擴增產物于1%的凝膠電泳檢測。XIAP引物序列、擴增片段大小詳見表1。表1 XIAP引物序列、擴增片段大小
1.2.4 Western-blot檢測XIAP的蛋白表達 用終濃度為1 mmol/L蛋白裂解液RIPA裂解細胞，在4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清。紫外分光光度儀測定蛋白濃度，－70 ℃儲存，將定量后的蛋白質100 ℃加熱5 min后上樣電泳，將轉好的硝酸纖維素膜用封閉液室溫振蕩封閉2 h，用1 mL 1∶400的一抗封閉4 ℃過夜，棄一抗后加入1 mL 1∶400的辣根過氧化酶標記的二抗，室溫下孵育2 h，棄去二抗后TBST洗膜5次，每次8 min，化學發光試劑顯影5 min照相。
1.2.5 流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡率的變化 選取對數生長期密度在1×10【sup】6【/sup】，1 500 r/min離心10 min，去上清，PBS洗滌。一半加1 mL PBS吹打成懸浮細胞，流式細胞儀檢測凋亡。另一半懸于250 μL PBS中，緩慢加入－20 ℃預冷的95%乙醇，終濃度為70%，冰浴30 min，加0.2 mL RNaseA，37 ℃水浴30 min，加入染色液PI0.3 mL，暗室下染色20 min。流式細胞儀檢測周期。
1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0進行分析，采用LSD-t檢驗，組間比較采用SNK-t檢驗，P
2 結 果
2.1 siRNA轉染腦膠質瘤U251細胞的轉染效率 計算出轉染效率在80%以上。
2.2 siRNA抑制 XIAP后mRNA的表達（見圖1） 共3個靶位的siRNA， siRNA2特異性抑制 XIAP的表達，而其他兩個靶位siRNA沒有明顯的抑制效果。
注：M為脂質體2000 DNA mark1～3 為siRNA1-34為陽性對照。
圖1 RT-PCR檢測3個靶位siRNA的特異性
2.3 siRNA抑制 XIAP前后的蛋白表達（見圖2） 內參顯示為均一的條帶，實驗組XIAP組蛋白灰度比值有較大的差異，以30 nmol/L最為顯著，蛋白表達量較多，而轉染前XIAP的蛋白表達幾乎很少，與內參對照比較各組的灰度值比值為12%、86%、71%、5.5%、73%、68%，各組XIAP蛋白的表達量由0.088±0.005上升到0.705±0.040（P
注：1為陽性對照組；2為陰性對照組；3為20 nmol/L組，4 為30 nmol/L組；5為50 nmol/L組；6為轉染前。
圖2 轉染前后腦膠質瘤U251細胞XIAP的表達
2.4 siRNA抑制DNMT1前后細胞周期和凋亡的比較（見表1） 人腦膠質瘤細胞U251經siRNA干擾后停滯在G1期的細胞增多，與轉染前及陰性對照組比較有統計學意義（P
3 討 論
RNA干擾是指21-23nt的siRNA介導識別并靶向切割同源性靶mRNA分子，導致mRNA降解，只有在特異性雙鏈核糖核酸（dsRNA）存在的條件下mRNA才被降解，從而實現特定基因的表達沉默；RNA干擾技術能同時封閉多個基因或基因家族；RNAi技術使基因表達暫時降低，基因組的信息仍是完整的，優越于基因敲降技術（可能破壞基因的完整性）；同時RNAi技術因其操作簡單、特異性高、能迅速而方便地使某個基因失去功能；鑒于以上優點RANi技術首先被應用于功能基因組和反向遺傳學的研究，其次用于研究mRNA差別剪接形成的異構體【sup】［2-4］【/sup】。
XIAP家族成員的表達增高是引起腫瘤細胞逃逸各種凋亡途徑（內源性的線粒體途徑和外源性的死亡受體途徑）的誘導因素的主要原因【sup】［5］【/sup】，XIAP是抑制蛋白家族中抗凋亡作用最強的一個成分，在細胞畸變、腫瘤形成時表達明顯增加【sup】［6］【/sup】，同時有研究證明XIAP的高表達與放療、化療的抵抗性呈正相關【sup】［7］【/sup】，XIAP蛋白水平的變化能夠明顯改善細胞的凋亡反應。
本實驗采用RNA干擾技術，通過脂質體2000成功地將siRNA轉入人腦膠質瘤U251細胞，在熒光顯微鏡下觀察轉染后帶熒光的細胞，轉染效率在80%以上，肯定了后繼實驗的可靠性；采用PCR檢測siRNA干擾后XIAP的mRNA表達，結果顯示siRNA2效果顯著，使XIAP低表達，甚至不表達；采用Western-blot檢測不同濃度siRNA干擾后XIAP蛋白的表達顯示：30 nmol/L siRNA抑制效率較強；采用流式細胞儀檢測發現經RNA干擾后停滯在G0/G1期的細胞增多，在S期的細胞減少，并且細胞的凋亡率增加；同時，本研究還發現高濃度的siRNA并不能帶來更高的抑制效應，甚至有抑制效應下降的現象，主要的原因可能與RNAi發生時引起的一些非特異性反應及劑量效應的缺失有關，并且一些學者發現當siRNA濃度增高時有基因表達上調的現象【sup】［8］【/sup】。結合本實驗結果認為，RNAi技術可抑制腦膠質瘤細胞U251上XIAP基因的表達，人工合成siRNA可通過抑制腦膠質瘤細胞的增殖和促進凋亡而發揮抗腫瘤作用。因此特異性siRNA干擾XIAP基因可能為人腦膠質瘤治療提供廣闊的應用前景。
參考文獻：
［1］ Tfelt-Hansen J,Kanuparthi D,Chattopadhyay N.The emerging role of pituitary tumor transforming gene in tumor genesis［J］.Clinic Med Press,2006,4（2）:130-137.
［2］ Chow LS,LoK W,Kwong J,et al.RASSFIA is a target tumor suppressor from 3p21.3 in nasopharyngeal carcinoma［J］.Cancer,2004,109（6）:839-847.
［3］ Dreijerink K,Braga E,Kuzmin I,et al.The candidate tumor suppressor geneRASS1A from human chromosome 3p21.3 are involved in kidney tumor genesis［J］.Proc Antacids Sci USA,2001,98（13）:7504-7509.
［4］ Murray PG,Qiu GH,Fu L,et al.Frequent epigenetic inactivation of the RASSF1A tumor suppressor gene in Hodgkin lymphoma［J］.Oncogene,2004,23（6）:1326-1331.
［5］ LaCasse EC,Holcik M,Korneluk RG,et al.Apoptosis in health,disease,and therapy:Overview and methodology in apoptosis in health and disease［J］.Clinical and therapeutic aspects Cambridge:Cambridge University Press,2005,6:1-48.
［6］ Takeuchi H,Kim J,Fujimoto A,et al.X-linked inhibitor of apoptosis protein expression level in colorectal cancer is regulated by hepatocyte growth factor met pathway via at signaling［J］.Clinic Cancer Press,2005,11:7621-7628.
［7］ Schimmer AD，Dalili S，Batey RA，et al.Targeting XIAP for the treatment of m alignancy［J］.Cell Death Differ,2006,13:179-188.
［8］ 陸嶸，房靜遠.表觀遺傳修飾與腫瘤［J］.生命科學,2006,18（1）:10-14.